JP2012522504A - 植物の細胞培養物からのプロシアニジンの産生および抽出 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2009年4月3日出願の米国特許仮出願第61/166,591号明細書の利益を主張する。
別段の指定のない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用されている。さまざまな本発明の実施形態を概説することを容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。
第1の実施形態において、キサンチンアルカロイドを実質的に含まないココアポリフェノール調製物を調製する方法であって、カカオ属またはヘラニア属の細胞を、ココアポリフェノールの産生をもたらすのに十分な時間および条件下で、懸濁培養物中で成長させるステップと、細胞懸濁培養物からココアポリフェノールを回収するステップとを含む方法が提供される。この方法の例では、得られたココアポリフェノール調製物は、検出可能なカフェインおよび/またはテオブロミンを実質的に(または、ある場合では完全に)含まない。他の特定の実施例では、調製物は、発酵させたさやから作出されたココアポリフェノール調製物中に存在すると思われるカフェインおよび/またはテオブロミンのレベルの50%未満のレベルのカフェインおよび/またはテオブロミンを含有する。好ましい実施形態では、細胞培養物を生成した調製物は、発酵させた豆から作出されたココアポリフェノール調製物中に存在すると思われるカフェインおよび/またはテオブロミンのレベルの30%未満、20%未満、15%未満、10%未満または5%未満のレベルのカフェインおよび/またはテオブロミンを含有する。開示されている方法の特定の実施形態では、カカオ属またはヘラニア属の細胞を、ココアプロシアニジン(例えば、オリゴマープロシアニジン)の産生をもたらすのに十分な時間および条件下で、懸濁培養物中で成長させ、細胞懸濁培養物からココアプロシアニジンを回収する。
本明細書において、カカオ属またはヘラニア属の細胞培養物からプロシアニジンを効率的に単離するための方法が記載されている。具体的に述べると、カカオ豆から抽出されたプロシアニジンと類似したプロシアニジンを機械的に単離することができるカカオ属またはヘラニア属の細胞懸濁培養物を樹立した。
・気候条件を制御することによる、信頼性が高く持続的なバイオマスの供給源
・抽出プロセス中のプロシアニジンの分解を最小限にする迅速かつ効率的な単離手順
・細胞培養物から単離されたプロシアニジンの組成が、カカオ豆から単離されたプロシアニジンの組成と類似していること
・細胞培養物のプロシアニジン生産性を操作し、最適化するために有用な技法
が挙げられる。
ココア培養物を生成するプロセスをここに概説し、詳細な例示的プロトコールを実施例に記載している。簡単に述べると、詳細は、当業者によって公知の変動に従って変動してよいが、プロシアニジンを産生する細胞培養の開始は、さまざまな植物の部位、例えば、体細胞胚形成について記載したように、例えば、花弁、がく片、仮雄ずいなどの花の組織、または節、節間、幼葉、成葉などの花ではない栄養組織のいずれかから得られた外植片からカルスおよび懸濁培養物を樹立することによって実現される。培養細胞の一部を周期的に新鮮な培地に移すことによって懸濁培養物を新鮮な懸濁培養物培地中に維持する。移動スケジュールおよび播種密度は、細胞の成長能力および培地からの糖の消費量によって決定する。
プロシアニジンを産生するカカオ属またはヘラニア属の細胞のバッチを、本明細書に記載の通り成長させ、細胞を回収してプロシアニジンを抽出する。懸濁細胞の回収は、いくつもの手段で実施することができ、その例は、本明細書に記載されている。
回収した細胞集団を破砕、粉砕または摩砕して細胞集団をホモジナイズし、抽出溶媒と試料をよく接触させるため、および抽出された部分が試料全体を代表することを確実にするために細胞を壊した。
カカオ属またはヘラニア属の細胞培養物からプロシアニジンを検出し同定するために使用される分析的な技法は、豆からの抽出物に対して使用される技法と同様である。ココアプロシアニジンの同定は、主に、オリゴマーを分離するためのさまざまなクロマトグラフィーの技法、次いで構造的に特徴づけるための独立した方法を使用して実現されている。Quesnel(例えば、非特許文献42参照)ならびにJalalおよびCollin(例えば、非特許文献43参照)は、それぞれペーパークロマトグラフィー法およびTLC法を使用してココア中のプロシアニジンを同定した。しかし、これらの刊行物によりココア中にプロシアニジンが存在することが認められたが、プロシアニジンの立体特異的な構造は解明されなかった。Porterら(例えば、非特許文献8参照)は、カラムクロマトグラフィー、TLC、HPLCおよび陰イオンFAB/MSを使用してココア中のプロシアニジンの厳密な調査を行って七量体を通してプロシアニジンオリゴマーの存在を立証した。さらに、彼らはNMRを使用して四量体を通してプロシアニジンの構造を確認し、プロシアニジンが主に(−)−エピカテキンからなることを見出した。プロシアニジンオリゴマーを特徴づけるためにカラムクロマトグラフィー、逆相HPLC、および陽イオンLSIMSの組み合わせを使用したClappertonらにより、八量体を通したココアプロシアニジンオリゴマーの証拠が報告された(例えば、非特許文献45参照)。この研究により、陽イオンLSIMSの有用性および大きなプロシアニジンオリゴマーを同定する手だてとしてのナトリウム付加物の使用が実証された。残念ながら、これらの方法は全て面倒で、構造情報を得るために長い調製時間を必要とし、多数の細胞培養物試料のハイスループットな分析およびスクリーニングをしにくい。また、これらの方法は、少量の試料には適さない。
大規模な植物の細胞培養は、商業的なプロセスの開発において重要な技術である。大規模な植物の細胞培養物は、微生物発酵において使用されるものと同様の大きなタンクにおいて実施することができる。これらのタンクにおける生産性の増強は、大規模なプロセスに特徴的な細胞の成長および産生に基づいて生体分子因子を決定することによって、およびプロシアニジンの生産性を増強する大規模なバイオプロセスの変動を最適化することによって実現することができる。生体分子因子としては、培地の構成成分、エリシター(elicitor)および生合成経路の前駆物質が挙げられる。スケールアップのプロセスの目的は、小規模において最適であることが観察された条件を大規模において再現することであるので、大規模なプロセスの前に、これらの因子をフラスコ規模のプロセスにおいて試験するべきである。しかし、大規模なバイオリアクター培養における条件は、フラスコ規模の培養におけるカカオ属またはヘラニア属の懸濁細胞と異なってよい。培養物のマクロな動態は、輸送の限界によって引き起こされる、懸濁細胞に影響を与える環境条件の変化の影響を受ける。例えば、成長の動態のパラメータは規模に無関係であるが、容器内の細胞培養物の全体的な成長は、気体状の溶解した栄養分および代謝産物の輸送規模に依存するので、規模に依存する(例えば、非特許文献46参照)。したがって、ココアプロシアニジンを産生させるためのバイオリアクターのプロセスにおけるスケールアップでは、成長速度、産物形成速度、栄養分の取り込み速度、および呼吸速度の必須データをもたらすために、いくつもの基礎実験を実施する。
本明細書に開示されている方法によって生成したプロシアニジンを、治療、食事、または化粧の目的のために対象に投与することができる。対象は、ヒト、またはサル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスもしくはラットなどの哺乳動物であってよい。
花の組織からのカカオカルスの誘導および増殖
緻密なカルス凝集塊を、炭素の供給源として[D+]−グルコースを使用した制御条件下で、オーキシン(2mg/Lの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D))、サイトカイニン(0.005mg/Lのチジアズロン(thisdiazuron)(TDZ))および他の補充物(250mg/LのL−グルタミン、100mg/Lのミオイノシトール)で強化した全強度のドライバー−クニユキのクルミ(Driver and Kuniyuki walnut;DKW)培地を使用して樹立した(表1の培地I)。培地を、pHを5.8に調整した後、オートクレーブすることによって滅菌した。カカオの未成熟の花材料の試料を、いくつもの栽培した植物から採取した。培養物のコンタミネーションを防ぐために、材料を培地に導入する前に、材料の表面を滅菌した。まず、材料を1%(w/v)の次亜塩素酸ナトリウムに20分間浸漬し、5分ごとに穏やかに撹拌した。無菌条件下で材料をデカントし、滅菌脱イオン水で3回すすぎ、各すすぎの間、穏やかに撹拌した。最終的にすすいだものをデカントし、花芽のみを滅菌ペトリ皿に移した。花芽を、滅菌小刀を使用して基部から花の長さの3分の1部分で横方向に切断した。仮雄ずい、がく片および花弁底部の外植片を、切断末端の開口部を通じて抽出した。
栄養組織からのカカオカルスの誘導および増殖
カルスを、オーキシン(2mg/LのIAAおよび4mg/LのIBA)、サイトカイニン(0.005mg/LのTDZ)およびL−グルタミン(250mg/L)を補充したムラシゲ−スクーグ(Murashige and Skoog;MS)培地で、炭素の供給源としてグルコース(20g/L)を用いて樹立した(表1の培地XXVII)。培地を、pH5.8に調整した後、オートクレーブすることによって滅菌した。カカオの栄養材料試料(幼葉、成葉、節および節間)をいくつもの温室栽培された植物から採取した。培養物のコンタミネーションを防ぐために、材料を培地に導入する前に、材料の表面を滅菌した。まず、材料を70%のエタノールに1分間浸漬し、その後25%の漂白剤に10分間浸漬し、5分間ごとに穏やかに撹拌した。無菌条件下で材料をデカントし、滅菌脱イオン水で3回すすぎ、各すすぎの間、穏やかに撹拌した。葉を5mmの正方形に切断し、節および節間を1〜2mmの円柱状に切断し、固体培地を含有するプレート上に外植した。プレートを25℃、暗闇で維持した。プレートを毎日コンタミネーションの兆候について観察し、コンタミネートした材料は廃棄した。4週間後にカルス形成が観察された。6週間後、カルスを外植片から分離し、上記および培地XXVII(表1)に示したカルス増殖培地に置いた。しかし、開始後、カルスは非常に急速に増殖し、樹立された。新しく形成された細胞をカルスの表面から単離し、2週間間隔で新鮮な培地で継代培養した。淡黄色から淡褐色を示す急速に成長している細胞株を継代培養のために選択した。
クプアスおよびテオブロマ オボバツムのカルスの誘導および増殖
クプアスおよびテオブロマ オボバツムのカルス培養物を、実施例1および実施例2においてカカオについて記載されている方法などの方法を使用して樹立した。
懸濁の開始
細胞懸濁培養物を、実施例1に記載の花の外植片から生じた白色の新鮮なカルスを、20種の異なる液体培地(培地IV〜XXIII;表1)25mlを含有する125mlのエルレンマイヤー(Erlenmeyer)フラスコに播種することによって樹立した。フラスコをシリコーンフォームのキャップで覆い、54日間、完全な暗闇下、24+1℃にサーモスタットで制御された部屋で旋回振とうを用いて120rpmで撹拌した。必要であると思われれば、毎週または隔週、継代培養物を移した。顆粒状の細胞懸濁物または細密な細胞懸濁物のいずれかとして形成された培養物を保持し、一方懸濁培養物を形成しなかった培養物は廃棄した。14日間細胞を成長させた後、10%(v/v)の細胞を、新鮮な培地25mlを含有する新しい125mlのフラスコに移し、その後、隔週で継代培養した。培地VIIIが懸濁細胞の開始における細胞増殖の最良の性能を示した(14日目で45%のPCV)。
懸濁細胞の成長
本実施例は、懸濁物の細胞成長を増加させるために使用する方法について記載する。
栄養細胞の懸濁培養物から均一な細胞株を創出するための細胞選択プロセス
新しく創出された細胞懸濁培養物は、通常、不均一な細胞の混合物である。この不均一性により、大規模な懸濁培養物において細胞の成長が不均衡になり、所望の代謝産物の産生パターンが不安定になる。大規模な産生に適した均一な細胞培養物は、これらの不均一な混合物から、所望の特性を有する培養物を継代培養し、選択することによって得ることができる。このプロセスを補助するために選択的かつ迅速なスクリーニングを開発してポリフェノールおよび細胞の成長を検出した。実施例8に記載のブタノール−HCl加水分解法を用いてポリフェノールの蓄積をモニターし、培養物の総容積に対する細胞容積の割合(PCV(%)=細胞容積×100/培養物の総容積)をバイオマスの尺度として使用した。細胞代謝の尺度として、炭水化物の消費速度を屈折率(Brix%)によって測定した。
カカオ属のカルス培養物および懸濁培養物からのポリフェノールの抽出
本実施例では、実施例1〜4において作り出されたカカオ属培養物のカルスおよび懸濁細胞からポリフェノールを抽出するために開発した方法について記載する。本実施例における実験では特にカカオの培養物を使用した。ポリフェノールを、0.1%のH2SO4を含む50%(v/v)のエタノール1.5mlを用いて新鮮重およそ0.25±0.04gのカルスから、および0.1%のH2SO4を含む80%(v/v) メタノール1.5mlを用いて乾燥重量0.1±0.003gの懸濁細胞(培地上清ではない)から抽出した。細胞を微小遠心管(2.0ml)内に置き、ビーズミル(bead mill)ホモジナイザーで1分間ホモジナイズした。ホモジネートを3500rpmで20分間遠心分離し、上清のみを別の微小遠心管に移した。
培養物におけるポリフェノール産生の予備分析
プロシアニジンの分析反応を行うために使用した方法は、元のSwainおよびHillisの方法(例えば、非特許文献51参照)およびPorterらの方法(例えば、非特許文献52参照)にかなり厳密に近づくように設計した。ブタノール−HCl抽出アッセイを使用してカカオの懸濁細胞の抽出物中のポリフェノールを測定した。含水メタノール抽出物0.1mlおよびブタノール−HCl試薬1.0mlを合わせ(95:5 v/v)、その溶液をQiagen deep well block(Valencia、CA、USA)内で、75℃で60分間加熱することにより、ポリフェノールが加水分解されて単量体の(−)−エピカテキンおよびシアニジンになる。加水分解された試料中にシアニジンが存在することは、淡紅色の形成によって観察された。280nmおよび520nmにおける吸光度を決定し、Chromadex、Inc.(Irvine、CA)から購入した種々の濃度のプロシアニジンB2を使用して作成した検量線を使用して、形成されたシアニジンの量に基づいてプロシアニジン含有量を算出した。明るい淡紅色により、懸濁培養物中のプロシアニジンの濃度が高いことが示される(図5)。この方法に基づいて、いくつかの懸濁培養物のプロシアニジン含有量は250mg/Lから1000mg/Lまでの範囲であった。
カカオ細胞からのポリフェノールの分析
実施例7からの含水メタノール抽出物を0.45μMのミリポア(Millipore)フィルターを通して濾過し、試料100μlをLC−MS分析に投入した。Symmetry C18カラム(100×2.1mm i.d.、3.5μm)(Phenomenex、Torrance、CA、USA)を使用した。CTC Analytics PALオートサンプラー(Leap Technologies、Carrboro、NC、USA)、600S Controllerを伴うWaters 626ポンプおよび190nmから780nmからスキャンするWaters 2996光ダイオード−アレイ検出器(PDA)を備えたWaters(Milford、Massachusetts、USA)Alliance HPLCシステムを使用してLC分析を実施した。データ解析のためにMassLinx(商標)を使用した。水−0.1%のギ酸(溶媒A)およびアセトニトリル−0.1%のギ酸(溶媒B)を1分当たり0.3mlの一定の流速で用いて勾配溶離を行った。以下の比率(v/v)の溶媒Bを用いた直線勾配プロファイルを適用した(時間(分)、%B):(0、7)、(5、15)、(20、75)、(25、100)、(35、100)、(35.1、7)(45、7)。(+)−カテキン、(−)−エピカテキン、カフェイン、テオブロミンおよびプロシアニジン(二量体から六量体)である化合物を280nmでモニターした。Waters Quattro Micro 三重極−四重極(triple-quadrupole)質量検出器(Milford、Massachusetts、USA)を使用してMSデータを得た。カルスに対するプロファイル方式でm/z150から1200までの、および懸濁細胞に対してm/z150から1800までスキャンして、フルスキャンデータの取得を実施した。カテキン、エピカテキン、テオブロミンおよびカフェインに対する信頼できる標準物質はChromadex.Inc(Irvine、CA)から購入し、それぞれの、含水メタノールへの適切な希釈物も、懸濁細胞からの抽出物と同じLC−MS分析に供した(図6Aから図6C)。
花由来の細胞懸濁物の細胞選択および培地の最適化プロセス
培養の7日ごとにバイオマスの増加、糖の消費量およびプロシアニジン生産性を測定した。これらのデータは望ましい細胞選択プロセスのために非常に重要である。良く成長している細胞をPCVおよび糖の消費量の測定値に基づいて優先的に選択し、次いで、良く成長している細胞株の中で良く産生している細胞株をプロシアニジンの産生収率に基づいて選択した。バイオマスが高く、プロシアニジンの産生収率が高いとバッチサイクル内の生産性を増加させることができる。細胞選択プロセスの前の平均プロシアニジン生産性は培養物1L当たりプロシアニジン52mgであり、これは細胞選択プロセスの1年後に最大1L当たり251mgのレベルまで改善し、実現された最高レベルは培養物1L当たりプロシアニジン1600mgであった(図10C)。最高の産生収率も同様に、5000mg/L PCV超に上昇した(図10D)。
生産性を増強するためのグルコースの添加
本実施例では、追加のグルコースを添加することによってカカオの懸濁培養物のプロシアニジン生産性を増加させるためのプロトコールの開発について記載する。
ココアの懸濁培養物のスケールアップ
植物の細胞培養物を使用することにおける一般的な問題は、標的産物の一貫した産生を得ることである(例えば、非特許文献53参照)。したがって、首尾よく大規模な植物の細胞培養をするための鍵は、安定な生産性を維持することである。スケールアップ条件下で、ココアの細胞の成長および産生は非常に一貫していて、安定であったので、ココアの細胞培養物の懸濁物を125mlのフラスコから500mlのフラスコにスケールアップするためのプロセスは首尾よく行われた。選択された細胞株の平均PCVは7日間で45〜55%であり、これは最初のPCVレベルである20%よりも約2.5倍高かった。大規模なフラスコ培養物を、暗闇条件下、旋回振とう機において100rpmで、維持培地である培地VIII中で成長させた。培養7日ごとに、バイオマス、培地中の糖濃度およびプロシアニジン生産性を測定した。
懸濁細胞培養物からの大規模分離
ココアの懸濁細胞培養物10Lから回収した凍結乾燥させたバイオマスを、バイオマスの容積1:1の比率で80%のメタノールと混合し、室温で1時間撹拌する。これを真空下、ブーフナー漏斗で濾紙を通して濾過した。抽出を少なくとも3回繰り返す。メタノール抽出物のそれぞれを採取し、プールし、40℃減圧下で濃縮してメタノール抽出物の容積を元の30%に減少させた。液液抽出するために、濃縮されたメタノール抽出物をジクロロメタンに加え、ジクロロメタン層抽出物を採取し、プールし、減圧下、室温で、比率25%で濃縮した。乾燥した抽出物をメタノールに溶解させ、蒸留水に滴下し、2日間0℃で放置して沈殿物を得た。
カカオの細胞培養物およびカカオ豆から産生されたポリフェノールおよびプロシアニジンの比較
懸濁培養物からの粗プロアントシアニジンの抽出
カカオの懸濁細胞培養物1Lから回収したバイオマスを、Labconcoの凍結乾燥機を使用して凍結乾燥させて乾燥カカオ細胞14.0gを生じさせた。乾燥粉末を、混合含水アセトン(70% v/v)250mLを用いて30分間抽出した。水溶液を3500rpmで15分間遠心分離し、上清を除去した。同じ様式で固体残渣を2回抽出した。2つの抽出物からの上清を合わせ、次いで部分真空下、40℃でロータリーエバポレーターによって蒸発させた。濃縮された水溶性残渣を、Laboconcoの凍結乾燥機を使用して−20℃で凍結させ、乾燥して濃厚な黄色の粗抽出物を生じさせた。乾燥細胞重量からの粗プロシアニジンの収率を、実施例8に記載の酸ブタノール加水分解法によって決定し、それは10〜15%の範囲にわたった。
発酵させていない生のカカオ豆を、Raw Harmony(Los Angeles、CA)から入手した。5gの、摩砕し乾燥させた発酵させていない豆または摩砕し脱脂した発酵させていないカカオ豆から粗プロシアニジンを抽出した。抽出は、各抽出ステップに含水アセトン(70% v/v)50mLを使用し、抽出を3回繰り返したこと以外は上記の懸濁細胞培養物についての手順と同様であった。合わせた抽出物を3500rpmで15分間遠心分離した。上清をデカントし、次いで部分真空下、40℃で蒸発させて溶媒を除去した。濃縮された水溶性残渣を、Laboconcoの凍結乾燥機を使用して−20℃で凍結し、乾燥させて赤紫色の粗抽出物を生じさせた。実施例8に記載の酸ブタノール加水分解アッセイによって推定される粗プロシアニジンの収率は10〜13%の範囲にわたった。
プロシアニジンのHPLC分析を、Waters 2795分離モジュール、Waters 996 PDA検出器およびWaters 474 走査型蛍光検出器からなる順相HPLCシステムによって実施した。Develosil Diolカラム(250x4.6mm ID、粒子サイズ5μ)を使用して得られたカカオの細胞の抽出物および生のカカオ豆の抽出物におけるプロシアニジンの特徴付けの条件および分離条件は、極性プロトン性の単量体および/またはオリゴマーのための改善されたプロセスを記載しているKelmら(例えば、特許文献11参照)から適合させた。二成分移動相は溶媒(A)、アセトニトリル:酢酸(98:2、v/v)および溶媒(B)、メタノール:水:酢酸(95:3:2、v/v/v)からなった。以下の通り、1分当たり0.8mLの流速を用いて30℃で直線勾配溶離を実施した:0〜35分、100〜60%のA;35〜40分、60%のA;40〜45分、60〜100%のA。プロシアニジンの分離を蛍光検出(276nmにおける励起波長、316nmにおける発光波長)、280nmにおけるUV検出によってモニターした(例えば、非特許文献55参照)。
カカオの細胞懸濁培養物から抽出されたプロシアニジンの抗酸化活性。
Claims (29)
- ココアのオリゴマープロシアニジンを調製する方法であって、
カカオ属の種の細胞を、ココアのオリゴマープロシアニジンの産生をもたらすのに十分な時間および条件下で、懸濁培養物中で成長させるステップと、及び
前記細胞懸濁培養物からココアのオリゴマープロシアニジンを含有する抽出物を作製し、それによってココアのオリゴマープロシアニジンを調製するステップとを含むことを特徴とする方法。 - カカオ細胞を、
ココアのオリゴマープロシアニジンの産生をもたらすのに十分な時間および条件下で、懸濁培養物中で成長させるステップと、
前記細胞懸濁培養物からココアのオリゴマープロシアニジンを回収するステップとを含み、前記回収されたココアのオリゴマープロシアニジンがキサンチンアルカロイドを実質的に含まないことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 得られたココアのオリゴマープロシアニジン調製物が、検出可能なカフェインおよびテオブロミンを含まないことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- カカオの細胞懸濁培養物が、未成熟のカカオの花の外植片から固形成長培地上でカルスを成長させるステップと、
前記カカオのカルス培養物から急速に成長している細胞株を選択し、前記急速に成長している細胞株を液体培地中に播種することによって細胞懸濁培養を開始するステップとによって作製されたことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 前記カカオの細胞懸濁培養物が、カカオの節、節間、成長点または茎組織から固形成長培地上でカルスを成長させるステップと、
前記カカオのカルス培養物から急速に成長している細胞株を選択するステップと、前記急速に成長している細胞株を液体培地中に播種するステップとによって細胞懸濁培養を開始することによって作製されたことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - ココアのオリゴマープロシアニジンの産生が、
細胞を回収するステップと、
ポリフェノールに富む画分を抽出するのに適した溶媒中で細胞バイオマスをホモジナイズするステップと、
プロシアニジンに富む画分を、溶媒−溶媒抽出および/またはクロマトグラフィーを使用して単離するステップと、及び
任意選択的に、前記プロシアニジン画分を乾燥または濃縮するステップと
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 細胞を回収するステップが、遠心分離、濾過、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を使用して作製されたことを特徴とする、キサンチンアルカロイドを実質的に含まないココアポリフェノール調製物。
- カカオ細胞の細胞懸濁培養物を作製する方法であって、
未成熟のカカオの花の外植片からのカルスまたはカカオの節、節間、成長点または茎組織からのカルスを、固形成長培地上で成長させるステップと、
前記カカオのカルス培養物から急速に成長している細胞株を選択するステップと、及び
前記急速に成長している細胞株を液体培地中に播種することによって細胞懸濁培養を開始するステップと
を含むことを特徴とする方法。 - 前記未成熟のカカオの花の外植片が、仮雄ずい、がく片および花弁底部の外植片から選択されることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞懸濁培養物をフラスコ、任意の適切な培養容器またはバイオリアクター内で成長させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記成長させるステップが、容器またはバイオリアクター内で、回分方式、流加方式または連続方式で実施されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 請求項9に記載の方法を使用して作製されたことを特徴とするカカオの細胞懸濁培養物。
- 表1に記載の液体培地XXXIIまたは液体培地XXXIIIを使用することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- ココアポリフェノールの混合物を含み、カフェインおよびテオブロミンを実質的に含まないココアポリフェノール調製物であって、カカオの細胞懸濁培養物から抽出されることを特徴とする調製物。
- ヘキサンを使用せずに抽出されることを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- カカオの細胞懸濁培養物からの抽出が、
細胞を回収するステップと、
ポリフェノールに富む画分を抽出するのに適した溶媒中で細胞バイオマスをホモジナイズするステップと、
プロシアニジンに富む画分を、溶媒−溶媒抽出および/またはクロマトグラフィーを使用して単離するステップと、及び
任意選択的に、前記プロシアニジン画分を乾燥または濃縮するステップと
を含むことを特徴とする、請求項15に記載の調製物。 - 細胞を回収するステップが、遠心分離、濾過、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項17に記載の調製物。
- 食事組成物に使用されることを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- 治療用組成物に使用されることを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- 動物用組成物に使用されることを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- 化粧品組成物に使用されることを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- 前記ココアポリフェノールが、カテキン、エピカテキンおよびそれらのプロシアニジンオリゴマーを含むことを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- オリゴマーが、二量体から十二量体までであることを特徴とする、請求項22に記載の調製物。
- オリゴマーが、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または、それらの任意の2つ以上の混合物を含むことを特徴とする、請求項22に記載の調製物。
- ココアポリフェノールがココアプロシアニジンであることを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- 液体の形態、乾燥した形態または凍結乾燥した形態であることを特徴とする、請求項15に記載の調製物。
- 表1に記載の液体培地XXXIIまたは液体培地XXXIIIを使用することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 対数増殖期の終わりに、追加のグルコースを懸濁培養物に添加し、それによってプロシアニジンの産生を増大させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
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