CN114126400A - 可可细胞悬浮方案 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用幼叶作为外植体来源建立可可属(Theobroma)细胞悬浮培养物的方法。还提供了用于产生可可属细胞悬浮培养物的诱导、增殖和悬浮培养基。这些方法和培养基可用于在可可属中产生次生代谢物，以及用于分离与可可属疾病相关的病毒粒子。

Description

可可细胞悬浮方案
技术领域
本公开一般性涉及植物细胞培养物，更具体地涉及建立可可属(Theobroma)细胞悬浮培养物的方法。
背景技术
可可属是锦葵科(Malvaceae)的一个开花植物属。可可属包含大约20种小型林下乔木，原产于中美洲和南美洲的热带森林。可可树(Theobroma cacao)可用于制作巧克力。
植物细胞悬浮培养是一种植物细胞在培养基中自由漂浮生长的方法。可可属细胞悬浮培养物通常适于大规模生产可可属次生代谢物，如可可碱。以往建立可可属细胞悬浮培养物的尝试主要依靠使用子叶或发育中的种子作为外植体材料。参见，例如，Tsai和Kinsella，Annals of Botany 48.4(1981)：549-558；Leathers and Scragg，Plantscience 62.2(1989)：217-227；Rojas等人，Actualidades Biológicas 30.89(2008)：117-123；Parra等人，Plant physiology and biochemistry 111(2017)：59-66；Rúa等人，Bioprocess and biosystems engineering40.10(2017)：1479-1492；Gallego等人，Scientific reports 8.1(2018)：13575。然而，在商业生产规模上获得这些种类的外植体可能是耗时且费力的，并且可全面增加可可属相关产品的商业生产成本。
因此，需要改进的方法，为建立可可属细胞悬浮培养物提供有效率且有效的方案。
发明内容
本文提供了利用幼叶作为外植体来源建立可可属细胞悬浮培养物的方法，所述方法适合于生产可可属次生代谢物以及分离与可可属疾病有关的病毒。本文还提供了用于所述方法的生长培养基。
在一个方面，本文提供了一种如下所述的制备可可属细胞悬浮培养物的方法：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织；将诱导的愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；以及将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中。在一些实施方式中，愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、1-萘乙酸(NAA)和6-苄基氨基嘌呤(BAP)。在某些变体中，1-萘乙酸(NAA)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在；6-苄基氨基嘌呤(BAP)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在。
在一些实施方式中，所述灭菌包括将所述外植体在真空下在次氯酸盐溶液中接触。在一些实施方式中，所述愈伤组织增殖培养基包含基础植物培养基和谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述悬浮培养基包含基础植物培养基和L-甘氨酸。在一些实施方式中，所述松脆型愈伤组织的诱导是在16小时光照和8小时黑暗的光周期后得到的。在一些实施方式中，提供了由上述方法产生的可可属细胞悬浮培养物。
在另一个方面，本文提供了一种如下所述的产生可可属次生代谢物的方法：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织；将转化的松脆型愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中；以及从悬浮培养基中回收次生代谢物。在一些实施方式中，所述愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、1-萘乙酸(NAA)和6-苄基氨基嘌呤(BAP)。在某些变体中，1-萘乙酸(NAA)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在；6-苄基氨基嘌呤(BAP)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在。
在一些变体中，所述产生可可属次生代谢物的方法还包括用可表达的转基因转化所述诱导的愈伤组织，所述转基因编码所述次生代谢物生物合成途径中的产物。在一些实施方式中，所述转化是通过粒子轰击或通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导来实现的。在一些实施方式中，所述次生代谢物是苯酚、类黄酮、甲基黄嘌呤或脂肪酸。在一些实施方式中，所述可可属是可可树、大花可可(Theobroma grandiflorum)或二色可可(Theobromabicolor)。在一些实施方式中，所述灭菌包括将所述外植体在真空下在次氯酸盐溶液中接触。在一些实施方式中，所述愈伤组织增殖培养基包含基础植物培养基和谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述悬浮培养基包含基础植物培养基和L-甘氨酸。在一些实施方式中，所述松脆型愈伤组织的诱导是在16小时光照和8小时黑暗的光周期后得到的。
在一些可与任何上述实施方式和变体组合的实施方式中，所述方法还包括将所述细胞悬液与一种或多种病毒一起共培养。在一些实施方式中，所述一种或多种病毒包括可可肿枝病毒(CSSV)。在一些实施方式中，提供了通过上述方法产生的可可属次生代谢物。
在又一个方面，本文提供了一种用于从可可属叶片外植体诱导松脆型愈伤组织的愈伤组织诱导培养基，其包含：基础植物培养基、1-萘乙酸(NAA)和6-苄基氨基嘌呤(BAP)。在某些变体中，1-萘乙酸(NAA)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在；6-苄基氨基嘌呤(BAP)以0.5mg/L至5mg/L的浓度存在。在其它变体中，所述愈伤组织诱导培养基还包含维生素混合物。
在又一个方面，本文提供了一种用于增殖从可可属叶片外植体诱导的松脆型愈伤组织的愈伤组织增殖培养基，其包含：基础植物培养基和浓度为1mg/L至5mg/L的噻苯隆(tidiazuron)(TDZ)。在一些变体中，所述愈伤组织诱导培养基还包含维生素混合物。
附图说明
图1显示了用于获得外植体的代表性叶片的照片。
图2显示了在1型、2型和3型叶片中的消毒效果(对于叶片类型表征，参见Greathouse等人，American journal of botany 58.4(1971)：281-286)。
图3显示了次氯酸钙和酒精在消灭叶片外植体上的真菌中的消毒效果。
图4显示了次氯酸钙和酒精在消灭叶片外植体上的细菌中的消毒效果。
图5显示了BAP/AIA激素平衡和光周期条件对愈伤组织形成的效果。
图6显示了BAP/AIA激素平衡对愈伤组织形成的效果。
图7显示了BAP/NAA激素平衡对愈伤组织形成的效果。
关于图5-7，BAP是6-苄基氨基嘌呤；NAA是1-萘乙酸。
具体实施方式
以下描述阐述了示例性的组成、系统、方法、参数等。然而，应当认识到，这样的描述并非意图作为对本公开的范围的限制，而是作为示例性实施方式的描述来提供。
建立可可属细胞悬浮培养物的方法
在一个方面，本文提供了一种如下所述的制备可可属细胞悬浮培养物的方法：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织；将诱导的愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；以及将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中。
可可属是锦葵科的一个开花植物属。用于本文所述方法的可可属物种的合适实例包括，例如，可可树、大花可可、二色可可、Theobroma angustifolium、卡努曼可可(Theobroma canumanense)、Theobroma mammosum、Theobroma microcarpum、Theobromaobovatum、Theobroma simiarum、Theobroma speciosum、Theobroma stipulatum、Theobroma subincanum、或Theobroma sylvestre。在一个变体中，可可属是可可树。在另一个变体中，可可属是大花可可。在又一个变体中，可可属是二色可可。
叶片外植体及其灭菌
外植体是从供体植物上取下的一块用于培养的组织。以往建立可可属细胞悬浮培养物的尝试主要依靠使用子叶或发育中的种子作为外植体材料。获得这些类型的外植体是耗时且费力的，因为需要人工授粉来产生种子。然而，一旦获得，对于组织培养而言，子叶或发育中的种子相对容易灭菌，因为它们生长在果实内部，与外部环境隔绝。相比之下，由于叶片暴露于外部环境，它们通常更难灭菌，这是限制其用作组织培养外植体的来源的原因之一。
在某些实施方式中，本发明提供了一种对可可属叶片灭菌以使其适合用作组织培养中的外植体的方法。在一些实施方式中，将叶片用肥皂清洗，用无菌蒸馏水冲洗，并切成块。在一些实施方式中，切好的叶片块在乙醇中浸泡消毒，用无菌水冲洗，并在真空下浸泡在次氯酸盐溶液中。在一些实施方式中，消毒后，所述叶片可用于各种方案中。
在一些实施方式中，乙醇以70％-95％的乙醇溶液提供。
在其它实施方式中，所述次氯酸盐溶液包含次氯酸钙。在一些实施方式中，所述次氯酸钙溶液的浓度在0.5％和10％之间、或0.5％和5％之间；或约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、或约10％。
在别的其它实施方式中，所述次氯酸盐溶液包含次氯酸钠。在一些实施方式中，所述次氯酸钠溶液的浓度在5％和30％之间；或约5％、约10％、约15％、约20％、约25％或约30％。
在别的其它实施方式中，将切好的叶片块在真空下在次氯酸盐溶液中浸泡；所述真空在10kPa和100kPa之间；或约10千帕、约20kPa、约30kPa、约40kPa、约50kPa、约60kPa、约70kPa、约80kPa、约90kPa或约100kPa。在一些实施方式中，所述真空和灭菌方案可进行调整以制备用于诸如根系形成之类的方案的其它可可样本。
松脆型愈伤组织的诱导
愈伤组织是生长中的无组织的植物薄壁细胞团。愈伤组织由亲本组织的增殖形成。从形态学上讲，愈伤组织培养物通常分为松脆型或紧密型。在解剖学上，松脆型愈伤组织由松散排列、有细胞间隙的大细胞构成。松脆型愈伤组织是松脆的，容易打碎，适合悬浮培养，在悬浮培养中，可以通过机械搅拌来分散组织。相反，紧密型愈伤组织是硬的，解剖学上由排列紧密、没有细胞间隙的小细胞构成。紧密型愈伤组织不容易解散。通常参见Kumar等人，“愈伤组织诱导(Callus Induction)”《植物生物技术》(Plant Biotechnology)，第1册，Apple Academic Press，2017.143-159。
在提供的方法的一些实施方式中，来自叶片外植体的松脆型愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上进行诱导。在一些实施方式中，所述愈伤组织诱导培养基包含：基础植物培养基、1-萘乙酸(NAA)和6-苄基氨基嘌呤(BAP)。在某些实施方式中，所述基础植物培养基包含钙。在另一个实施方式中，所述基础植物培养基还包含硝酸盐。在一个变体中，所述基础植物培养基包含木本植物培养基(WPM)基础盐、Murashige & Skoog(MS)基础盐、或Driver &Kuniyuki Walnut(DKW)基础盐混合物，或其任何组合。参见Lloyd和McCown，HortScience16(1981)：453；Murashige和Skoog，Physiologia plantarum 15.3(1962)：473-497；木本植物培养基(Woody Plant Medium)产品手册(产品代码：PT026)，HiMedia Laboratories；Murashige & Skoog植物盐混合物(Murashige and Skoog Plant Salt Mixture)产品手册(产品代码：TS1004)，HiMedia Laboratories。
在上述的一些变体中，所述愈伤组织诱导培养基还包含：一种或多种维生素、一种或多种糖、L-谷氨酰胺、或肌醇、或其任何组合。在某些变体中，所述一种或多种维生素是维生素混合物。在另一个变体中，所述维生素混合物包含Gamborg B-5(B5)维生素、或Driver& Kuniyuki Walnut(DKW)维生素、或其任何组合。参见Gamborg等人，Experimental cellresearch 50.1(1968)：151-158；木本植物培养基产品手册(产品代码：PT026)，HiMediaLaboratories。在另一个变体中，所述一种或多种糖是蔗糖。
在一个变体中，所述愈伤组织诱导培养基包含：木本植物培养基(WPM)基础盐；Gamborg B-5(B5)维生素；蔗糖；L-谷氨酰胺；肌醇；1-萘乙酸(NAA)；和6-苄基氨基嘌呤(BAP)。
在一些变体中，NAA的浓度在0.1mg/L和5mg/L之间；或约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约1.1mg/L、约1.2mg/L、约1.3mg/L、约1.4mg/L、约1.5mg/L、约1.6mg/L、约1.7mg/L、约1.8mg/L、约1.9mg/L、约2.0mg/L、约3.0mg/L、约4.0mg/L或约5.0mg/L。
在一些变体中，BAP的浓度在0.1mg/L和5mg/L之间；或约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约1.1mg/L、约1.2mg/L、约1.3mg/L、约1.4mg/L、约1.5mg/L、约1.6mg/L、约1.7mg/L、约1.8mg/L、约1.9mg/L、约2.0mg/L、约3.0mg/L、约4.0mg/L或约5.0mg/L。
在一些变体中，L-谷氨酰胺的浓度在50mg/L和300mg/L之间、或200mg/L和275mg/L之间、或230mg/L和270mg/L之间、或245mg/L和255mg/L之间；或约50mg/L、约75mg/L、约100mg/L、约125mg/L、约150mg/L、约175mg/L、约200mg/L、约225mg/L、约250mg/L、约275mg/L或约300mg/L。
在一些变体中，肌醇的浓度在10mg/L和200mg/L之间、或75mg/L和125mg/L之间、或90mg/L和110mg/L之间、或95mg/L和105mg/L之间；或约10mg/L、约20mg/L、约30mg/L、约40mg/L、约50mg/L、约60mg/L、约170mg/L、约80mg/L、约90mg/L、约100mg/L、约110mg/L、约120mg/L、约130mg/L、约140mg/L、约150mg/L、约160mg/L、约170mg/L、约180mg/L、约190mg/L或约200mg/L。
在一些变体中，糖(例如蔗糖)的浓度在5g/L和100g/L之间；或在20g/L和80g/L之间；或约5g/L、约10g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L、约40g/L、约45g/L、约50g/L、约55g/L、约60g/L、约65g/L、约70g/L、约75g/L、约80g/L、约85g/L、约90g/L、约95g/L或约100g/L。
应该理解，本文所述的愈伤组织诱导培养基中各种组分的任何描述都可彼此组合，就像每一个组合都被单独列出一样。例如，在一些变体中，包含1-萘乙酸(NAA)和6-苄基氨基嘌呤(BAP)二者的愈伤组织诱导培养基可具有1.0mg/L的NAA浓度和0.5mg/L的BAP浓度。在另一个变体中，NAA浓度为约1.0mg/L并且BAP浓度为约1mg/L。在又一个变体中，NAA浓度为约1.0mg/L并且BAP浓度为约3.0mg/L。
在其它变体中，所述愈伤组织诱导培养基包含NAA、BAP和蔗糖。在上述内容的一个变体中，NAA的浓度为约1.0mg/L，BAP的浓度在0.5mg/L和3mg/L之间，蔗糖为约30g/L。
在别的其它变体中，所述愈伤组织诱导培养基包含NAA、BAP、蔗糖和L-谷氨酰胺。在上述内容的一个变体中，NAA的浓度为约1.0mg/L，BAP的浓度在0.5mg/L和3mg/L之间，蔗糖为约30g/L，并且L-谷氨酰胺为约250mg/L。
在别的其它变体中，所述愈伤组织诱导培养基包含NAA、BAP、蔗糖、L-谷氨酰胺和肌醇。在上述内容的一个变体中，NAA的浓度为约1.0mg/L，BAP的浓度在0.5mg/L和3mg/L之间，蔗糖为约30g/L，L-谷氨酰胺为约250mg/L，并且肌醇的浓度为约100mg/L。
在提供的方法的一些实施方式中，在光周期后得到松脆型愈伤组织的诱导。光周期在本文中表示为光照小时数与黑暗小时数之比；而光照和黑暗总小时数合计达24小时。
在一个变体中，所述光周期为12:12至24:0，13:11至20:4、或14:10至18:6；或约16:8。
通过将底物放置在照明得当的腔室内，可以确保暴露在光下，这是本领域中了解的。在一些实施方式中，可以使用30-240μmol/m2·秒、50-200μmol/m2·秒、50-190μmol/m2·秒、50-180μmol/m2·秒、50-170μmol/m2·秒、50-160μmol/m2·秒、50-150μmol/m2·秒、50-100μmol/m2·秒、50-90μmol/m2·秒、50-80μmol/m2·秒、50-70μmol/m2·秒或50-60μmol/m2·秒的光合有效辐射(PAR)或光合光子通量密度(PPFD)。
应该理解，本文所述的光周期、PAR和PPFD的任何描述都可彼此组合，就像每一个组合都被单独列出一样。例如，在一个变体中，本文所述的方法中采用的光周期为16小时:8小时的光照:黑暗，并且光合有效辐射(PAR)或光合光子通量密度(PPFD)为50-200μmol/m2·秒。
愈伤组织的增殖
在一些实施方式中，诱导的愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖。在一些实施方式中，所述愈伤组织增殖培养基包含：基础植物培养基和噻苯隆(TDZ)。在某些实施方式中，所述基础植物培养基包含钙。在另一个实施方式中，所述基础植物培养基还包含硝酸盐。在一个变体中，所述基础植物培养基包含木本植物培养基(WPM)基础盐、Murashige &Skoog(MS)基础盐、或DKW基础盐混合物，或其任何组合。参见Lloyd和McCown，HortScience16(1981)：453；Murashige和Skoog，Physiologia plantarum 15.3(1962)：473-497；木本植物培养基产品手册(产品代码：PT026)，HiMedia Laboratories；Murashige & Skoog植物盐混合物产品手册(产品代码：TS1004)，HiMedia Laboratories。
在上述的一些变体中，所述愈伤组织增殖培养基还包含：一种或多种维生素、一种或多种糖、L-谷氨酰胺、或肌醇、或其任何组合。在某些变体中，所述一种或多种维生素是维生素混合物。在另一个变体中，所述维生素混合物包含Gamborg B-5(B5)维生素、或Driver& Kuniyuki Walnut(DKW)维生素、或其任何组合。参见Gamborg等人，Experimental cellresearch 50.1(1968)：151-158；木本植物培养基产品手册(产品代码：PT026)，HiMediaLaboratories。在另一个变体中，所述一种或多种糖包括蔗糖。
在一个变体中，所述愈伤组织诱导培养基包含：木本植物培养基(WPM)基础盐；Gamborg B-5(B5)维生素；蔗糖；L-谷氨酰胺；肌醇；和噻苯隆(TDZ)。
在一些变体中，TDZ的浓度在0.1mg/L和5mg/L之间；或约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约1.1mg/L、约1.2mg/L、约1.3mg/L、约1.4mg/L、约1.5mg/L、约1.6mg/L、约1.7mg/L、约1.8mg/L、约1.9mg/L、约2.0mg/L、约2.1mg/L、约2.2mg/L、约2.3mg/L、约2.4mg/L、约2.5mg/L、约2.6mg/L、约2.7mg/L、约2.8mg/L、约2.9mg/L、约3.0mg/L、约4.0mg/L或约5.0mg/L。
在一些变体中，L-谷氨酰胺的浓度在50mg/L和300mg/L之间、或200mg/L和275mg/L之间、或230mg/L和270mg/L之间、或245mg/L和255mg/L之间；或约50mg/L、约75mg/L、约100mg/L、约125mg/L、约150mg/L、约175mg/L、约200mg/L、约225mg/L、约250mg/L、约275mg/L、约300mg/L。
在一些变体中，肌醇的浓度在10mg/L和200mg/L，或75mg/L和125mg/L之间、或90mg/L和110mg/L之间、或95mg/L和105mg/L之间；或约10mg/L、约20mg/L、约30mg/L、约40mg/L、约50mg/L、约60mg/L、约170mg/L、约80mg/L、约90mg/L、约100mg/L、约110mg/L、约120mg/L、约130mg/L、约140mg/L、约150mg/L、约160mg/L、约170mg/L、约180mg/L、约190mg/L或约200mg/L。
在一些变体中，糖(例如蔗糖)的浓度在5g/L和100g/L之间；或20g/L和80g/L之间；或约5g/L、约10g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L、约40g/L、约45g/L、约50g/L、约55g/L、约60g/L、约65g/L、约70g/L、约75g/L、约80g/L、约85g/L、约90g/L、约95g/L或约100g/L。
本文中所述的愈伤组织增殖培养基中各种成分的任何描述都可彼此组合，就像每一种组合都被单独列出一样。例如，在一些变体中，包含TDZ和L-谷氨酰胺的愈伤组织增殖培养基可具有2mg/L和3mg/L之间的TDZ浓度、以及200mg/L和300mg/L之间的L-谷氨酰胺浓度。
在其它变体中，所述愈伤组织增殖培养基包含TDZ、L-谷氨酰胺和蔗糖。在上述内容的一个变体中，TDZ的浓度在2mg/L和3mg/L之间，L-谷氨酰胺的浓度在200mg/L和300mg/L之间，蔗糖的浓度在20g/L和40g/L之间。
在其它变体中，所述愈伤组织增殖培养基包含TDZ、L-谷氨酰胺、蔗糖和肌醇。在上述内容的一个变体中，TDZ的浓度在2mg/L和3mg/L之间，L-谷氨酰胺的浓度在200mg/L和300mg/L之间，蔗糖的浓度在20g/L和40g/L之间，并且肌醇的浓度在50mg/L和150mg/L之间。
愈伤组织的悬浮
本领域已知的为微生物沉没培养而开发的合适的发酵技术可应用于本文所述的植物悬浮培养系统。
在一些实施方式中，本发明的增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中。
在一些实施方式中，所述悬浮培养基包含：基础植物培养基；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)；和激动素(KIN)。在某些实施方式中，所述基础植物培养基包含钙。在另一个实施方式中，所述基础植物培养基还包含硝酸盐。在一个变体中，所述基础植物培养基包含木本植物培养基(WPM)基础盐、Murashige & Skoog(MS)基础盐、或DKW基础盐混合物，或其任何组合。参见Lloyd和McCown，HortScience 16(1981)：453；Murashige和Skoog，Physiologiaplantarum 15.3(1962)：473-497；木本植物培养基产品手册(产品代码：PT026)，HiMediaLaboratories；Murashige & Skoog植物盐混合物产品手册(产品代码：TS1004)，HiMediaLaboratories。
在上述内容的一些变体中，所述悬浮培养基还包含：一种或多种维生素、一种或多种糖、L-甘氨酸或青霉素，或其任何组合。在某些变体中，所述一种或多种维生素是维生素混合物。在另一个变体中，所述维生素混合物包含Gamborg B-5(B5)维生素、或Driver &Kuniyuki Walnut(DKW)维生素、或其任何组合。参见Gamborg等人，Experimental cellresearch 50.1(1968)：151-158；木本植物培养基产品手册(产品代码：PT026)，HiMediaLaboratories。在另一个变体中，所述一种或多种糖包括蔗糖。
在一个变体中，所述悬浮培养基包含：Murashige & Skoog(MS)基础盐；Driver &Kuniyuki Walnut(DKW)维生素；蔗糖；青霉素；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；和激动素(KIN)。
在一些变体中，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度在0.1mg/L和5mg/L之间；或约0.1mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L、约0.5mg/L、约0.6mg/L、约0.7mg/L、约0.8mg/L、约0.9mg/L、约1.0mg/L、约2.0mg/L、约3.0mg/L、约4.0mg/L或约5.0mg/L。
在一些变体中，激动素(KIN)的浓度在0.01mg/L和0.5mg/L之间；或约0.01mg/L、约0.02mg/L、约0.03mg/L、约0.04mg/L、约0.05mg/L、约0.06mg/L、约0.07mg/L、约0.08mg/L、约0.09mg/L、约0.1mg/L、约0.11mg/L、约0.12mg/L、约0.13mg/L、约0.14mg/L、约0.15mg/L、约0.16mg/L、约0.17mg/L、约0.18mg/L、约0.19mg/L、约0.2mg/L、约0.3mg/L、约0.4mg/L或约0.5mg/L。
在一些变体中，L-甘氨酸的浓度在0.5mg/L和5mg/L之间；或约0.5mg/L、约1mg/L、约1.5mg/L、约2mg/L、约2.5mg/L、约3mg/L、约3.5mg/L、约4mg/L或约5mg/L。
在一些变体中，青霉素的浓度在10mg/L和300mg/L之间；或约10mg/L、约20mg/L、约30mg/L、约40mg/L、约50mg/L、约60mg/L、约70mg/L、约80mg/L、约90mg/L、约100mg/L、约110mg/L、约120mg/L、约130mg/L、约140mg/L、约150mg/L、约160mg/L、约170mg/L、约180mg/L、约190mg/L、约200mg/L或约300mg/L。
在一些变体中，糖(例如蔗糖)的浓度在5g/L和100g/L之间；或20g/L和80g/L之间；或约5g/L、约10g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L、约40g/L、约45g/L、约50g/L、约55g/L、约60g/L、约65g/L、约70g/L、约75g/L、约80g/L、约85g/L、约90g/L、约95g/L或约100g/L。
本文中所述的悬浮培养基中各种成分的任何描述都可彼此组合，就像每一种组合都被单独列出一样。例如，在一些变体中，包含2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和激动素(KIN)二者的悬浮培养基可具有0.1mg/L和1mg/L之间的2,4-D浓度、以及0.05mg/L和0.5mg/L之间的KIN浓度。
在一些其它变体中，所述悬浮培养基包含2,4-D、KIN和蔗糖。在上述内容的一个变体中，2,4-D的浓度在0.1mg/L和1mg/L之间，KIN的浓度在0.05mg/L和0.5mg/L之间，并且蔗糖的浓度在20g/L和40g/L之间。
在其它变体中，所述悬浮培养基包含2,4-D、KIN、蔗糖和L-甘氨酸。在上述内容的一个变体中，2,4-D的浓度在0.1mg/L和1mg/L之间，KIN的浓度在0.05mg/L和0.5mg/L之间，蔗糖的浓度在20g/L和40g/L之间，并且L-甘氨酸的浓度在0.1mg/L和10mg/L之间。
在其它变体中，所述悬浮培养基包含2,4-D、KIN、蔗糖、L-甘氨酸和青霉素。在上述内容的一个变体中，2,4-D的浓度在0.1mg/L和1mg/L之间，KIN的浓度在0.05mg/L和0.5mg/L之间，蔗糖的浓度在20g/L和40g/L之间，L-甘氨酸的浓度在0.1mg/L和10mg/L之间，并且青霉素的浓度在10mg/L和300mg/L之间。
本文中关于“约”某个值或参数包括(并描述了)针对该值或参数本身的实施方式。例如，关于“约x”的描述包括对“x”本身的描述。在其它情况下，术语“约”当与其它测量结果相结合使用，或用于修饰值、单位、常数或值的范围时，指的是+/-10％的变化。
还应理解，本文中关于在两个值或参数“之间”包括(并描述了)包括这两个值或参数本身的实施方式。例如，关于“在x和y之间”的描述包括对“x”和“y”本身的描述。
次生代谢物的产生
本文描述的方法可用于在可可属中产生次生代谢物。因此，在另一个方面，本文提供了一种如下所述的产生可可属次生代谢物的方法：从可可属叶片获得外植体；对所述外植体进行灭菌；在愈伤组织诱导培养基上诱导来自所述外植体的易松脆型愈伤组织；将转化的松脆型愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中；以及从悬浮培养基中回收次生代谢物。在上述方面的一些变体中，本文所述的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基和悬浮培养基的任何变体均都可以用于所述方法。
次生代谢是指生物体生存并不绝对需要的生物途径。次生代谢中的代谢途径被称为“次生代谢途径”。次生代谢途径的化合物如底物、中间体和产物因此被称为次生代谢物。植物次生代谢物的实例包括苯酚类、黄酮类化合物、单宁类、生物碱类、类固醇类、萜烯类等。在可可属中发现的次生代谢物的实例包括甲基黄嘌呤，如可可碱和咖啡因。在一些实施方式中，次生代谢物是苯酚、类黄酮、甲基黄嘌呤或脂肪酸。
本领域已知的为微生物沉没培养而开发的合适的发酵技术可应用于本文所述的植物悬浮培养系统以产生植物次生代谢物。
所述可可属次生代谢物可被加工成可可属产品，或对其味道和/或风味有贡献。例如，可可属产品包括可可酒、巧克力、复合巧克力、类巧克力物质、可可粉和可可脂。
在一些变体中，所述产生可可属次生代谢物的方法还包括用可表达的转基因转化所述诱导的愈伤组织，所述转基因编码所述次生代谢物生物合成途径中的产物。在一些实施方式中，所述转基因基因编码合成次生代谢物的酶。在一些实施方式中，所述转基因基因编码合成次生代谢物前体的酶。在一些实施方式中，所述转基因编码抑制次生代谢物降解的基因产物。合适的转化技术包括，例如，用病毒载体转染、用质粒载体转化、电穿孔、显微注射、土壤杆菌介导的转移、直接DNA摄取、晶须介导的转化和微粒轰击。用于转化植物细胞、植物及其部分的方法在下列文献中描述：Draper等人，1988，植物遗传转化与基因表达(Plant Genetic Transformation and Gene Expression.)《实验室手册》(A LaboratoryManual)，Blackwell Sci.Pub.Oxford，365页；Potrykus和Spangenburg，1995，《植物基因转移》(Gene Transfer to Plants.)Springer-Verlag，Berlin；以及Gelvin等人，1993，《植物分子生物手册》(Plant Molecular Biol.Manual.)Kluwer Acad.Pub.Dordrecht。一篇转基因植物的综述，包括转化技术，载于Galun和Breiman，1997，《转基因植物》(TransgenicPlants.)Imperial College Press，London。在一些实施方式中，所述转化是通过粒子轰击或通过土壤杆菌介导来实现的。
病毒粒子的产生
在某些实施方式中，本文描述的方法可用于分离和分析与可可属中传染性疾病有关的病毒粒子。在一些实施方式中，本文所述的方法还包括所述细胞悬液与一种或多种病毒共培养。在一些实施方式中，所述一种或多种病毒包括可可肿枝病毒(CSSV)，它是造成可可肿枝病的病原体。
CSSV是花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)的一种植物致病性病毒，主要感染可可树。CSSV可以在感染的第一年内降低可可产量，并通常在数年内杀死可可树。症状因菌株而异，但通常发生叶变色、茎/根肿胀、和枯死。该病毒通过粉蚧媒介在树之间传播。因此，本发明中公开的方法和培养基可能有助于CSSV的分离和表征以及可可肿枝病的管理。
实施例
提供以下实施例是为了说明所提供的实施方式，而不是意图限制本公开的范围。
实施例1
利用叶片外植体建立可可细胞悬液
本实施例演示了利用叶片作为供体外植体建立可可细胞悬液。
选择1年或2年龄可可树植株并用作供体材料以收集幼叶作为用于形成愈伤组织的外植体。选择颜色正迅速变绿的第二最幼叶片(根据Greathouse等人，American journalof botany 58.4(1971)：281-286分类为I1期)并收获用于离体培养(图1)。
将叶片用肥皂清洗，并用无菌蒸馏水冲洗三次。然后，将叶片切成2cm2大小的块，浸泡在70％酒精中消毒五分钟，并用超纯无菌水冲洗3次。然后将叶片外植体在真空条件(70千帕)下在1％次氯酸钙或20％次氯酸钠中浸泡50-60分钟，并用超纯无菌水冲洗3-5次。
消毒后，将所述无菌叶片在层流室中在无菌条件下切成1cm2的块，并置于有30ml固体愈伤组织诱导培养基(CIM)(表1)的陪替氏培养皿中1个月。在该培养期后，立即将叶片外植体转移到固体愈伤组织增殖培养基(CPM)(表2)中8周，每2-3周迁移，直到愈伤组织大量增殖。所述培养物以16小时光照:8小时黑暗的光周期温育，温度为27±2℃。
表1.愈伤组织诱导培养基(CIM)
培养基组分 浓度
木本植物培养基(WPM)盐 50％<sup>a</sup>
Gamborg B-5(B5)维生素 1ml/L
L-谷氨酰胺 250mg/L
肌醇 100mg/L
蔗糖 30g/L
1-萘乙酸(NAA) 1.0mg/L
6-苄基氨基嘌呤(BAP) 0.5-3.0mg/L
a培养基中100％的组分是指使用如HiMedia Laboratories的木本植物培养基(产品代码：PT026)产品手册中所述的1升溶液的配方。
表2.愈伤组织增殖培养基(CPM)
培养基组分 浓度
木本植物培养基(WPM)盐 100％<sup>a</sup>
Gamborg B-5(B5)维生素 1ml/L
L-谷氨酰胺 250mg/L
肌醇 100mg/L
蔗糖 30g/L
噻苯隆(TDZ) 2.2mg/L
a培养基中100％的组分是指使用如HiMedia Laboratories的木本植物培养基(产品代码：PT026)产品手册中所述的1升溶液的配方。
之后，将500-1000mg的松脆型愈伤组织转移到250ml烧瓶中4周，所述烧瓶中有30ml含500mg/L果胶酶的液体悬浮培养基(SUM，表3)，每周更新培养基(使细胞沉降，除去20mL的旧培养基上清液并加入20mL新培养基)。然后，每周在不含果胶酶的SUM培养基中更新细胞悬液，为期2-6个月。将液体培养基中的所述培养物放入120rpm的振荡器中在27±2℃的温度下在黑暗中温育。
表3.悬浮培养基(SUM)
培养基组分 浓度
Murashige & Skoog(MS)盐 100％<sup>a</sup>
Driver & Kuniyuki Walnut(DKW)维生素 1ml/L
L-甘氨酸 2mg/L
蔗糖 30g/L
青霉素 100mg/L
2.4-D(2,4-二氯苯氧乙酸) 0.5mg/L
激动素(KIN) 0.1mg/L
a培养基中100％的组分是指使用如HiMedia Laboratories的Murashige & Skoog植物盐混合物(产品代码：TS1004)产品手册中所述的1升溶液的配方。
实施例2
叶片消毒
本实施例探讨了建立可可细胞悬浮培养物中影响叶片消毒的因素。
图2显示了2型叶片是诱导愈伤组织形成的最佳叶片类型。然而，由于使用高浓度次氯酸钙后高比例的叶片死亡，因此设计了使用低浓度次氯酸钙真空处理一段时间的实验(图3和4；表4和5)。结果发现，低浓度次氯酸钙(0.5mg/L)处理40分钟是对可可叶片消毒的最佳处理。
表4.对真菌存在的偏差分析
Figure BDA0003458298230000201
表5.对细菌存在的偏差分析
Figure BDA0003458298230000202
Figure BDA0003458298230000211
实施例3
激素和光周期对愈伤组织诱导的效应
本实施例论证了在建立可可细胞悬浮培养物中激素和光周期对愈伤组织诱导的效应。
筛选一组植物生长激素，得出在使用愈伤组织诱导培养基中1-萘乙酸(NAA)和6-苄基氨基嘌呤(BAP)的组合。图5和6显示了BAP和吲哚乙酸(IAA)的组合的结果，图7显示了NAA与BAP组合的结果。发现1mg/L NAA与0.5-3mg/L BAP组合令人惊讶地诱导理想的量的松脆型愈伤组织形成。其它植物激素组合产生的愈伤组织质量较差(即愈伤组织紧密，不适合建立细胞悬浮培养物)和/或对于建立细胞悬浮培养物而言量过少。不希望受任何理论的束缚，NAA和BAP的组合被认为对于诱导松脆型愈伤组织来建立可可细胞悬浮培养物是重要的。
图5还显示了在培养物温育中使用光照的结果。发现以16小时光照:8小时黑暗的光周期温育培养物时，松脆型愈伤组织形成效率高。

Claims (29)

1.一种制备可可属(Theobroma)细胞悬浮培养物的方法，所述方法包括：
从可可属叶片获得外植体；
对所述外植体进行灭菌；
在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织，其中所述愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、浓度为0.5mg/L至5mg/L的1-萘乙酸(NAA)和浓度为0.5mg/L至5mg/L的6-苄基氨基嘌呤(BAP)；
将诱导的愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；以及
将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述可可属是可可树(Theobroma cacao)、大花可可(Theobroma grandiflorum)或二色可可(Theobroma bicolor)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述灭菌包括将所述外植体在真空条件下在次氯酸盐溶液中接触。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中所述愈伤组织诱导培养基还包含维生素混合物。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述愈伤组织增殖培养基包含基础植物培养基和谷氨酰胺。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述悬浮培养基包含基础植物培养基和L-甘氨酸。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中所述松脆型愈伤组织的诱导是在16小时光照和8小时黑暗的光周期后得到的。
8.一种通过根据权利要求1-7中的任一项所述的方法产生的可可属细胞悬浮培养物。
9.一种产生可可属次生代谢物的方法，所述方法包括：
从可可属叶片获得外植体；
对所述外植体进行灭菌；
在愈伤组织诱导培养基上从所述外植体诱导松脆型愈伤组织，其中所述愈伤组织诱导培养基包含基础植物培养基、浓度为0.5mg/L至5mg/L的1-萘乙酸(NAA)和浓度为0.5mg/L至5mg/L的6-苄基氨基嘌呤(BAP)；
将转化的松脆型愈伤组织在愈伤组织增殖培养基上增殖；
将增殖的愈伤组织悬浮在悬浮培养基中；以及
从所述悬浮培养基中回收次生代谢物。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括用可表达的转基因转化诱导的愈伤组织，所述转基因编码所述次生代谢物生物合成途径中的产物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述转化是通过粒子轰击或通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导来实现的。
12.根据权利要求9至11中的任一项所述的方法，其中所述次生代谢物是苯酚、类黄酮、甲基黄嘌呤或脂肪酸。
13.根据权利要求9至12中的任一项所述的方法，其中所述可可属是可可树、大花可可或二色可可。
14.根据权利要求9至13中的任一项所述的方法，其中所述灭菌包括将所述外植体在真空下在次氯酸盐溶液中接触。
15.根据权利要求9至14中的任一项所述的方法，其中所述愈伤组织诱导培养基还包含维生素混合物。
16.根据权利要求9至15中的任一项所述的方法，其中所述愈伤组织增殖培养基包含基础植物培养基和谷氨酰胺。
17.根据权利要求9至16中的任一项所述的方法，其中所述悬浮培养基包含基础植物培养基和L-甘氨酸。
18.根据权利要求9至17中的任一项所述的方法，其中所述松脆型愈伤组织的诱导是在16小时光照和8小时黑暗的光周期后得到的。
19.一种通过根据权利要求9-18中的任一项所述的方法产生的可可属次生代谢物。
20.根据权利要求1至19中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括将细胞悬液与一种或多种病毒一起共培养。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种病毒包括可可肿枝病毒(CSSV)。
22.一种用于从可可属叶片外植体诱导松脆型愈伤组织的愈伤组织诱导培养基，其包含：
基础植物培养基；
任选的一种或多种维生素；和
浓度为0.5mg/L至5mg/L的1-萘乙酸(NAA)，和
浓度为0.5mg/L至5mg/L的6-苄基氨基嘌呤(BAP)。
23.一种用于增殖从可可属叶片外植体诱导的松脆型愈伤组织的愈伤组织增殖培养基，其包含：
基础植物培养基；
任选的一种或多种维生素；和
浓度为1mg/L至5mg/L的噻苯隆(TDZ)。
24.根据权利要求22或23所述的愈伤组织增殖培养基，其中所述基础植物培养基包含钙。
25.根据权利要求24所述的愈伤组织增殖培养基，其中所述基础植物培养基还包含硝酸盐。
26.根据权利要求22或23所述的愈伤组织增殖培养基，其中所述基础植物培养基包含木本植物培养基(WPM)基础盐。
27.根据权利要求22至26中的任一项所述的愈伤组织增殖培养基，其中一种或多种维生素作为维生素混合物存在。
28.根据权利要求27所述的愈伤组织增殖培养基，其中所述维生素混合物包含GamborgB-5(B5)维生素。
29.根据权利要求22至28中的任一项所述的愈伤组织增殖培养基，其还包含：
一种或多种糖；
L-谷氨酰胺；和
肌醇。
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