KR20160054015A

KR20160054015A - 식물 세포 배양 유래 프로시아니딘의 생산 및 추출

Info

Publication number: KR20160054015A
Application number: KR1020167010166A
Authority: KR
Inventors: 마이라바라푸 벤카트라메쉬; 디. 라이 와그너; 소니아 랄; 프레데릭 레자르드; 성용 윤
Original assignee: 다이아나플랜트사이언스, 아이엔씨.
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-05-04
Publication date: 2016-05-13
Also published as: KR20120059451A; US20120021080A1; JP2015109863A; JP2012522504A; CN102414312A; JP5789595B2; EP2414509A4; US8568798B2; EP2414509B1; BRPI0925040A2; EP2966165A1; WO2010114567A1; EP2414509A1

Abstract

본 발명에서 제공된 코코아 폴리페놀(cocoa polyphenol) 제조물을 제조하는 방법은 상기 세포 현탁 배양으로부터 코코아 폴리페놀을, 예를 들면 프로시아니딘(procyanidins)을 수득하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 실시예에서, 상기 결과로 생긴 코코아 폴리페놀 제조물은 대체로(또는 경우에 따라, 완전히) 카페인(caffeine) 및 테오브로민(theobromine)을 탐지할 수 없고, 보통 더욱 대체로 크산틴 알칼로이드(xanthine alkaloids)가 없다. 또한, 코코아 폴리페놀을, 더욱 구체적으로, 프로시아니딘 제조물을 만드는데 유용한 세포 현탁 배양을 포함하여, 카카오 세포의 세포 현탁 배양을 생산하는 방법이 기재되었다. 또한, 테오브로마 속(Theobroma sp) 및 헤라니아 속(Herrania sp) 세포 현탁 배양 및 특이적으로 크산틴 알칼로이드가 없는 코코아 폴리페놀 제조물(카페인 및/또는 테오브로민이 없는)코코아 폴리페놀 제조물이 역시 제공된다.

Description

식물 세포 배양 유래 프로시아니딘의 생산 및 추출{PRODUCTION AND EXTRACTION OF PROCYANIDINS FROM PLANT CELL CULTURES}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2009년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 제 61/166,591에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

기술 분야

본 기술은 카카오(cacao) 조직의 세포 배양을 개발하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 기술은 높은 수준의 프로시아니딘(procyanidins)을 생산하는 세포주를 선별하고, 식품 구성분, 식품 첨가물, 치료 조성물 또는 화장품 조성물을 생산하는 세포 배양 유래 프로시아니딘을 추출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 기술은 카카오 세포의 세포 현탁 배양을 생장시키는 액체 배지와 같은 신규한 배지 및 이러한 현탁 세포에 의해 프로시아니딘 생산을 향상시키는 액체 배지 조성물에 관한 것이다.

폴리페놀(Polyphenols)은 식물, 과일 및 야채에 광범위하게 분포되어 있고, 인간 및 동물의 건강에 있어서 항산화제, 항돌연변이성 및 암 예방 활성을 포함하는 그들의 생리학적 기능 때문에 지속적인 관심을 받고있다(Salvia et al., J. Agric. Food Chem. 39: 1549-1552, 1991; Bomser et al., Cancer Lett., 135: 151-157, 1999; Zhao et al., Carcinogenesis, 20: 1737-1745, 1999). 역학적 연구는 폴리페놀 중에서, 플라보노이드(flavonoids)가 심장 질환의 위험을 줄일 수 있음을 제시하였다(Hertog et al., Lancet: 342: 1007-1011, 1993). 게다가, 식이(dietary) 플라반-3-올(flavan-3-ols) 및/또는 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)은 실험 동물에서 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis) 및 관상동맥 심장 질환(coronary heart disease)을 감소시키는 것을 나타냈다(Tijburg et al., Atherosclorosis, 135: 37-47, 1997; Yamakoshi et al., Atherosclerosis, 142: 139-149, 1999). 이러한 효과의 원인이 되는 기작 중의 하나는 그들의 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein , LDL)의 산화 저해와 관련된다(Steinberg, Circulation, 85: 2337-2344, 1992).

상기 카카오 식물(Theobroma cacao L., Sterculiaceae)의 종자는 폴리페놀이 풍부한 것이 알려져 있다 (Porter et al., Phytochemistry, 30: 1657-1663, 1991). 카카오 및 초콜렛 생산품의 주요 성분인, 카카오 콩을 발효하고, 볶아서 제조되는 카카오 술(liquor)의 상기 항산화제 구성분은 플라반-3-올 및 프로시아니딘 저중합체(oligomers)로 특정화되었다(Sanbongi et al., J. Agric. Food Chem., 46: 454-457, 1998; Adamson et al., J. Agric. Food Chem., 47: 4184-4188, 1999).

테오브로마(Theobroma)의 다른 종 및 헤라니아(Herrania)와 같은 다른 속은 카카오 프로시아니딘의 원천으로 알려져 있다. 20 개의 테오브로마의 다른 종이 기재되어 있지만 보통 12 개만이 인정되었다. 이것 중에 9 개는 아마조니아(Amazonia)가 원산지이므로, 유전학적 분포의 중심은 지역의 서부에 나타난다(Giacometti, 1994, In “Neglected Crops: 1492 from a different perspective (J.E. Hernando Bermejo and J. Leon, Eds.)( Plant Production and Protection Series No. 26, FAO, Rome, Italy, p205-209).

상기 테오브로마 속은 전형적으로 신열대구이고, 위도 18°N 및 15°S 사이의 서반구(Western Hemisphere)의 열대 우림에 분포되어있다. 대부분 종이 있는 지역은 코스타리카(Costa Rica) 및 북동부 콜롬비아(northeastern Colombia) 사이이다. 5 개 부문(section) 및 20 개의 종이 인정되었다. 테오브로마 그랜디플로럼(Theobroma grandiflorum)은 11 개의 종으로 구성된 글로소페탈럼(Glossopetalum) 부문에 속하고; 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 는 테오브로마 부문에 속하는 유일한 종이다.

테오브로마의 4개 종은 식용 과육의 생산자로서 기재되었다: 테오브로마 그랜디플로럼, 테오브로마 카누마넌스(Theobroma canumanense) Pires & Froes, 테오브로마 서빈카넘(Theobroma subincanum) Martius, (브라질의 Cupui 및 콜롬비아의 Cacau de monte) 및 테오브로마 트리컬러(Theobroma tricolor) Humb. & Bonpl., 은 서부 아마조니아부터 남부 멕시코(Mexico)까지 분포된 작은 나무이다. 초콜릿은 이러한 종의 종자들로 만들어진다(Giacometti, 1994, In “Neglected Crops: 1492 from a different perspective (J.E. Hernando Bermejo and J. Leon, Eds.) Plant Production and Protection Series No. 26, FAO, Rome, Italy, p205-209). 테오브로마 및 헤라니아의 몇몇 종의 콩은 유사한 프로시아니딘을 생산하며, 이러한 화합물은 상기 콩으로부터 추출될 수 있는 것으로 보인다(Romanczyk et al., WO 97/36497).

상기 코코아 콩안의 폴리페놀은 자엽의 색소 세포안에 저장되어 있다. 이러한 색소 세포안의 안소시아닌(anthocyanins)의 양에 따라, 또한 폴리페놀-저장 세포(polyphenol-storage cells)로 불리며, 그들은 짙은 자주색이다. 폴리페놀의 세 그룹은 이러한 세포로 구별될 수 있다: 카테킨(catechins) 또는 플라반-3-올(flavan-3-ols)(~37%), 안소시아닌(anthocyanins)(~4%) 및 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)(~58%). 상기 주요 카테킨은 전체 폴리페놀량의 35%로 구성된 (-)-에피카테킨(epicatechin)이다. 프로시아니딘(보통 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)이라 언급됨)은 농축된 주요 연장 아단위(sub-unit)로서 에피카테킨(epicatechin)과 함께 응축한 이량체(dimmers), 삼량체(trimers) 또는 저중합체(oligomers)에 4→8 또는 4→6 결합하는 주로 플라반-3,4-디올이다(Romanczyk et al., WO 97/36497).

신선한 코코아 콩의 건조된 탈지 덩어리에서 상기 전체 용해성 있는 폴리페놀의 양은 15 내지 20%이고(공기에 건조된 코코아 콩안의 동일한~6%, 54% 지방 및 6% 수분을 포함하는), 및 발효된 콩 ~5%이다. 따라서, 폴리페놀의 재료로서 코코아 콩을 이용하는 것의 주요 단점 중의 하나는 대부분 상기 폴리페놀이 상기 콩의 과정 동안 소실된다는 것이다. 굽거나 지방을 없애는 다른 단계 역시 소실을 유도한다. 따라서 코코아 가루는 신선한 콩안의 전에 폴리페놀의 10% 미만을 가지고 있다. 코코아 콩을 사용하는 것의 또 다른 문제점은 테오브로마 카카오(Theobroma cacao)의 제한된 생장 범위이다. 테오브로마 카카오는 따뜻하고 습기가 있는 적도의 위도 약 20°남쪽 및 북쪽지역에서만 생장한다. 저장 및 그들이 가공될 수 있고 폴리페놀이 추출될 수 있는 지역으로 운송 동안 상기 콩의 폴리페놀량을 저장하는 것이 어렵다.

식물 세포 배양은 이러한 문제점을 극복할 수 있는 매력적인 대안이다. 식물 세포 배양은 최근에 플라보노이드(flavonoids)의 분리에 사용되었다. 예를 들면, 4→8 연결된 (-)-에피카테킨-, (+)-카테킨 및 갈산(gallic acid)은 로자(Rosa) 배양으로부터 분리되었다(Muhitch & Fletcher, Plant Physiol., 75:592?595, 1984). 현탁 배양(Suspension cultures) 및 크리토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica)의 캘러스(calluses)는 프로시아니딘의 건조 중량의 26% 만큼 생산하는 것이 알려졌고(Teramoto & Ishikura, Bot. Mag. Tokyo 98: 171-179, 1985; Ishikura & Teramoto, Agric. Biol. Chem. 47: 421-423, 1983), 슈도스가 멘시에시(Pseudotsuga mensiesii) 현탁 배양은 프로시아니딘의 건조 중량의 40% 만큼 생산하였다(Stafford & Cheng, Phytochemistry 19: 131-135, 1980). 또한, 연구는 비티스 비니페라(Vitis vinifera)의 세포 현탁 배양의 프로시아니딘 생산을 보여준다(Decendit & Merillon, Plant Cell Rep. 15: 762-765, 1996; Waffo-Teguo et al., Phytochem. 42:1591-1593, 1996).

테오브로마 카카오의 조직 배양 연구는 상기 식물의 영양계번식(clonal propagation)의 목적을 위해 몇몇의 실험실에서 개발되었던 체세포배형성(somatic embryogenesis)에 초점이 맞춰져 있었다. 테오브로마 카카오 체세포배형성의 상기 첫번째 보고는 1977년 미성숙한 접합자배(zygotic embryo) 조직 외식을 이용한 방법을 기재한 Esan에 의한 것이다(Proc. 5th Int. Cacao Res. Conf. 1975. Ibadan: Cacao Res. Inst. Nigeria, 1977: 116-125, 1977). 유사한 방법은 후에 다른 이들에 의해 보고되었다(Pence et al., J. Am. Soc. Hort. Sci. 104: 145-148, 1979; Villalobos & Aguilar, Abstr. VII Int. Congr. Plant Tissue and Cell Cult., Amsterdam, Int. Assoc. for Plant Tissue Culture, pp 140, 1990). 그 후의 연구는 잎(Litz, In Dimick, P.S., Ed., Cacao biotechnology symposium. The Pennsylvania State University Press, University Park, PA, pp 111-120, 1986), 주심(nucellus) (Chatelet et al., C.R. Acad. Sci., Paris 315: 55-62, 1992; Figueira & Janick, Acta Hort. 336: 231-238, 1993; Sondhal et al., Acta Hort. 336: 245-248, 1993), 및 꽃잎(petals) 및 헛수술(staminodes) (Lopez-Baez et al., C.R. Acad. Sci., Paris 316: 579-584, 1993; Alemanno et al., Plant Cell Tiss. Organ Cult. 46: 187-194, 1996; Alemanno & Michaux-Ferriere, In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 33: 163-172, 1997)을 포함하는 꽃 외식(floral explants)을 포함하는 체조직(somatic tissues) 유래 조직 배양 방법의 개발에 초점이 맞춰졌다. 이러한 초기의 방법은, 성공적이긴 하지만, 모든 유전자형에 적용할 수 없었고, 재생된 식물의 빈도는 낮았다. 또한, 광범위한 유전자형을 번식시킬 수 있는 더 효과적인 방법이 개발되었다(Li et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 34: 293-299, 1998; Maximova et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 38: 252-259, 2002). 하지만, 모든 기재된 방법은, 부정배(somatic embryos)를 생산하는 조직 배양 방법을 사용할 때, 현탁 세포를 증가시키는 방법은 나타내지 않았다.

테오브로마 카카오의 세포 배양을 개발하는 출판된 연구의 제한된 양이 있다. 이 연구의 대부분은 1970 년대 및 1980년대에 있었다(Hall & Collin, Annals of Bot. 39: 555, 1975; Jalal & Collin, Phytochem. 16: 1377-1380, 1977; Jalal & Collin, New Phytol. 83: 343-349, 1979; Tsai et al., J. Food Sci. 47: 768-773, 1982; Wen et al., J. Am. Oil Chemist’s Soc. 16: 1720-1724, 1984). 이러한 것 중 근소한 것이 테오브로마 카카오의 세포 배양에서 플라보노이드를 연구하였다. 예를 들면, Jalal 및 Collin (1979)은 상기 캘러스의 플라보노이드 조성 및 세포 배양이 유사하였고, 원래 온전한 자엽의 그것과 조금 다른 것을 보고하였다. 조직 배양 둘 다 (-)-에피카테킨, 루코시아니딘(leucocyanidins), 카페익(caffeic) 및 쿠마르산(coumaric acids)을 함유하였다. 상기 메틸레이트된 퓨린(purines), 테오브로민(theobromine) 및 카페인(caffeine)은 상기 조직 배양에서 탐지되지 않았다. 하지만, 테오브로마 카카오의 캘러스 및 현탁 배양이 그것의 체내에서 발견된 약 10% 농도로 카페인, 테오브로민 및 테오필린(theophylline)을 생산하는 것을 보고하였다.

최근에 가장 큰 생효율성(bioefficacy)을 갖는 것을 보이는 저중합체 프로시아니딘의 형성을 보고한 기존의 연구가 없었다. Jalal 및 Collin (New Phytol. 83: 343-349, 1979)은 테오브로마 카카오의 세포 배양에서 루코시아니딘(leucocyanidins)의 탐지를 보고하였다. 하지만, 상기 화합물을 탐지하는 상기 방법에 기반하여 상기 루코시아니딘의 천연 또는 크기를 특정화하는 것은 불가능하다. 추가적으로, 조직 배양 방법은 테오브로마 또는 헤라니아(Herrania)의 다른 종에 대해 기재되지 않았다.

도 1은 빠르게 생장하는 세포주를 나타낸 사진이다.
도 2는 다양한 접종 밀도의 배양에서 바이오매스(biomass) 밀도의 대표적인 시간 추이를 나타내는 그래프이다.
도 3은 식물생장과 관련된 조직 유래 선별된 세포의 시간에 따른 세포 생장 및 탄수화물 소비를 보이는 그래프이다.
도 4는 식물 생장과 관련된 조직 유래 세포의 세포 선별 과정으로 인해 향상된 시간에 따른 프로시아니딘(procyanidin) 생산을 나타낸 그래프이다.
도 5는 프로시아니딘 측정을 위한 부탄올-HCl(butanol-HCl) 가수분해를 나타낸다. 프로시아니딘의 산 가수분해는 그들의 2개 단량체 형식인 (-)-에피카테킨((-)-Epicatechin) 및 시아니딘(cyanidin)으로 분해를 유도하며 색은 분홍색이다. 각 시료의 분홍색의 강도는 다른 세포주에서 수득되는 프로시아니딘의 양을 나타낸다(도 5a). 도 5a의 상기 방법은 시료의 빠른 선별을 위한 96웰 플레이트(well plate) 형식에 최적화되었다(도 5b). 상기 시아니딘 흡수는 520 nm이며, 에피카테킨 흡수는 280 nm이다(도 5c); 정량은 상기 시아니딘 흡수값으로 계산되었다.
도 6은 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 세포 배양 유래 프로시아니딘 및 알칼로이드(alkaloids)대한 연속 크로마토그래프(chromatographs). 도 6a 내지 6c는 다양한 정확한 표준 화합물의 HPLC LC-MS 분석을 나타낸다. 도 6d 내지 6f는 테오브로마 카카오 현탁 세포의 HPLC LC-MS 분석을 나타낸다.
도 7은 추가적인 포도당 첨가에 따른 MX1440-3496 세포주의 시간에 따른 프로시아니딘 생산 향상을 나타내는 그래프이다.
도 8은 형광 탐지 형식에서 발효되지 않은 코코아 추출물(도 8a) 및 현탁 세포 추출물(도 8b)안의 연속 HPLC 크로마토그램(chromatograms) 1-머(monomers); 2, 2-머(dimers); 3, 3-머(trimers); 4, 4-머(tetramers); 5, 5-머(pentamers); 6, 6-머(hexamers); 7, 7-머(heptamers); 8, 8-머(octamers); 9, 9-머(nonamers); 10, 10-머(decamers); 11, 11-머(undecamer); 12, 12-머(dodecamers).
도 9는 PDA 탐지 형식에서 280 nm에서 발효되지 않은 코코아 추출물(도 9a) 및 현탁 세포 추출물(도 9b)의 연속 HPLC 크로마토그램이다.
도 10은 테오브로마 카카오 세포 배양의 프로시아니딘 생산성 및 수득량 및 탄수화물 소비를 나타낸 연속 그래프이다. 도 10a 및 도 10b는 꽃이 아닌 및 꽃 조직 유래 현탁 세포 배양의 프로시아니딘 생산성(도 10b) 및 생산 수득량(도 10a)을 확인하였다. 도 10c는 프로시아니딘 생산성 향상에 영향을 주는 세포 선별을 보여준다. 도 10d는 프로시아니딘 생산 수득량 향상에 영향을 주는 세포 선별을 나타낸다. 도 10e는 XXVI 배지에서 테오브로마 카카오 세포 배양의 탄수화물 분석을 나타낸다(표 1).

요약

세포 배양을 재생시키는 방법의 개발은 높은 수득량의 프로시아니딘을 생산할 수 있고 상기 배양 유래 이러한 화합물을 효율적으로 추출하는 방법의 개발은 현저히 이러한 가치있는 화합물의 생산을 증가시킬 수 있으며, 프로시아니딘의 소실을 감소시키는 코코아 콩 과정에 대한 새로운 방법 개발의 번거로운 업무를 요구하지 않을 것이다. 이러한 세포 배양 및 방법은 본 발명에 기재되어있다. 본 발명은 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는(xanthine alkaloid-free) 코코아 폴리페놀(cocoa polyphenols) 제조물을 제조하며, 충분한 시간 동안 및 코코아 폴리페놀(polyphenols)의 생산을 유도하는 조건하에서 현탁 배양에서 테오브로마(Theobroma) 또는 헤라니아(Herrania) 세포를 생장시키고, 상기 세포 현탁 배양로부터 코코아 폴리페놀을 수득하는 것으로 구성된 방법을 제공한다. 특히, 공개된 방법의 실시태양에서, 테오브로마 또는 헤라니아 세포는 충분한 시간 동안 및 코코아 프로시아니딘(cocoa procyanidins)(예를 들면, 저중합체의 프로시아니딘)의 생산을 유도하는 충분한 조건에서 현탁 배양 안에서 생장되고, 상기 세포 현탁 배양로부터 코코아 프로시아니딘을 수득하는 것이다. 이러한 방법의 예로서, 상기 결과로 생긴 코코아 폴리페놀(또는 프로시아니딘) 제조물은 대체로(또는 몇몇 경우에, 완전히) 카페인(caffeine) 및/또는 테오브로민(theobromine)이 탐지될수 없다.

또한, 카카오 세포의 세포 현탁 배양을 생산 방법을 제공한다. 이러한 방법의 예는 고체 성장 배지에서 미성숙한 테오브로마 속 꽃 외식(floral explant) 또는 테오브로마속 식물생장과 관련된 물질(vegetative material) 유래 캘러스를 생장; 상기 테오브로마 속 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주를 선별; 및 액체 배제로 상기 빠르게 생장하는 세포주를 접종함으로써 상기 현탁 배양을 개시하는 것을 포함한다. 실시예를 거쳐 상기 미성숙한 테오브로마 카카오 꽃 외식은 경우에 따라 헛수술(staminode), 꽃받침(sepal) 및 꽃잎 기부 외식(petal base explants)에서 선택된다. 다른 특이적, 제한이 없는 실시예에서, 상기 테오브로마 속 식물생장과 관련된 물질은 어리거나 성숙한 잎, 줄기, 분열조직(meristem), 절 (nodes) 또는 절간(internodes)으로부터 선택된다.

또한, 본 발명에서 기재된 방법 중 어떤 하나를 사용하여 생산된 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는 코코아 폴리페놀 제조물을 제공한다. 특히 실시태양에서, 상기 코코아 폴리페놀 제조물은 크산틴 알칼로이드의 탐지할 수 있는 수준이 부족하다(상기 제조물은 크산틴 알칼로이드가 없다). 다른 실시태양에서, 상기 지수 생장 시기의 말기에 상기 현탁 배양에 보충하는 포도당의 첨가는 프로시아니딘 생산을 증가시킨다.

또한, 본 발명에서 상기 기재된 방법 중 어느 하나로 생산된 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양 및 코코아 폴리페놀(예를 들면, 프로시아니딘)을 생산하는 이러한 세포 현탁물의 이용을 고려한다. 코코아 폴리페놀 및 카페인 및/또는 테오브로민이 대체로 없는 혼합물로 구성된 코코아 폴리페놀 제조물은 본 발명에서 제공되며, 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양로부터 추출된 제조물이다. 특히, 제한이 없는 실시예에서, 상기 코코아 폴리페놀 제조물은 프로시아니딘(예를 들면, 저중합체의 프로시아니딘)으로 구성되고 대체로 카페인 및/또는 테오브로민이 없다. 특히, 제한이 없는 실시태양에서, 본 발명에 기재된 상기 코코아 폴리페놀은 식이, 화장품, 치료 또는 가축의 질병치료 조성물에 사용될 수 있다.

앞서 말한 것 및 다른 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조한 과정의 하기 설명에서 더욱 분명해 질것이다.

상세한 설명

Ⅰ. 약어

2,4-D : 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)

2iP : 6-(γ,γ-디메틸라릴아민)퓨린 (6-(γ,γ-dimethylallylamine) purine)

B5 : 갬보그 B5(Gamborg’s B5)

BA : 벤질아데닌 (Benzyl adenine)

CP : Chee 및 Poole

DKW : Driver 및 Kuniyuki Walnut

FAB/MS : 팹-질량분석 (Fast atom bombardment/mass spectrometry)

HCl : 염산(hydrochloric acid)

HPLC : 고속액체 크로마토그래피 (High performance liquid chromatography)

H2SO4 : 황산 (Sulfuric acid)

IAA : 인돌아세트산 (Indole acetic acid)

IBA : 인돌뷰티르산 (Indole butyric acid)

LC : 액체크로마토그래피 (Liquid chromatography)

LSIMS : 액체 2차 이온화법 (Liquid secondary ion mass spectrometry)

MS : 질량분광학(Mass spectroscopy)

MS 배지, 비타민 또는 염 : Murashige 및 Skoog 배지 (Murashige and Skoog medium), Murashige 및 Skoog 비타민(Murashige and Skoog vitamins), 또는 Murashige 및 Skoog 염 (Murashige and Skoog Salts)

NAA : 1-나프탈렌 아세트산 (1-Naphthalene acetic acid)

NMR : 핵자기공명(Nuclear magnetic resonance)

NN : Nitsch 및 Nitsch (Nitsch and Nitsch)

PCV : 압축세포용적(Packed cell volume)

PDA : 광 다이오드 어레이 (Photodiode array)

QL : Quiorin 및Lepoivre (Quiorin and Lepoivre)

RI : 굴절률(Refractive index)

rpm : 분당 회전 수 (revolutions per minute)

SH : Schenk 및 Hildebrandt (Schenk and Hildebrandt)

TDZ : 티디아주론(thisdiazuron)

TLC : 박층크로마토그래피 (thin layer chromatography)

vvm : 분 당 배양 부피당 가스 부피(volume of gas per volume of culture per minute)

WPM : McCown’s Woody 식물 배지(McCown’s Woody Plant Medium)

Ⅱ. 용어

특별히 명시한 것이 없으면, 기술적인 용어는 기존의 사용에 따라 쓰인다. 본 발명의 다양한 실시태양의 검토를 가능하게 하기 위해, 하기의 특정 용어의 설명을 제공한다:

항산화제는 자유 라디칼(free radicals)로 인한 것과 같은 산화력 있는 손상(산소로 인한 손상)을 감소시키는 물질이다.

캘러스(callus)는 박막(thin-walled) 덩어리, 미분화된 식물 세포, 영양 배지에서 상처를 입히는 것(wounding) 또는 배양의 결과로서 발생된 것이다.

카테킨(Catechins)은 자연적으로 식물에서 발생하는 폴리페놀릭 화합물(polyphenolic compounds)이다. 또한, 그들은 플라반-3-올(flavan-3-ols)이라 불린다.

코코아는 테오브로마 카카오(Sterculiacae 목) 유래 종자이며, 주로 두 품종으로 구성된다: Criollo 및 Forestero는 몇몇의 아변종(subvarities)으로 분류된다. 트리니타리오(Trinitario)로 불리는 세번째 그룹은 Criollo 및 Forestero의 잡종(cross between)이다. 본 발명에서 포함하는 다른 종은, 예를 들면, 테오브로마 그랜디플로럼(Theobroma grandiflorum), 테오브로마 오보바텀(Theobroma obovatum), 테오브로마 스페시오섬(Theobroma speciosum), 테오브로마 서브인카넘(Theobroma subincanum), 및 테오브로마 실베스트리스(Theobroma sylvestris)이다.

플라보노이드(Flavonoids)는 특유의 삼량체 이종고리식의 핵을 포함하는 화합물 군 중 어떤 것이며, 보통 배당체의(glycosidic) 형태를 발생하며, 종종 색소로서 식물에 광범위하게 분포되어 있다.

폴리페놀(Polyphenols)은 그들의 화학적 구조에 따라 분류될 수 있는 4000개 이상의 화학적으로 독특한 플라보노이드를 포함하는 생체플라본류(bioflavonoids)로 알려져 있는 물에 용해되는 식물 색소이다. 폴리페놀 단량체는 카테킨(catechin), 에피테킨(epicatechin), 루코시아니딘(leucocyanidin)을 포함한다. 폴리페놀 저중합체는 프로시아니딘(procyanidins)을 포함한다.

프로시아니딘은 2개 및 15개 단위보다 큰 범위에 이르는 카테킨 단위가 이어져 구성된 중합 화합물이다. 또한, 프로시아니딘은 보통 프로안소시아니딘(프로안토시아니딘) 또는 응축한 탄닌(tannins)으로 불린다.

현탁 배양은 액체 영양 배지에서 조절된 조건하에 원핵세포 또는 진핵세포가 생장되는 과정이다.

조직 배양은 배양 배지에서 살아있는 조직을 유지하고 생장시키는 기술 또는 과정이다.

크산틴(Xanthines), 크산틴의 유도체(3,7-디하이드로-퓨린-2,6-디온: 3,7-dihydro-purine-2,6-dione)는 약한 흥분제 및 기관지 확장제로서 보통 그들의 영향이 이용되는 알칼로이드(alkaloids)군이다. 메틸화 크산틴 유도체는 카페인(caffeine), 파라잔틴(paraxanthine), 테오필린(theophylline) 및 테오브로민(theobromine)(주로 초콜릿 안에서 발견되는)을 포함한다. 이러한 화합물은 포스포디에스터라제(phosphodiesterase) 및 아데노신(adenosine)을 저해한다.

특별히 설명된 것이 없으면, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적인 용어는 보통 당업계의 당업자에 의해 이해되는 것으로서 같은 의미를 갖는다. 단수형 명사 “하나(a),” “하나(an),” 및 “상기(the)” 는 특별히 지시하지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, 상기 단어 “또는”은 맥락에서 분명히 지시되지 않으면 “및”을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 이유로 “A 또는 B를 포함하는”은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에서 기재된 것과 유사한 또는 동일한 방법 및 물질은 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 하기에 적합한 방법 및 물질이 기재되어있다. 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 다른 본 발명에서 언급된 참조문헌은 그들의 전체가 참조로서 포함된다. 분쟁의 경우, 상기 본 명세서는 용어의 설명을 포함하여 조절할 것이다. 게다가, 상기 물질, 방법 및 실시예는 오직 실례가 되며, 한정하려는 것이 아니다.

Ⅲ. 몇몇의 실시태양의 개요

본 발명에서 제공된 첫번째 실시태양은 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는(xanthine alkaloid-free) 코코아 폴리페놀(cocoa polyphenol) 제조물을 제조하는 방법이며, 이는 충분한 시간 동안 코코아 폴리페놀의 생산을 유도하는데 충분한 조건하에서 현탁 배양에 의해 테오브로마(Theobroma) 또는 헤라니아(Herrania) 세포를 생장시키는 단게, 및 상기 현탁 배양에서 코코아 폴리페놀을 수득하는 단계로 구성된다. 이러한 방법의 실시예에서, 상기 결과로 생긴 코코아 폴리페놀 제조물은 대체로(또는 경우에 따라, 완전히) 탐지할 수 있는 카페인(caffeine)/또는 테오브로민(theobromine)이 없다. 다른 특정 실시예에서, 상기 제조물은 발효된 파드(pod)로 만들어지는 코코아 폴리페놀 제조물에 제시될 수 있는 카페인 및/또는 테오브로민의 수준의 50% 미만을 포함한다. 선호되는 실시태양에서, 상기 제조물 유래된 세포 배양은 발효된 콩으로 만들어지는 코코아 폴리페놀 제조물에 제시될 수 있는30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만 수준의 카페인 및/또는 테오브로민을 포함한다. 상기 공개된 방법 중 특정 실시태양에서, 테오브로마 또는 헤라니아 세포는 충분한 시간 동안 및 코코아 프로시아니딘(예를 들면, 저중합체의 프로시아니딘)의 생산을 유도하는데 충분한 조건하에서 현탁 배양에서 생장되고, 상기 세포 현탁 배양에서 코코아 프로시아니딘을 수득한다.

본 발명에서 제공된 대표적인 방법에서, 상기 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양은 고체 생장 배지에서 미성숙한 테오브로마 또는 헤라니아 꽃 외식 또는 테오브로마 또는 헤라니아 식물생장과 관련된 물질 유래 캘러스를 생장시키고, 상기 테오브로마 또는 헤라니아 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주를 선별하고, 상기 빠르게 자라는 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 상기 현탁 배양을 개시함으로써 생산된다.

상기 제공된 방법 중에서 상기 코코아 폴리페놀(프로시아니딘을 포함하여)의 생산은 상기 세포의 수득하는 단계; 폴리페놀이 풍부한 분획물의 추출을 위한 적합한 용액에서 세포 바이오매스(biomass)를 균질화하는 단계; 프로시아니딘이 풍부한 분획물의 분리(예를 들면, 용액-용액 추출물 및/또는 크로마토그래피(chromatography)); 및 선택적으로 프로시아니딘 분획물의 건조 또는 농축하는 단계로 구성된다. 경우에 따라, 상기 세포의 수득은 원심분리, 여과 또는 그들의 조합으로 구성된다.

또한, 본 발명에서 공개된 상기 방법 중의 어떤 것을 이용하여 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는 코코아 폴리페놀 제조물을 제공한다. 실시예를 거쳐, 코코아 폴리페놀 제조물은 2% 미만 테오브로민 및 2% 미만 카페인을 함유할 경우, 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는 것으로 여겨진다. 특히, 제한없는 실시예에서 코코아 폴리페놀 제조물은 1.5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0% 테오브로민 및/또는 0.25% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만 또는 0% 카페인을 함유하는 경우, 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는 것으로 여겨진다. 특히, 제한없는 실시예에서 코코아 폴리페놀 제조물은 1.5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0% 테오브로민 및/또는 0.25% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만 또는 0% 카페인을 함유하는 경우, 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는 것으로 여겨진다. 가장 바람직한 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는 수준은 0% 테오브로민 및 0% 카페인이다(상기 제조물은 크산틴 알칼로이드가 없다).

이제, 다른 실시태양은 카카오 세포의 세포 현탁 배양을 생산하는 방법이다. 이 방법의 실시예는 고체 생장 배지에서 미성숙한 테오브로마 또는 헤라니아 꽃 외식 또는 테오브로마 또는 헤라니아 식물생장과 관련된 물질 유래 캘러스를 생장시키고, 상기 테오브로마 또는 헤라니아 캘러스 배양로부터 빠르게 생장하는 세포주를 선별하고, 상기 빠르게 생장하는 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 상기 현탁 배양을 개시하는 것을 포함한다. 실시예를 거쳐, 상기 미성숙한 테오브로마 카카오 또는 헤라니아 꽃 외식은 경우에 따라, 헛수술(staminode), 꽃받침(sepal) 및 꽃잎 기부 외식(petal base explants)으로부터 선택된다. 다른 특정 제한없는 실시예에서, 상기 테오브로마 카카오 또는 헤라니아 식물생장과 관련된 물질은 어리거나 성숙한 잎, 줄기, 분열조직(meristem), 혹(nodes), 또는 절간(internodes)에서 선택된다.

선택적으로, 상기 카카오 세포의 세포 현탁 배양을 생산하는 방법은 추가적으로 플라스크, 어떤 적합한 배양 용기, 또는 생물반응장치에서 상기 현탁 배양을 생장시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 생장은 경우에 따라 용기 또는 생물반응장치 및 배치(batch)에서, 유가배양(fedbatch) 또는 지속적인 형식에서 되는 것이다.

또한, 상기 방법 중 어떤 것으로 생산되는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양 및 코코아 폴리페놀 또는, 더 특히, 프로시아니딘을 생산하는 이러한 세포 현탁 배양의 이용이 본 발명에서 고려된다.

이러한 기재된 것에 의해 제공되는 다른 실시태양은 코코아 폴리페놀의 혼합물 및 자연히 대체로 카페인 및 테오브로민이 없는, 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양로부터 추출되는 코코아 폴리페놀 제조물이다. 실시예를 거쳐, 코코아 폴리페놀 제조물은 2% 미만 테오브로민 및 0.5% 미만 카페인을 포함하는 경우 대체로 카페인 및 테오브로민이 없는 것으로 여겨진다. 특히, 제한없는 실시예에서 코코아 폴리페놀 제조물은 대체로 1.5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0% 테오브로민 및 0.25% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만 또는 0% 카페인을 포함하는 경우 크산틴 알칼로이드가 없는 것으로 여긴다. 가장 바람직한 대체로 크산틴 알칼로이드가 없는 수준은 0% 테오브로민 및 0% 카페인이다. 상기 용어 "자연히 대체로 카페인 및 테오브로민이 없는"와 관련하여 "자연히"는 LH-20 크기 제외 크로마토그래피와 같은 정제 과정을 통하여 카페인 및 테오브로민의 상대적인 부재가 발생하지 않는 것을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 지수 생장 시기의 말기에 상기 현탁 배양로 보충하는 포도당 첨가는 프로시아니딘 생산을 증기시킨다.

추가적인 실시태양은 헥산(hexane) 또는 다른 유기용매를 이용하여 지방질을 제거하는 단계없이 생산되는 코코아 폴리페놀 제조물이다. 따라서, 헥산 사용없이 생산되는(예를 들면, 추출되는) 코코아 폴리페놀(예를 들면, 프로시아니딘) 제조물이 본 발명에서 고려된다.

또한, 제공되는 특정 실시태양은 코코아 폴리페놀 제조물이며, 이는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양로부터 추출되며, 상기세포를 수득하고, 폴리페놀이 풍부한 분획물의 추출물에 대해 적합한 용액에서 세포 바이오매스를 균질화하고, 프로시아니딘이 풍부한 분획물을 분리하며(예를 들면, 용액-용액 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용하여), 선택적으로 상기 프로시아니딘 분획물을 건조, 동결건조 또는 농축하는 것을 포함한다. 예를 들면, 수득된 상기 세포는 원심분리, 여과 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 본 발명에서 제공된 코코아 폴리페놀 제조물은 식이 조성물, 및/또는 치료적 조성물, 및/또는 동물의 질병치료 조성물, 및/또는 화장품 조성물에 이용될 수 있는 것이 고려된다.

또한, 본 발명에서 기재된 대표적인 제조물 및/또는 본 발명에 기재된 방법을 이용하여 생산된 것은 카테킨, 에피카테킨 및 프로시아니딘 저중합체를 포함하는 것을 고려한다. 특정 실시예에서, 제조물에 따라 상기 저중합체는 2-머(dimers), 3-머(trimers), 4-머(tetramers), 5-머(pentamers), 6-머(hexamers), 7-머(heptamers), 8-머(octamers), 9-머(nonamers) 또는 그것의 두 개 또는 그 이상의 것의 혼합물을 포함한다.

또한, 상기 코코아 폴리페놀은 코코아 프로시아니딘인 제조물이 고려된다.

본 발명에서 제공된 코코아 폴리페놀은 액체 형태, 건조 형태 또는 동결건조된 형태안에 제공될 수 있다.

Ⅳ. 코코아 조직 배양

본 발명에 기재된 방법은 테오브로마 또는 헤라니아의 세포 배양로부터 프로시아니딘을 효과적으로 분리하는 것이다. 특히, 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양은 코코아 콩으로부터 상기 추출된 프로시아니딘에 유사한 프로시아니딘의 일반적인 분리를 허용하는 것이 수립되었다. 또한, 본 발명에서 제공된 방법은 이러한 프로시아니딘의 풍부한 세포 배양 재료 생산을 유도하였다. 이러한 방법의 대표적인 장점은 하기를 포함한다:

- 기후적 조건의 조절로 인한 하고 신뢰할 수 있고, 지속적인 바이오매스(biomass)

- 추출 과정 동안 프로시아니딘의 분해를 최소화하는 빠르고 효율적인 분리 과정

- 코코아 콩으로부터 분리되는 프로시아니딘의 조성물과 유사한 세포 배양으로부터 분리된 프로시아니딘

- 세포 배양 프로시아니딘 생산성을 조작하고 최적하는데 유용한 기술

일반적으로, 본 발명에서 테오브로마 또는 헤라니아 식물의 다양한 조직 유래 캘러스 배양의 수립이 기재된다. 수립된 캘리(calli)는 다양한 유형의 세포 배양 배지를 이용하여 현탁 배양에서 재배되는 것에 쓰인다. 안정한 현탁 세포 배양은 세포가 수립되고, 상기 세포가 추출되며, 알려진 흡광분광 방법에 의한 프로시아니딘양이 분석될 때, HPLC-MS 방법이 각각의 프로시아니딘 확인에 쓰인다. 이러한 분석으로부터, 상기 바람직한 프로시아니딘을 생산할 수 있는 현탁 배양은 추가적인 생산성의 최적화를 위해 선택된다.

코코아 배양의 생성

코코아 배양을 생성하는 상기 과정은 보통 본 발명에 기재되어 있으며, 상세한 모범적인 프로토콜은 실시예에 기재되어 있다. 요약하자면, 상기 세부 사항은 알려진 변수에 따라 당업계의 당업자에 의해 달라질 수 있으나, 상기 프로시아니딘을 생산하는 세포 배양의 개시는 다양한 식물 부분, 예를 들면, 꽃잎(petals), 꽃받침(sepals,), 헛수술(staminodes) 등 또는 혹(node), 절간(internode), 어린 잎, 성숙한 잎, 상기 체세포배발생(somatic embryogenesis)과 같은 꽃이 아닌 식물생장과 관련된 조직 중 어느 것으로부터 유래된 외식 유래 캘러스 및 현탁 배양을 수립함으로써 달성된다. 상기 현탁 배양은 신선한 배지로 상기 배양된 세포의 부분을 주기적 이동함으로써 신선한 현탁 배양 배지에서 유지된다. 이동 주기 및 접종 밀도는 세포 생장 성과 및 상기 배지로부터 당 소비로부터 결정된다.

한 실시태양은 이러한 배양을 개시하는 것에 충분한 조건하의 상기 프로시아니딘을 생산하는 배양을 개시하는 것과 생산성 있는 세포 배양을 수립하는 것에 충분한 생산 배지를 수립하고, 다음으로 상기 프로시아니딘을 분리하는 것에 충분한 양의 시간에 대한 상기 생산하는 세포 배양의 규모 확대를 제공한다. 따라서, 상기 조건을 바꾸는 것은 배양을 개시하거나, 이러한 배양에서 프로시아니딘의 변경된 양을 유도하는 생산하는 배양을 수립하는 것을 요구한다. 상기 식물 세포 배양 미세환경의 물리적 측면(예를 들면, 빛 조사) 및/또는 화학적 측면(예를 들면, 배지 조성물 또는 화학적 유도인자)은 상기 바람직한 변경된 양을 달성하기 위해 달라질 수 있다.

예를 들면, 탄수화물(예를 들면, 자당(sucrose) 또는 포도당) 농도는 상기 배양에서 프로시아니딘의 양을 증가시키기 위해 현탁 배양에서 증가시킬 수 있다. 또한, 질소원(예를 들면, 질산암모늄(ammonium nitrate))는 식물 세포 배양에서 2차 대사산물의 생산을 위해 조작될 수 있다(참조 Neera et al., Phytochemistry. 31(12): 4143-4149, 1992). 따라서, 테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양 배지에 질소원의 농도를 감소시키는 것은 상기 배양에서 프로시아닌딘의 생산을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 또한, 특정한 아미노산(글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 및 세린(serine)과 같은)의 주입은 2차 대사산물의 생산에 현저히 영항을 줄 수 있다. 결과적으로, 테오브로마 또는 헤라니아 현탁 배양안의 이러한 아미노산의 농도는 프로시아니딘의 생산을 강화하기 위해 증가시킬 수 있다. 부가적인 아미노산은 상기 배지에 포함될 수 있으며, 테오브로마 또는 헤라니아의 현탁 배양에 의한 프로시아니딘의 생산을 증가시키는 그들의 능력이 시험될 수 있다.

또한, 조명 조건은 테오브로마 또는 헤라니아의 세포 배양 안의 변경된 프로시아니딘 양을 달성하기 위해 다를 수 있다. 예를 들면, 상기 조명은 조사 또는 상기 빛의 노출 길이를 증가시킴으로써 변화될 수 있으며, 이로 인해 프로시아니딘 생산이 증가된다. 상기 빛 조사의 파장은 프로시아니딘의 증가된 생산을 달성하기 위해 변화될 수 있다. 예를 들면, 자외선(UV light)은 식물 세포 배양에서 안소시아닌(anthocyanin) 생산을 유도하는 것으로 알려져 있다(Meyer, J. Biotechnology 93: 45-57, 2002).

식물 세포 배양 미세환경의 조작에 대해 당업계에 알려진 다른 변경은 본 설명의 범위 내에서 고려되며 당업계의 당업자에 의해 수행될 수 있다.

배양으로부터 코코아 세포의 수득

프로시아니딘을 생산하는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 집단(batch)는 재배되었고, 상기 프로시아니딘을 추출하기 위해 수득되었다. 현탁 세포의 수득은 몇 가지 방법에서, 본 발명에 기재된 것 중의 실시예에서 수행될 수 있다.

세포 배양이 정지기에 도달하고, 상기 바람직한 프로시아니디의 생산성에 도달하면, 상기 배양은 용기안에 농축된 덩어리로 정리하는 것이 허용되며, 일반적으로 고체 세포 바이오매스 뒤에 남겨지는 배지는 옮겨질 수 있다. 상기 세포 바이오매스은 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 마찬가지로 옮긴다. 그 대신에, 상기 세포 현탁은 원심분리될 수 있으며, 상기 상청액(배지)를 제거하고, 그 다음으로 상기 세포 덩어리를 세척하고, 다시 원심분리하여 상기 액체를 제거한다. 세번째 선택안은 상기 배지를 제거하기 위해 세포 배양 현탁액을 여과하는 것이다. 이러한 방법 중 어떤 것은 작은 ml부터 배양의 몇몇의 1000 L 규모 부피의 생산까지 범위의 세포 배양 부피로 적용될 수 있다.

추출 과정

상기 수득된 세포 덩어리는 상기 시료에 추출하는 용액의 접촉을 더 잘 허용하며, 상기 전체 시료에 대해 대표적인 추출 부분을 보장하기 위해 상기 세포 덩어리를 균질화하고 부수기 위해 파쇄, 가공되거나 제분되었다.

프로시아니딘은 불안정한 화합물이다. 따라서, 상기 세포 바이오매스은 추출전에 저장되는 것이 필요한 경우 동결 보존이, 예를 들면 액체 질소와 함께 동결되는 것이 바람직하다.

테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양로부터 전체 폴리페놀의 추출은 코코아 콩으로부터 전체 폴리페놀을 추출하는데 사용한 방법과 몇가지 주요한 차이점을 제외하고 유사하다. 코코아 콩의 경우, 상기 콩을 갈은 후 상기 개시 단계는 상기 갈린 조각을 탈지하는 것이다(nibs). 이 과정은 폴리페놀의 손실을 유도한다. 상기 세포 배양은 상기 콩만큼 지방을 갖지않으므로, 이러한 단계가 필요하지 않다. 이 단계를 제거하는 것은 세포 배양으로부터 상기 추출 단계 동안 폴리페놀의 손실을 감소시킨다.

또한, 탈지는 헥산과 같은 용액을 요구하며, 상기 최종 추출물에서 상기 용액의 흔적이 발견된다. 이것은 코코아 콩 유래 생산된 추출물 안에서 불쾌한 냄새를 유발하며, 상기 용액은 독성이 있을 수 있거나 식품 구성분과 같은 특정한 사용에 바람직하지 않을 수 있다. 세포 배양 바이오매스 유래 추출물에 대한 본 발명의 방법은 상기 용액의 사용을 제거하므로(헥산과 같은), 상기 결과로 생기는 추출물에서 용액 오염 또는 불쾌한 냄새가 없다.

대표적인 방법에서 폴리페놀은 70-80% 수분을 함유한 메탄올(aqueous methanol) 또는 70% 수분을 함유한 아세톤(aqueous acetone), 또는 그들의 조합과 함께 갈리고, 균질환된 세포로부터 추출된다. 또한, 물 및 에탄올(ethanol)이 사용되었으며, 이러한 용액을 사용하여 부분적으로 오직 저중합체의 프로시아니딘이 추출되며, 높은 분자량의 폴리머(polymers)는 전혀 추출되지 않는다(Grayer, In J.B. Harborne, Plant Phenolics (Vol. 1), pp 283-323, 1989. San Diego, Academic Press, Inc.; Lee & Widmer, In L.M.L. Nollet, Handbook of Food Analysis (Vol. 1), pp 821-894, 1996, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.).

미량 성분에 대한 완전한 추출 후, 개개의 프로시아니딘이 희석된 수준에서 상기 추출물안에 존재될 수 있다. 농도는 낮은 온도 및 프로시아니딘의 분해를 최소화하는 감소된 압력하에 달성된다(Lee & Widmer. In L.M.L. Nollet, Handbook of Food Analysis (Vol. 1), pp 821-894, 1996, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.).

이 시기의 테오브로마 또는 헤라니아의 세포 배양 유래 상기 폴리페놀 추출물은 상대적으로 깨끗하며 즉시 분석될 수 있다. 본 발명에 기재된 상기 방법의 한 가지 장점은 콩의 폴리페놀 추출에 비해, 세포 배양 유래 테오브로마 또는 헤라니아 폴리페놀 추출물은, 우선, 탐지할 수 없는 불순물(예를 들면, 카페인 및 테오브로민) 수준을 갖는 것이다. 하지만, 카페인 및 테오브로민과 같은 미량 불순물을 제거하는 추가적인 정화가 유익할 수도 있다. 이러한 불순물 흔적조차 제거하는 상기 추출물 정화가 가능하다. 이러한 정화단계는 혼화되지 않는(non-miscible) 용액이 있는 액체-액체 간막이(partitioning) 및 Sephadex LH-20에서 컬럼 크로마토그래피(column chromatography), 폴리아미드(polyamide), 엠버라이트(Amberlite) XAD-2, 예비 HPLC, 및 상업적으로 일회용의 카트리지(cartridges)를 이용한 고체상 추출(solid phase extraction, SPE)를 포함할 수 있다(Grayer, In J.B. Harborne, Plant Phenolics (Vol. 1), pp 283-323, 1989. San Diego, Academic Press, Inc.; Markham & Bloor, In C.A. Rice-Evans and L. Packer, Flavonoids in Health and Disease, pp 1-33, 1998, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.). 대부분의 플라보노이드(flavonoids)가 이러한 용액에서 제한된 용해능을 가지므로, 테오브로민 및 카페인의 제거는 보통 클로로포름(chloroform) 또는 염화 메틸렌(methylene chloride )와 함께 추출로 성취될 수 있다.

분석 과정

테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양 유래 프로시아니딘의 탐지 및 분석에 대해 사용된 분석적 기술은 콩 유래 추출물에 사용된 그것과 유사하다. 코코아 프로시아니딘의 확인은 대부분 저중합체의 분리를 위한 다양한 크로마토그래픽 기술을 사용한 후, 구조적 특징에 대한 독립적인 방법을 사용하여 달성되었다. Quesnel (Phytochemistry 7: 1583-1592, 1968), 및 Jalal 및 Collin (Phytochem. 16: 1377-1380, 1977)은 종이 크로마토그래피(chromatography) 및 TLC 방법을 이용하여 코코아 안의 프로시아니딘을 확인하였다. 하지만, 코코아에서 프로시아니딘의 존재를 인정한 이러한 출판물에도 불구하고, 상기 프로시아니딘의 입체특이적 구조는 설명되지 않았다. Porter et al. (Phytochemistry 30: 1657-1663, 1991)는 컬럼 크로마토그래피, TLC, HPLC 및 음이온(negative ion) FAB/MS 을 사용하여 저중합체(oligomers) 부터 헵타머(heptamers)까지 프로시아니딘의 존재를 규명하기 위해 코코아 안의 프로시아니딘의 조사를 수행하였다. 부가적으로, 그들은NMR을 이용하여 사량체(tetramer)까지 프로시아니딘의 구조를 확인하였고, 주로 (-)-에피카테킨((-)-epicatechin)으로 구성된 그들을 발견하였다. 저중합체부터 옥타머(octamers)까지 코코아 프로시아니딘의 증거는 프로시아니딘 저중합체를 특정화 하기 위해 컬럼 크로마토그래피, 역상 HPLC, 및 양이온 LSIMS의 조합을 이용한 Clapperton et al. (Proceedings, 16th International Conference of Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal; Groupe Polyphenols: Norbonne, France, Vol II, pp 112-115, 1992)에 의해 보고 되었다. 이 연구는 거대한 프로시아니딘 저중합체를 확보하는 수단으로서, 양이온 LSIMS의 사용 및 나트륨 부가물의 사용을 나타냈다. 불행히도, 이러한 모든 방법은 힘들고, 구조적 정보를 수득하기 위해 긴 제조 시간을 요구하며, 높은 처리량 분석 및 세포 배양 시료의 대단히 많은 수의 선별에 적당하지 않았다. 또한, 이러한 방법은 작은 시료에 적합하지 않다.

상기 현재 공개에 대해, 본 발명자들은 테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양 유래 프로시아니딘의 추출물에 대한 높은 처리량 소규모 방법, 프로시아니딘 단량체 및 저중합체의 빠른 분리를 위한 역상(reverse phase) HPLC방법 및 그들의 분자적 특징에 기반한 프로시아니딘 저중합체의 동시적 확인을 위한 질량 분광학(mass spectroscopy, MS) 방법을 개발하였다.

테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양의 대량 과정 최적화

대량 식물 세포 배양은 상업적 과정의 개발에서 중요한 기술이다. 이것은 미생물 발효에서 사용되는 것과 유사한 큰 탱크에서 수행될 수 있다. 이러한 탱크에서 생산성 향상은 대량 과정에서 세포의 생장 및 생산 특징에 기반한 생체분자(Biomolecular) 요인을 결정하고, 프로시아니딘 생산성을 향상시키는 변동이 심한 대량 응용생물학적제법(bioprocess)을 최적화함으로써 달성될 수 있다. 생체분자 요인은 생합성 과정에서 배지 구성분, 유도인자(elicitors) 및 전구체를 포함한다. 상기 규모 확대 과정은 상기 더 작은 규모에서 최적화되었던 조건을 대규모에서 재현하는 것이기 때문에, 대량 과정에서 이러한 요인들은 플라스크-규모 과정에서 시험되어야한다. 하지만, 대량 생물반응장치 배양에서 조건은 플라스크-규모 배양에서 테오브로마 또는 헤라니아 현탁 세포와 다를 수 있다. 상기 배양의 대규모운동(macrokinetic)은 이동 제한으로 인한 현탁된 세포에 영향을 미치는 환경적 조건 변화에 영향을 받는다. 예를 들면, 생장 운동(growth kinetics)의 기준은 규모 독립적이지만, 용기에서 세포 배양의 전체적인 생장은 기체의 이동 및 용해된 영양분 및 대사산물에 규모 의존 때문에 규모 의존적이다(Dicosmo & Misawa, Plant Cell Culture Secondary Metabolism, pp11-44, 1996. Boca Raton, Florida, CRC Press LLC). 따라서, 코코아 프로시아니딘 생산에 대한 생물반응장치 과정의 규모 확대에서, 생장률의 기본적인 데이터, 생산물 형성률, 영양분 흡수율 및 호흡률를 산출에 대해 다수의 기본적인 실험이 수행되었다.

일반적으로, 식물 세포 배양에서 높은 생산성은 상기 세포 농도 및 특정 생산성을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 최대 세포 농도는 영양분 공급, 기질 당 바이오매스의 산출 및 수분(water content)에 의존한다. 상기 기초 데이터에 기반하여, 추가의 환경 요인들이 바이오매스를 증가시키기 위해 한번에 변경될 수 있는 하나 또는 복수의 요인들에 의해 변경된다. 따라서, 대부분 폴리페놀이 생장하지 않는 것(non-growth)과 관련된 화합물이기 때문에, 두 단계 배양이 고려될 수 있다. 단일 단계 과정은 이상적으로 단일 생장률 및 단일 발달 단계에 배양을 제한하기 때문에, 이 운행은 몇몇 발달 단계가 생장하지 않는 것과 관련된 화합물의 생산이 전제조건일 경우 적합하지 않을 것이다. 상기 통기율(aeration rate), 교반 속도, 다른 혼합에 관련된 변수 및 심지어 배지 조성의 변수는 생장 단계 및 생산 단계에 대해 개별적으로 최적화된다. 하지만, 최적화한 모든 조건에을 유지하는 동안 과정을 규모 확장하는 것은 불가능하다. 선택은 가장 중요하게 여겨지는 변수에 관하여 만들어져야 한다.

또한, 상기 탄소 및 질소원의 연관된 양이 2차 대사산물의 생합성 및 세포 생장을 향상시키는데 중요한 역할을 하기 때문에, 생장 및 생산에 탄소 및 질소원을 추가하는 효과는 탄소 및 질소 소비의 기초 공학 기술 데이터에 기반하여 조사되었다(Basaria, Current Biology, 2: 370-374, 1990). 그 후, 산소 및 이산화탄소의 공급이 조사될 수 있다. 산소에 더하여, 이산화탄소는 식물 세포 배양에서 세포 생장 및 2차 대사산물을 개선하는 것이 보고되었다(Thanh et al., Biologia Plantarum, 50: 752-754, 2006; Tate & Payne, Plant Cell Reports, 10: 22-25, 1991). 식물 세포의 산소 요구량은 세포 생장 단계에서 비교적 낮지만, 대사산물 합성 동안 현저히 증가할 수 있다. 이러한 가스의 수준은 테오브로마 또는 헤라니아 세포의 반응장치 배양에서 그들의 최적화 사용을 위해 조절된다. 대량 발효에서, 실험적 규모에서 도입될 수 있는 동일한 양의 기체(공기, 산소 등)을 도입하는 것은 불가능하다. 따라서, 상기 질량 이동 계수 상수는 생물반응장치 과정에서 표면의 기체 속도 상수를 만들기 위해 유지되어야만 한다.

대사 산물의 형성 및 방출을 자극하는 유도인자의 사용은 중요한 과정 전략이다. 높은 생산물 농도, 예를 들면 용적측정의(volumetric) 생산성을 도달하는데 필요한 상기 과정 시간을 감소시키는데 매우 유용하다. 또한, 유도(elicitation)는 신규한 화합물의 형성을 유도할 수 있다(Payne et al., Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, pp333-351, 1995, New York, John Wiley & Sons, Inc). 몇몇의 생물/비생물 후보의 유도 최적화는 그들을 처리해야 하는 때, 어떤 용량이 가장 좋을 수 있는지, 그들에게 얼마나 노출되어야 하는지와 세포가 언제 수득되어야 하는지 최적화하기 위해 대량 반응장치 배양에서 시험될 수 있다. 각 유도인자는 생합성 과정에서 효소의 다른 유형을 유도할 수 있기 때문에, 유도인자의 복수 처리를 이용한 공동 효과는 생산성을 향상시키는 것에 시험되었다.

반응장치 운행 방법은 생장, 생산 및 그들의 상호작용에 대한 세포 동역학에 의존한다. 앞서 기재한 바와 같이, 본 발명의 표적 화합물은 생장하지 않는 것과 관련되므로 두 단계 배양 과정이 고려되어야 한다. 따라서, 유가배양(fed-batch)은 생산 시간이 바이오매스가 생장하는 것에 요구되는 시간에 비해 상당히 길 때 특히 매력적인 선택이며, 이러한 경우에, 상기 바이오매스 집단에서 더 적은 수의 생물반응장치를 유도하는 그 후의 생물반응장치의 부피가 가능하다.

Ⅴ. 프로시아니딘의 사용 및 투여

본 발명에 공개된 상기 방법에 의해 발생된 프로시아니딘은 치료적, 식이 또는 화장품 목적을 위해 개채에 투여될 수 있다. 상기 개체는 인간 또는 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 마우스(mouse) 또는 랫(rat)과 같은 가축 포유 동물일 수 있다.

치료적 사용에 관해, 상기 프로시아니딘은 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 심장혈관계 질환(cardiovascular disease), 암, 혈압조절 및/또는 고혈압과 같은 몇몇의 장애 또는 질환을 치료 또는 예방하는 것에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 프로시아니딘은 병을 예방하여 암이 발생할 위험이 있는 개체, 종양을 가지는 개체 또는 기존에 종양을 치료하는 개체에 투여될 수 있다. 상기 종양의 치료는 상기 종양의 수술적 제거, 화학요법, 면역치료 또는 방사선 치료를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 공개된 상기 방법에 의해 발생된 상기 프로시아니딘은 적어도 하나의 첨가제와 조합되어 각각을 동시적으로 우선하여 또는 종양 치료 후에 개체에 투여된다. 상기 첨가제는 본 발명에 기제된 다른 물질일 수 있으며, 종양 생장을 저해하거나 감소시킨다. 그 대신에, 상기 첨가제는 종양 생장을 저해하는 개체의 능력을 개선시키거나, 종양에 대한 처리 과정 동안 개체가 감염에 대항하는 것을 돕는 물질(항생제와 같은)일 수 있다. 예를 들면, 상기 첨가제는 사이토카인(cytokine)과 같이 면역계를 자극하는 물질일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 상기 방법에 의해 발생된 프로시아니딘은 어떤 유형의 종양이 발생하는 위험이 있는 개체 또는 어떤 유형의 종양으로 고통받는 개체에 투여될 수 있다. 상기 종양은 양성 종양 또는 악성 종양일 수 있다. 상기 종양은 상피성 암(carcinoma), 육종(sarcoma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma) 또는 신경계 종양을 포함할 수 있다. 특히 몇몇의, 제한이 없는 실시예에서, 상기 종양은 유선 종양(breast tumor), 간 종양(liver tumor), 췌장 종양(pancreatic tumor), 위장 종양(gastrointestinal tumor), 결장 종양(colon tumor), 자궁 종양(uterine tumor), 난소 종양(ovarian tumor), 자궁 경부 종양(cervical tumor), 고환 종양(testicular tumor), 전립선 종양(prostate tumor), 뇌 종양(brain tumor), 피부 종양(skin tumor), 흑색종(melanoma), 망막 종양(retinal tumor), 폐 종양(lung tumor), 신장 종양(kidney tumor), 골 종양(bone tumor), 골육종(osteosarcoma), 비인두 종양(nasopharyngeal tumor), 갑상선 종양 (thyroid tumor), 백혈병(leukemia), 또는 림프종(lymphoma)을 포함한다. 보통, 본 발명에서 제공된 상기 방법에 의해 발생된 상기 프로시아니딘 종양 생장을 방지하거나 저해하는 것에 충분한 양이 개체에 투여될 수 있다.

다른 실시태양에서, 상기 프로시아니딘은 병을 예방하여 아테롬성 동맥 경화증, 심장혈관계 질환 또는 고혈압이 발달되는 위험이 있는 개체에 투여될 수 있다. 그 대신에, 상기 프로시아니딘은 아테롬성 동맥 경화증, 심장혈관계 질환 또는 고혈압과 같은 존재하는 질환을 치료하기 위한 개체에 투여될 수 있다. 상기 조성물은 공동-투여될 수 있거나, 항종양 물질, 항산화제, 또는 아테롬성 동맥 경화증, 심장혈관계 질환, 혈압 조절 및/ 또는 고혈압과 관련된 증상 또는 상태를 완화하는 다른 물질과 순차적으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에서 제공된 상기 방법에 의해 발생된 상기 프로시아니딘은 식이 조성물로 이용될 수 있다. 액체 형태로 구강으로 투여될 때, 상기 액체는 물-기반, 우유-기반, 차-기반, 과일 주스-기반 또는 그들의 어떤 조합일 수 있다. 내부 투여를 위한 고체 및 액체 형식은 추가적으로 진한 감미료를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 공개된 상기 발명에 의해 발생된 상기 프로시아니딘은 개체의 피부 질 또는 외관을 개선하는 화장품 조성물로 쓰일 수 있다. 개선된 피부 외관, 질감 및 습기는 상기 프로시아니딘 조성물을 외부에서, 내부로 또는 이들의 조합으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 허용가능한 운반체는 상기 조성물의 상기 구성분에 대하여 용액, 운반체, 희석액 또는 분산제 로서 다양하게 작용할 수 있고, 적절한 희석에서 피부의 표면에 상기 균일한 구성분의 적용을 허용할 수 있다. 또한, 상기 허용할 수 있는 캐리어는 피부로 상기 조성물의 침투를 가능하게 할 수 있다.

상기 공개된 방법에 의해 발생된 상기 프로시아니딘을 포함하는 조성물은 약학적 생산물, 식품 생산물 및 음료 조성물을 포함하는 갖가지 완성품에 유용하며, 제약업계의 당업자에 잘 알려진 표준 기술에 부합하여 제조될 수 있다. 활성 물질을 포함하는 약학적 조성물은 선택된 투여의 특정 형식에 따라 적합한 고체 또는 액체 운반체와 만들어질 수 있다. 이 공개안의 유용한 상기 약학적 허용가능한 운반체 및 첨가체는 관례적이다. 예를 들면, 비경구 제형은 보통 약학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 물, 생리적인 염분, 다른 안정된 염용액, 수분을 함유하는 덱스트로오스(dextrose), 글리세롤(glycerol) 또는 이와 유사한 것과 같은 유체 운반체인 주입가능한 유체를 포함한다. 포함될 수 있는 첨가제는, 예를 들면 인간 혈청 알부민(albumin) 또는 혈청 제조물과 같은 다른 단백질 이다. 또한, 바람직하게는, 투여되는 상기 프로시아니딘 조성물은 습윤 또는 유화제, 방부제, 및 pH 완충제 및 이와 유사한 것들, 예를 들면 초산나트륨(sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우린산염(sorbitan monolaurate)과 같은 독성이 없는 보조물질의 미량을 포함할 수 있다.

주입가능한 유체에 더하여, 국소 및 경구 제형이 적용될 수 있다. 경구제형은 액체(예를 들면, 시럽, 음료 또는 현탁액) 또는 고체(예를 들면, 가루, 정제(pill), 정제(tablets) 또는 캡슐(capsules))일 수 있다. 고체 조성물을 위해, 기존의 독성이 없는 고체 운반체는 만니톨(mannitol), 락토스(lactose), 전분 또는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate)의 약학적 등급을 포함할 수 있다. 국소 제조물은 점안액, 연고, 크림, 분무 및 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 국소 투여에 적합한 본 발명의 제형은 상기 조성물의 구성분에 대해 용액, 운반체, 희석액 또는 유처리제로 혼합되며, 적합한 희석에서 피부의 표면에 상기 구성분의 균일한 적용을 허용한다. 또한, 상기 허용가능한 운반체는 피부로 상기 조성물의 침투를 가능하게 할 수 있다.

상기 프로시아니딘 조성물의 제형은 선택된 투여 형태에 의해 결정될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 실제 방법은 알려져 있거나, 당업계의 당업자에 분명할 것이다.

이 공개의 상기 방법에 의해 발생된 상기 프로시아니딘 조성물은 인간 또는 가축 포유동물에 그들에 세포에 효과적인 국소적으로, 경구로, 정맥주사로, 근육내에, 복강으로, 비강으로, 피부내로, 피하로와 같은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 및 상기 투여량 식이요법의 특이적 형식은 상기 경우를 고려하여 당업계의 당업자에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 상기 개체, 상기 질환, 상기 관련된 질환 단계 및 상기 처리가 예방적인지). 처리는 매일 또는 한 달에 며칠에 걸쳐 화합물의 복수 투여, 또는 1년까지 포함할 수 있다.

이러한 조성물은 이러한 투여를 필요로 하는 개체에 투여량 및 의료, 영양 또는 수의업계의 당업자에 의해 알려진 기술로 특정 개체의 연령, 성, 무게 및 상태, 및 투여경로와 같은 요인을 고려하여 투여될 수 있다.

치료, 식이, 화장품 및 가축 사용에 대한 조성물의 제조물, 투여량 및 투여는 당업계에 잘 알려져있다(참조, 예를 들면, U.S. Patent Nos. 5,554,645, 5,853,728, 6,194,020, 6,312,753, 6,998,417, 7,122,574, 7,314,634, 7,320,797 및 U.S. Patent Application Publication No. 2007/0148107, 이것은 본 발명에 참조로서 포함된다).

하기 실시예는 확실한 특정한 특징 및/또는 실시태양을 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 상기 특정한 특징 또는 실시태양의 본 발명에 대해 제한하는 것이 아니다.

실시예

실시예 1. 꽃 조직 유래 테오브로마 카카오( Theobroma cacao) 캘러스(Callus) 유도 및 증식

조밀한 캘러스 응집체가 충만한 농도의 옥신(auxin)(2 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)), 시토키닌(cytokinin)(0.005 mg/L thisdiazuron (TDZ)) 및 다른 보충제(250 mg/L L-glutamine, 100 mg/L myo-inositol)를 증가시킨 Driver 및 Kuniyuki 호두 (Driver and Kuniyuki walnut, DKW) 배지 이용하여 [D+]-포도당([D+]-glucose)을 탄소원으로 사용하여 조절된 조건하에 수립하였다(표 1의 배지I). 상기 배지는 pH 5.8로 조정한 후에 고압살균으로 살균하였다. 미성숙한 꽃 물질 테오브로마 시료는 재배된 많은 식물에서 수집하였다. 상기 배양의 오염을 방지하기 위해, 상기 물질은 그들을 배양 배지로 도입하기 전에 표면-살균하였다. 상기 물질은 첫째로 1% (w/v) 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite)안에 담궜고, 20분 동안 5분마다 부드럽게 교반하였다. 살균 조건하에 상기 물질은 옮겼고, 멸균된 탈염수로 3회 세척되었으며, 각 세척 동안 부드럽게 교반하였다. 상기 마지막 세척물은 옮겼으며, 꽃 봉오리만을 멸균된 페트리 플레이트(Petri plates)로 옮겼다. 상기 꽃봉오리는 기부로부터 1/3 꽃 길이 부분을 멸균된 메스를 사용하여 횡단하여 절단하였다. 헛수술(Staminodes), 꽃받침(sepal) 및 꽃잎 기저 외식(petal base explants)은 상기 절단 말단의 개구부를 통해 추출하였다.

상기 추출된 물질은 고체 캘러스 유도 배지에 두었다. 약 50개의 외식을 각 플레이트에 걸쳐 상기 전체 표면에 분포하였다. 상기 페트리 플레이트는 파라필름으로 동봉하였고, 14일 동안 25℃에서 어두운 곳에서 유지하였다. 상당한 캘러스 형성을 10일 후에 확인하였다. 캘러스 유도 배지에서 꽃 부분을 두었던 14일 내에, 상기 캘러스는 외식으로부터 분리하였고, 캘러스 증식 배지인 표 1에 열거된 배지 I, II 및 III 에 두었다. 4주 간격을 두고, 빠르게 생장하는 세포를 캘러스 표면으로부터 분리하였고, 새로운 배지에서 계대배양하였다. 흰색 내지 연한 노랑색을 보이는 빠르게 생장하는 세포주는 계대배양에서 선별하였다(도 1).

실시예2 . 식물생장과 관련된 조직으로부터 테오브로마 카카오 캘러스 유도 및 증식

Murashige 및 Skoog (MS) 배지에서 수립된 캘러스는 탄소원으로서 포도당(20 g/L) (배지 XXVII, 표 1)와 함께 옥신 (2 mg/L IAA and 4 mg/L IBA), 시토키닌 (0.005mg/L TDZ), 및 L-글루타민(L-Glutamine) (250 mg/L)로 보충되었다. 상기 배지는 고압멸균으로 멸균 후, pH 5.8로 조정하였다. 테오브로마 카카오 식물생장과 관련된 물질의 시료(어린 잎 및 성숙한 잎, 혹 및 절간)은 온실에서 생장한 세포로부터 수집되었다. 상기 배양의 오염을 방지하기 위해, 상기 물질은 상기 배양 배지로 그들을 도입하기 전에 표면 멸균하였다. 상기 물질은 첫째로 70% 에탄올(ethanol)에 1 시간 동안 담궈졌고, 후에 25% 표백제에 10분 동안 담궈졌고 매 5 분 마다 부드럽게 교반하였다. 멸균 조건하에 상기 물질은 옮겼고 멸균된 탈염수로 3회 세척하였고 매 세척동안 부드럽게 교반하였다. 잎들은 5 mm 정사각형으로, 혹 및 절간은 1-2 mm 원기둥으로 절단하고 고체 배지를 함유하는 플레이트에 외식하였다. 플레이트는 25℃에서 어두운 곳에서 유지하였다. 그들을 오염의 신호를 매일 관찰하였고, 상기 오염된 물질은 제거하였다. 4주 후 캘러스 형성을 확인하였다. 6주 후에, 상기 캘러스를 외식으로부터 분리하였고, 상기 캘러스 증식 배지 및 ⅩⅩⅤⅡ(표 1) 나타낸 배지에 두었다. 하지만, 개시 후에, 상기 캘러스는 매우 빠르게 증식하였고, 수립하였다. 새로이 형성된 세포를 상기 캘러스의 표면으로부터 분리하였고, 2주 간격으로 새로운 배지로 계대배양하였다. 연한 노랑 내지 밝은 갈색을 보이는 빠르게 생장하는 세포주는 계대배양에서 선별하였다.

상기 코코아 캘러스를 수립한 후에, ⅩⅩⅤⅡ 배지에서 상기 높은 옥신량이 세포 생장을 지연시켰고, 스트레스를 겪는 세포를 나타내는 순차적인 세대에서 매우 갈색인 캘러스를 형성하였으므로, 캘러스의 지속가능성에 낮은 농도의 옥신의 영향을 시험하는 것이 필요했다. 다양한 배지를 코코아 캘러스를 유지하는 그들의 능력 및 세포 현탁 발생에서 상기 유지 배지의 후속의 영향을 위해 시험하였다. ⅩⅩⅤⅡ 배지는 포도당의 MS배지에 6 mg/L 의 옥신(2 mg/L IAA 및 4 mg/L IBA), 2X MS 비타민 및 250 mg/L 의 글루타민이 보충되고, 7 g/L 한천을 갖는다. 예를 들면, 상기 배지의 상기 옥신을 4 mg/L (2 mg/L IAA 및 2 mg/L IBA, 표 1의 배지 ⅩⅩⅤⅢ) 및 2 mg/L IBA 형태의 옥신(표 1의 배지 ⅩⅩⅠⅩ)감소시켰다.

4 mg/L 으로 옥신을 감소시키는 것은 캘러스을 색이 진한 갈색 내지 밝은 갈색을 통해 노란색으로 개선하였다. 상기 캘러스 세포 생장은 활발한 수준으로 되돌아 갔다. 세포 현탁 배양을 동일하게 배지 ⅩⅩⅤⅡ에서 계대배양한 건강한 캘러스로부터 수립한 것으로 수립하였다.

2 mg/L 옥신이 있는 배지에서 상기 캘러스의 색은 변하였고, 세포 생장은 활발한 수준으로 되돌아 갔다. 하지만 이러한 칼리(calli)는 상기 동일한 배지로 계대배양하였을 때, 배지 ⅩⅩⅤⅢ의 캘러스에 비해 상기 캘러스의 세포 생장은 감소하였다.

2 mg/L 옥신으로 감소시킨 후에, 추가적 MS 비타민의 제거 효과 (표 1의 배지 ⅩⅩⅩ) 는 글루타민의 제거(표 1의 배지 ⅩⅩⅩⅠ)와 함께 생장을 기록하였다. 이러한 두 개 배지 유래 캘러스는 배지 ⅩⅩⅠⅩ의 캘러스 유래 생장 특징이 다르지 않았다. 하지만, 프로시아니딘의 생산에 관해서 상기 배지의 추가적 비타민의 존재는 유익하다는 것에 주목하였다. 코코아 식물생장과 관련된 캘러스를 유지하는데 상기 가장 좋은 배지는 배지 ⅩⅩⅤⅢ이고, 캘러스의 장기간 지속가능성을 가능하게 하고, 세포 현탁의 용이한 수립 및 프로시아니딘의 생산성 유지를 허용하게 한다.

실시예 3. 테오브로마 그랜디플로럼 ( Theobroma grandiflorum ) 및 테오브로마 오보바텀(Theobroma obovatum) 캘러스 유도 및 증식

테오브로마 그랜드플로럼 및 테오브로마 오보바텀의 캘러스 배양을 테오브로마 코코아에 대한 실시예1 및 2와 같은 방법을 사용하여 수립하였다.

실시예 4. 현탁 개시

세포 현탁 배양을 실시예 1에 기재한 꽃 외식 유래 생장된 하얀색 새로운 칼리를 20개의 다른 종류의 액체 배지 25 ml을 포함하는 125 ml 삼각 플라스크(Erlenmeyer flasks)에 접종함으로써 수립하였다(표 1의 배지ⅠⅤⅩⅩⅢ). 상기 플라스크는 실리콘 발포 고무 마개(foam caps)로 봉하였으며, 24±1℃로 자동온도조절 장치로 조절된 방에서 회전 진탕과 함께 120 rpm으로 교반하여 완전한 암조건에 54일 동안 두었다. 상기 계대배양은 필요에 따라 1주 또는 2주에 옮겼다. 과립의 또는 좋은 세포 현탁을 형성한 배양이 유지하였지만, 현탁 배양을 형성하지 않은 배양은 제거하였다. 세포 생장 14일 후에, 새로운 25 ml의 배지가 포함된 새로운 125 ml 플라스크로 상기 세포의 10% (v/v) 를 이동시켰고, 그 후에 2주 동안 계대배양하였다. 배지 ⅤⅢ는 현탁된 세포 개시에서 세포 증식에 가장 좋은 성과(14일째에 45% 가득찬 세포 부피(packed cell volume , PCV) 를 보였다.

꽃이 아닌(식물생장과 관련된) 조직(혹, 절간, 어린 잎, 성숙한 잎)의 현탁액을 생장시키기 위해, 실시예 2의 발생된 칼리(calli)를 상기 기재된 꽃 외식과 유사한 방법으로 액체 배지에 옮겼다. 상기 사용된 배지는 염의 유형(DKW 염(DKW salts) 보다 염(MS salts)이고, 이는 더 많은 암모늄(ammonium) 및 질소원, 및 더 낮은 황산염(sulfate)을 포함한다)에 관하여 표준 유지 배지와 다른 배지 ⅩⅩⅠⅤ였고, 2,4-D 대신에 옥신으로서 2 mg/L IAA 및 4 mg/L IBA 을 포함하였다(표 1). 배지 ⅤⅢ에서 칼리를 개시하고, 보통 2 내지 3주 만에 전체 탄수화물원이 소비되는데 반해, 이 배지에서, 현탁 배양을 더 빠르게 수립하였고, 상기 칼리는 7일 안에 상기 배지의 당을 모두 소비하였다. 꽃이 아닌 조직의 이러한 수립된 현탁액의 프로시아니딘 생산성은 꽃 조직으로부터 생장된 상기 현탁액의 그것에 비해 높았다(배양의 전체 프로시아니딘/L 중 1.1g)(도 10a 및 10b).

실시예 5. 현탁 세포 생장

본 실시예는 현탁액의 세포 생장을 증가시키는데 사용된 방법을 설명한다.

세포 배양 생산성은 세포 생장율의 기능 및 세포 생장 정지의 밀도에 따라 증가한다. 최적화 접종 밀도를 결정하기 위해, 테오브로마 카카오 세포의 현탁 배양을 10, 15 및 20% (v/v) 의 초기 세포 밀도에서 시작하였고, 14일 동안 생장을 허용하였다. 도 2는 접종 밀도 기능에 따라 바이오매스 밀도의 대표적인 시간 추이를 보여준다. 10%의 세포 밀도로 개시된 배양은 생장이 현저히 지체됐으며, 14일 안에 최대 밀도에 도달하지 않았다. 배지ⅤⅢ에서 15% 및 20%의 세포 밀도로 개시된 배양은 13일 안에 밀도의 두 배가 되었으며, 14일 이내에 40-43% 최대 평균 세포 밀도에 도달하였다. 하지만, 어떤 배양은 상기 세포 선별 과정 14일 후에 60% 이상 가득찬 세포 부피를 보였다.

배지 ⅤⅢ 및 배지 Ⅰ는 배지 ⅤⅢ가 피타젤(Phytagel)을 함유하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법이다. 모두 DKW 염 및 비타민에 기반하는 이러한 배지는 배지 구성물의 배치간 변수를 유도할 수 있는 몇몇의 저장 용액을 사용하여 제조하였다. 따라서, 배지 ⅩⅩⅩⅡ를 전혼합된 DKW 기본 염(Phytotechnology Laboratories, LLC, Catalogue # D190) 을 사용하여 만들었고, 배지 ⅤⅢ 및 배지 ⅩⅩⅩⅡ 사이의 현탁 세포 생장을 비교하였다. 두 배지에서 세포의 생장에서 현저한 차이점은 없었다. 따라서, ⅩⅩⅩⅡ 배지는 현탁 배양 유지에 일상적으로 사용하였다.

유사한 조사를 테오브로마 그랜디플로럼(Theobroma grandiflorum) 및 테오브로마 오보바텀(Theobroma obovatum)과 함께 수행하였다. 세포 배양 생산성은 세포 생장 정지시 세포 생장률 및 상기 밀도의 기능에 따라 증가하였다. 최적화 접종 밀도를 결정하기 위해, 테오브로마 그랜디플로럼 및 테오브로마 오보바텀 세포의 현탁 배양을 10, 15 및 20% (v/v) 의 초기 세포 밀도로 개시하였고, 14일 동안 생장을 허용하였다.

일반적으로, 배양을 짧은 생장 기간을 가지는 또는 최대 세포 밀도가 초기에 도달하는 높은 밀도로 개시하였다. 10%의 세포 밀도로 개시된 배양은 생장에서 현저한 지체를 보이고, 14일 이내에 최대 밀도에 도달하지 않았다. 15% 및 20%의 세포 밀도로 개시된 배양은 13일 이내에 두배의 밀도가 되었으며, 14일 이내에 40-43%의 최대 세포 밀도에 도달하였다. 이 생장률은 타서스 속(Taxus sp)과 같은 다른 식물 세포 현탁 배양에 대하여 기존에 보고된 것에 비해 느리다. 하지만, 테오브로마 세포 배양의 세포 생장은 하기의 실시예 6에 기재된 추가적인 상기 생장 배지 및 엄격한 세포 선별의 최적화로서 증가될 수 있다.

실시예 6. 식물생장과 관련된 세포 현탁 배양 유래 동일한 세포주를 발생하는 세포 선별 과정

새로이 만들어지는 세포 현탁 배양은 보통 세포의 이종 혼합물이다. 이 이질성은 안정되지 않은 세포 생장 및 대량 현탁 배양에서 바람직한 대사 산물의 불한정한 생산 양식을 유도한다. 대량 생산에 적합한 동일한 세포 배양은 이러한 이종 혼합물을 계대배양 하고 상기 바람직한 특징이 있는 배양을 선택함으로써 유래할 수 있다. 폴리페놀 및 이 과정을 보조하는 세포 생장을 탐지하기 위해 선별적이고 빠른 선별을 개발하였다. 실시예 8에 기재된 부탄올-HCl(butanol-HCl) 가수분해 방법을 폴리페놀 축적을 확인하기 위해 사용하였으며, 가득찬 세포 부피(PCV(%) = 세포 부피 × 100/전체 배양 부피)를 바이오매스 기준으로 적용하였다. 탄수화물 소비율은 세포 대사의 기준으로 굴절률(refractive index, Brix%)으로 측정하였다.

식물생장과 관련된 조직(혹) 유래 현탁 배양은 실시예 2 및 4에 기재된 칼리로부터 유래하였다. 하나의 잘 생장하는 세포주(MX1440-3496)를 선별하였고, 기본 배지(DKW 염 대 MS 배지) 및 호르몬의 양의 유형이 다른 세 가지 다른 배지에서 생장되었다(표 1의 배지 ⅩⅩⅩⅡ，ⅩⅩⅩⅢ 및 ⅩⅩⅩⅠⅤ). 배지 ⅩⅩⅩⅡ 및 배지 ⅩⅩⅩⅠⅤ에서 가득찬 세포 부피는 7일 째에 33.7±4.7% 및 25.7±4.0% 였으며, 이는 배지 ⅩⅩⅩⅢ (47.6±6.6%) 보다 느리게 생장하는 것을 보였다. 세포 생장률은 세포 배양 과정에서 부피적 생산성 최대화에 상당히 중요하다. 또한 배지 ⅩⅩⅩⅢ는 소비된 배지의 굴절률로 측정된 탄수화물 소비율이 우수했다. 따라서, 그것을 MX1440-3496 세포주의 추가적인 세포 선별 과정에 대한 유지 배지로서 선택하였다.

크거나 덩어리 세포 응집체의 선별은 낮은 배양 성과를 유도하기 때문에, 크거나 덩어리 또는 응집체를 형성하지 않는 잘 생장하는, 순도 높은 세포는 용적 생산량을 증가시키고 응집된 세포를 제거하기 위해 각 계대배양 시간에 바람직하게 선별하였다. 따라서, 상기 선별된 세포는 주로 노랑색 순도 높은 세포 형태를 가지며, 상기 순도 높은 현탁 배양은 더 나은 생장 및 동일한 현탁 배양의 생산을 유도한다. 상기 MX1440-3496 세포주는 10일 동안 분열 시간으로 생장하였으나, 분열 시간은 실행가능한 세포 선별과정 후에 5 일 감소하는 것을 보였다(도 3). 전체 프로시아니딘 생산 수준은 상기 세포 선별 과정 전에 초기에 0.5 g/L PCV 였으나, 상기 세포 선별 과정과 함께 8.9 배(4.7 g/L PCV)로 증가하였다(도 4).

실시예 7. 테오브로마 캘러스 배양 및 현탁 배양로부터 폴리페놀의 추출

이 실시예는 실시예 1-4에서 개발된 테오브로마의 캘러스 및 배양의 현탁 세포로부터 폴리페놀을 추출하기 위해 개발된 방법을 설명한다. 이 실시예의 실험은 특히 테오브로마 카카오의 배양을 사용하였다. 폴리페놀을 0.1% H₂SO₄을 포함하는 1.5 ml 50% (v/v) 에탄올(ethanol)과 함께 약 0.25±0.04 g 신선한 칼리의 무게 및 0.1% H₂SO₄을 포함하는 1.5 ml 80% (v/v) 메탄올(methanol)과 함께 0.1±0.003 g 현탁된 세포의 건조 무게(상청액 배지가 없는)로부터 추출하였다. 상기 세포는 미세원심분리 튜브(2.0 ml)에 두었고, 1분 동안 비드 밀(bead mill) 균질기로 균질화하였다. 상기 균질화된 것을 3500 rpm 에서 20 분동안 원심분리하였고, 상청액만을 다른 미세원심분리 튜브로 옮겼다.

선별되기 위해 많은 수의 현탁된 세포 배양이 필요할 때, 하기와 같은 더욱 높은 처리량 방법을 사용하였다: 분석되는 세포 배양의 각 플라스크로부터, 96-깊은 웰 플레이트로 1ml을 분주하였다. 96-깊은 웰 플레이트로 옮기기 전에 상기 시료의 가득한 세포 부피를 기록하였다. 각 웰의 세포는 원심분리기에서6000 rpm에서 4분 동안 원심분리함으로써 펠렛(pellet)화하였다. 각 웰로부터 상기 상청액을 제거하였고, 플라스틱 이동 파이펫(pipet)으로 제거하였다. 다음으로, 추출 용액의 0.5 ml 및 텅스텐(tungsten) 카비드(carbide) 비드(bead) 를 각 웰에 더하고, 세포를 15 Hz 에서 2분 동안 갈기 위해 상기 플레이트를 Mixer Mill 에 두었다. 그 후, 상기 플레이트는 원심분리기로 옮겼고, 세포 잔해는 6000 rpm 에서 4 분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다.

실시예 8. 배양에서 폴리페놀 생산의 예비 분석

상기 프로시아니딘 분석 반응을 수행하기 위해 사용된 방법은 상기 원래 Swain 및 Hillis (J. SCI. Food Agric. 10:63, 1959) 방법 및 Porter et al. (Phytochemistry, 25(1):223, 1986) 방법에 상당히 근접하여 비슷하게 만들어졌다. 상기 부탄올-HCl 추출 분석은 테오트로마 카카오 현탁된 세포의 추출물에서 폴리페놀을 측정하기 위해 사용된 것이다. 상기 폴리페놀을 0.1 ml 수분을 포함한 메탄올(methanol) 추출물 및 1.0 ml 부탄올-HCl 시약(95:5 v/v) 을 혼합하고, 상기 용액을 Qiagen deep well block (Valencia, CA, USA). 에서 75oC 에서 60 분 동안 가열함으로써 상기 (-)-에피카테킨((-)-epicatechin) 단량체(monomers) 및 시아니딘(cyanidin)으로 가수분해하였다. 상기 흡수는 280 및 520 nm 에서 확인되었으며, 프로시아니딘양은 Chromadex, Inc. (Irvine, CA)에서 구입한 프로시아니딘 B2(procyanidin B2)의 다른 농도를 사용하여 보정곡선을 사용하여 형성된 시아니딘의 양에 기초하여 계산하였다. 더 밝은 분홍색은 현탁 배양의 더 높은 프로시아니딘의 양을 나타낸다(도 5). 이러한 방법에 기초한, 몇몇의 현택 배양의 상기 프로시아니딘의 양의 범위는 250 mg/L 부터 1000 mg/L 까지이다.

실시예 9. 테오브로마 카카오( Theobroma cacao ) 세포 유래 폴리페놀의 분석

실시예 7로부터 상기 수분을 함유한 메탄올 추출물을 0.45 μM Millipore 필터를 통과하여 여과하고 상기 시료의 100 ㎕를 LC-MS 분석에 주입하였다. 대칭 C18 컬럼(column) (100 × 2.1 mm i.d., 3.5 μm) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 사용하였다. LC 분석을 물(Milford, Massachusetts, USA) 을 이용하여 수행하였다. 연합 HPLC 시스템은 CTC 해석 PAL 오토샘플러(autosampler)(Leap Technologies, Carrboro, NC, USA), 600S 조절장치로 물이 공급되는 Waters 626 및 190 내지 780 nm로 스캐닝(scanning)하는 Waters 2996 포토다이오드-어레이 검출기(photodiode-array detector, PDA)로 장비를 갖췄다. MassLinx^TM 을 데이터 분석에 사용하였다. 점변 용리(Gradient elution)를 물-0.1% 포름산(formic acid)(용액 A) 및 아세토니트릴(acetonitrile)-0.1% 포름산 (용액B)과 함께 0.3 ml의 변함없는 흐름 속도에서 수행하였다. 용액 B의 하기 비율과 함께 직선 경사도 프로필(profile)이 적용하였다(t(분), %B): (0, 7), (5, 15), (20, 75), (25, 100), (35, 100), (35.1, 7) (45, 7). 상기 (+)-카테킨((+)-catechin), (-)-에피카테킨, 카페인(caffeine), 테오브로민(theobromine) 및 프로시아니딘(procyanidins) (이량체 내지 헥사머(hexamer)) 화합물을 280 nm에서 확인하였다. Waters Quattro Micro 3부로 된-4중극(triple-quadrupole) 질량 탐지기(mass detector)(Milford, Massachusetts, USA)를 상기 MS 데이터를 수득하기 위해 사용하였다. 완전한 정밀검사 데이터 습득을 캘러스에 대하여 프로필 형식에서 m/z 150 부터 1200 까지, 현탁된 세포에 대하여 m/z 150 부터 1800 까지 스캐닝하여 수행하였다. 카테킨, 에피카테킨, 테오브로민 및 카페인에 대한 확실한 표준을 Chromadex. Inc (Irvine, CA)에서 구입하였고, 또한, 수분을 함유하는 메탄올에 각각의 적절한 희석액을 현탁 세포 유래 추출물처럼 상기 동일한 LC-MS 분석에 종속시켰다(도 6a 내지 6c).

탈지된 개개의 테오브로마 카카오 종자에서 주요한 알칼로이드인 상기 테오브로민 및 카페인의 수준이, 각각 25.2 mg/g 건조 무게 및 4.6 mg/ g 건조 무게인 것을 탐지하였다. 이와 대조적으로, 테오브로마 카카오 현탁된 세포는 측정가능한 카페인 또는 테오브로민을 생산하지 않았지만(도 6e 및 6f), 그들은 상기 종자에 비교할만한 수준으로 카테킨 및 에피카테킨을 생산하였다(도 6d). 이러한 결과는 식물 세포 배양이 원하지 않는 화합물에 의한 조금의 오염과 함께 관심있는 화합물의 높은 농도를 생산할 수 있음을 증명한다.

실시예 10. 꽃 유래 세포 현탁액을 위한 세포 선별 및 배지 최적화 과정

바이오매스 증가, 당 소비 및 프로시아니딘 생산성을 배양 7일 동안 측정하였다. 이러한 데이터는 바람직한 세포 선별 과정에 매우 중요하다. 잘 생장하는 세포는 가득찬 세포 부피 및 당 소비 측정에 기초하여 선별하였으며, 잘 생산하는 세포주는 프로시아니딘 생산 수득량에 기초하여 상기 잘 생장하는 세포주 중에서 선별하였다. 더 높은 바이오매스 및 더 높은 프로시아니딘 수득량은 배치(batch) 사이클(cycle)안의 생산성을 높일 수 있다. 평균 프로시아니딘 생산성은 배양의 프로시아니딘/L의 52 mg 이었으며, 이는 상기 세포 선별 과정의 1 년 후에 251 mg/L 수준으로 개선되었고, 가장 높은 달성된 수준은 배양 L 당 프로시아니딘 1600 mg 였다(도 10c). 가장 높은 프로시아니딘 수득량은 가득찬 세포 부피의 5000 mg/L 이상으로 증가하였다(도 10d)

B5 주요 염 및 MS 미량염을 이용하여 배지 ⅩⅩⅤ를 개발하였고, 따라서, 배지 안의 암모늄(ammonium) 이온의 농도를 낮춘 것과 배지 ⅤⅢ의 보통 유지 배지를 비교하였다. 탄소원은 60 g/L 자당(sucrose)였고, 호르몬은 2 mg/L 2,4-D 및 0.005 mg/L TDZ에 비해 0.1 mg/L NAA 및 0.2 mg/L 키네틴(kinetin)이었다. 2 주 경과 후에, 상기 배지 ⅩⅩⅤ에서 시험된 현탁물은 생장이 없었으나, 대조군 배지 ⅤⅢ에 비해 4 배 많은 수준의 프로시아니딘을 현탁물에 축적하였다(배지 ⅤⅢ에서 22 mg/L 에 비해, 배지 ⅩⅩⅤ에서 95 mg/L 이상). 이 배지 안의 높은 비율의 질소/암모늄 이온, 옥신(auxin)에 비해 과다한 시토키닌(cytokinin)과 조합으로 인한 것일 수 있다.

MS 염, 30 g/L 수크로스 및 1.5 mg/L 2,4-D가 있는 배지 ⅩⅩⅤⅠ를 개발하였다. 이 배지로 옮겨진 현탁 배양은 대조군 배지 ⅤⅢ보다 13일 째에 4 배 더 많은 수준의 프로시아니딘의 축적을 보였다(ⅤⅢ 배지의 22 mg/L 에 비해, ⅩⅩⅤⅠ 배지의 87 mg/L 프로시아니딘). 상기 두 배지에서 상대적으로 세포 생장은 유사하였으나(ⅩⅩⅤⅠ 배지에서 60% PCV 내지 25% PCV 에 비해, ⅤⅢ 배지에서 61% PCV부터 22% PCV), 탄소원으로 포도당을 선호할 수 있는 세포를 나타내는 당 소비가 달랐다(도 10e).

실시예 11. 생산성 향상을 위한 포도당 첨가

이 실시예는 포도당의 보충적인 첨가를 통해 카카오 현탁 배양의 프로시아니딘 생산성을 증가시키기 위한 프로토콜의 개발을 설명한다.

식물 2차 대사산물은 생장배지부터 생산배지까지 배지를 변화함으로써 유도할 수 있다. 배지 최적화를 위해, 탄소원 또는 질소원은 중요한 요인으로 여겨질 수 있다. 포도당 형태의 추가의 탄수화물을 꽃 및 식물 생장과 관련된 조직 유래 현탁 배양로부터 프로시아니딘 생산을 증가시키기 위해 지수 생장 단계의 말기에 이용할 수 있다.

프로시아니딘 생산성의 현저한 개선을 포도당 첨가에 의해 꽃 조직-유래 현탁 세포주 (MX1241-58)로부터 얻었다. 7일 동안, 상기 배양은 실시예 5에 기재된 정상 배양 조건 하에 정상적으로 ⅩⅩⅩⅡ 배지로 유지하였다. MX1241-58 세포 배양은 포도당 첨가 전 7 일 째에 수집하였으며, 평균적으로 이것의 PCV 및 RI는 49.5±3.5 % 및 0.2 이었다.

상기 평균 프로시아니딘 생산 수준은 189.5±17.7 mg/L PCV 이었다. 7일 째에, 5 ml 50% 포도당 저장 용액을 굴절율을 3% 이상 조정하여 상기 현탁 배양에 첨가하였고, 그 후 배지의 포도당 농도는 0.5% 이하인 경우 반복하였다. 상기 포도당 첨가 후에, 플라스크 안의 상기 배양을 상기 현탁물안의 농축된 포도당을 분산시키기 위해 약 10초 동안 손으로 힘차게 흔들었고, 상기 굴절률을 다시 측정하였을 때 평균적으로 3이었다. 다른 배양 일(7, 11, 16 및 21에)에 3-4회 포도당 첨가 및 한번의 신선한 배지 첨가(25 일)와 함께, 프로시아니딘 생산 수준은 4.4 g/L PCV 까지 증가하였고, 이는 이것의 초기 값 보다 24배 더 높았으며, PCV 는 49.5±3.5% 부터 69.0±1.4% 까지 증가하였다.

이것의 생산 수준을 개선하기 위해 유사한 처리를 세포주 MX1440-3496 (실시예 6에 기재된)에 적용하였다. 이 실험은 포도당 첨가에 대한 상기 세포주의 반응을 시험하기 위해 만들었다. MX1440-4496 세포주는 실시예 6에 기재된 배지 ⅩⅩⅩⅢ에서 유지하였다. 6일 째에, MX1440-3496 세포주의 6개 플라스크를 무작위적으로 선택하였고, 각 3개의 플라스크의 2 세트를 분류하였다. 3개의 플라스크 세트에 50% 포도당 저장용액을 처리하였고, 다른 3개 플라스크는 처리하지 않고 남겼다. 6일 째에 모든 6개의 플라스크에 대해 포도당 첨가에 앞서 상기 측정은 평균적으로 45% PCV, 0.3±0.1 RI, 2.41±0.19 g/L PCV 프로시아니딘 생산이었다. 5 mL 50% 포도당 저장용액을 세개 처리된 프라스크에 첨가하였다. 포도당 첨가 후에 상기 처리된 플라스크의 RI는 6.0±1.1 로 증가하였고 평균 PCV는 39.7±0.6% 이었다.

모든 상기 플라스크를 수집하였고 포도당 첨가 후 1, 3, 4, 5 및 6일에서 그들의 PCV, RI 및 프로시아니딘 생산을 측정하였다. 상기 처리되지 않은 플라스크는 현저한 RI 변화를 보이지 않았고, 45% 부터 53±3.6%까지 PCV의 경미한 증가를 보였다. 그들의 생산은 처리 후 6일 째에 2.83±1.17 g/L PCV에 머물렀다. 이와 대조적으로, 상기 처리된 플라스크는 6일 째에 지속적으로 증가하는 PCV에서 53±2.7%로 증가를 보였다. RI는 현저히 0일 째에 6±1.1 부터 6일 째에 2.0±1.3까지 이어지는 일(day) 당 0.6 내지 0.8 단위로 떨어졌다. 또한, 그동안에 그들의 생산은 5일 째에 포도당 첨가 전에 2.42±1.93 g/L PCV 부터 12.93±2.24 g/L로 증가하였다. 상기 포도당 처리는 증가된 프로시아니딘 생산 및 도 7에서 나타낸 바와 같이 프로시아니딘 생산에 대한 세포 배양 과정을 위한 현저한 개선을 나타내는 이러한 생산 특징을 유도한다(도 7).

실시예 12. 코코아 현탁 배양의 규모 확대

상기 식물 세포 배양 사용의 일반적인 문제점은 표적 생산물의 지속적인 생산을 수득하는 것이다(Kim et al., Biotechnol Prog. 20(6) 1666, 2004). 따라서, 성공적인 대량 식물 세포 배양을 위한 비결은 안정한 생산성을 유지하는 것이다. 코코아 세포 생장 및 생산이 매우 지속적이었고 규모 확대 조건하에 안정하였기 때문에, 코코아 세포 배양의 규모 확대 현탁에 대한 과정은 125 ml 플라스크부터 500 ml 플라스크까지 성공적으로 수행하였다. 선별된 세포주의 평균 PCV는 7일 동안 45~55% 이었고, 이는 상기 초기 PCV 의 20% 수준 보다 약 2.5 배 더 높은 것이었다. 대량 플라스크 배양은 암조건에서 100 rpm 에서 회전 진탕기에서 배지 ⅤⅢ 의 유지 배지안에서 생장시켰다. 배양 매 7일 마다, 바이오매스, 배지 안의 당 농도 및 프로시아니딘 생산성을 측정하였다.

카카오 세포 2.7 L를 6.5 L 생물반응장치(작업량=5.0L)에 접종하였고, 0.2 vvm(분 당 배양 부피 당 기체의 부피) 기체 흐름 속도, 100 rpm 교반 속도 및 23℃용기 온도 하에 7일 동안 길렀다. 바이오매스는 매우 느리게 증가하였고, 지체 단계는 4일 지속되었다. 높은 접종 부피는 상기 세포에 대한 쟁점이었는데, 왜냐하면, 이것은 영양분 허용가능성을 제한 할 수 있고, 또한, 상기 세포를 균일하게 혼합하는 것을 어렵게 하기 때문이다. 이상적으로 개시 접종 부피는 25 및 40% PCV 사이여야만 했다. 바이오매스 농도 및 특정 생산성에 영향을 주는 중요한 인자 중의 하나는 용존 산소량(dissolved oxygen, DO) 농도 및 이산화탄소(CO₂) 같은 용해된 기체 대사산물의 기체 교환이다(Dicosmo & Misawa, “Plant Cell Culture Secondary Metabolism”, 1996, pp44). 플라스크 배양에서, 상기 용존 산소량 및 기체 대사산물의 조절은 불가능하지만, 반응장치 배양에서 그들을 조절하는 것은 가능하다. 이 실시예에서, 용존 산소량 수준은 점차적으로 떨어졌으며, 이는 세포 대사의 우수한 지표였다.

실시예 13. 현탁된 세포 배양 유래 대량 분리

코코아 현탁 세포 배양의 10L 부터 회수된 동결건조된 바이오매스는 바이오매스 부피 1:1 비율로 80% 메탄올(methanol)을 혼합하였고, 상온에서 1 시간 동안 섞었다. 이것을 진공하에 Buchner funnel에서 여과지를 통하여 여과하였다. 추출은 적어도 3회 반복하였다. 수집된 각 메탄올 추출물을 모았고, 원래 30%에 대한 메탄올 추출물의 부피를 감소시키기 위해 감소된 압력하에 40℃에서 농축하였다. 상기 농축된 메탄올 추출물을 액체-액체 추출을 위해 디클로로메탄(dichloromethane)에 첨가하였고, 상기 디클로로메탄 층 추출물을 수집하였으며, 모으고, 감소된 압력 하에 상온에서 25% 비율로 농축하였다. 상기 건조된 추출물을 메탄올에 용해하였으며, 증류수에 넣었고, 침전물을 수득하기 위해 2일 동안 0℃에 두었다.

상기 건조된 세포 유래 전-정제된 프로시아니딘의 실제 수득량은 50~60%와 함께 10~20% 순도를 포함한다. 불순물의 효과적 제거를 위해, C18 및 실리카 컬럼(silica column)를 이용하여 Waters prep-LC (Milford, Massachusetts, USA) 로 추가적인 정제를 하였으며, 상기 순도는 전-LC 정제 과정 후에 99% 이상 증가될 수 있다. 높은 순도의 표적 화합물 프로시아니딘을 수득하기 위해 , 상기 결정화의 추가적 과정을 적용할 수있다.

실시예 14. 테오브로마 카카오( Theobroma cacao ) 세포 배양 및 코코아 콩 유래 폴리페놀 및 프로시아니딘의 비교

현탁배양 유래 가공되지 않은 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)의 추출

테오브로마 현탁 세포 배양의 1L 로부터 수득된 상기 바이오매스를 Labconco 동결건조기를 이용하여 건조된 카카오 세포 14.0 g 를 얻기위항 동결건조하였다. 상기 건조된 가루를 혼합된 수분을 함유한 아세톤(acetone) (70% v/v) 250 mL으로 30분 동안 추출하였다. 상기 수분을 함유한 용액을 3500 rpm 에서 15분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 상기 고체 잔여물을 같은 방법으로 다시 원심분리하였다. 두 추출액 유래 상기 상청액을 같이 혼합하였고, 그 후 부분적인 진공하에 회전 증발기로 증기를 40℃에서 증발하였다. 상기 농축된 수분을 함유한 잔여물을 -20℃에서 동결하였고, Laboconco 동결건조기를 이용하여 진한 노랑색 미가공된 추출액을 얻기 위하여 건조시켰다. 상기 건조된 세포 무게로부터 상기 미가공된 프로시아니딘의 수득량을 실시예 8에 기재된, 10-15% 범위에 이르는 산 부탄올 가수분해 방법으로 결정하였다.

발효되지 않고 가공되지 않은 코코아 콩 유래 가공되지 않은 프로안소시아니딘의 추출

발효되지 않고, 가공되지 않은 코코아 콩을 상기 Raw Harmony 로부터 수득하였다(Los Angeles, CA). 가공되지 않은 프로시아니딘을 건식분쇄(ground dried)의 5 g, 발효되지 않은 콩 또는 갈고, 탈지되고, 발효되지 않은 코코아 콩으로부터 추출하였다. 현탁세포 배양에 사용된 상기 기재된 방법과 50 mL 수분을 함유한 아세톤(70% v/v)을 제외한 유사한 추출을 각 추출 단계 및 추출 동안 사용하였고, 추출을 3회 반복하였다. 상기 조합된 추출물을 3500 rpm 에서 15분 동안 원심분리하였다. 상기 상청액을 버린 후에 40℃에서 부분 진공하에 용액을 제거하기 위해 증발시켰다. 상기 농축된 수분을 함유한 잔여물을 -20℃에서 동결하였으며, Laboconco 동결건조기를 이용하여 자주색 가공되지 않은 추출물을 얻기 위하여 건조시켰다. 상기 가공되지 않은 프로시아니딘의 수득량을 10-13 % 범위에 이르는 실시예 8에 기재된 산 부탄올 가수분해 분석으로 평가하였다.

프로시아니딘의 고성능액체크로마토그래피 (High performance liquid chromatography, HPLC)분석

프로시아니딘의 HPLC 분석을 Waters 2795 분리 모듈(separation module), 상기 Waters 996 PDA 탐지기 및 상기 Waters 474 스캐닝 형광 탐지기(scanning fluorescence detector)로 구성된 정상 HPLC시스템으로 수행하였다. 테오브로마 카카오 세포 추출물의 프로시아니딘의 특정화 및 분리 조건, 및 가공되지 않은 코코아 콩 추출물을 극성 프로틱(protic) 단량체 및/또는 저중합체에 대한 개선된 과정을 기재한 Kelm et al. (U.S. Pat. Appl. No. 2007075020)에 조정된 Develosil Diol 컬럼(column) (250×4.6 mm ID, 5 μ 입자 크기) 을 이용하여 수득하였다. 상기 두 부분으로 이뤄진 이동 상은, 용액(A), 아세토니트릴(acetonitrile):아세트산(acetic acid)(98:2, v/v) 및 용액(B), 메탄올:물:아세트산(95:3:2, v/v/v)을 포함한다. 직선 점변 용리를 하기와 같이 0.8 mL/분 흐름속도로 30℃에서 수행하였다: 0-35 분, 100-60% A; 35-40 분, 60% A; 40-45 분, 60 - 100% A. 프로시아니딘의 분리를 형광 탐지로 확인하였다(276 nm에서 자극 파장, 316 nm에서 배출 파장), 280 nm에서 UV탐지(Lazarus et al., J. Agric. Food Chem. 47: 3693, 1999).

도 8은 발효되지 않은 코코아 콩 추출물(도 8a) 및 테오브로마 카카오 세포 현탁액 추출물(도 8b)의 형광 탐지에 의한 크로마토그램(chromatograms)을 보여준다. Kelm et al. (U.S. Pat. Appl. No. 2007075020)에 기재된 크로마토그래픽 분리에 따라서, 상기 발효되지 않은 코코아 콩 추출물은 12-머(dodecamer)(중합도= 12) 까지 포함하였다. 이 실시예는 콩에 대해 보고된 것과 같이 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 세포 배양 유래 프로시아니딘 추출물이 역시 동일한 프로필(profile)을 갖는 것을 확인하였다. 도 9는 발효되지 않은 코코아 콩 추출물(도 9a) 및 테오브로마 카카오 세포 배양 추출물(도 9b)의 흡수 크로마토그램을 나타낸다. 이 탐지 형식은 카페인 및 테오브로민의 탐지를 허용하며, 이 실험의 결과는 콩 유래 상기 추출물이 이러한 두 화합물의 존재를 나타내는 반면, 상기 세포 배양물의 상기 추출물에서 그들이 탐지되지 않은 것을 증명한다.

따라서, 이 실시예는 테오브로마 카카오 세포 배양이 코코아 콩안에 똑같은 프로시아니딘을 생산할 수 있는 반면 바람직하지 않은 화합물인 카페인 및 테오브로민을 생산하지 않는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명에 기재된 세포 배양에 대한 상기 추출 과정은 코코아 콩 탈지에 필요한 헥산(hexanes)과 같은 용액의 사용을 요구하지 않는다. 따라서, 테오브로마 카카오 세포 배양 유래 프로시아니딘 추출물은 헥산과 같은 독성 용액의 잔여물을 포함하지 않을 것이다.

실시예15 . 카카오 세포 현탁 배양 유래 프로시아니딘 추출물의 항산화제 활성

이 실시예는 상기 실시예에서 기재된 방법에 의해 배양된 카카오 세포 유래 추출된 프로시아니딘의 항산화제 활성에 대해 시험하는 방법을 설명한다.

본 명세서의 증거는 이러한 화합물의 카카오 프로시아니딘의 건강을 증진하는 특성 및 상기 항산화제 특성간의 연관성을 제시한다. 보통 이러한 항산화제는 심장혈관계 질환에서 몇몇 유형의 종양 향상 및 저밀도 지방단백질(low density lipoprotein, LDL) 산화를 포함하는 특정한 산화력 및 자유 라디칼(free radical) 과정에 영향을 준다고 여겨진다. 따라서, 카카오 프로시아니딘의 잠재적인 항산화제를 측정하는 것은 건강을 증진하는 특성이 있는 조성물 안에 이러한 화합물의 사용을 가능하게 하는 암 및 심장 질환과 같은 인간 질병을 예방에 있어, 이러한 화합물의 영향을 확인하는 합리적인 방법이다. 유사하게, 항산화제는 적은 주름이 있는 어려보이는 피부를 유지하는데 도움을 준다고 여겨지므로, 상기 카카오 프로시아니딘은 화장품 조성물에 쓰일 수 있다.

카카오 프로시아니딘과 같은 상기 다가페놀(polyphenolic) 화합물의 항산화제 능력은 당업계에 알려진 많은 과정으로 측정하였다. 가장 잘 알려진 방법은 산소 라디칼 흡수 능력(Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC)이다(Cao G, Alessio H, Cutler R (1993). "Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants" Free Radic Biol Med 14 (3): 303-11). 상기 분석은 아조-개시자(azo-initiator) 화합물과 같은 자유 라디칼 발생기와 혼합된 후에 형광 분자(베타-피코레리트린(beta-phycoerythrin) 또는 플루오르세인(fluorescein) 각각) 의 산화력이 있는 분해를 측정하였다. 아조-개시자는 가열에 의해 자유 라디칼을 생산하는 것으로 여겨지며, 이는 상기 형광 분자를 파괴하고 상기 형광의 손실을 유도한다. 항산화제는 산화력있는 파괴로부터 상기 형광 분자를 보호할 수 있다. 상기 보호의 정도는 형광계를 사용하여 수량화될 수 있다. 플루오르세인은 현재 형광 탐침으로 가장 많이 쓰인다. 상기 능력을 자동적으로 측정할 수 있고, 계산할 수 있는 장비는 상업적으로 구매가능하다(Biotek, Roche Diagnostics).

산화력있는 파괴 과정에 따라 상기 형광 강도는 감소하였으며, 이 강도는 전형적으로 상기 아조-개시자(자유 라디칼 발생기)의 첨가 후에 35 분 동안 기록되었다. 형광 발광 붕괴로 측정된 플루오르세인의 상기 파괴(또는 분해)는 항산화제의 존재에 의해 현저히 적어졌다. 붕괴 곡선(형광 발광 강도 대 시간)은 기록되었고, 두 붕괴 곡선(항산화제가 있거나 없는) 사이의 범위를 계산하였다. 나중에, 상기 항산화제가 매개하는 보호의 정도를 표준 물질로서 항산화제 트롤록스(trolox)(비타민 E유사체)를 이용하여 수량화하였다. 다른 트롤록스 농도는 표준 곡선을 만드는데 사용하였고, 시험 시료를 이것에 대해 비교하였다. 시험 시료(음식)에 대한 결과는 "트롤록스 등가물(trolox equivalents)" 또는 TE로 보고하였다.

저장 용액 명칭	부피	화학 물질	양
DKW 10X 다량 요소 용액 A	1L	NH₄NO₃	14.16 g
DKW 10X 다량 요소 용액 A	1L	Ca(NO₃)₂.4H₂O	19.69 g
DKW 10X 다량 요소 용액 B	1L	CaCl₂.2H₂O	1.49 g
		K₂SO₄	15.59 g
		MgSO₄.7H₂O	7.40 g
		KH₂PO₄	2.65 g
DKW 100X 미량 요소 용액	1L	Zn(NO₃)₂.6H₂O	1.70 g
		MnSO₄.H₂O	3.34 g
		CuSO₄.5H₂O	25.0 mg
		H₃BO₄	480.0 mg
		Na₂MoO₄.2H₂O	39.0 mg
철 용액(Iron Solution) 1000X 저장 용액	1L	Na₂EDTA (0.5M solution)	200 ml
철 용액(Iron Solution) 1000X 저장 용액	1L	FeSO₄.7H₂O	27.8 g
DKW 1000X 비타민 저장 용액	100 mL	미오-이노시톨(Myo-Inositol)	10.0 g
		티아민(Thiamine-HCl)	0.2 g
		니코틴 산(Nicotinic acid)	0.1 g
		글리신(Glycine)	0.2 g
B5 1000X 비타민 저장 용액	50 mL	미오-이노시톨	5.0 g
		니코틴 산	50.0 mg
		피리독신(Pyridoxine)	50 mg
		티아민	500.0 mg
B5 주요 염 IM1 10X 저장 용액	1L	(NH₄)₂SO₄	2.68 g
		CaCl₂	1.13 g
		MgSO₄	2.44 g
		KNO₃	25.0 g
		NaH₂PO₄	3.0 g
MS 미량 염 MM 1000X 저장 용액	1L	MnSO₄.H₂O	16.9 g
		ZnSO₄.7H₂O	8.6 g
		H₃BO₄	6.2 g
		KI	0.83 g
		Na₂MoO₄.2H₂O	0.25 g
		CuSO₄.5H₂O	25.0 mg
		CoCl₂.6H₂O	25.0 mg
MM/IM1 비타민 1000X 저장 용액	1L	비오틴(Biotin)	10.0 mg
		판토텐산 칼슘(Calcium pantothenate)	1.0 g
		미오-이노시톨	100.0 g
		피리독신	1.0 g
		티아민	1.0 g
		피리딘-3-카르복시산(Pyridine-3-carboxylic acid)	1.0 g

Claims

테오브로마 카카오 식물로부터 유래된 다수의 캘러스 세포(callus cells derived from a Theobroma cacao plant)를 포함하고, 상기 캘러스 세포는 프로시아니딘(procyanidins)을 생산하고 측정가능한 카페인 또는 테오브로민(measurable caffeine or theobromine)을 생산하지 않기 위해서 선별되는 테오브로마 캘러스 세포주(Theobroma callus cell line).