CN112021180B - 板栗体细胞胚发育的同步化方法及组培苗生根方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种板栗体细胞胚发育的同步化方法及组培苗生根方法，涉及植物组织培养技术领域。本发明提供的板栗体细胞胚发育的同步化方法，对胚性愈伤组织进行液体悬浮培养，并对不同发育时期特定体积大小的胚性愈伤组织进行筛选，获得生长状态一致的胚性愈伤组织，并且应用此方法进而得到生长状态一致的球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚。其中，球形胚的同步率为91.82％，心形胚的同步率为83.92％，鱼雷形胚的同步率为76.69％，子叶形胚的同步率为69.52％，基本实现了板栗体细胞胚发育过程中各个时期的同步化。本发明提供了一种组培苗的生根方法，能够促进组培苗的生根，提高生根率。

Description

板栗体细胞胚发育的同步化方法及组培苗生根方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是涉及一种板栗体细胞胚发育的同步化方法及组培苗生根方法。
背景技术
板栗(Castanea Mollissima)是壳斗科栗属植物，是我国重要的生态经济林树种。板栗抗病性强，虫害较少，耐瘠薄，耐干旱，在造林绿化和生态系统服务中发挥重要作用。板栗产量居世界坚果产量之首，具有重要的经济价值，有“干果之王”的美称。
燕山红栗(C.mollissima cv.Yanshanhongli)是我国秦岭以北地区适宜栽植的优良品种之一。燕山红栗具有环境适应性强，结果早，果肉甜糯，含糖量高，外形美观，耐贮藏等特性，是北京板栗主栽品种之一，深受人们的喜爱。因此，板栗优良品种的快速繁殖尤为重要，但是迄今为止，燕山红栗等优良品种的繁殖一直采用嫁接的方法，这种方法无法实现优良品种的大规模无性繁殖。而通过体细胞胚再生可以快速实现板栗优良品种的大量繁殖，目前已初步建立了板栗体细胞胚再生体系，但是现有的板栗体细胞胚再生体系中存在同步率低和生根难的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种板栗体细胞胚发育的同步化方法，以缓解板栗体胚再生过程中体细胞胚发育各个时期同步率低的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种组培苗的生根方法，能够促进组培苗的生根，提高生根率。
为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种板栗体细胞胚发育的同步化方法，包括以下步骤：
a.将板栗的胚性愈伤组织接种至E1液体培养基中悬浮培养，筛选保留20-40目的胚性愈伤组织；
b.将步骤a保留的胚性愈伤组织接种至E2液体培养基中悬浮培养，筛选保留20-40目的球形胚；
c.将步骤b保留的球形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留20-40目的心形胚；
d.将步骤c保留的心形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留10-20目的鱼雷形胚；
e.将步骤d保留的鱼雷形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留10-20目的体细胞胚；
f.将步骤e保留的体细胞胚在E2液体培养基中继代培养，得到子叶形胚；
所述E1液体培养基为含有生长素和/或细胞分裂素的液体植物培养基；
所述步骤b-f中的E2液体培养基各自独立的为不含生长素或细胞分裂素的液体植物培养基。
作为进一步技术方案，所述E1液体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、0.8-1.2g/L水解酪蛋白、1.5-2.0μM 2,4-D、0.8-1.5μM6-BA和25-35g/L蔗糖；
优选地，所述E1液体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、1.0g/L水解酪蛋白、1.8μM 2,4-D、1.1μM 6-BA和30g/L蔗糖；
所述E2液体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&NitschVitamins、0.8-1.2g/L水解酪蛋白、0.3-0.8g/L谷氨酰胺和55-65g/L蔗糖；
优选地，所述E2液体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、1.0g/L水解酪蛋白、0.5g/L谷氨酰胺和60g/L蔗糖。
作为进一步技术方案，所述步骤a和步骤b中，每0.09-0.11g的胚性愈伤组织各自独立的接种至90-110mL的液体培养基中；
优选地，每0.10g的胚性愈伤组织各自独立的接种至100mL的液体培养基中。
作为进一步技术方案，所述步骤a-f的培养温度各自独立的为24-26℃，优选为25℃；
和/或，所述步骤a-f的培养方式各自独立的为震荡培养；
所述震荡培养的转速为90-110r/min，优选为100r/min。
作为进一步技术方案，所述步骤a-f的培养时间各自独立的为6-8天，优选为7天。
作为进一步技术方案，所述板栗的胚性愈伤组织的诱导方法包括：
将板栗的外植体接种至IMM固体培养基上培养，得到愈伤团，然后将愈伤团置于IMM液体培养基中培养，再转接到E2固体培养基上培养，得到胚性愈伤组织；
所述IMM固体培养基和/或IMM液体培养基为含有生长素的植物培养基；
所述E2固体培养基为不含生长素或细胞分裂素的固体植物培养基。
作为进一步技术方案，所述板栗的外植体包括胚珠或胚尖；
优选地，所述胚尖为盛花期后45-54天胚尖。
作为进一步技术方案，所述IMM固体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、25-35g/L蔗糖、1.8-2.2mg/L2,4-D和5-7g/L固化剂；
优选地，所述IMM固体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、30g/L蔗糖、2.0mg/L 2,4-D和6g/L琼脂；
所述IMM液体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&NitschVitamins、25-35g/L蔗糖和1.8-2.2mg/L 2,4-D；
优选地，所述IMM液体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、30g/L蔗糖和2.0mg/L 2,4-D；
所述E2固体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&NitschVitamins、0.8-1.2g/L水解酪蛋白、0.3-0.8g/L谷氨酰胺、55-65g/L蔗糖和3-4g/L固化剂；
优选地，所述E2固体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、1.0g/L水解酪蛋白、0.5g/L谷氨酰胺、60g/L蔗糖和3.5g/L植物凝胶。
作为进一步技术方案，所述将愈伤团置于IMM液体培养基中培养的时间为6-8周，优选为7周。
第二方面，本发明提供了一种组培苗的生根方法，包括以下步骤：
将子叶形胚进行诱导得到组培苗，然后将组培苗在生根培养基中培养生根；
所述组培苗不含根部组织；
所述生根培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、25-35g/L蔗糖、5-7g/L固化剂和0.1-2.0mg/L IBA；
优选地，所述生根培养基的组分包括：2.3g/L WPM、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂和0.5mg/L IBA；
优选地，所述组培苗在生根培养基中培养的条件包括：
温度为23-25℃，时间为15-17h，每天光照15-17h。
与现有技术相比，本发明提供的板栗体细胞胚发育的同步化方法及组培苗生根方法具有如下有益效果：
本发明提供的板栗体细胞胚发育的同步化方法，对胚性愈伤组织进行液体悬浮培养，并对不同发育时期特定体积大小的胚性愈伤组织进行筛选，获得生长状态一致的胚性愈伤组织，并且应用此方法进而得到生长状态一致的球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚。其中，球形胚的同步率为91.82％，心形胚的同步率为83.92％，鱼雷形胚的同步率为76.69％，子叶形胚的同步率为69.52％，基本实现了板栗体细胞胚发育过程中各个时期的同步化。
本发明提供了一种组培苗生根方法，能够促进组培苗的生根，提高生根率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的板栗体细胞胚在不同发育时期的形态图，其中a为球形胚、b为心形胚、c为鱼雷形胚、d为子叶形胚；
图2为本发明提供的板栗体细胞胚在液体/固体培养条件下的不同发育时期的同步率；
图3为本发明提供的板栗组培苗在IBA浓度为0.5mg/L的培养基中生根的照片。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种板栗体细胞胚的同步化方法，包括以下步骤：
a.将板栗的胚性愈伤组织接种至E1液体培养基中悬浮培养，筛选保留20-40目的胚性愈伤组织；
b.将步骤a保留的胚性愈伤组织接种至E2液体培养基中悬浮培养，筛选保留20-40目的球形胚；
c.将步骤b保留的球形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留20-40目的心形胚；
d.将步骤c保留的心形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留10-20目的鱼雷形胚；
e.将步骤d保留的鱼雷形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留10-20目的体细胞胚；
f.将步骤e保留的体细胞胚在E2液体培养基中继代培养，得到子叶形胚。
所述E1液体培养基为含有生长素和/或细胞分裂素的液体植物培养基。其中生长素包括但不限于萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)或2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，或者本领域技术人员所熟知的其他能够用于愈伤组织培养的生长素；细胞分裂素包括但不限于6-苄氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)或玉米素(ZT)，或者本领域技术人员所熟知的其他能够用于愈伤组织培养的细胞分裂素。
在本发明中，采用含有生长素和/或细胞分裂素的E1液体培养基对胚性愈伤组织培养，促进胚性愈伤组织的增殖。
所述步骤b-f中的E2液体培养基各自独立的为不含生长素或细胞分裂素的液体植物培养基。在本发明中，采用E2液体培养基对胚性愈伤组织培养，实现胚性愈伤组织的发育。
在本发明中，采用液体悬浮培养的方式对胚性愈伤组织进行培养。与固体培养相比，首先，悬浮培养可以增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；其次，可避免有害代谢产物的局部积累而对细胞自身产生毒害。通过悬浮培养能产生大量的比较均一的细胞，而且细胞增殖速度快。
胚性愈伤组织根据不同的生长时期，其体积大不同。基于此，本发明采用筛网过滤的方法获得生长状态一致的胚性愈伤组织，并且应用此方法进而得到生长状态一致的球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚。
本发明提供的板栗体细胞胚发育的同步化方法，对胚性愈伤组织进行液体悬浮培养，并对不同发育时期特定体积大小的胚性愈伤组织进行筛选，获得生长状态一致的胚性愈伤组织，以及球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚。其中，球形胚的同步率为91.82％，心形胚的同步率为83.92％，鱼雷形胚的同步率为76.69％，子叶形胚的同步率为69.52％，基本实现了板栗体细胞胚发育过程中的各个时期的同步化。
作为进一步技术方案，所述E1液体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、0.8-1.2g/L水解酪蛋白、1.5-2.0μM 2,4-D、0.8-1.5μM6-BA和25-35g/L蔗糖。其中，WPM为木本植物用培养基，含有木本植物生长所必须的营养物质；Nitsch&Nitsch Vitamins为维生素溶液。
优选地，所述E1液体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、1.0g/L水解酪蛋白、1.8μM 2,4-D、1.1μM 6-BA和30g/L蔗糖。在本发明中，通过对E1液体培养基的组分的进一步调整和优化，使得进一步促进胚性愈伤组织的增殖，避免分化。
所述E2液体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&NitschVitamins、0.8-1.2g/L水解酪蛋白、0.3-0.8g/L谷氨酰胺和55-65g/L蔗糖；
优选地，所述E2液体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、1.0g/L水解酪蛋白、0.5g/L谷氨酰胺和60g/L蔗糖。
在本发明中，通过对E2液体培养基的组分的进一步调整和优化，使得胚性愈伤组织更好的发育。
作为进一步技术方案，所述步骤a和步骤b中，每0.09-0.11g的胚性愈伤组织各自独立的接种至90-110mL的液体培养基中。
优选地，每0.10g的胚性愈伤组织各自独立的接种至100mL的液体培养基中。
在本发明中，通过对胚性愈伤组织和液体培养基比例的进一步调整和优化，使得胚性愈伤组织能够更好的生长。
作为进一步技术方案，所述步骤a-f的培养温度各自独立的为24-26℃，例如可以为，但不限于24℃、24.5℃、25℃、25.5℃或26℃，优选为25℃。
和/或，所述步骤a-f的培养方式各自独立的为震荡培养。
在本发明中，采用液体悬浮培养的方式对胚性愈伤组织进行震荡培养，使愈伤组织块变成具有良好分散性的细胞和小的细胞聚集体，增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；并且，在振荡条件下可避免有害代谢产物的局部积累而对细胞自身产生毒害；另外，振荡培养还可以适当改善气体的交换。
所述震荡培养的转速为90-110r/min，例如可以为，但不限于90r/min、95r/min、100r/min、105r/min或110r/min，优选为100r/min。
在本发明中，通过对胚性愈伤组织培养温度和培养转速的进一步调整和优化，为胚性愈伤组织提供一个更适宜的培养环境。
作为进一步技术方案，所述步骤a-f的培养时间各自独立的为6-8天，例如可以为，但不限于6天、6.5天、7天、7.5天或8天，优选为7天。
随着胚性愈伤组织的培养，培养液中的营养物质逐渐消耗，有害物质逐渐增加，胚性愈伤组织的培养时间影响愈伤组织的生长状态。通过对胚性愈伤组织培养时间的进一步调整和优化，使得胚性愈伤组织生长良好，同时也有利于对同一生长状态的胚性愈伤组织的筛选。
作为进一步技术方案，所述板栗的胚性愈伤组织的诱导方法包括：
将板栗的外植体接种至IMM固体培养基上培养，得到愈伤团，然后将愈伤团置于IMM液体培养基中培养，再转接到E2固体培养基上培养，得到胚性愈伤组织。
在本发明中，将板栗的外植体接种至IMM固体培养基上培养，诱导得到愈伤团，待愈伤团长到4-6mm时，将愈伤团置于IMM液体培养基中培养，进一步对愈伤团进行诱导和增殖，之后再转接到E2固体培养基上培养，得到胚性愈伤组织。
所述IMM固体培养基和/或IMM液体培养基为含有生长素的植物培养基。含有生长素的IMM固体培养基或IMM液体培养能够诱导植物外植体的细胞的脱分化，获得愈伤组织。
所述E2固体培养基为不含生长素或细胞分裂素的固体植物培养基。在本发明中，采用E2固体培养基对愈伤组织培养，获得胚性愈伤组织。
作为进一步技术方案，所述板栗的外植体包括但不限于胚珠或胚尖，或者本领域技术人员所熟知的其他易于诱导得到胚性愈伤组织的外植体。
优选地，所述胚尖为盛花期后45-54天胚尖。采用盛花期后45-54天胚尖更有利于胚性愈伤组织的形成。
作为进一步技术方案，所述IMM固体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、25-35g/L蔗糖、1.8-2.2mg/L2,4-D和5-7g/L固化剂；
优选地，所述IMM固体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、30g/L蔗糖、2.0mg/L 2,4-D和6g/L琼脂；
所述IMM液体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&NitschVitamins、25-35g/L蔗糖和1.8-2.2mg/L 2,4-D；
优选地，所述IMM液体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、30g/L蔗糖和2.0mg/L 2,4-D；
所述E2固体培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、100-120mg/L Nitsch&NitschVitamins、0.8-1.2g/L水解酪蛋白、0.3-0.8g/L谷氨酰胺、55-65g/L蔗糖和3-4g/L固化剂；
优选地，所述E2固体培养基的组分包括：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&NitschVitamins、1.0g/L水解酪蛋白、0.5g/L谷氨酰胺、60g/L蔗糖和3.5g/L植物凝胶。
在本发明中，固化包括但不限于琼脂或植物凝胶，或者本领域技术人员所熟知的用于固体培养基配制的固化剂。
在本发明中，通过对IMM固体培养基、IMM液体培养基和E2固体培养基组分的进一步优化和调整，使得更好的得到胚性愈伤组织。
作为进一步技术方案，所述将愈伤组织置于IMM液体培养基中培养的时间为6-8周，例如可以为，但不限于6周、7周或8周，优选为7周。
通过对IMM液体培养基中培养时间进一步的优化和调整，得到生长状态良好的愈伤组织。
第二方面，本发明提供了一种组培苗的生根方法，包括以下步骤：
将采用本发明提供的同步化方法得到的子叶形胚进行诱导得到组培苗，然后将组培苗在生根培养基中培养生根。
所述组培苗不含根部组织。本发明中的组培苗为不含根部组织的组培苗。
所述生根培养基的组分包括：2.0-2.5g/L WPM、25-35g/L蔗糖、5-7g/L固化剂和0.1-2.0mg/L IBA。在生根培养基中，IBA的浓度会影响组培苗的生根率。
优选地，所述生根培养基的组分包括：2.3g/L WPM、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂和0.5mg/L IBA。
通过对生根培养基进一步优化和调整，使得组培苗的生根率更高。
优选地，所述组培苗在生根培养基中培养的条件包括：
温度为23-25℃，时间为15-17h，每天光照15-17h。
本发明提供的组培苗生根方法，能够促进组培苗的生根，提高生根率。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
需要说明的是，本发明中培养基的各成分配置好后，于121℃高温高压灭菌20分钟；本发明中各培养基涉及的成分均通过市售购买得到。
实施例1
(1)植物材料
燕山红栗(C.mollissima cv.Yanshanhongli)采自北京市怀柔区板栗试验站。板栗的采样时期为花后45-54天，选取的是未成熟的幼胚。
(2)板栗胚性愈伤组织的诱导
取板栗的幼胚胚尖，采用3％次氯酸钠和75％酒精杀菌消毒后接种到IMM固体培养基上，等到愈伤团长到5mm时，再将愈伤团放到液体IMM培养基中培养7周，最后再转接到E2固体培养基上培养，直至胚性愈伤形成。
(3)板栗体细胞胚同步化的培养
a.将0.1g胚性愈伤组织接种至250mL无菌锥形瓶中，并加入100mL的E1液体培养基，摇床培养7天后，将悬浮培养物依次用20目和40目的筛网过滤，保留40目上的胚性愈伤组织，用无菌滤纸吸掉胚性愈伤表面残留的培养基；
b.将步骤a保留的0.1g胚性愈伤组织接种至含有100mL的E2液体培养基的锥形瓶中悬浮培养，摇床培养7天后，依次用20目和40目的筛网过滤，保留40目上的球形胚，用无菌滤纸吸掉球形胚表面残留的培养基；
c.将步骤b保留的球形胚在含有100mL的E2液体培养基的锥形瓶中继代培养，摇床培养7天后，依次用20目和40目的筛网过滤，保留40目上的心形胚，用无菌滤纸吸掉心形胚表面残留的培养基；
d.将步骤c保留的心形胚在含有100mL的E2液体培养基的锥形瓶中继代培养，摇床培养7天后，依次用10目和20目的筛网过滤，保留20目上的鱼雷形胚，用无菌滤纸吸掉鱼雷形胚表面残留的培养基；
e.将步骤d保留的鱼雷形胚在含有100mL的E2液体培养基的锥形瓶中继代培养，摇床培养7天后，依次用10目和20目的筛网过滤，保留20目上的胚，用无菌滤纸吸掉体细胞胚表面残留的培养基；
f.将步骤e保留的体细胞胚在含有100mL的E2液体培养基的锥形瓶中继代培养，摇床培养7天后，得到子叶形胚；
步骤a-f的培养条件为：25℃，摇床转速100r/min。
其中，E1液体培养基的组分为：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、1.0g/L水解酪蛋白、1.8μM 2,4-D、1.1μM 6-BA和30g/L蔗糖；
E2液体培养基的组分为：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、1.0g/L水解酪蛋白、0.5g/L谷氨酰胺和60g/L蔗糖；
E2固体培养基的组分为：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、1.0g/L水解酪蛋白、0.5g/L谷氨酰胺、60g/L蔗糖和3.5g/L植物凝胶。
IMM固体培养基的组分为：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、30g/L蔗糖、2.0mg/L 2,4-D和6g/L琼脂；
IMM液体培养基的组分为：2.3g/L WPM、109mg/L Nitsch&Nitsch Vitamins、30g/L蔗糖和2.0mg/L 2,4-D。
对比例1
固体培养的方法为称取约0.1g胚性愈伤接种到E2固体培养基中。每7天继代一次，每一周观察一次板栗体细胞胚的形态并统计数据，计算并统计板栗体细胞胚各个时期的同步率。
板栗体细胞胚的同步率
表1实施例1和对比例1的胚性愈伤组织各个发育时期的同步率
胚 球形胚 心形胚 鱼雷形胚 子叶形胚
实施例1 91.82％ 83.92％ 76.69％ 69.52％
对比例1 78.51％ 32.24％ 25.79％ 19.33％
如图1和表1所示，在实施例1的板栗体细胞胚同步化培养过程中，液体培养一周之后获得球形胚(图1中的a)，液体培养两周之后可以观察到心形胚(图1中的b)，液体培养三周后获得鱼雷形胚(图1中的c)，液体培养五周后发育为子叶形胚(图1中的d)。其中，球形胚的同步率为91.82％、心形胚为83.92％、鱼雷形胚为76.69％、子叶形胚为69.52％。
板栗体细胞胚在液体/固体培养条件下的各个发育时期的同步率如图2所示，可以看出，实施例1与对比例1相比，采用本发明提供的板栗体细胞胚的同步化方法，体细胞胚在各个发育时期的同步率远超对比例1。可见，本发明提供的板栗体细胞胚发育同步化的方法，能够为优化板栗体细胞胚的再生体系奠定良好的基础。
实施例2
将实施例1中的子叶形胚进行诱导得到组培苗，然后将将生长状态良好的板栗组培苗接种到生根培养基中进行培养，其中生根培养基的组分包括：2.3g/L WPM、30g/L蔗糖、0.1mg/L IBA和6.5g/L琼脂(pH 5.5)。板栗组培苗在23-25℃，16h/8h光周期下培养。三次重复，培养25天后统计生根情况并分析数据。
实施例3
与实施例2的区别在于，生根培养基中IBA的浓度为0.2mg/L。
实施例4
与实施例2的区别在于，生根培养基中IBA的浓度为0.5mg/L。板栗组培苗的生根的照片如图3所示。
实施例5
与实施例2的区别在于，生根培养基中IBA的浓度为1.0mg/L。
实施例6
与实施例2的区别在于，生根培养基中IBA的浓度为2.0mg/L。
对比例2
与实施例2的区别在于，生根培养基中不添加IBA。
组培苗的生根情况
表2实施例2-6和对比例2的组培苗生根情况
项目 最初接种数 25天生根数 生根率(％)
对比例2 90 0 0
实施例2 87 9 10.27±0.031d
实施例3 122 63 51.65±0.025b
实施例4 93 70 75.28±0.012a
实施例5 87 45 51.69±0.017b
实施例6 92 39 42.40±0.033c
注：字母代表显著水平是0.05。
如表2所示，不同浓度IBA处理的组培苗生根效果呈现显著差异，随着IBA浓度的升高，组培苗生根率呈现先升高再下降的趋势，当采用组分为：2.3g/L WPM、30g/L蔗糖、0.5mg/L IBA和6.5g/L琼脂的生根培养基对组培苗进行培养时(图3)，板栗组培苗的生根率最高(75.28％)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (14)

1.一种板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 将板栗的胚性愈伤组织接种至E1液体培养基中悬浮培养，筛选保留20-40目的胚性愈伤组织；
b. 将步骤a保留的胚性愈伤组织接种至E2液体培养基中悬浮培养，筛选保留20-40目的球形胚；
c. 将步骤b保留的球形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留20-40目的心形胚；
d. 将步骤c保留的心形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留10-20目的鱼雷形胚；
e. 将步骤d保留的鱼雷形胚在E2液体培养基中继代培养，筛选保留10-20目的体细胞胚；
f. 将步骤e保留的体细胚胚在E2液体培养基中继代培养，得到子叶形胚；
所述E1液体培养基为含有生长素和/或细胞分裂素的液体植物培养基；
所述步骤b-f中的E2液体培养基各自独立的为不含生长素或细胞分裂素的液体植物培养基；
所述步骤a-f的培养方式各自独立的为震荡培养；
所述步骤a-f的培养时间各自独立的为6-8天；
所述E1液体培养基的组分为：2.0-2.5 g/L WPM、100-120 mg/L Nitsch & NitschVitamins、0.8-1.2 g/L水解酪蛋白、1.5-2.0 µM 2,4-D、0.8-1.5 µM 6-BA和25-35 g/L蔗糖；
所述E2液体培养基的组分为：2.0-2.5 g/L WPM、100-120 mg/L Nitsch & NitschVitamins、0.8-1.2 g/L水解酪蛋白、0.3-0.8 g/L谷氨酰胺和55-65 g/L蔗糖。
2.根据权利要求1所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述E1液体培养基的组分为：2.3 g/L WPM、109 mg/L Nitsch & Nitsch Vitamins、1.0 g/L水解酪蛋白、1.8 µM 2,4-D、1.1 µM 6-BA和30 g/L蔗糖；
所述E2液体培养基的组分为：2.3 g/L WPM、109 mg/L Nitsch & Nitsch Vitamins、1.0 g/L水解酪蛋白、0.5 g/L谷氨酰胺和60 g/L蔗糖。
3.根据权利要求1所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述步骤a和步骤b中，每0.09-0.11g的胚性愈伤组织各自独立的接种至90-110 mL的液体培养基中。
4.根据权利要求3所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，每0.10 g的胚性愈伤组织各自独立的接种至100 mL的液体培养基中。
5.根据权利要求1所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述步骤a-f的培养温度各自独立的为24-26℃；
所述震荡培养的转速为90-110 r/min。
6.根据权利要求5所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述步骤a-f的培养温度各自独立的为25℃；
所述震荡培养的转速为100 r/min。
7.根据权利要求1所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述步骤a-f的培养时间各自独立的为7天。
8.根据权利要求1所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述板栗的胚性愈伤组织的诱导方法包括：
将板栗的外植体接种至IMM固体培养基上培养，得到愈伤团，然后将愈伤团置于IMM液体培养基中培养，再转接到E2固体培养基上培养，得到胚性愈伤组织；
所述IMM固体培养基和/或IMM液体培养基为含有生长素的植物培养基；
所述E2固体培养基为不含生长素或细胞分裂素的固体植物培养基；
所述IMM固体培养基的组分为：2.0-2.5 g/L WPM、100-120 mg/L Nitsch & NitschVitamins、25-35 g/L 蔗糖、1.8-2.2 mg/L 2,4-D和5-7 g/L固化剂；
所述IMM液体培养基的组分为：2.0-2.5 g/L WPM、100-120 mg/L Nitsch & NitschVitamins、25-35 g/L 蔗糖和1.8-2.2 mg/L 2,4-D；
所述E2固体培养基的组分为：2.0-2.5 g/L WPM、100-120 mg/L Nitsch & NitschVitamins、0.8-1.2 g/L水解酪蛋白、0.3-0.8 g/L谷氨酰胺、55-65 g/L蔗糖和3-4 g/L固化剂。
9.根据权利要求8所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述板栗的外植体包括胚珠或胚尖；
所述胚尖为盛花期后45-54天胚尖。
10.根据权利要求8所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述IMM固体培养基的组分为：2.3 g/L WPM、109 mg/L Nitsch & Nitsch Vitamins、30 g/L 蔗糖、2.0mg/L 2,4-D和6 g/L琼脂；
所述IMM液体培养基的组分为：2.3 g/L WPM、109 mg/L Nitsch & Nitsch Vitamins、30 g/L 蔗糖和2.0 mg/L 2,4-D；
所述E2固体培养基的组分为：2.3 g/L WPM、109 mg/L Nitsch & Nitsch Vitamins、1.0 g/L水解酪蛋白、0.5 g/L谷氨酰胺、60 g/L蔗糖和3.5 g/L植物凝胶。
11.根据权利要求8所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述将愈伤团置于IMM液体培养基中培养的时间为6-8周。
12.根据权利要求11所述的板栗体细胞胚发育的同步化方法，其特征在于，所述将愈伤团置于IMM液体培养基中培养的时间为7周。
13.一种组培苗的生根方法，其特征在于，包括以下步骤：
将采用权利要求1-12任一项所述的同步化方法得到的子叶形胚进行诱导得到组培苗，然后将组培苗在生根培养基中培养生根；
所述组培苗不含根部组织；
所述生根培养基的组分为：2.0-2.5 g/L WPM、25-35 g/L 蔗糖、5-7 g/L固化剂和0.1-2.0 mg/L IBA；
所述组培苗在生根培养基中培养的条件包括：
温度为23-25℃，每天光照15-17 h。
14.根据权利要求13所述的组培苗的生根方法，其特征在于，所述生根培养基的组分为：2.3 g/L WPM、30 g/L 蔗糖、6.5 g/L琼脂和0.5 mg/L IBA。
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