RU2757318C1 - Способ получения микрорастений лекарственного растения Stephania glabra (Roxb.) Miers - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии растений, предполагает использование метода культуры растительной ткани для микроклонального размножения лекарственного вида Stephania glabra. Способ осуществляют следующим образом: из первичного экспланта на жидкой питательной среде культивируют гетерогенную культуру, после чего полученную гетерогенную клеточную культуру культивируют на питательной среде для образования соматических зародышей с последующим формированием из полученных соматических зародышей микрорастений на питательной безгормональной твердой среде. В качестве первичного экспланта используют молодые листья растения Stephania glabra, которые предварительно стерилизуют в ламинарном боксе в 0,1-0,2% растворе диацида в течение 3-5 минут и после тщательной промывки в 5-ти сменах стерильной воды культивируют не менее 3-х пассажей на питательной среде для получения гетерогенной культуры на орбитальной качалке с 14-суточными интервалами в темноте при температуре 25°C и относительной влажности 50-70%. Жидкую питательную среду для получения гетерогенной культуры (W_2,4D жидкая) готовят на основе макро- и микросолей по прописи Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием нитрата аммония (NH₄NO₃) до 400 мг/л. В результате, она содержит, мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO_3, 1900 - KNO₃, 170 - KH₂PO₄, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37,3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27,8 – FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - H₃BO₃, 22,3 - MnSO₄ 4H₂O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 – никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 – сахароза и 0,5 - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота. В качестве питательной среды для образования соматических зародышей используют питательную среду, которая содержит, мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO_3, 1900 - KNO_3,, 170 - KH₂PO₄, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37,3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27,8 – FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - H₃BO₃, 22,3 - MnSO₄ 4H₂O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 - сахароза, 0,5 - 6-бензиламинопурин и 2,0 - α-нафтилуксусная кислота, культивирование ведут не менее 2-х пассажей с 20-суточными интервалами на орбитальном шейкере в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 50-70%. Затем сформированные соматические зародыши для доращивания и регенерации полноценных микрорастений в количестве 30-50 штук на колбу помещают в 100 мл колбы Эрленмейерана на безгормональную твердую питательную среду и доращивают на свету в течение не менее 4-х недель (Фиг. Б) до формирования отдельных микрорастений, при этом безгормональная твердая питательная среда включает, мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO₃, 1900 - KNO₃, 170 - KH₂PO₄, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37,3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27,8 – FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - H₃BO₃, 22,3 - MnSO₄ 4H₂O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 – тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 - сахароза, 7000 – агар. В заявленном способе весь процесс от этапа получения первичного каллуса из листового экспланта до высадки сформированных микрорастений в грунт занимает не более 21-24 недели, включает в себя смену трех вариантов питательных сред: индукционную (W_2,4D (жидкая)), морфогенную (W_B/А (жидкая)) и безгормональную (W₀ (твердая)), что более чем в 3 раза ускоряет процесс получения микрорастений и значительно сокращает трудозатраты, кроме того, обеспечивает стабильное формирование микрорастений S. glabra за счет сохранения эмбриогенности клеточных культур на всем протяжении технологического процесса. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 ил.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии растений, предлагает использование метода культуры растительной ткани для микроклонального размножения лекарственного вида Stephania glabra. Метод может быть использован для воспроизводства редких и исчезающих видов растений в целях сохранения биологического разнообразия, оздоровления, селекции, исследований по генетике и морфогенезу, а также для ускорения массового размножения и получение ценного сырья лекарственных видов - продуцентов вторичных метаболитов для медицины, фармацевтической промышленности и косметологии.

Стефания гладкая (Stephaniaglabra (ROXB) - двудомная многолетняя лиана из семейства луносемянниковые (Menispermaceae), произрастает в тропических и субтропических лесах Индии, Бирмы, Вьетнама, Южного Китая, Японии, является продуцентом ценных вторичных метаболитов. К настоящему моменту из растения было выделено и охарактеризовано более 3 0 алкалоидов, ряд из них имеет фармакологическую значимость (Semwal D.K.; Semwal R.B. Efficacy and safety of Stephania glabra: An alkaloid-rich traditional medicinal plant. Nat. Prod. Res. 2015, 29: 396-410). Так, для получения природного стефарина (синонимы: стефаглабрин, гиндарицин), важного для медицины и фармакологии алкалоида проапорфинового ряда, используются клубни растения. Содержание стефарина в них может достигать до 0,8% (Madan B.R., Khanna N.K., Mahatma О.P., Madan V, Dadhich A.P. Further studies on some pharmacological actions of gindarine hydrochloride-alkaloid of Stephania glabra (ROXB.) Miers. Indian J Pharmacol. 1974, 6: 97-102; Titova, M.V., Reshetnyak, O.V., Osipova, E.A., Osip'yants, A.I., Shumilo, N.A., Oreshnikov, A.V., Nosov, A.M. Submerged cultivation of Stephania glabra (Roxb.) Meiers cells in different systems: Specific features of growth and accumulation of alkaloid stepharine. Appl. Biochem. Microbiol. 2012, 48: 64 5-649). Являясь источником ценных биологически-активных веществ, S. glabra широко применяется в народной медицине регионов юго-восточной Азии и Индии для лечения таких заболеваний как астма, диабет, онкологические заболевания, туберкулез, воспаления и проч. В виду активного использования растения в ряде регионов произрастания S. glabra признана исчезающим видом.

Известен способ каллусообразования in vitro из эксплантов, выделенных из листа, стебля и клубня растения Stephania glabra, проходивший в несколько этапов. Для инициации культуры in vitro поверхностно простерилизованные экспланты помещали на твердую питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга (MS), содержащую витамины по прописям Уайта и Стаба, железо в хелатной форме, мезоинозит, сахарозу, с добавлением различных фитогармонов-2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4Д), α-нафтилуксусной кислоты

(НУК), 6-бензиламинопурина (БАП), сочетание 2,4Д и кинетина. Через 2 недели культивирования для пролиферации каллуса и уменьшения концентрации токсичных веществ в непосредственной близости от клеток, экспланты с образованными на них первичными каллусами переносили на жидкую питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга (MS), с добавлением витаминов, хелатного железа, мезоинозита, сахарозы, фитогормонов 2,4Д и кинетина. При культивировании в темноте, на орбитальной качалке (100 об/мин) с интервалом субкультивирования 20-25 дней была получена стабильная мелкоагрегированная суспензионная клеточная культура стефании гладкой (Гурова Т.Ф., Попов Ю.Г. и др. Каллюсообразование и накопление алкалоидов в культуре ткани стефании гладкой // Растительные ресурсы, 1980 №16, с. 421-425).

Однако недостатком данного способа является то, что получение мелко агрегированных клеточных культур не приводило к реализации дальнейшего морфогенного потенциала клеточной культуры, и было направленно на получение недифференцированной быстро растущей ткани, количество средних и крупных агрегатов было относительно невелико и использовалось для получения вторичных метаболитов. Способ не предназначен для получения и укоренения растений.

Известен также способ получения клонов стефании из суспензионной клеточной культуры стефании гладкой, продуцента стефарина. Исходный стабильный мелко агрегированный штамм выращивался на орбитальной качалке (100 об/мин) с интервалом субкультивирований 20-25 дней на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга (MS), с добавлением тиамина, Са-пантотената, сахарозы и различных фитогормонов -2,4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), α-нафтилуксусной кислоты (НУК). Индивидуальные клеточные клоны переносили на разные субстраты для выращивания и получали отдельные клеточные линии различные по морфологическим признакам (Осипова Е.А., Попов Ю.Г., Шамина З.Б. Получение индивидуальных клонов стефании и их характеристика // Физиология растений, том 39, вып. 2, 1992).

Основным недостатком работы являлось получение клонов, гетерогенных по ряду признаков, в том числе по признаку продуктивности вторичных метаболитов, а не формирования эмбриогенных структур.

Наиболее близким по количеству существенных признаков и достигаемому результату к заявляемому техническому решению является четырех этапный способ образования растений стефании гладкой методом соматического эмбриогенеза, описанный Поповым Ю.Г. Согласно методу на I этапе суспензионную культуру стефании культивировали в течение 15 пассажей (43 недели) в модифицированной жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга (MS), содержащей фитогормоны 2,4-Д и кинетин, для получения гетерогенной культуры. Состав этой модифицированной жидкой питательной среды приведен в таблице 1 (среда для получения гетерогенной культуры). Клеточную суспензию куль тивировали с 20-дневными интервалами в темноте, на орбитальной качалке (100 об/мин) при температуре 26°С и относительной влажности 70%. В результате реализации первого этапа описанного метода получали гетерогенную культуру, содержащую единичные клетки и агрегаты, состоящие из крупных округлых клеток паренхимального типа, окруженных мелкими меристематическими клетками. На II этапе полученную гетерогенную культуру переносили в питательную среду для образования соматических зародышей, состав среды приведен в табл. 1 (среда для образования соматических зародышей). Культивирование производили в течение 7-9 пассажей (20-25 недель). На данном этапе использовали две питательных среды, одна из них в качестве регулятора роста помимо кинетина дополнительно включала α-нафтилуксусную кислоту (НУК), а другая β-индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрациях 0,1-0,5 мг/л. Культивирование на указанных средах приводило к образованию соматических зародышей в количестве 30-50 штук/конгломерат при наличии НУК и 10-12 штук/конгломерат при наличии ИУК. Для осуществления этапа III сформировавшиеся соматические зародыши переносили на твердые питательные среды, дополненные ИУК, НУК, для формирования корешка, состав сред указан в табл. 1 (среда для формирования корешка). Культивирование вели в течение 60 дней. На IV этапе полученные эмбриоиды с корешками переносили на твердую безгормональную питательную среду для формирования микрорастения, см. табл. 1 (среда для формирования растений), Через 1,5-2 месяца культивирования на данной среде начинала проявляться ростовая активность, приводящая к формированию нормального микрорастения (Попов Ю.Г. Соматический эмбриогенез в образование растений в культуре ткани стефании гладкой // Биологические науки. Физиология растений, №6, 1985, с. 86-89).

К недостаткам данного метода следует отнести трудоемкость и значительную длительность технологического процесса, приводящего к формированию микрорастений S. glabra. Методика требует последовательного использования четырех вариантов питательных сред с периодом субкультивирования на каждой из них от 7 до 15 пассажей, что растягивает во времени процесс получения растений-регенерантов. Существенным недостатком является то, что на промежуточном этапе (этап II) культура теряет эмбриогенность, при этом уменьшается способность каллуса к дальнейшему формированию соматических зародышей, что приводит к необходимости возобновлять все этапы работы от начала до конца. Кроме того, итогом культивирования на II этапе являются соматические зародыши с почечкой, но без корешка, т.е. на этом этапе зародыш неполноценный и не способен развиться в описанных условиях в нормальное растение. Соматические зародыши требуют дополнительного времени для развития корня при длительном культивировании (IV этап). Кроме того, в описании метода отсутствует этап переноса микрорастений в грунт и информация о количестве укорененных растений.

Технической проблемой, поставленной перед изобретением, является упрощение и сокращение длительности технологического процесса, производство возобновляемого источника соматических зародышей, приводящего к стабильному формированию микрорастений S. glabra за счет сохранения эмбриогенности клеточных культур на всем протяжении технологического процесса.

Поставленная техническая проблема решается тем, что в известном способе, который включает в себя культивирование первичного экспланта на жидкой питательной среде для получения гетерогенной культуры, после чего, полученную гетерогенную клеточную культуру культивируют на питательной среде для образования соматических зародышей, с последующим формированием из полученных соматических зародышей микрорастений на питательной безгормональной твердой среде, согласно изобретению в качестве первичного экспланта используют молодые листья растения Stephania glabra, которые предварительно стерилизуют в ламинарном боксе в 0,1-0,2% растворе диацида в течение 3-5 минут и после тщательной промывки в 5-ти сменах стерильной воды культивируют не менее 3-х пассажей на питательной среде для получения гетерогенной культуры на орбитальной качалке с 14-суточными интервалами в темноте при температуре 25°С и относительной влажности 50-70%. Жидкую питательную среду для получения гетерогенной культуры (W_2,4Д жидкая) готовят на основе макро- и микросолей по прописи Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием нитрата аммония (NH₄NO₃) до 400 мг/л. В результате, она содержит мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO₃, 1900 - ΚΝO₃, 170 - KH₂PO₄, 440 -CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37, 3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27, 8 - FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - Н_{3 В}О₃, 22,3 - MnSO₄ 4H₂O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 - KI, 100 - мезоинозита, 100 - пептона, 0,5 - никотиновой кислоты, 0,5 - пиридоксин гидрохлорида, 0,2 - тиамин гидрохлорида, 1- цистеин, 25000 сахарозы, и 0,5 - 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (W_2,4Д жидкая) (Табл. 2).

В качестве питательной среды для образования соматических зародышей используют питательную среду (W_b/a жидкая, табл.2, фиг. А), которая содержит мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO₃, 1900 - KNO₃, 170 - KH₂PO₄, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37, 3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27,8 - FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - H₃BO₃, 22, 3 - MnSO4 4H₂O, 0, 025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0, 25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0, 83 - KI, 100 -мезоинозит, 100 - пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1- цистеин, 25000 сахароза, 0,5 - 6-бензиламинопурин и 2,0 - α-нафтилуксусная кислота, культивирование ведут не менее 2-х пассажей с 2 0 суточными интервалами на орбитальном шейкере в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 50-70%.

Затем сформированные соматические зародыши для доращивания и регенерации полноценных микрорастений в количестве 30-50 штук на колбу помещают в 100 мл колбы Эрленмейерана безгормональную твердую питательную среду (W₀ твердая) и доращивают на свету в течение не менее 4-х недель (Фиг. Б) до формирования отдельных микрорастений (Фиг. В), при этом безгормональная твердая питательная среда включает мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO₃, 1900 - KNO₃, 170 -KH₂PO₄, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37, 3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27, 8 -FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - Н₃ВО₃, 22,3 - MnSO₄ 4H₂O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 -CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 - KI, 100 - мезоинозит, 100 - пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид 1- цистеин, 2 5000 - сахароза, 7000 - агар (W₀ твердая, табл. 2).

Использование для стерилизации эксплантов 0,1-0,2% раствора диацида обеспечивает качественную поверхностную стерилизацию инфицированного материала и, соответственно, приводит к получению качественного стерильного материала. Стерилизация первичных эксплантов диацидом в концентрации раствора менее 0,1% является мало эффективной и приводит к получению инфицированных клеток и гибели эксплантов. Стерилизация раствором диацида в концентрации раствора более 0,2% приводит к ожогу и некрозу клеток на первичном экспланте.

Использование для культивирования жидкой среды W_2,4Д позволило получить долгоживущую первичную гетерогенную клеточную культуру, представляющую собой после 3-х циклов культивирования, небольшие кластеры меристематических клеток (83-91% от общего числа клеток) и паренхимных клеток, занимающих центры более крупных агрегатов. И, кроме того, дает возможность получения инициальных клеток разных генотипов, которые впоследствии могут образовать морфогенные структуры. При этом также значительно упрощается и сокращается длительность всего технологического процесса, поскольку по сравнению с прототипом желаемый результат достигается в 5 раз быстрее.

Применение питательной среды (W_B/A жидкая) для образования соматических зародышей по сравнению с прототипом позволяет получить гетерогенную морфогенную линию, состоящую из смеси корней, узелков с корнями и соматических зародышей на разных стадиях развития вплоть до «торпеды». Использование заявленной питательной среды W_B/A с сочетанием фитогормонов БАП и НУК в указанных концентрациях позволило получить сформированные биполярные соматические зародыши, характеризующиеся правильной формой со слабо развитыми семядольными листьями. Кроме того, уменьшение в питательной среде содержания нитрата аммония до 4 00 мг/л увеличило скорость роста клеточной культуры. Полученная таким способом эмбриогенная клеточная культура состоит из небольших конгломератов (8-12 штук эмбриоидов) и отделенных друг от друга соматических зародышей (Фиг. А), что дает возможность, по сравнению с прототипом, соматическим зародышам развиваться равномерно, формируя одновременно и вершину, и корешок. Известно, что при культивировании соматических зародышей в культуре in vitro на твердых средах развитие корневой системы затруднено, а применение заявленной жидкой среды приводит не только к уменьшению времени на развитие обоих полюсов зародыша, но и в дальнейшем сокращает время периода адаптации растения перед высадкой в грунт. Кроме того, использование заявленной среды по сравнению с прототипом приводит к значительному увеличению количества биполярных эмбриоидов.

Использование для доращивания микрорастений питательной среды (W₀ твердая) из-за отсутствия в ней растительных регуляторов роста позволяет соматическим зародышам запустить в работу собственную гормональную систему и, в конечном результате, сократить сроки формирования микрорастений, а также уменьшить период адаптации растения перед высадкой в грунт.

На процесс культивирования оказывает влияние также и влажность воздуха в помещении, в котором ведут культивирование. Так, культивирование на питательных средах при влажности менее 50% приводит к быстрому высыханию среды и сокращает время пассажа, что требует дополнительных пересадок и расхода реактивов. Культивирование клеточных культур с повышенной влажностью более 70% способствует развитию инфекций и, соответственно, гибели клеток.

Целесообразно для укоренения микрорастений использовать универсальный грунт, который предварительно стерилизуют при 90°С в течение 1-2 ч, емкости с высаженными растениями на 1 неделю накрывают стеклом для поддержания влажности. Этот способ обеспечивает 95%-ное укоренение микрорастений (Фиг. Г и Д).

Изобретение иллюстрируется следующими таблицами: Таблица 1 - Состав питательных сред, представленных в прототипе; Таблица 2 - Состав питательных сред, представленных в изобретении. На фигурах представлен вид растений стефании гладкой (Stephania glabra) на различных стадиях роста: А - жидкая змбриогенная клеточная культура с соматическими зародышами; Б - твердая клеточная безгормональная клеточная культура 4 недели; В - отдельное микрорастение стефании гладкой готовое к высадке в грунт; микрорастения стефании гладкой в грунте 2 недели; Д - взрослые растения стефании гладкой в горшках 1,5 года.

Заявленное изобретение осуществляется следующим образом.

Пример 1.

Берут среднюю часть молодого листа стефании гладкой площадью 5 мм². Первоначально поверхностно стерилизуют молодые листья в нестерильных условиях. Сначала их промывают в проточной водопроводной воде 10 мин, затем в дистиллированной воде 10 мин, после чего листочки стерилизуют в течение 3 мин в 0,1% растворе диацида. После этого стерилизованные листочки отмывают от раствора диацида, промывая их 5 раз (по 3 мин) стерильной водой. Стерилизованные экспланты используют для дальнейшего культивирования, их переносят в жидкую питательную среду для получения гетерогенного каллуса на основе макро и микросолей среды MS, (см табл.2, W_{2, 4Д} жидкая), в которую вводят следующие компоненты: никотиновую кислоту 0,5 мг/л, пиридоксин гидрохлорид 0,5 мг/л, тиамин гидрохлорид 0,2 мг/л, мезоинозит 100 г/л, пептон 100 мг/л, цистеин 1 мг/л, сахарозу 25000 мг/л и дополняют регулятором роста 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л. Экспланты помещают в колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 200 мл жидкой питательной среды и инкубируют с 14-ти суточными интервалами на орбитальном шейкере (100 об/мин) в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 50%. После 3-х циклов культивирования из эксплантов получают долгоживущую первичную гетерогенную клеточную культуру. Мелкоклеточные агрегаты этой культуры переносят в колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 200 мл жидкой питательной среды W_B/A, на основе модифицированной среды MS, с уменьшенным содержанием нитрата аммония (NH₄NO₃) до 400 мг/л, содержащей никотиновую кислоту 0,5 мг/л, пиридоксин гидрохлорид 0,5 мг/л, тиамин гидрохлорид 0,2 мг/л, мезоинозит 100 г/л, пептон 100 мг/л, цистеин 1 мг/л, сахарозу 25000 мг/л, дополненную фитогормонами БАЛ и НУК в концентрациях 0,5 мг/л и 2,0 мг/л, соответственно (Таблица 2). Культуру инкубируют с 20-суточными интервалами на орбитальном шейкере (100 об/мин) в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 50%. После 2-х циклов культивирования в этой питательной среде из гетерогенных агрегатов образуются соматические эмбриоиды размером 2-6 мм в количестве 180 штук и более на колбу. Полученные соматические зародыши в количестве 3 0 штук переносят в 100 мл колбы Эрленмейера, содержащие 4 0 мл стерильной безгормональной твердой питательной среды W₀ (модифицированная MS среда с уменьшенным содержанием нитрата аммония (NH₄NO₃) до 400 мг/л), дополненная никотиновой кислотой и пиридоксин гидрохлорид в концентрации 0,5 мг/л, тиамин гидрохлоридом - 0,2 мг/л, мезоинозитом и пептоном -100 г/л, цистеином - 1 мг/л, сахарозой - 25000 мг/л, агаром - 7000 мг/л (Таблица 2). После 4 недель роста на данной питательной среде соматические зародыши вырастают в микрорастения высотой 2-6 см со сформированной корневой системой (см. фиг. В и Г). Отдельные микрорастения пинцетом рассаживают в предварительно простерилизованный при 90°С в течение 2 ч универсальный грунт, емкости с высаженными растениями на 1 неделю накрывают стеклом для поддержания влажности. В результате реализации данного способа получено 20 растений стефании гладкой (см. фиг. Г).

Пример 2.

Берут среднюю часть молодого листа стефании гладкой площадью 5 мм². На первом этапе поверхностную стерилизацию молодых листьев проводят в нестерильных условиях. Сначала их промывают в проточной водопроводной воде 10 мин, затем в дистиллированной воде 10 мин, после чего экспланты стерилизуют в течение 5 мин в 0,2% растворе диацида. Стерилизованный материал отмывают от раствора диацида, промывая 5 раз (по 3 мин) стерильной водой. Стерилизованные экспланты используют для дальнейшего культивирования.

Продезинфицированные экспланты переносят в жидкую питательную среду для получения гетерогенного каллуса на основе макро и микросолей среды MS, (см табл. 2), в которую вводят следующие компоненты: никотиновую кислоту 0,5 мг/л, пиридоксин гидрохлорид 0,5 мг/л, тиамин гидрохлорид 0,2 мг/л, мезоинозит 100 г/л, пептон 100 мг/л, цистеин 1 мг/л, сахарозу 25000 мг/ли дополняют регулятором роста 2, 4Д в концентрации 0,5 мг/л. Экспланты помещают в колбы колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 200 мл жидкой питательной среды, и инкубируют с 14-ти суточными интервалами на орбитальном шейкере (90 об/мин) в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 70%.

После 3-х циклов культивирования из эксплантов получают гетерогенную клеточную культуру. Мелкоклеточные агрегаты этой культуры переносят в колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 200 мл жидкой питательной среды W_B/A, на основе модифицированной среды MS, с уменьшенным содержанием нитрата аммония (NH₄NO₃) до 400 мг/л, содержащей никотиновую кислоту 0,5 мг/л, пиридоксин гидрохлорид 0,5 мг/л, тиамин гидрохлорид 0,2 мг/л, мезоинозит 100 г/л, пептон 100 мг/л, цистеин 1 мг/л, сахарозу 25000 мг/л, дополненную фитогормонами БАЛ и НУК в концентрациях 0,5 мг/л и 2,0 мг/л, соответственно (Таблица 2). Культура инкубируют с 20-ти суточными интервалами на орбитальном шейкере (100 об/глин) в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 70%. После 3-х циклов культивирования в этой питательной среде из гетерогенных агрегатов образуются соматические эмбриоиды размером 2-6 мм в количестве более 200 штук на колбу. Полученные соматические зародыши в количестве 40 штук переносят в 100 мл колбы Эрленмейера, содержащие 40 мл стерильной безгормональной твердой питательной среды W₀ (модифицированная MS среда с уменьшенным содержанием нитрата аммония (NH₄NO₃) до 400 мг/л), дополненная никотиновой кислотой и пиридоксин гидрохлорид в концентрации 0,5 мг/л, тиамин гидрохлоридом 0,2 мг/л, мезоинозитоми пептоном - 100 г/л, цистеином - 1 мг/л, сахарозой - 25000 мг/л, агаром - 7000 мг/л (Таблица 2). После 4 недель роста на данной питательной среде из соматоматических зародышей получают микрорастения длиной 2-6 см со сформированной корневой системой. Отдельные микрорастения пинцетом рассаживают в предварительно простерилизованный при 90°С в течение 2 ч универсальный грунт, емкости с высаженными растениями на 1 неделю накрывают стеклом для поддержания влажности. В результате реализации данного способа получено 26 растений стефании гладкой.

Предложенный метод микроклонального размножения растений стефании имеет ряд практических преимуществ по сравнению с прототипом, среди них:

- сокращение числа этапов технологического процесса от получения первоначального каллуса до взрослого растения, укорененного в грунте, по сравнению с прототипом; где не указан процесс получения первоначального каллуса и не отражена способность полученных микрорастений к укоренению;

- значительное уменьшение циклов субкультивирования на гормон содержащих питательных средах, что по сравнению с прототипом уменьшает количество однополярных соматических зародышей и приводит к увеличению количества биполярных соматических зародышей более 200 шт., и это значительно превышает показатель, представленный в прототипе, описанном Поповым Ю.Г. (1985);

- при создании описанных условий формируются биполярные соматические зародыши, которые способны за короткий срок 4-7 недель развиваться в нормальные здоровые растения-регенеранты, готовые к укоренению;

- существенным преимуществом изобретения является то, что длительное культивирование на зхаявленной морфогенной питательной среде W_B/A не приводит к негативному изменению в количестве образуемых соматических зародышей стефании гладкой, их качестве или возможности регенерировать в целые растения (более 6 лет). Таким образом, суспензионная эмбриогенная клеточная линия стефании гладкой может поддерживаться как угодно долго, создавая пул стерильного материала для регенерации микрорастений стефании гладкой в любое время;

- помимо этого модифицированная морфогенная суспензионная клеточная культура стефании гладкой, полученная при культивировании в жидкой питательной среде W_B/A накапливает большое количество вторичных метаболитов: стефарина и других алкалоидов. В частности, содержание стефарина в суспензионной культуре составило 0,9% от сухого веса ткани, что значительно превышает данный показатель для клеточных культур стефании гладкой, известный из литературных источников (Titova, M.V., Reshetnyak, O.V., Osipova, Ε.A., Osip'yants, Α.I., Shumilo, Ν.Α., Oreshnikov, A.V., Nosov, A.M. Submerged cultivation of Stephania glabra (Roxb.) Meiers cells in different systems: Specific features of growth and accumulation of alkaloid stepharine. Appl. Biochem. Microbiol. 2012, 48: 645-649; Gorpenchenko T.Y., Grigorchuk V.P., Fedoreyev S.A., Tarbeeva D.V., Tchernoded G.K., Bulgakov V.P. Stepharine production in morphogenic cell culture sof Stephania glabra (ROXB.) Miers. Plant Cell Tiss Organ Cult.2017, 128: 67-76).

Таким образом, в заявленном способе весь процесс от этапа получения первичного каллуса из листового экспланта до высадки сформированных микрорастений в грунт занимает не более 21-24 недели включает в себя смену трех вариантов питательных сред: индукционную (W_2,4d (жидкая), морфо генную (W_B/A (жидкая) и безгормональную (W₀ (твердая), что более чем в 3 раза ускоряет процесс получения микрорастений и значительно сокращает трудозатраты. Кроме того, обеспечивает стабильное формирование микрорастений S. glabrasa счет сохранения эмбриогенности клеточных культур) на всем протяжении технологического процесса.

Claims (2)

1. Способ получения микрорастений лекарственного растения Stephania glabra, включающий культивирование первичного экспланта на жидкой питательной среде для получения гетерогенной культуры, после чего полученную гетерогенную клеточную культуру культивируют на питательной среде для образования соматических зародышей с последующим формированием из полученных соматических зародышей микрорастений на питательной безгормональной твердой среде, отличающийся тем, что в качестве первичного экспланта используют молодые листья растения Stephania glabra, которые предварительно стерилизуют в 0,1-0,2% растворе диацида в течение 3-5 минут и после тщательной промывки в 5-ти сменах стерильной воды культивируют не менее 3-х пассажей на питательной среде для получения гетерогенной культуры, которая содержит, мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO_3, 1900 - KNO₃, 170 - KH₂PO_4, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 -MgSO₄ 7H₂O, 37,3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27,8 – FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - H₃BO₃, 22,3 - MnSO₄ 4H2O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 – сахароза и 0,5 - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, на орбитальной качалке с 14-суточными интервалами в темноте при температуре 25°C и относительной влажности воздуха 50-70%; в качестве питательной среды для образования соматических зародышей используют питательную среду, которая содержит, мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO_3, 1900 - KNO₃, 170 - KH₂PO_4, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37,3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27,8 – FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - H₃BO_3, 22,3 - MnSO₄ 4H₂O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 - сахароза, 0,5 - 6-бензиламинопурин и 2,0 - α-нафтилуксусная кислота, культивирование ведут не менее 2 пассажей с 20-суточными интервалами на орбитальном шейкере в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 50-70%; после чего сформированные соматические зародыши переносят для получения микрорастений на безгормональную твердую питательную среду и доращивают на свету в течение не менее 4-х недель до получения отдельных микрорастений, при этом безгормональная твердая питательная среда включает, мг/л, соответственно: 400 - NH₄NO₃, 1900 - KNO₃, 170 - KH₂PO₄, 440 - CaCl₂ 2H₂O, 370 - MgSO₄ 7H₂O, 37,3 - Na₂EDTA 2H₂O, 27,8 – FeSO₄ 7H₂O, 6,2 - H₃BO₃, 22,3 - MnSO₄ 4H₂O, 0,025 - CuSO₄ 5H₂O, 0,025 - CoCl₂ 2H₂O, 8,6 - ZnSO₄ 7H₂O, 0,25 - Na₂MoO₄ 2H₂O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 - сахароза, 7000 – агар.
2. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученные отдельные микрорастения высаживают в емкости, заполненные простерилизованным при 90°С в течение 1-2 ч универсальным грунтом, и накрывают на одну неделю.

Images