CN102414312A - 从植物细胞培养物中生产和抽提原花青素 - Google Patents
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Abstract
本发明提供制备可可多酚制备物的方法，该方法包括从细胞悬浮培养物中收获可可多酚，例如，原花青素。在这些方法的实施例中，产生的可可多酚制备物基本上(或在某些情况下完全)不含可检测的咖啡因和可可碱，并且更普遍的是基本上不含黄嘌呤生物碱。本发明还描述了生产可可细胞的细胞悬浮培养物的方法，包括用于制备可可多酚和(更特定的)原花青素制备物的细胞悬浮培养物。本发明还提供了由此制作的可可属sp和Herrania sp细胞悬浮培养物和可可多酚制备物，特别是无黄嘌呤生物碱的(或无咖啡因和/或可可碱的)可可多酚制备物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年4月3日提交的美国临时申请号61/166,591的权益，该申请在此以其整体引入作为参考。
技术领域
本发明涉及用于发展可可组织细胞培养物的方法。本发明还涉及选择生产高水平原花青素的细胞系及从细胞培养物中抽提同样物质以生产食品配料、食品添加剂、治疗组合物、或化妆品组合物的方法。本发明还涉及新培养基，如用于生长可可细胞的细胞悬浮培养物的液体培养基及用于提高此悬浮细胞的原花青素生产的液体培养基组合物。
背景技术
多酚广泛分布于植物、水果和蔬菜中，并且因其在人类和动物健康中的生理功能(包括抗氧化、抗突变和预防癌症的活性)受到了相当的重视(Salvia等，J.Agric.Food Chem.39：1549-1552，1991；Bomser等，Cancer Lett.，135：151-157，1999；Zhao等，Carcinogenesis，20：1737-1745，1999)。流行病学研究曾暗示了多酚中的黄酮类化合物可以降低心脏病的风险(Hertog等，Lancet：342：1007-1011，1993)。此外，已有结果显示膳食黄烷-3-醇和/或原花青素在实验动物中降低了动脉粥样硬化和冠心病的发病率(Tijburg等，Atherosclorosis，135：37-47，1997；Yamakoshi等，Atherosclerosis，142：139-149，1999)。负责这些效果的机制之一涉及到它们对于低密度脂蛋白(LDL)氧化的抑制作用(Steinberg，Circulation，85：2337-2344，1992)。
已知可可植物(可可属可可Theobroma cacao L.，梧桐科)的种子富含多酚(Porter等，Phytochemistry，30：1657-1663，1991)。制备自发酵和烘烤可可豆的可可酒的某些抗氧化组分(可可和巧克力产品的主要成分)已被鉴定为黄烷-3-醇和原花青素寡聚体(Sanbongi等，J.Agric.Food Chem.，46：454-457，1998；Adamson等，J.Agric.Food Chem.，47：4184-4188，1999)。
可可属的其他种和如Herrania的其他属也是可可原花青素的已知的来源。可可属的二十个不同种已有所描述，但通常只有十二种被接受。在这些种中，九个原产于亚马逊河流域，因此遗传分布的中心似乎是该区域的西半部(Giacometti，1994，In“Neglected Crops：1492 from a different perspective(J.E.Hemando Bermejo和J.Leon，编)Plant Production and Protection Series No.26，FAO，Rome，Italy，p205-209)。
可可属一般在新热带区，并且分布在北纬18°和南纬15°之间的西半球的热带雨林中。具有最多物种的区域是在哥斯达黎加和东北哥伦比亚之间。人们发现了五派和二十个种。大花可可树(Theobroma grandiflorum)属于由十一个种组成的Glossopetalum(Glossopetalum)派；可可属可可是可可派的唯一种。
可可属的四个种已被描述为可食用肉的生产者：大花可可树、Theobromacanumanense Pires & Froes、Theobroma subincanum Martius、(巴西的Cupuí及哥伦比亚的Cacau de monte)和Theobroma tricolor Humb.& Bonpl，是自西亚马逊河流域至南墨西哥都有分布的小树。巧克力也由这些种的种子制造(Giacometti，1994，In“Neglected Crops：1492 from a different perspective(J.E.Hemando Bermejo和J.Leon，编)Plant Production and Protection Series No.26，FAO，Rome，Italy，p205-209)。已有结果显示可可属与Herrania属的几个种的豆生产类似的原花青素，并且这些化合物能从豆中抽提(Romanczyk等，WO 97/36497)。
可可豆中的多酚储存于子叶的色素细胞中。根据那些色素细胞(也称为多酚储存细胞)中的花青素量，它们是白色到深紫色的。在这些细胞中能区分三组多酚：儿茶酸或黄烷-3-醇(～37％)、花青素(～4％)、及原花青素(～58％)。主要的儿茶酸是(-)-表儿茶酸，其构成高达35％的总多酚含量。原花青素(通常被称为原花青素(proanthocyanidins))主要是黄烷-3，4-二醇，其4→8或4→6结合于聚集的二聚体、三聚体、或寡聚体，以表儿茶酸作为主要延伸亚单位(Romanczyk等，WO 97/36497)。
在新鲜可可豆的干的不含脂肪的质量中可溶性多酚的总量为15％到20％(相当于含有54％脂肪和6％水分的空气干燥可可豆的～6％)，而在发酵豆中为～5％。因此，使用可可豆作为多酚来源的一个主要缺点是在豆的加工过程中损失了大部分多酚。其他步骤如烘烤和脱脂也导致损失。因而，可可粉中只有10％以下的新鲜豆中所发现的总多酚。使用可可豆的另一个问题是可可属可可这个植物的有限生长范围。它仅生长于赤道北纬和南纬约20°的面积内温暖、潮湿的气候中。这使得在储存和转运至加工及多酚抽提区域的过程中保持豆的多酚含量变得困难。
植物细胞培养物是克服这些问题的有吸引力的替代方法。最近植物细胞培养物已被用于分离黄酮类化合物。关于原花青素的情况，几个组已经能够从培养物中分离特殊的化合物。例如，已经从Rosa(Rosa)培养物中分离到4→8连接的(-)-表儿茶酸-(+)-儿茶酸和五倍子酸(Muhitch & Fletcher，Plant Physiol.，75：592-595，1984)。已发现日本柳杉(Cryptomeria japonica)的悬浮培养物和愈合组织生产多达26％干重的原花青素(Teramoto & Ishikura，Bot.Mag.Tokyo 98：171-179，1985；Ishikura & Teramoto，Agric.Biol.Chem.47：421-423，1983)，而花旗松(Pseudotsuga mensiesii)悬浮培养物生产多达其干重40％的原花青素(Stafford &Cheng，Phytochemistry 19：131-135，1980)。还有报告显示在葡萄(Vitis vinifera)的悬浮培养物中生产原花青素(Decendit & Merillon，Plant Cell Rep.15：762-765，1996；Waffo-Teguo等，Phytochem.42：1591-1593，1996)。
可可属可可的组织培养研究集中于体细胞胚胎发生，已在几个实验室中发展了该技术用于植物无性繁殖的目的。Esan在1977年第一个报道了可可属可可体细胞胚胎发生(Proc.5th Int.Cacao Res.Conf.1975.Ibadan：Cacao Res.Inst.Nigeria，1977：116-125，1977)，他描述了使用未成熟合子胚组织外植体的方法。后来其他人也报道了类似方法(Pence等，J.Am.Soc.Hort.Sci.104：145-148，1979；Villalobos& Aguilar，Abstr.VII Int.Congr.Plant Tissue and Cell Cult.，Amsterdam，Int.Assoc.forPlant Tissue Culture，pp 140，1990)。后来的研究集中于从包括叶(Litz，In Dimick，P.S.，编，Cacao biotechnology symposium.The Pennsylvania State University Press，University Park，PA，pp 111-120，1986)、珠心(Chatelet等，C.R.Acad.Sci.，Paris315：55-62，1992；Figueira & Janick，Acta Hort.336：231-238，1993；Sondhal等，Acta Hort.336：245-248，1993)及包括花瓣和雄蕊的花卉外植体(Lopez-Baez等，C.R.Acad.Sci.，Paris 316：579-584，1993；Alemanno等，Plant Cell Tiss.OrganCult.46：187-194，1996；Alemanno & Michaux-Ferriere，In Vitro Cell Dev.Biol.Plant33：163-172，1997)的体组织中发展组织培养方法。这些早期方法，尽管是成功的，并不适用于所有基因型，并且再生植物的频率较低。人们还发展了能繁殖更大范围基因型的更有效方法(Li等，In Vitro Cell Dev.Biol.Plant 34：293-299，1998；Maximova等，In Vitro Cell Dev.Biol.Plant 38：252-259，2002)。然而，当使用组织培养方法以生产体细胞胚胎时，所有已描述的方法均未给出饲养悬浮细胞的方法。
关于发展可可属可可的细胞培养只有有限数量的工作发表。这个工作绝大多数在1970’和1980’年间(Hall & Collin，Annals of Bot.39：555，1975；Jalal & Collin，Phytochem.16：1377-1380，1977；Jalal & Collin，New Phytol.83：343-349，1979；Tsai等，J.Food Sci.47：768-773，1982；Wen等，J.Am.Oil Chemist’s Soc.16：1720-1724，1984)。这些工作中，只有几个研究了可可属可可细胞培养物中的黄酮类。例如，Jalal和Collin(1979)报道了愈合组织和细胞悬浮物中的黄酮类组合物类似并且与最初完整子叶的黄酮类组合物相比变化少得多。两种组织培养物均含有(-)-表儿茶酸、无色花青素、咖啡酸和香豆酸。在组织培养物中检测不到甲基化嘌呤、可可碱和咖啡因。然而，Gurney等(J.Expt.Bot.43：769-775，1992)报道了可可属可可的愈合组织和悬浮培养物生产浓度约为那些体内发现的10％的咖啡因、可可碱和茶碱。
尚未有现有技术报道寡聚体原花青素的形成，近年来寡聚体原花青素已显示出最大的生物学效果。Jalal和Collin(New Phytol.83：343-349，1979)报道了在可可属可可细胞培养物中检测无色花青素。然而，基于用来检测化合物的方法，不可能鉴定无色花青素的性质或大小。另外，对可可属或Herrania其他种的组织培养方法未有描述。
发明内容
发展用于生成能生产高产量原花青素的细胞培养物的方法及发展用于从培养物有效抽提这些化合物的方法能显著提高这些有价值的化合物的生产，并且不需要发展新方法用于加工可可豆以降低原花青素损失的繁重任务。本发明描述了此类细胞培养物和方法。
本发明提供制备基本上无黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物的方法，该方法包括在足以导致可可多酚的生产的时间和条件下在悬浮培养物中生长可可属或Herrania细胞，并从细胞悬浮培养物中收获可可多酚。在本发明的方法的具体实施方案中，在足以导致可可原花青素(例如，寡聚体原花青素)的生产的时间和条件下在悬浮培养物中生长可可属或Herrania细胞，并且从细胞悬浮培养物中收获可可原花青素。在这些方法的实施例中，所得的可可多酚(或原花青素)制备物基本上(或在某些情况下完全)不含有可检测的咖啡因和/或可可碱。
本发明还提供了生产可可细胞的细胞悬浮培养物的方法。这些方法的实施例涉及在固体生长培养基上从不成熟可可属花卉外植体或从可可属营养物质中生长愈合组织；从可可属愈合组织培养物中选择快速生长的细胞系；并通过接种快速生长的细胞系于液体培养基起始细胞悬浮培养物。以实施例的方式，在某些情况下可可属可可不成熟花卉外植体选自退化雄蕊、萼片及花瓣基部外植体。在其他特定的、非限制性的实施例中，可可属营养物质选自年轻或成熟的叶、茎、分生组织、节点、或节间。
本发明还提供了用此处所述方法的任一个生产的基本上无黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物。在具体实施方案中，可可多酚制备物缺乏可检测水平的黄嘌呤生物碱(该制备物是无黄嘌呤生物碱的)。在其他实施方案中，在指数生长阶段的末期加入补充的葡萄糖到悬浮培养物增加了原花青素的生产。
在此涵盖的还有以所述方法任一个生产的可可属或Herrania细胞悬浮培养物，及这些细胞悬浮培养物用以生产可可多酚(例如原花青素)的使用。此处还提供了可可多酚制备物，包括可可多酚的混合物并且基本上不含有咖啡因和/或可可碱，该制备物是从可可属或Herrania细胞悬浮培养物中抽提得到。在特定的、非限制性的实施例中，可可多酚制备物包括原花青素(例如，寡聚体原花青素)并且基本上不含有咖啡因和/或生物碱。具体的、非限制性的实施方案中，在此所述的可可多酚能被用于饮食、化妆品、治疗或兽医组合物。
下面的说明中上述和其他对象、特征和优势将更加明显，下面的说明参考附图进行。
附图说明
图1是快速生长细胞系的照片。
图2是显示在不同接种密度的培养物中生物量密度的典型时相图。
图3是显示来自营养组织的所选健康细胞随时间推移的细胞生长和碳水化合物消耗的图。
图4是显示来自营养组织的细胞因为细胞选择过程随时间推移的原花青素生产改善的图。
图5说明了测定原花青素的丁醇-盐酸水解分析。原花青素的酸水解导致其分解为两个单体形式，颜色为粉红色的(-)-表儿茶酸和花青素。在每个样本中的粉色的强度代表了在不同细胞系中得到的原花青素量(图5A)。图5A中的方法被优化为96孔板形式用于快速筛选样本(图5B)。蓝色素在520nm吸收而表儿茶酸在280nm吸收(图5C)；从蓝色素吸收值来计算定量。
图6是来自可可属可可细胞培养物的原花青素和生物碱的系列色谱。图6A至6C代表不同的可信标准化合物的高效液相色谱LC-MS分析。图6D至6F显示可可属可可悬浮细胞的高效液相色谱LC-MS分析。
图7是显示MX1440-3496细胞系中由于添加补充葡萄糖的随时间推移的原花青素生产增强的图。
图8是未发酵可可抽提物(图8A)和悬浮细胞抽提物(图8B)以荧光检测器模式的系列高效液相色谱的色谱。标记1到12指示原花青素多聚化的程度，分别是：1、单体；2、二聚体；3、三聚体；4、四聚体；5、五聚体；6、六聚体；7、七聚体；8、八聚体；9、九聚体；10、十聚体；11、十一聚体；12、十二聚体。
图9是未发酵可可抽提物(图9A)和悬浮细胞抽提物(图9B)以PDA检测器模式在280nm的系列HPLC色谱。
图10是系列图，显示了在可可属可可细胞培养物中的原花青素生产力和产量及碳水化合物消耗。图10A和图10B阐明自非花卉和花卉组织的悬浮培养物的原花青素生产力(图10B)和生产量(图10A)。图10C显示对于原花青素生产力改善的细胞选择效应。图10D显示对于原花青素生产量改善的细胞选择效应。图10E显示在培养基XXVI中可可属可可细胞培养物的碳水化合物分析(表1)。
具体实施方式
I.缩写
2，4-D 2，4-二氯苯氧乙酸
2iP 6-(γ，γ-二甲基丙烯胺)嘌呤
B5 Gamborg’s B5
BA 苄基腺嘌呤
CP Chee和Poole
DKW Driver和Kuniyuki Walnut(Driver and Kuniyuki Walnut)
FAB/MS 快原子轰击/质谱
HCl 盐酸
HPLC 高效液相色谱
H2SO4 硫酸
IAA 吲哚乙酸
IBA 吲哚丁酸
LC 液相层析
LSIMS 液体二次离子质谱
MS 质谱
MS 培养基，
维生素，
或盐 Murashige和Skoog培养基，Murashige和Skoog维生素，或Murashige和Skoog盐
NAA 1-萘乙酸
NMR 核磁共振
NN Nitsch和Nitsch
PCV 细胞压积
PDA 光电二极管阵列
QL Quiorin和Lepoivre
RI 折射率
rpm 每分钟转数
SH Schenk和Hildebrandt
TDZ thisdiazuron
TLC 薄层层析
vvm 每分钟每体积培养物的气体体积
WPM McCown’s Woody植物培养基
II. 术语
除非另有说明，按传统用法使用技术术语。为方便综述本发明的多个实施方案，提供了下列特殊术语的解释：
抗氧化物是降低氧化损伤(由氧造成的损伤)如自由基造成的损伤的物质。
愈合组织是大量的薄壁、未分化植物细胞，是由创伤或在营养介质中培养发展而来。
儿茶酸是在植物中天然产生的多酚类化合物。它们也被称为黄烷-3-醇。
可可是可可属可可(梧桐目下)的种子并且主要由两个品种构成：Criollo和Forestero，分为若干亚种。被称为Trinitario的第三组是Criollo和Forestero的杂交。此处包括的其他种有(例如)大花可可树(Theobroma grandiflorum)、可可属obovatum(Theobroma obovatum)、可可属speciosum(Theobroma speciosum)、可可属subincanum(Theobroma subincanum)和可可属樟子松(Theobroma sylvestris)。
黄酮类是含有特征性三聚芳香杂环核的一组化合物中的任一个，通常产生为糖苷形式并在植物中广泛分布，经常作为色素。
多酚是水溶性植物色素，也被称为生物黄酮，其包括了超过4000个化学唯一的黄酮类化合物(可以根据其化学结构进行分类)。多酚单体包括儿茶酸、表儿茶酸、无色花青素。多酚寡聚体包括原花青素。
原花青素是由两个到多于五十个单位之间的偶联的儿茶酸单位构成的多聚体化合物。原花青素一般还被称为原花青素(proanthocyanidins)或浓缩单宁。
悬浮培养是个过程，通过该过程，原核或者真核细胞在可控的条件下于液体营养介质中生长。
组织培养是保持组织存活并生长于培养基的技术或过程。
黄嘌呤、黄嘌呤衍生物(3，7-二氢-嘌呤-2，6-二酮)，是一组生物碱，其通常被用于作为温和兴奋剂和支气管扩张药的效应。甲基化黄嘌呤衍生物包括咖啡因、副黄嘌呤、茶碱和可可碱(主要在巧克力中发现)。这些化合物抑制磷酸二酯酶和拮抗腺嘌呤核苷。
除非另作解释，在此使用的所有技术和科技用语与本发明所属领域内的普通技术人员通常所理解的具有相同含义。除非上下文另外明显说明，单数用语“a，”“an，”和“the”包括复数对象。类似地，除非上下文另外明显说明，单词“或”有意包括“和”。因此“包括A或B”意思是包括A、或B、或A和B。尽管类似于或等同于在此所述那些的方法和材料可被用于实践或试验本发明，下面描述了适当的方法和材料。在此提及的所有文献、专利申请、专利及其他参考以其整体引入作为参考。在冲突的情况下，本说明书、包括术语的解释，将被采用(control)。此外，材料、方法和实施例仅作说明而无意限制本发明。
III. 几个实施方案的概述
此处第一个实施方案中提供制备基本上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物的方法，该方法包括在足以导致可可多酚生产的时间和条件下于悬浮培养物中生长可可或Herrania，并从细胞悬浮培养物中收获可可多酚。在此方法的实施例中，产生的可可多酚制备物基本上(或在某些情况下完全地)没有可检测的咖啡因和/或可可碱。在其他特定实施例中，制备物含有少于50％水平的(如发酵豆荚所制造的可可多酚制备物中含有的)咖啡因和/或可可碱。在优选实施方案中，细胞培养物生成的制备物含有(如发酵豆所制造的可可多酚制备物中含有的)少于30％、少于20％、少于15％、少于10％、或少于5％水平的咖啡因和/或可可碱。在本发明方法的具体实施方案中，在足以导致可可原花青素(例如，寡聚体原花青素)的生产的时间和条件下于悬浮培养中生长可可或Herrania(Herrania)细胞，并从细胞悬浮培养物中收获可可原花青素。
在此处提供的代表性方法中，通过在固体生长培养基上生长愈合组织(愈合组织来自不成熟的可可或Herrania花卉外植体或来自可可或Herrania营养物质)、从可可或Herrania愈合组织培养物中选择快速生长细胞系及通过接种快速生长细胞系于液体培养基中来起始细胞悬浮培养物来生产可可或Herrania细胞悬浮培养物。
在某些提供的方法中可可多酚(包括原花青素)的生产包括：收获细胞；在适当的溶剂中搅匀细胞生物质以抽提富含多酚部分；分离富含原花青素部分(如使用溶剂-溶剂萃取和/或层析)；及可选地干燥或浓缩原花青素部分。在某些情况下，收获细胞包括离心、过滤、或其组合。
还提供了用此处所述方法任一个生产的基本上不含黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物。通过实施例的方式，如果可可多酚制备物含有少于2％的可可碱和少于0.5％的咖啡因，即可认为其基本上不含黄嘌呤生物碱。在特定的非限制性实施例中，如果可可多酚制备物含有少于1.5％、少于1％、少于0.5％或0％的可可碱和/或含有少于0.25％、少于0.2％、少于0.1％或0％的咖啡因，可认为其基本上不含黄嘌呤生物碱。在另一实施例中，如果可可原花青素制备物含有少于2％的可可碱和少于0.5％的咖啡因，即可认为其基本上不含黄嘌呤生物碱。在特定的非限制性的实施例中，如果可可多酚制备物含有少于1.5％、少于1％、少于0.5％或0％的可可碱和/或含有少于0.25％、少于0.2％、少于0.1％或0％的咖啡因，可认为其基本上不含黄嘌呤生物碱。最理想的基本上不含黄嘌呤生物碱的水平是0％可可碱和0％咖啡因(制备物是无黄嘌呤生物碱的)。
还有另一个实施方案是生产可可细胞的细胞悬浮培养物的方法。此方法的实施例包括：在固体生长培养基上生长愈合组织(愈合组织来自不成熟的可可或Herrania花卉外植体或来自可可或Herrania营养物质)；从可可或Herrania愈合组织培养物中选择快速生长细胞系；通过接种快速生长细胞系于液体培养基中来起始细胞悬浮培养物。通过实施例的方式，在某些情况下不成熟可可属可可或Herrania花卉外植体选自退化雄蕊、萼片和花瓣基部外植体。在其他特定的非限制性的实施例中，可可属可可或Herrania营养物质选自年轻或成熟的叶、茎、分生组织、节点、或节间。
可选地，生产可可细胞的细胞悬浮培养物的方法还包括在烧瓶、任何适当的培养容器或生物反应器中生长细胞悬浮培养物。例如，在某些情况下在容器或生物反应器中并以分批、分批添料或连续模式实现生长。
此处涵盖的还有通过所述方法任一个生产的可可或Herrania细胞悬浮培养物，以及这些细胞悬浮培养物用以生产可可多酚或(更特定的)原花青素的使用。
本发明提供的另一实施方案是包括可可多酚混合物、且基本上天然不含咖啡因和可可碱的可可多酚制备物，该制备物抽提自可可或Herrania细胞悬浮培养物。以实施例的方式，如果可可多酚制备物含有少于2％的可可碱和少于0.5％的咖啡因，即可认为其基本上不含咖啡因和可可碱。在特定的非限制性实施例中，如果可可多酚制备物含有少于1.5％、少于1％、少于0.5％或0％的可可碱和/或含有少于0.25％、少于0.2％、少于0.1％或0％的咖啡因，即可认为其基本上不含黄嘌呤生物碱。最理想的基本上不含黄嘌呤生物碱的水平是0％可可碱和0％咖啡因。参考“基本上天然不含咖啡因和可可碱”的术语“天然”表明咖啡因和可可碱的相对缺乏不是经由纯化步骤(如LH-20体积排阻层析)产生。在其他实施方案中，在指数生长阶段末期加入补充的葡萄糖到悬浮培养物中增加了原花青素生产。
又一实施方案是可可多酚制备物，该制备物生产不经过使用正己烷或其他有机溶剂的脱脂步骤。因此，此处涵盖的是不使用正己烷生产(如抽提)的可可多酚(例如原花青素)的制备物。
在特定实施方案中还提供了可可多酚制备物，其中从可可属或Herrania细胞悬浮培养物中抽提包括：收获细胞，在适当的溶剂中搅匀细胞生物质以抽提富含多酚部分，分离富含原花青素部分(如使用溶剂-溶剂萃取和/或层析)，及可选地干燥、冻干、或浓缩原花青素部分。例如，收获细胞可以包括离心、过滤、或其组合。
可以理解此处提供的可可多酚制备物可以用在膳食组合物、和/或治疗组合物、和/或兽医组合物、和/或化妆品组合物中。
还可以理解此处所述的和/或用此处所述方法生产的代表性制备物含有包括儿茶酸、表儿茶酸和原花青素寡聚体的可可多酚。在特定实施例中，寡聚体是二聚体直至十二聚体。例如，在某些制备物中，寡聚体包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或其任意两个或更多个的混合物。
还可以理解其中可可多酚是可可原花青素的制备物。
此处提供的可可多酚制备物可以液体形式、干燥形式或干粉形式提供。
IV.可可组织培养
在此所述的是用于从可可属或Herrania细胞培养物中有效分离原花青素的方法。特别是，已建立了可可属或Herrania细胞悬浮培养物，该培养物使得与抽提自可可豆的原花青素类似的原花青素能够常规分离。而且，在此提供的方法导致了这些原花青素的多产的细胞培养物来源的生产。这些方法的代表性优势包括：
●由于控制气候条件的可靠而持续的生物质来源
●在抽提过程中最小化原花青素降解的快速而有效的分离步骤
●在组成上从细胞培养物分离的原花青素类似于从可可豆分离的那些原花青素
●用于操作并优化细胞培养物原花青素生产力的技术
一般来说，在此所述的是从可可属或Herrania植物的不同组织建立愈合组织培养物。建立的愈合组织被用于使用不同类型的细胞培养介质饲养悬浮培养物。当已建立稳定的悬浮细胞培养物时，抽提细胞并通过可识别光谱方法分析原花青素含量，而使用HPLC-MS方法来鉴定单独的原花青素。自这样的分析，选择能生产所需的原花青素的悬浮培养物来进一步优化生产力。
生成可可培养物
在此一般性概述生成可可培养物的过程，并在实施例中描述详细的范例方法。简单讲，尽管本领域技术人员可以根据已知变化变动具体细节，但对于体细胞胚胎发生，可以如所述通过自来源于不同植物部分(例如，花卉组织如花瓣、萼片、雄蕊等，或非花卉营养组织如节点、节间、年轻叶、成熟叶)的外植体建立愈合组织和悬浮培养物以实现原花青素生产细胞培养物的起始。通过定期转移部分培养细胞到新鲜培养基中，在新鲜悬浮培养基中维持悬浮培养物。通过细胞生长性能和培养基中的糖消耗来确定转移计划和接种密度。
一实施方案提供了改变原花青素含量的方法，该方法涉及在足以起始这样的培养物的条件下起始原花青素生产的培养，及建立足以用于建立生产型细胞培养物的生产培养基，随后是在一段合适的时间内按比例增加生产型细胞培养物以分离原花青素。相应地，改变起始培养或建立生产型培养所需的条件能导致在此培养物中原花青素含量(量)的改变。可以改变植物细胞培养物微环境中的物理方面(例如，光辐照度)和/或化学方面(例如，介质组成或化学诱导子)以实现想要改变的含量。
例如，为了增加培养物中的原花青素量，可以增加悬浮培养基中的碳水化合物(如蔗糖或葡萄糖)浓度。此外，可以操作氮源(如硝酸铵)来生产植物细胞培养物中的次级代谢物(见Neera等，Phytochemistry.31(12)：4143-4149，1992)。因此，降低可可属或Herrania细胞培养基中的氮源浓度可以被用以增加培养物中原花青素的生产。此外，注入某些氨基酸(如谷氨酸、甘氨酸和丝氨酸)也可能显著影响次级代谢物的生产。结果是，为了增强原花青素的生产，可以增加可可属或Herrania悬浮培养基中的这些氨基酸的浓度。其他氨基酸也可以包括在培养基中，并且检验其增加可可属或Herrania悬浮培养物的原花青素生产的能力。
为了实现改变可可属或Herrania细胞培养物中的原花青素含量，也可以改变光照条件。例如，通过增加辐照或曝光长度来改变光照，因而增加原花青素生产。还可以改变光辐照的波长以实现增加原花青素生产。例如，已知紫外光能诱导植物细胞培养物中的花青素生产(Meyer，J.Biotechnology 93：45-57，2002)。
本领域内已知的用于操作植物细胞培养物微环境的其他修改也涵盖在本说明书的范围内，并且本领域内任何技术人员均可完成修改。
从培养物中收获可可细胞
如在此所述生长一批生产原花青素的可可属或Herrania细胞，并且收获细胞以抽提原花青素。可以此处描述的多种方法，实施例完成收获悬浮细胞。
一旦细胞培养物到达稳定期并达到所需的原花青素生产力，允许培养物在容器中沉淀成紧密的一团并且能够轻轻倒掉培养基，留下大部分为固体的细胞生物质。然后洗涤细胞生物质以去除残留的培养基并类似地轻轻倒掉。或者，可以离心细胞悬浮并丢弃上清(培养基)，然后洗涤细胞质并再次离心以丢弃液体。第三个选择是过滤细胞培养物悬浮以去除培养基。这些方法的任何一个可以使用在从几毫升到生产级体积的几千升培养物不等的细胞培养物体积。
抽提步骤
粉碎、研磨或磨碎收获的细胞质以匀质化细胞质，并且破碎细胞以使得抽提溶剂能与样本更好地接触，和保证提取的部分是代表整个样本的。
原花青素是不稳定化合物。因此，如果在抽提前需要储存细胞生物质，优选冷冻储存，例如通过用液氮冷冻。
除了几个主要的差异，从可可属或Herrania细胞培养物中抽提总多酚类似于从可可豆中抽提总多酚所用的步骤。在可可豆的情况下，磨碎豆之后的起始步骤是去除磨碎的片(碎粒)中的脂肪。此过程导致了多酚的损失。因为细胞培养物没有豆子那么多的脂肪，因而不需要这个步骤。自细胞培养物抽提过程中去除此步骤降低了多酚的损失。
而且，脱脂需要如正己烷的溶剂，并且在最终抽提物中发现有痕量溶剂。这导致了在自可可豆生产的抽提物中有难闻的气味，并且溶剂可能是有毒的或不能用在某些用途(如食品配料)。因为此处所述的自细胞培养物生物质抽提的方法排除了使用溶剂(如正己烷)，在所得的抽提物中没有溶剂污染或难闻的溶剂气味。
从磨碎、匀质化的细胞中，代表性方法中的多酚以70％到80％甲醇水溶液或70％丙酮水溶液、或其组合来抽提。也能使用水和乙醇，尽管使用这些溶剂只能部分抽提寡聚体原花青素，而根本不能抽提高分子量聚合物(Grayer，In J.B.Harborne，Plant Phenolics (Vol.1)，pp 283-323，1989.San Diego，Academic Press，Inc.；Lee & Widmer，In L.M.L. Nollet，Handbook of Food Analysis(Vol.1)，pp821-894，1996，Basel，New York，Hong Kong，Marcel Dekker，Inc.)。
在彻底抽提次要组分之后，单独的原花青素可能以稀释水平存在于抽提物中，在低温(40℃以下)和在减压下实现浓缩以最小化原花青素的降解(Lee & Widmer.In L.M.L.Nollet，Handbook of Food Analysis(Vol.1)，pp 821-894，1996，Basel，New York，Hong Kong，Marcel Dekker，Inc.)。
在此阶段自可可属或Herrania细胞培养物的多酚抽提物相对干净，能立刻对其进行分析。此处所述方法的一个益处在于，与豆子的多酚抽提物相比，来源于可可属或Herrania细胞培养物的多酚抽提物的杂质(例如，咖啡因和可可碱)开始就为检测不到的水平。然而，做进一步的清理以去除细微杂质(如咖啡因和可可碱)是有益的。有可能清理抽提物以去除甚至是痕量的这些杂质。此清理步骤可包括以非互溶溶剂所作的液-液分部和在葡聚糖LH-20、聚酰胺、AmberliteXAD-2、制备型HPLC上的柱层析，及使用可购得一次性针筒的固相抽提(SPE)(Grayer，In J.B.Harborne，Plant Phenolics (Vol.1)，pp 283-323，1989.San Diego，Academic Press，Inc.；Markham & Bloor，In C.A.Rice-Evans and L.Packer，Flavonoids in Health and Disease，pp 1-33，1998，Basel，New York，Hong Kong，Marcel Dekker，Inc.)。通常通过以氯仿或二氯甲烷抽提实现可可碱和咖啡因的去除，因为多数黄酮类化合物在这些溶剂中溶解度有限。
分析步骤
用于检测和鉴定自可可属或Herrania细胞培养物得来的原花青素的分析技术与用于豆的抽提物的那些类似。主要使用多种层析技术分离寡聚体及随后使用独立的方法进行结构鉴定来实现可可原花青素的鉴定。Quesnel(Phytochemistry 7：1583-1592，1968)和Jalal与Collin(Phytochem.16：1377-1380，1977)分别使用了纸层析和薄层层析法鉴定了可可中的原花青素。然而，尽管这些文献承认了原花青素存在于可可中，但未阐明原花青素的立体结构。Porter等(Phytochemistry 30：1657-1663，1991)用柱层析、薄层层析、高效液相色谱及阴离子快原子轰击/质谱对可可原花青素进行了严格的调查，从而发现了原花青素寡聚体直至七聚体的存在。此外他们使用核磁共振证实了原花青素直至四聚体的结构，并发现它们主要由(-)-表儿茶酸构成。Clapperton等报道了可可原花青素寡聚体直至八聚体的证据(Proceedings，16th International Conference of Groupe Polyphenols，Lisbon，Portugal；Groupe Polyphenols：Norbonne，France，Vol II，pp 112-115，1992)，他们使用柱层析、反相高效液相色谱及阳离子液体二次离子质谱的组合来鉴定原花青素寡聚体。此工作阐明了使用阳离子液体二次离子质谱及使用钠加合物作为鉴定大一些的原花青素寡聚体的方法。不幸的是，所有这些方法都很费力，需要较长制备时间以获得结构信息，并且经不起大量细胞培养物样本的高通量分析和筛选。而且，这些方法不适用于小样本。
对于本发明，我们发展了高通量微量方法用于自可可属或Herrania细胞培养物中抽提原花青素，反相高效液相色谱法用于原花青素单体和寡聚体的快速分离，及质谱(MS)法用于基于其分子特征对原花青素寡聚体进行同步鉴定。
可可属或Herrania细胞培养物的大规模过程优化
在改进工业用过程时大规模植物细胞培养是个重要的技术。这可以在类似于微生物发酵所用的那些大罐中进行。通过基于大规模过程中的细胞生长和生产特征确定生物分子因素、及通过优化能增强原花青素生产力的大规模生物过程变量，可以实现这些罐中生产力的增长。生物分子因素包括培养基成分、诱导子和生物合成途径中的前体。在大规模过程之前，应该在烧瓶规模的过程中检验这些因素，因为放大过程的目的在于大规模复制在小规模下观察为最适的那些条件。然而，大规模生物反应器培养中的条件与烧瓶规模培养可可属或Herrania悬浮细胞不同。由运输限制导致的影响悬浮细胞的环境条件改变会影响培养物的宏观动力学。例如，当生长动力学参数是规模不依赖的，在容器中细胞培养物的总体生长是规模依赖性的，因为气体和溶解的营养物质和代谢产物的运输具有规模依赖性(Dicosmo & Misawa，Plant Cell Culture Secondary Metabolism，pp 11-44，1996.BocaRaton，Florida，CRC Press LLC)。因此，在放大可可原花青素生产的生物反应器过程时，要完成许多基础实验以获得生长率、产物形成速率、营养物质吸收速率及呼吸率的重要数据。
一般来说，通过增加细胞浓度和特定生产力，能够实现植物细胞培养物中的高生产力。最大细胞浓度依赖于营养供给、每底物的生物质产量和水含量。基于基础数据，可以逐一变动另外的环境因素或同时变动多个因素以增加生物量。生物过程变量如通气量、悬浮培养的流变性能影响着生物反应器中的传质与混合，并且反过来不仅影响细胞生长而且影响植物次级代谢物的生产。因此，可能要考虑两步培养，因为多数多酚通常是非生长相关的化合物。因为一步过程理论上将培养限制成单一生长速率并且可能为单一发展阶段，当几个发展阶段是生产非生长相关化合物的前提条件时，这个操作将不适合。分开优化生长阶段和生产阶段的通气率、搅拌速度、其他混合相关变量及甚至培养基组合物。然而，不可能放大过程而保持所有条件最适化。对于被认为是最重要的变量必须做出选择。
因为碳源和氮源的相对量在增强次级代谢物生物合成和细胞生长中发挥了重要作用，基于碳和氮消耗的基本工程学数据，还研究了补充碳源和氮源对于生长和生产的效果(Basaria，Current Biology，2：370-374，1990)。然后，可以研究氧和二氧化碳的补充。除氧以外，已有报道二氧化碳能改善植物细胞培养物中的细胞生长和次级代谢物生产(Thanh等，Biologia Plantarum，50：752-754，2006；Tate & Payne，Plant Cell Reports，10：22-25，1991)。在细胞生长阶段植物细胞的氧需求相对低，但是在代谢物合成期间可能显著增高。为了在可可属或Herrania细胞的反应器培养中达到其最佳使用，控制了这些气体的水平。在大规模发酵中，不可能引入与实验室规模引入的同样量的气体(空气、氧等)。因此，为了在生物反应器过程中使得表观气速恒定，应维持传质系数的常数。
使用诱导子以刺激代谢物形成和分泌是重要的过程策略。它曾有效用于降低达到高产物浓度(如体积生产力)所需用的过程时间。而且，诱导可以导致新化合物的形成(Payne等，Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems，pp333-351，1995，New York，John Wiley & Sons，Inc)。在大规模反应器培养中检验具有几个生物/非生物备选物的诱导的优化，以优化应处理诱导剂的时间、最佳的剂量、细胞暴露于诱导剂的时长及应收获细胞的时间。因为每个诱导剂能诱导生物合成途径中不同类型的酶，还检验了使用多重诱导剂处理的协同效应以增强生产力。
反应器操作方法依赖于细胞生长、生产及其关系的动力学。如之前所述，在此研究中的靶标化合物是非生长相关的，这意味着必须考虑二步培养过程。因此，当生产时间大大长于生长生物量所需的时间时，分批补料培养是特别吸引人的选择，并且在此情况下，随后的生物反应器的体积的更大升级是可能的，会导致生物量列车中生物反应器的数目较少。
V.原花青素的用途及施用
本发明方法生成的原花青素可以为治疗、膳食或化妆品目的施用于受试者。受试者可以是人类或兽类哺乳动物(如猴子、马、奶牛、猪、狗、猫、小鼠或大鼠)。
关于治疗用途，可以使用原花青素来治疗或预防若干失调或疾病，如动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、血压变化和/或高血压。例如，可以预防性地给有发展成肿瘤风险的受试者、给患有肿瘤的受试者或给之前治疗过肿瘤的受试者施用原花青素。肿瘤治疗包括但不限于手术去除肿瘤、化疗、免疫治疗或放疗。在其他实施方案中，通过在本发明方法生成的原花青素与至少一个其他试剂组合(或者在肿瘤治疗之前、或者同时、或者之后)施用于受试者。其他试剂也可以是在此所述的抑制或降低肿瘤生长的另一试剂。或者，其他试剂可以是在治疗肿瘤过程期间改进受试者抑制肿瘤生长的能力的试剂或帮助受试者抵抗感染的试剂(如抗生素)。例如，其他试剂可以是刺激免疫系统的试剂，如细胞因子。
通过在此提供的方法生成的原花青素可以施用于有发展任何类型肿瘤风险的受试者，或施用于患有任何类型肿瘤的受试者。肿瘤可以是良性肿瘤或恶性肿瘤。肿瘤可以包括癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、或神经系统的肿瘤。在几个特定的非限制性实施方案中，肿瘤包括乳腺肿瘤、肝脏肿瘤、胰腺肿瘤、消化道肿瘤、结肠肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、睾丸肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、视网膜肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、骨肿瘤、骨肉瘤、鼻咽癌肿瘤、甲状腺瘤、白血病、或淋巴瘤。一般来讲，通过在此提供方法生成的原花青素以足以用于预防或抑制肿瘤生长的量施用于受试者。
在其他实施方案中，可以预防性地施用原花青素于有发展成动脉粥样硬化、心血管疾病或高血压风险的受试者。或者，可以施用原花青素于受试者以治疗已有的疾病(如动脉粥样硬化、心血管疾病或高血压)。组合物可以与其他试剂一起施用或顺序施用(其他试剂，如抗肿瘤试剂、抗氧化剂、或者缓解与动脉粥样硬化、心血管疾病、血压改变和/或高血压相关的症状或病征的试剂)。
此外，本发明方法生成的原花青素能用在膳食组合物中。当以液体形式口服施用时，液体可能是基于水的、基于奶的、基于茶的、基于果汁的或其某些组合。用于内部施用的固体和液体配方还包括增稠剂、甜味剂。
本发明方法生成的原花青素还可用在化妆品组合物中以改善受试者皮肤的质量或外观。通过外用、内用或其组合施用原花青素组合物能实现皮肤外观、纹理和湿度的改善。可接受的载体可以作为用于组合物成分的溶剂、载体、稀释剂或分散剂起不同作用，并使得成分能以合适的稀释程度统一用于皮肤表面。可接受的载体也可以有利于组合物渗透进皮肤。
含有本发明方法生成的原花青素的组合物能用于很多种的终产物(包括医药产品、食品产品和饮料组合物)，并可按照医药领域内那些技术人员所熟知的标准技术制备。取决于所选的特定施用模式，包括活性试剂的医药组合物能够与合适的固体或液体载体配制。用于本发明的医药可接受的载体和辅料是常规的。例如，肠外配方通常包括可注射液体，该液体是医药上及生理上可接受的液体媒介(如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等)。包括的辅料有(例如)其他蛋白质(如人血清白蛋白或血浆制备物)。如需要，待施用的原花青素组合物也可以含有微量的无毒辅助物质(如润湿或乳化剂、防腐剂、及pH缓冲剂等)，例如醋酸钠或山梨醇单月桂酸酯。
除可注射液体之外，可以使用外用和口服制剂。口服制剂可以是液体(例如，糖浆、饮料、溶液、或悬浮液)、或固体(例如，粉末、丸剂、片剂、或胶囊)。对于固体组合物，传统无毒固体载体可包括医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。外用制备物可包括眼药水、软膏、霜剂、喷雾剂等。优选地，适用于外用施用的本发明制剂与组合物成分的溶剂、载体、稀释剂或分散剂相混合，并使得成分能以合适的稀释程度统一用于皮肤表面。可接受的载体也有利于组合物渗透进皮肤。
通过所选施用模式确定原花青素组合物的剂型。制备这样的剂型的实际方法对于本领域技术人员来讲是已知或显而易见的。
通过本发明方法生成的原花青素组合物可被施用于人类或兽类哺乳动物，在它们的细胞内组合物以多种方式(如外用、口服、静注、肌注、腹腔注射、滴鼻、皮内注射、鞘内注射和皮下注射)发挥效果。本领域技术人员考虑到案例的特殊情况(例如受试者、疾病、涉及的疾病状态和是否是预防性治疗)来选择施用的特殊模式和给药方案。治疗可以包括在几天到数月、或甚至数年的时期内每日或每几天给与一定剂量的化合物。
这样的组合物可以一定剂量并通过医药、营养或兽医领域技术人员熟知的技术施用给需要此施用的受试者，考虑到诸如特殊受试者的年龄、性别、体重和疾病状况及施用方式等因素。
用于医疗、膳食、化妆品和兽医用途的组合物的制备、剂量和施用在领域内众所周知(见，例如，美国专利号5,554,645、5,853,728、6,194,020、6,312,753、6,998,417、7,122,574、7,314,634、7,320,797和美国专利申请文献号2007/0148107，所有这些在此引入作为参考)。
提供下列实施例以阐明某些特殊功能和/或实施方案。这些实施例不应解释为限制本发明为所述的特定技术特征或实施方案。
实施例
实施例1.可可属可可愈合组织自花卉组织的诱导和增殖
在可控条件下使用[D+]-葡萄糖作为碳源，使用以生长素(2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))、细胞分裂素(0.005mg/L thisdiazuron(TDZ))及其他添加物(250mg/L L-谷氨酸、100mg/L肌醇)增强的完全Driver和Kuniyuki walnut(DKW)培养基，建立了紧密愈合组织聚集(表1中培养基I)。在调节pH至5.8之后，以高压灭菌消毒培养基。从若干栽培植物中收集可可属可可的不成熟花卉材料样本。为防止培养物的污染，在加入至培养基之前将材料进行表面消毒。首先将材料浸泡于1％(w/v)次氯酸钠中20分钟并每5分钟轻轻搅动一次。在灭菌条件下将材料轻轻倒出并以灭菌去离子水润洗三次并在每次润洗期间轻轻搅动。轻轻倒去最后的润洗液，并且仅转移花蕾至灭菌Petri板。用消毒的解剖刀从基部起在花长的1/3位置处切过花蕾。从切口端的开口处提取雄蕊、萼片和花瓣基部外植体。
放置提取的材料于固体愈合组织诱导培养基。在每个平板的整个表面上分布大约50个外植体。用封口膜密封Petri平板并在25℃维持其在黑暗中14天。10天后可观察到主要的愈合组织的形成。在放置花的部分于愈合组织诱导培养基的14天内，从外植体分离出愈合组织并放置于表1所列培养基I、II和III的愈合组织增殖培养基上。每隔四个星期，从愈合组织的表面分离出快速生长的细胞并分培于新鲜培养基。选择显示为发白到淡黄色的快速生长细胞系用来分培(图1)。
实施例2.可可属可可愈合组织自营养组织的诱导和增殖
在添加了生长素(2mg/L IAA和4mg/L IBA)、细胞分裂素(0.005mg/L TDZ)及L-谷氨酸(250mg/L)和葡萄糖(20g/L)作为碳源的Murashige和Skoog(MS)培养基中建立了愈合组织(表1，培养基XXVII)。在调节pH至5.8之后，以高压灭菌消毒培养基。从若干温室生长植物中收集可可属可可的营养材料样本(年轻和成熟的叶、节点和节间)。为防止培养物的污染，在加入至培养基之前将材料进行表面消毒。首先将材料浸泡于70％乙醇中1分钟，然后浸入25％漂白剂中10分钟并每5分钟轻轻搅动一次。在灭菌条件下将材料轻轻倒出并以灭菌去离子水润洗三次并在每次润洗期间轻轻搅动。将叶子切成5毫米正方形，而节点及节间切成1-2毫米圆柱体，并外植于含固体培养基的平板上。在25℃、黑暗中维持平板。每天观察其污染的迹象并丢弃污染的材料。在四周后观察到愈合组织形成。六周之后，自外植体分离出愈合组织并放置于如上面所述及培养基XXVII(表1)所显示的愈合组织增殖培养基上。然而，起始后，愈合组织非常快地增殖和建立。从愈合组织的表面分离新形成的细胞并以每两周的间隔分培于新鲜培养基。选择显示为淡黄色到浅褐色的快速生长细胞系进行分培。
在建立可可愈合组织之后，有必要检验较低量的生长素对于愈合组织可持续性的效果，因为培养基XXVII中的高生长素含量在延迟细胞生长并在后代中形成深棕色愈合组织，显示了细胞正在经受压力。检验不同培养基维持可可愈合组织的能力以及维持培养基对于细胞悬浮创建的下游效应。培养基XXVII在MS培养基中添加有6mg/L生长素(2mg/L IAA和4mg/L IBA)、2X MS维生素及250mg/L谷氨酸及20g/L葡萄糖和7g/L琼脂。用于维持时，将培养基中的生长素降低至4mg/L(2mg/L IAA和2mg/L IBA，表1中培养基XXVIII)和2mg/L生长素(以IBA形式，表1中培养基XXIX)。
降低生长素至4mg/L改善了愈合组织的颜色，从深褐色到浅褐色直至黄色。愈合组织细胞生长重回到旺盛的水平。建立细胞悬浮培养和从培养基XXVII上分培的健康愈合组织建立的那些一样容易。
在含2mg/L生长素的培养基中愈合组织的颜色变化并且细胞生长恢复到旺盛的水平。然而，与培养基XXVIII中的愈合组织相比，当这些愈合组织分培于同样培养基时，愈合组织的细胞生长降低。
在降低生长素至2mg/L之后，也记录了去除过量MS维生素(表1中培养基XXX)连同去除谷氨酸(表1中培养基XXXI)对于生长的效果。来自这两种培养基的愈合组织与来自培养基XXIX的愈合组织的生长特征看起来并无不同。然而，注意到在培养基中存在过量维生素对于生产原花青素是有利的。用于维持可可营养愈合组织的最好的培养基是培养基XXVIII，因为此培养基使得愈合组织能长期持续、还使得细胞悬浮能容易地建立并且原花青素生产力能够维持。
实施例3.大花可可树和可可属obovatum愈合组织的诱导与增殖
使用如实施例1和2中所述可可属可可所用的那些方法建立大花可可树和可可属obovatum的愈合组织培养。
实施例4.悬浮的起始
通过接种自实施例1中所述的花卉外植体获得的白色新鲜愈合组织于125mlErlenmeyer烧瓶(含有25ml二十种不同液体培养基，培养基IV-XXIII；表1)，建立了细胞悬浮培养。以硅泡沫帽盖住烧瓶，并在恒温控制的房间内、在24±1℃、完全黑暗的条件下以120rpm搅动加旋转摇动54天。如认为必要，每周或每两周转移分培。保留形成为粒状或细胞细小悬浮的培养物，而丢弃不形成悬浮培养物的培养物。在14天细胞生长之后，转移10％(v/v)细胞于含有25ml新鲜培养基的新125ml烧瓶并此后每两周分培一次。培养基VIII显示在悬浮细胞起始中对于细胞繁殖有最佳性能(在第14天达45％PCV)。
为培养非花(营养)组织(节点、节间、年轻叶、成熟叶)，以类似于上述用于花卉外植体的方式转移实施例2中生成的愈合组织于液体培养基。所用培养基是培养基XXIV，就盐类型而言，该培养基与常规维持培养基VIII不同(MS盐，而非DKW盐，含有更多铵和氮源及更少硫酸盐)，并且包括2mg/L IAA和4mg/LIBA作为代替2，4-D的生长素(表1)。在此培养基中，建立悬浮培养更快，并且愈合组织在七天内消耗了培养基中的所有糖，而对于培养基VIII中起始的愈合组织则通常要用2到3周来消耗全部碳水化合物源。这些建立的非花组织悬浮的原花青素生产力也比得自花卉组织悬浮的生产力高(1.1克总原花青素/升培养物)(图10A和10B)。
实施例5.悬浮细胞生长
此实施例描述用于增加悬浮细胞生长的方法。
细胞培养物生产力增长是细胞生长速率和细胞生长停止时的密度的作用。为了确定最适接种密度，以开始细胞密度的10％、15％和20％(v/v)起始可可属可可细胞的悬浮培养并使其生长14天。图2显示接种密度起作用下的生物量密度的典型时程。以细胞密度的10％起始的培养物显示出生长的显著滞后，并且在14天内未达到最大密度。在培养基VIII中以细胞密度的15％和20％起始的培养物在13天内密度翻倍并且在14天内达到最大平均细胞密度40-43％。然而，在细胞选择过程之后，在第14天某些培养物显示出超过50％-60％的细胞压积(PCV)。
除了培养基VIII不含有Phytagel以外，培养基VIII和培养基I是相同的处方。这两种培养基均以DKW盐和维生素为基础，使用能导致培养基成分的批次间差异的几个储存液配制而成。因而，使用预混合的DKW基础盐(PhytotechnologyLaboratories，LLC，目录#D190)创建培养基XXXII并且比较了培养基VIII和XXXII之间的悬浮细胞生长。在任一培养基中细胞生长均没有显著差异。因此，日常使用培养基XXXII来维持悬浮培养物。
以大花可可树和可可属obovatum完成了类似研究。细胞培养物生产力增长是细胞生长速率和细胞生长停止时的密度的作用。为了确定最适接种密度，以开始细胞密度的10％、15％和20％(v/v)起始大花可可树和可可属obovatum细胞的悬浮培养并使其生长14天。
一般来讲，以更高密度起始的培养物具有更短的生长期或更早地到达最大细胞密度。以细胞密度的10％起始的培养物显示出生长的显著滞后，并且在14天内未达到最大密度。以细胞密度的15％和20％起始的培养物在13天内密度翻倍并且在14天内达到最大平均细胞密度为40-43％。此生长率比之前所报道的其他植物细胞悬浮培养物(如红豆杉(Taxus sp))生长率更低。然而，通过进一步优化生长培养基和如下面实施例6所述的严格细胞选择，可以提高可可属细胞培养物的细胞生长。
实施例6.自营养细胞悬浮培养物创建同种细胞系的细胞选择过程
新创建的细胞悬浮培养物一般是异质性的细胞混合物。此异质性导致了大规模悬浮培养物中不平衡的细胞生长和所需代谢物的不稳定生产模式。通过分培和选择具有所需特征的培养物，可以从这些异质性混合物中衍生适用于大规模生产的同种细胞培养物。发展选择性的和快速的筛选检测多酚和细胞生长以辅助此过程。使用实施例8所述的丁醇-盐酸水解法来监控多酚累积，并且使用细胞压积(PCV(％)＝细胞体积×100/总培养物体积)作为生物量的衡量。通过折射率(Brix％)测定碳水化合物消耗速率作为细胞代谢的衡量。
如实施例2和4所述从愈合组织中得到营养组织(节点)衍生的悬浮培养物。选择一个生长很好的细胞系(MX1440-3496)并在三种不同培养基中生长，三种培养基在基础培养基类型(DKW盐对MS培养基)和激素类型和数量(表1中的培养基XXXII、XXXIII和XXXIV)上不同。培养基XXXIII和培养基XXXIV中的细胞压积(PCV)在第七天时只有33.7±4.7％和25.7±4.0％，比培养基XXXIII(47.6±6.6％)显示生长更慢。细胞生长率对于最大化细胞培养过程中的体积生产力非常重要。在以所费培养基的折射率(RI)所测定的碳水化合物消耗率上培养基XXXIII也是更好的。因此，选择此培养基作为MX1440-3496细胞系进一步细胞选择过程的维持培养基。
在每次分培时，优选非块状或不形成聚集体的生长良好的、细小细胞以提高体积生产力并消除聚集细胞，因为选择大的或块状的细胞聚集物导致糟糕的培养性能。因此，所选细胞主要是黄色细小细胞的形态，而且细小悬浮培养物导致同种悬浮培养的更好的生长和生产。MX1440-3496细胞系开始以超过10天的倍增时间生长，而在进行细胞选择过程后倍增时间显示为降低到5天(图3)。在细胞选择过程之前总原花青素生产水平开始是0.5g/L PCV，但随着细胞选择过程进行增加了8.9倍(4.7g/LPCV)(图4)。
实施例7.自可可属愈合组织培养物和悬浮培养物中抽提多酚
此实施例描述发展用于自实施例1-4中发展的可可属培养物的愈合组织和悬浮细胞中抽提多酚的方法。此实施例的实验特别使用可可属可可的培养物。用包含0.1％H2S04的1.5ml 50％(v/v)乙醇从大约0.25±0.04g湿重的愈合组织中、及用包含0.1％H2SO4的1.5ml 80％(v/v)甲醇从0.1±0.003g干重的悬浮细胞(无上清培养基)中抽提多酚。将细胞放置于离心管(2.0ml)中并以珠磨匀浆器匀质化1分钟。以3500rpm离心匀浆20分钟并只移动上清到另一离心管中。
当需要筛选大量的悬浮细胞培养物时，使用如下的更强大的高通量方法：从待分析的每烧瓶细胞培养物中，取1ml分装至96-深孔平板。在转移至96-深孔平板之前，也记录样本的细胞压积(PCV)。在台式离心机中以6000rpm离心平板4分钟来沉淀每孔中的细胞。以塑料移液管从每孔中去除并丢弃上清。接着，向每孔中加入0.5ml抽提溶剂(80∶20甲醇∶水)和钨硬质合金珠，并将平板放置在混磨机上以在15Hz下碾磨细胞2分钟。然后转移平板到离心机并通过6000rpm离心4分钟沉淀细胞碎片。
实施例8.培养物中多酚生产的初步分析
用于进行原花青素分析反应的方法被设计为与最初的Swain和Hillis的方法(J.SCI.Food Agric.10：63，1959)和Porter等的方法(Phytochemistry，25(1)：223，1986)相当接近。丁醇-盐酸抽提分析被用于测定可可属可可悬浮细胞抽提物中的多酚。通过合并0.1ml甲醇水溶液抽提物和1.0ml丁醇-盐酸试剂(95∶5v/v)、并在Qiagen深孔加热模块(Qiagen deep well block，Valencia，加利福尼亚，美国)上于75℃加热溶液60分钟，将多酚水解成(-)-表儿茶酸和儿茶酸单体。在水解样本中儿茶酸的存在可以通过形成粉红色观察到。确定了280nm和520nm处的吸收值，并基于用不同浓度原花青素B2(购自Chromadex，Inc.，欧文，加利福尼亚)创建的校准曲线得到的儿茶酸量计算了原花青素含量。更亮的粉色指示悬浮培养物中更高浓度的原花青素(图5)。基于此方法几个悬浮培养物的原花青素含量从250mg/L到1000mg/L不等。
实施例9.自可可属可可细胞得来的多酚的分析
来自实施例7的甲醇水溶液抽提物经由0.45μM微孔过滤器过滤，并且注射100ul样本用于LC-MS分析。使用对称C18柱(100×2.1mm内径，3.5μm)(Phenomenex，托伦斯，加利福尼亚，美国)。用Waters(Milford，马萨诸塞州，美国)Alliance HPLC系统完成LC分析，该系统装备有CTC分析PAL自动上样仪(CTC Analytics PAL autosampler，Leap Technologies，卡波罗，北卡罗来纳州，美国)、带有600S控制器的Waters 626泵以及可从190nm到780nm扫描的Waters2996光电二极管阵列检测器(PDA)。使用MassLinxTM做数据分析。用水-0.1％甲酸(溶剂A)和乙腈-0.1％甲酸(溶剂B)以恒定流速0.3ml min-1进行梯度洗脱。使用具有下列溶剂B比例的线性梯度参数(时间(分钟)，％B)：(0，7)、(5，15)、(20，75)、(25，100)、(35，100)、(35.1，7)(45，7)。在280nm处监测化合物(+)-儿茶酸、(-)-表儿茶酸、咖啡因、可可碱和原花青素(二聚体到六聚体)。使用Waters Quattro微三重四极杆质谱检测器(Waters Quattro Microtriple-quadrupole mass detector，Milford，马萨诸塞州，美国)获得MS数据。对于愈合组织用从m/z 150到1200扫描的参数模式，而对于悬浮细胞用从m/z 150到1800扫描的参数模式完成全扫描数据的获取。儿茶酸、表儿茶酸、可可碱和咖啡因的可靠标准购自Chromadex.Inc(欧文，加利福尼亚)，并且每个标准在甲醇水溶液中的合适稀释也进行与自悬浮细胞的抽提物同样的LC-MS分析(图6A到6C)。
确定单独脱脂的可可属可可种子中主要的黄酮类可可碱和咖啡因的水平分别为25.2mg/g干重和4.6mg/g干重。相比之下，可可属可可悬浮细胞未生产可测量的咖啡因或可可碱(图6E和6F)，而它们能生产水平可与种子相媲美的儿茶酸和表儿茶酸(图6D)。这些结果显示植物细胞培养物能生产高浓度的相关化合物而少有不想要化合物的污染。
实施例10.花卉衍生细胞悬浮的细胞选择和培养基优化过程
每七天培养测定一次生物量增加、糖消耗及原花青素生产力。这些数据对于所需细胞选择过程非常重要。基于PCV和糖消耗测定优选生长良好的细胞，并且随后基于原花青素生产量从生长良好的细胞系中挑选生产良好的细胞系。更高生物量和更高原花青素生产量能增加批次循环中的生产力。在细胞选择过程之前平均原花青素生产力为52mg原花青素每升培养物，在一年细胞选择过程之后其提高至251mg/L的水平，并且得到的最高水平为1600mg原花青素每升培养物(图10C)。最高生产量也增加至超过5000mg/L PCV(图10D)。
用B5主要盐和MS少量盐生成培养基XXV，从而相比于通常的维持培养基培养基VIII降低了培养基中铵离子的浓度。碳水化合物源为60g/L蔗糖，且激素为0.1mg/L NAA和0.2mg/L激动素(相比2mg/L 2，4-D和0.005mg/L TDZ)。在两周的时间后，在培养基XXV中检验悬浮显示无生长，但是悬浮中积累的原花青素达到对照培养基VIII中的大于四倍的水平(用培养基XXV大于95mg/L，相比于用培养基VIII为22mg/L)。这可能由于在此培养基中的硝酸盐/铵离子的比例较高、加上与生长素相比过剩的细胞分裂素所造成。
用MS盐、30g/L蔗糖及1.5mg/L 2，4-D生成培养基XXVI。转移至此培养基的悬浮培养物显示出原花青素累积更高，在第13天达到比培养基VIII中大于四倍的水平(用培养基XXVI 87mg/L，相比于用培养基VIII为22mg/L)。尽管在两种培养基中细胞生长相对类似(在培养基VIII中为从22％PCV到61％PCV，相比于在培养基XXVI为60％PCV至25％PCV)，糖消耗不同，显示了细胞会优选葡萄糖作为碳水化合物源(图10E)。
实施例11.葡萄糖添加用于生产力增强
此实施例描述通过补充添加葡萄糖以增强可可悬浮培养物的原花青素生产力的方法的发展。
通过改变培养基从生长培养基到生产培养基诱导植物次级代谢物的生产。对于生产培养基优化，可以认为或者碳水化合物源或者氮源是关键因素。为了增强自花卉及营养组织衍生的悬浮培养物的原花青素生产，在指数生长阶段末期使用葡萄糖形式的额外碳水化合物。
通过葡萄糖添加，自花卉组织衍生悬浮细胞系(MX1241-58)中获得了原花青素生产力的显著改进。在如实施例5所述的正常培养条件下在培养基XXXII中正常维持培养物七天。在第7天添加葡萄糖之前，从MX1241-58细胞培养物中取样，并且其平均PCV和RI为49.5±3.5％和0.2。平均原花青素生产水平为189.5±17.7mg/L PCV。在第7天，加入5ml 50％葡萄糖储存液至悬浮培养物中以调节RI至大于3％，并且随后当培养基中葡萄糖浓度低于0.5％时重复此步骤。在添加葡萄糖之后，用手剧烈摇晃烧瓶中的培养物大约10秒钟以分散悬浮中集中的葡萄糖，并且再次测定RI，平均RI为3。在不同培养天数(在第7、11、16和21天)时加入3-4次葡萄糖及一次新鲜培养基(第25天)，原花青素生产水平增加到高达4.4g/L PCV，比其起始值高24倍，并且PCV从49.5±3.5％增加至69.0±1.4％。
应用类似的处理至(实施例6中所述)细胞系MX1440-3496以改善其生产水平。设计此实验来检验细胞系对于葡萄糖添加的响应。在实施例6中所述的培养基XXXIII中维持MX1440-4496细胞系。在第6天，随机挑选了6个烧瓶的MX1440-3496细胞系，并将其分为两组，每组为三瓶。一组三个烧瓶以50％葡萄糖储存液处理而另外三个烧瓶不做处理。在第6天加入葡萄糖之前测定所有六个烧瓶，平均值为，PCV为45％，RI为0.3±0.1且原花青素生产PCV为2.41±0.19g/L。加入5mL 50％葡萄糖储存液至三个处理烧瓶。在葡萄糖添加后处理烧瓶的平均RI增加至6.0±1.1，并且平均PCV为39.7±0.6％。
在葡萄糖添加之后第1、3、4、5和6天，从所有烧瓶中取样并测定它们的PCV、RI和原花青素生产。未处理的烧瓶显示RI无显著变化，而PCV从45％轻微增加至53±3.6％。其生产在处理后第6天停留在2.83±1.17g/L PCV。相反，处理的烧瓶显示PCV稳步增长，在第6天增加至53±2.7％。RI以每天0.6至0.8单位RI的速率显著降低，从第0天的6±1.1到达第6天的2.0±1.3。与此同时，其生产也从加入葡萄糖之前的2.42±1.93g/L PCV增加到第5天的12.93±2.24g/L PCV。葡萄糖处理导致原花青素生产的增长，并且如图7所示这些生产特征代表用于原花青素生产的细胞培养过程的显著改进。
实施例12.可可悬浮培养的放大
在使用植物细胞培养中的普遍问题是获得靶标产物的连续生产(Kim等，Biotechnol Prog.20(6)1666，2004)。因此，成功的大规模植物细胞培养的关键在于维持稳定生产力。成功进行了可可细胞培养物悬浮从125ml烧瓶到500ml烧瓶的放大过程，因为在放大条件下可可细胞生长和生产均非常一致和稳定。所选细胞系的七天平均PCV为45～55％，是起初PCV水平20％的大约2.5倍。在黑暗条件下、在回旋振荡器上、以100rpm在维持培养基培养基VIII中生长更大规模的烧瓶培养物。每培养七天测定一次生物量、培养基中糖消耗及原花青素生产力。
接种2.7L可可细胞至6.5L生物反应器(工作体积＝5.0L)中，并在0.2vvm(每体积培养物每分钟的气体体积)的气体流速下、在100rpm搅动速度和23℃容器温度下培养七天。生物量增长非常缓慢，并且延迟期长达四天。对细胞来讲大接种体积是个问题，因为这会限制养分供应而且还使得细胞的均匀混合变得困难。理想的起始接种体积应在25％和40％PCV之间。影响生物量浓度和特定生产力的一个重要因素是溶解氧(DO)浓度和溶解气体代谢物如CO2的气体交换(Dicosmo& Misawa，“Plant Cell Culture Secondary Metabolism”，1996，pp44)。在烧瓶培养物中，不可能控制溶解氧和气体代谢物，但是在反应器培养物中控制溶解氧和气体代谢物是可行的。在此实施例中，DO水平逐渐降低，这是细胞代谢的好指示物。
实施例13.自悬浮细胞培养物中的大规模分离
自10L可可悬浮细胞培养物中重获的冻干生物量与80％甲醇以生物量体积的1∶1的比例混合，并且在室温下搅拌1小时。真空条件下、在布氏漏斗中将其经过滤纸过滤。至少重复抽提三次。收集每次的甲醇抽提物，集合并在40℃、减压下浓缩以减少甲醇抽提物的体积到最初的30％。将浓缩甲醇抽提物加至二氯甲烷中做液-液抽提并收集、集合二氯甲烷层抽提物，并且在室温、减压下以25％的比例浓缩。溶解干燥的抽提物于甲醇中，逐滴加入去离子水，并且在0℃放两天以获得沉淀物。
自干燥细胞得到的预先纯化原花青素的实际产量在10～20％之间，具有50～60％的纯度。为有效去除杂质，通过使用C18和硅胶柱的Waters prep-LC(Milford，马萨诸塞州，美国)完成了进一步纯化，并且在prep-LC纯化过程后纯度会增加至超过99％。为了得到高纯度的原花青素靶标化合物，使用附加的结晶过程。
实施例14.自可可属可可细胞培养物和可可豆中生产的多酚和原花青素的比较。
自悬浮培养物中抽提粗原花青素
用Labconco冻干机冻干自1L可可属可可悬浮细胞培养物重获的生物量以得到14.0g干可可细胞。用250mL混合的丙酮水溶液(70％v/v)抽提干粉30分钟。以3500rpm离心水溶液15分钟并移出上清。再次以同样方式抽提固体残留物。两次抽提得到的上清被合并到一起，并且随后在部分真空下、在40℃、以旋转蒸发器蒸发。在-20℃冷冻浓缩的水化残留物并以Laboconco冻干机干燥以得到厚的黄色粗抽提物。通过实施例8所述的酸丁醇水解法确定自细胞干重得到的粗原花青素产量，并且该产量在10-15％之间。
自未发酵生可可豆抽提粗原花青素
未发酵生可可豆得自Raw Harmony(洛杉矶，加利福尼亚)。从5g磨碎的干的未发酵豆或磨碎、脱脂的未发酵可可豆中抽提粗原花青素。抽提与上述用于悬浮细胞培养物的步骤类似，除了在每个抽提步骤中使用50mL丙酮水溶液(70％v/v)，并且重复抽提三次。以3500rpm离心合并的抽提物15分钟。轻轻倒出上清并随后在部分真空中、在40℃下蒸发以去除溶剂。在-20℃冷冻浓缩的水化残留物并用Laboconco冻干机干燥以得到紫红色的粗提取物。通过实施例8中所述的酸丁醇水解分析估计的粗原花青素产量在10-13％之间。
原花青素的高效液相色谱(HPLC)分析
以正相HPLC系统完成原花青素的HPLC分析，该系统由Waters 2795分离模块、Waters 996 PDA检测仪和Waters 474扫描荧光检测仪组成。用Develosil Diol柱(250x4.6mm内径，5μ粒径，改编自Kelm等(美国专利申请号2007075020)，其描述了质子极性单体和/或寡聚体的改进过程)获得可可属可可细胞抽提物和生可可豆抽提物中的原花青素鉴定和分离的条件。。二元流动相由溶剂(A)、乙腈∶冰醋酸(98∶2，v/v)和溶剂(B)、甲醇∶水∶冰醋酸(95∶3∶2，v/v/v)组成。在30℃下以0.8mL/min流速完成下列线性梯度洗脱：0-35分钟，100-60％A；35-40分钟，60％A；40-45分钟，60-100％A。通过荧光检测(激发波长在276nm，发射波长在316nm)、280nm处的紫外检测监测原花青素的分离(Lazarus等，J.Agric.FoodChem.47：3693，1999)。
图8显示通过荧光检测仪测定的未发酵可可豆抽提物(图8A)和可可属可可细胞悬浮抽提物(图8B)的层析图。按照Kelm等(美国专利号2007075020)所述的层析分离，未发酵可可豆抽提物由多至十二聚体(聚合度＝12)组成。本实施例证实了来自可可属可可细胞培养物的原花青素抽提物也具有与豆中所报道的同样的属性。图9显示未发酵可可豆抽提物(图9A)和可可属可可细胞培养物抽提物(图9B)的紫外吸收层析图。此检测模式使得咖啡因和可可碱能被检测，并且此实验结果说明，当豆中的抽提物显示抽提物中有这两种化合物存在时，在细胞培养物的抽提物中未检测到这两种化合物。
因此，此实施例显示了可可属可可的细胞培养物能生产与可可豆相同的原花青素，而不生产不所需的化合物咖啡因和可可碱。而且，在此所述的用于细胞培养物的抽提步骤不需要使用如(可可豆脱脂所需的)正己烷的溶剂。因此，得自可可属可可细胞培养物的原花青素抽提物不会有有毒溶剂如正己烷的残留。
实施例15.自可可细胞悬浮培养物得到的原花青素抽提物的抗氧化活性。
此实施例描述了检验自通过上述实施例所述方法培养的可可细胞中抽提的原花青素的抗氧化活性的方法。
文献中的证据说明可可原花青素的促进健康的性质和这些化合物抗氧化性质之间的关系。通常人们相信，这些抗氧化物影响某些类型的肿瘤进展以及心血管疾病中的LDL氧化中涉及的氧化和自由基过程。因此，测定可可原花青素的抗氧化潜力成为确定这些化合物在预防人类疾病(如癌症和心脏病)中的有效性的合理方法，以使得这些化合物能被用在具有健康促进性质的组合物中。类似地，人们相信，抗氧化物能帮助维持具有更少皱纹的年轻皮肤，并且因此可可原花青素能被用于化妆品组合物。
通过本领域内已知的若干步骤测定多酚类化合物(如可可原花青素)的抗氧化能力。最常用的方法是氧自由基吸收能力(ORAC)法(Cao G，Alessio H，Cutler R(1993).“Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants”FreeRadic Biol Med 14(3)：303-11)。分析测定了荧光分子(β-藻红蛋白或荧光素)在与自由基发生器如偶氮引发物化合物混合后的氧化降解。偶氮引发物被认为可以通过加热生产过氧自由基，其损害了荧光分子，导致荧光的丢失。抗氧化物能够保护荧光分子不被氧化变性。保护程度可以使用荧光计定量。现今作为荧光探针用得最多的是荧光素。在市场上可以购得能够自动测量和计算能力的装置(Biotek，Roche Diagnostics)。
随着氧化变性的进行荧光强度降低，并且通常在加入偶氮引发物(自由基发生器)之后记录此荧光强度35分钟。以荧光延迟为荧光素的变性(或分解)的测定指标，其在抗氧化物存在时变得不那么明显。记录(荧光强度对时间)衰减曲线并计算两条衰减曲线(有抗氧化物或无抗氧化物)之间的面积。随后，用抗氧化物trolox(维生素E类似物)作为标准，定量抗氧化物介导的保护的程度。用不同浓度trolox制作标准曲线，并且将检验样本与之相比。检验样本(食品)的结果报告为“trolox等价物”或TE。
表1.培养基I-XXXIV的组成(表2提供了储存液的配方)
表1(续)
表1(续)
表1(续)
表2.表1所述培养基中所用储存液配方
Claims (28)
1.一种制备可可寡聚体原花青素的方法，包括：在足以导致可可寡聚体原花青素的生产的时间和条件下、在悬浮培养物中生长可可属sp.Theobroma sp.细胞，并且自细胞悬浮培养物中生产含可可寡聚体原花青素的抽提物，从而制备可可寡聚体原花青素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括：在足以导致可可寡聚体原花青素的生产的时间和条件下、在悬浮培养物中生长可可属可可Theobroma cacao细胞，并且自细胞悬浮培养物中收获可可寡聚体原花青素，其中收获的可可寡聚体原花青素基本上不含黄嘌呤生物碱。
3.根据权利要求1所述的方法，其中产生的可可寡聚体原花青素制备物不含有可检测的咖啡因和可可碱。
4.根据权利要求1所述的方法，其中通过下列步骤生产可可属可可细胞悬浮培养物：在固体生长培养基上生长来自非成熟可可属可可花卉外植体的愈合组织；自可可属可可愈合组织培养物中选择快速生长细胞系；并且通过接种快速生长细胞系于液体培养基来起始细胞悬浮培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过下列步骤生产可可属可可细胞悬浮培养物：在固体生长培养基上生长来自可可属可可节点、节间、分生组织或茎组织的愈合组织；自可可属可可愈合组织培养物中选择快速生长细胞系；并且通过接种快速生长细胞系于液体培养基来起始细胞悬浮培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其中可可寡聚体原花青素的生产包括：
收获细胞；
在合适溶剂中匀质化细胞生物量以抽提富集多酚部分；
用溶剂-溶剂抽提和/或层析分离富集原花青素部分；及可选地
干燥或浓缩原花青素部分。
7.根据权利要求6所述的方法，其中收获细胞包括离心、过滤或其组合。
8.通过权利要求1所述方法生产的基本上无黄嘌呤生物碱的可可多酚制备物。
9.一种生产可可细胞的细胞悬浮培养物的方法，包括：
在固体生长培养基上，生长来自非成熟可可属可可花卉外植体或来自可可属可可节点、节间、分生组织或茎组织的愈合组织；
自可可属可可愈合组织培养物中选择快速生长细胞系；及
通过接种快速生长细胞系于液体培养基来起始细胞悬浮培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其中非成熟可可属可可花卉外植体选自退化雄蕊、萼片和花瓣基部外植体。
11.根据权利要求9所述的方法，还包括在烧瓶、任何合适的培养容器或生物反应器中生长细胞悬浮培养物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在容器或生物反应器中、并以分批、分批补料或连续的模式实现生长。
13.通过权利要求9所述方法生产的可可属可可细胞悬浮培养物。
14.根据权利要求9所述的方法，使用表1中所列出的液体培养基XXXII或XXXIII。
15.一种可可多酚制备物，包括可可多酚混合物，并基本上不含咖啡因和可可碱，该制备物自可可属可可细胞悬浮培养物中抽提。
16.根据权利要求15所述的制备物，其不用正己烷抽提。
17.根据权利要求15所述的制备物，其中自可可属可可细胞悬浮培养物中抽提包括：
收获细胞；
在合适溶剂中匀质化细胞生物量以抽提富集多酚部分；
用溶剂-溶剂抽提和/或层析分离富集原花青素部分；及可选地
干燥或浓缩原花青素部分。
18.根据权利要求17所述的方法，其中收获细胞包括离心、过滤或其组合。
19.根据权利要求15所述的制备物，用于膳食组合物。
20.根据权利要求15所述的制备物，用于治疗组合物。
21.根据权利要求15所述的制备物，用于兽医组合物。
22.根据权利要求15所述的制备物，用于化妆品组合物。
23.根据权利要求15所述的制备物，其中可可多酚包括儿茶酸、表儿茶酸和其原花青素寡聚体。
24.根据权利要求22所述的制备物，其中寡聚体是二聚体至十二聚体。
25.根据权利要求22所述的制备物，其中寡聚体包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或其任意两个或更多个的混合物。
25、根据权利要求15所述的制备物，其中可可多酚是可可原花青素。
26.根据权利要求15所述的制备物，其是液体形式、干燥形式或粉末形式。
27.根据权利要求1所述的方法，使用表1所列出的液体培养基XXXII或XXXIII。
28.根据权利要求1所述的方法，还包括在指数生长期末期加入补充的葡萄糖至悬浮培养物中，从而增强原花青素生产。
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