CN101002539A - 一种筛选甘薯耐盐突变体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选甘薯耐盐突变体的方法。该方法包括：1)将继代培养的甘薯胚性悬浮细胞，进行70－100Gy的60Coγ－射线辐照处理，剂量率为1－1.2Gy/分钟；2)将处理后的胚性悬浮细胞用液体MS+1.5～2.5mg/L 2，4－D+2.0～3.5％NaCl培养3－5周，转至液体MS+1.5～2.5mg/L 2，4－D+1.0～2.0％NaCl中培养1－3周，再转至液体MS+1.5～2.5mg/L 2，4－D中培养；3)将获得的细胞团转移到固体MS+1.5～2.5mg/L 2，4－D中培养；4)将具有体细胞胚的胚性愈伤组织在固体MS+0.5～2.0mg/L ABA+2.0～3.5％NaCl上培养3－5周，转至固体MS+0.5～2.0mg/L ABA+1.0～2.0％NaCl上培养1－3周，再转至固体MS+0.5～2.0mg/L ABA上培养；5)将再生的小植株培养在MS基本培养基上，使其形成完整的再生植株；6)将再生植株培养在MS+1.0％～2.0％NaCl上；7)将成活的植株用含有0.5～1.0％NaCl的霍格兰溶液水培3－5周，得到甘薯耐盐突变体。

Description

一种筛选甘薯耐盐突变体的方法
技术领域
本发明涉及一种筛选甘薯耐盐突变体的方法。
背景技术
土壤盐渍化是威胁农业生产的一个全球性问题，全球约有10亿hm2的盐渍土，约占世界陆地面积的7.6％。我国约有0.2亿hm2盐渍土，并且随着灌溉面积和设施栽培面积的不断扩大，土壤的次生盐渍化也在日趋严重。提高植物的耐盐性是对盐渍土进行生物治理和综合开发利用的一个重要途径。
甘薯是一种重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源用作物，我国相当一部分甘薯种植于沿海坡地和丘陵干旱地区，由于这些地区的土壤含盐量较高，加上旱区土壤返盐严重，给甘薯生产带来不少困难。所以，开发甘薯耐盐突变体的筛选方法，对进一步开发耐盐甘薯新品种应用于甘薯生产具有重要的意义和应用价值。
到目前为止，有关甘薯耐盐突变体的筛选方法的报道很少，仅李爱贤等(2002，农业生物技术学报，10(1)：24-28)报道了甘薯耐盐突变体离体筛选的初步研究结果，即用2.0mg/L NaCl处理甘薯胚性悬浮细胞1次，然后进行正常培养，不再进行筛选培养，获得了少量再生植株，但未对这些再生植株的耐盐性进行鉴定。再生植株的耐盐性鉴定结果表明，这些植株不具有耐盐性。
因此，目前急需开发出能成功地筛选甘薯耐盐突变体的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选甘薯耐盐突变体的方法。
本发明所提供的筛选甘薯耐盐突变体的方法，包括以下步骤：
(1)将继代培养的甘薯胚性悬浮细胞，用辐射剂量为70-100Gy的60Coγ-射线进行辐照处理，剂量率为1-1.2Gy/分钟；
(2)将辐照处理后的甘薯胚性悬浮细胞用含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS液体培养基(MS+1.5～2.5mg/L 2，4-D+2.0％～3.5％NaCl)进行筛选培养，3-5周后，转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS液体培养基中进行培养；1-3周后，再转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS液体培养基中培养；
(3)将获得的直径为0.5-2.0mm的耐盐细胞团转移到含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS固体培养基上，在25-28℃、黑暗条件下进行静置培养，使细胞团增殖形成胚性愈伤组织和体细胞胚；
(4)将具有体细胞胚的胚性愈伤组织在含有0.5-2.0mg/L ABA、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS固体培养基上进行重复筛选培养，3-5周后，转移至含有0.5-2.0mg/L ABA、质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS固体培养基上进行培养；1-3周后，再转至含有0.5-2.0mg/L ABA的MS固体培养基上进行培养，使体细胞胚发芽形成再生小植株；
(5)将再生的小植株培养在MS基本培养基上，使其形成完整的再生植株；
(6)将再生的完整植株培养在含有质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS培养基上，筛选除去假阳性耐盐植株；
(7)将获得的耐盐植株移栽到土壤中，使其成活；
(8)将成活的植株进一步用含有质量百分含量为0.5％-1.0％的NaCl的霍格兰(Hoagland)溶液水培3-5周，再次筛选除去假阳性耐盐植株，得到甘薯耐盐突变体。
上述方法中，所述步骤(1)的甘薯胚性悬浮细胞可按照常规方法进行制备、继代，如可按照下述文献中描述的方法进行甘薯胚性悬浮细胞的制备、继代：刘庆昌等(农业生物技术学报，1996，4(3)：238～242)。所述继代培养的甘薯胚性悬浮细胞可为继代培养8-14次的甘薯胚性悬浮细胞。所述继代培养的甘薯胚性悬浮细胞优选为继代培养2-5天的甘薯胚性悬浮细胞。
为了提高筛选效果，所述步骤(2)中，还包括在用含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS液体培养基(MS+1.5～2.5mg/L 2，4-D+1.0％～3.5％NaCl)进行筛选培养之前，进行如下培养的步骤：将辐照处理后的甘薯胚性悬浮细胞先在含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS液体培养基中培养5-7天。
所述步骤(2)中的培养条件均可为在25-28℃、每天10-15小时光照进行振荡培养；所述振荡培养的条件为水平摇床，转速为100转/分钟；所述光照的光照强度为400-700lux。
所述步骤(3)中，所述耐盐细胞团的直径优选为0.5-1.5mm。
所述步骤(4)和(6)中的培养条件均可为在25-28℃、每天10-15小时光照；所述光照的光照强度为3000-4000lux。
所述步骤(7)中，成活培养的空气相对湿度可为80％-90％。
所述步骤(8)中的水培温度可为25-28℃。
本发明用适当剂量和剂量率的60Coγ-射线辐照处理甘薯胚性悬浮细胞，将辐照处理后的甘薯胚性悬浮细胞以NaCl作为选择剂进行多步间断离体重复筛选，并将离体筛选获得的耐盐突变体用含有NaCl的霍格兰(Hoagland)溶液进行水培筛选，获得甘薯耐盐突变体。本发明所具有的主要优点和效果如下：
(1)重复性好：利用本发明的方法，进行3次以上的独立实验，均获得了稳定一致的结果。  (2)适用范围广：本发明的方法适用于多个甘薯品种，如在甘薯品种栗子香、徐薯18等中均获得稳定遗传的耐盐突变体。(3)操作简单方便，易于掌握。
下面结合较佳实施例进一步说明。
附图说明
图1为栗子香耐盐细胞团增殖形成的胚性愈伤组织和体细胞胚
图2A为在添加1.0mg/L ABA、2.0％NaCl的MS固体培养基上培养4周的栗子香的耐盐胚性愈伤组织和开始发芽的体细胞胚
图2B为栗子香的耐盐体细胞胚发芽形成的再生小植株
图3为在添加1.0％NaCl的MS培养基上筛选获得的栗子香耐盐植株
图4为在温室中，用含有0.7％NaCl的霍格兰溶液水培4周后栗子香耐盐植株的生长情况
图5为获得的栗子香耐盐突变体
具体实施方式
本发明的筛选甘薯耐盐突变体的方法，具体包括以下步骤：
1、制备甘薯胚性悬浮细胞。将甘薯胚性悬浮细胞培养10周后，取继代培养2-5天的胚性悬浮细胞，用辐射剂量为70-100Gy的60Coγ-射线进行辐照处理，剂量率为1.0-1.2Gy/分钟。
2、将辐照处理后的甘薯胚性悬浮细胞用含有1.5-2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的Murashige和Skoog(MS)液体培养基培养5-7天后，将甘薯胚性悬浮细胞用含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、2.0％-3.5％NaCl的MS液体培养基培养3-5周后，转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、1.0％-2.0％NaCl的MS液体培养基中培养1-3周后，再转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS液体培养基进行培养。培养条件均为在25-28℃、每天10-15小时光照进行振荡培养。其中，振荡培养的条件为水平摇床，转速为100转/分钟；光照的光照强度为400-700lux。
3、将获得的直径为0.5-2.0mm的耐盐细胞团转移到含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS固体培养基中，在25-28℃、黑暗条件下进行静置培养，使细胞团增殖形成胚性愈伤组织和体细胞胚。
4、将具有体细胞胚的胚性愈伤组织在含有0.5-2.0mg/L脱落酸(ABA)、2.0％-3.5％NaCl的MS固体培养基上进行重复筛选培养，4周后，转至添加0.5-2.0mg/LABA、1.0％-2.0％NaCl的MS固体培养基上进行培养；1周后，再转至含有0.5-2.0mg/LABA但不含NaCl的MS固体培养基上进行培养，使体细胞胚发芽形成再生小植株。其中，培养条件均为25-28℃，每天10-15小时光照、光照强度为3000-4000lux。
5、将再生的小植株培养在MS基本培养基中，使其形成完整的再生植株。
6、将再生的完整植株培养在含有1.0％-2.0％NaCl的MS培养基上，筛选除去假阳性耐盐植株(假阳性耐盐植株死亡，真正的耐盐植株存活下来)。其中，培养条件均为25-28℃，每天10-15小时光照、光照强度为3000-4000lux。
7、将获得的耐盐植株移栽到土壤中，在80％-90％的相对空气湿度下，使其成活。
8、将成活植株进一步用含有0.5％-1.0％NaCl的霍格兰(Hoagland)溶液水培4周，再次筛选除去假阳性耐盐植株(假阳性耐盐植株死亡，真正的耐盐植株存活下来)。水培温度为25-28℃，自然光照。
其中，MS基本培养基的组成如表1，液体MS基本培养基中不加琼脂。Hoagland溶液的组成如表2。
表1 Murashige和Skoog培养基的组成
    组成     浓度(mg/L)
    NH4NO3KNO3CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OK2HPO4.H2ONa2-EDTAFeSO4.7H2OMnSO4.4H2OZnSO4.7H2OH3BO3KINa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O盐酸硫胺素VB1烟酸盐酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸蔗糖琼脂pH     1650190044037017037.327.822.38.66.20.830.250.0250.0250.10.50.51001.03000080005.8
表2 霍格兰(Hoagland)溶液的组成
    组成     浓度(g/L)
    硝酸钙硝酸钾硫酸镁磷酸氢二铵EDTA-FeNa氯化锰硫酸铜硫酸锌硼酸钼酸铵     0.950.610.490.120.03670.0020.000240.000290.001860.000035
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、甘薯品种栗子香的耐盐突变体的筛选
1、按照如下方法制备栗子香的胚性悬浮细胞：(1)取温室旺盛生长植株的茎尖约30mm，用自来水冲洗后，用70％酒精消毒10秒，再用2％次氯酸钠消毒5分钟，最后用无菌蒸馏水洗净；(2)在解剖镜下剥取长约0.5mm的茎尖，在26-28℃、黑暗下，培养在添加2.0mg/L 2，4-D、3.0％蔗糖和0.8％琼脂、pH5.8的MS培养基上，培养4-8周后即形成理想的胚性愈伤组织；(3)将胚性愈伤组织用孔径100μm的不锈钢网筛破碎成细胞团，然后转移到装有2.0mg/L 2，4-D和3％蔗糖、pH5.8的20mL MS培养基的100mL三角瓶中，放在100转/分钟的水平摇床上，在26-28℃、每天13小时光照、光照强度500lux下进行培养，每隔7天继代培养1次，继代培养10次后用于辐照处理。
2、取继代培养3天的胚性悬浮细胞5g，用辐射剂量为80Gy的60Coγ-射线进行辐照处理，剂量率为1.12Gy/分钟。
3、将辐照处理后的胚性悬浮细胞用含有2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基培养5-7天。其中，培养条件是在26-28℃，每天13小时光照、光照强度为500lux，在水平摇床上以100转/分钟的转速进行振荡培养。
4、将胚性悬浮细胞在含有2.0mg/L 2，4-D、2.0％NaCl的MS液体培养基中筛选培养4周后，转至含有2.0mg/L 2，4-D、1.0％NaCl的MS液体培养基中培养1周后，再转至含有2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基中培养6周后，共获得270个直径为0.8-1.2mm的耐盐细胞团。培养条件均为水平摇床、转速为100转/分钟的振荡培养，26-28℃，每天13小时、500lux光照。
5、将获得的耐盐细胞团转移到含有2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基上，在26-28℃、黑暗条件下静置培养6周，结果如图1所示，细胞团增殖形成胚性愈伤组织和体细胞胚。
6、将具有体细胞胚的胚性愈伤组织在含有1.0mg/L ABA、2.0％NaCl的MS固体培养基中培养4周(图2A)后，转至添加1.0mg/L ABA、1.0％NaCl的MS固体培养基中培养1周后，再转至含有1.0mg/L ABA的MS固体培养基上培养3周，共获得223个耐盐胚性愈伤组织，并且体细胞胚发芽形成小植株，获得如图2B所示的276株再生植株。培养条件均为26-28℃，每天13小时光照、光照强度为3000lux。
7、将再生的小植株在MS基本培养基上培养4周，形成完整的再生植株。培养条件为26-28℃，每天13小时光照、光照强度为3000lux。
8、将再生的完整植株培养在含有1.0％NaCl的MS培养基上，培养条件为26-28℃，每天光照13小时、光照强度为3000lux，筛选除去假阳性耐盐植株，获得51株耐盐植株。其中，筛选获得的部分栗子香耐盐植株如图3所示，左侧的两瓶为栗子香耐盐植株，右侧的一瓶为不耐盐植株，已死亡。
9、将获得的耐盐植株移栽到装有1∶1的蛭石和土的移栽盆中，在80％-90％的空气相对湿度下，全部成活。在温室中，将这51株植株(系)进一步用含有0.7％NaCl的霍格兰溶液水培4周，水培温度为26-28℃，温室自然光照，再次筛选除去假阳性耐盐植株。其中，获得的部分耐盐植株如图4所示，“98”和“152”为耐盐植株，对照(CK)为未经耐盐筛选的栗子香植株，其它为假阳性植株，对照和假阳性植株均死亡。
10、将获得的耐盐植株栽入含有0.7％NaCl的土壤中，在26-28℃，温室自然光照培养12周，获得18株耐盐突变体。其中，部分耐盐突变体如图5所示，表明这些耐盐突变体在含有0.7％NaCl的土壤中旺盛生长。
实施例2、甘薯品种徐薯18的耐盐突变体的筛选
1、按照如下方法制备徐薯18的胚性悬浮细胞：(1)取温室旺盛生长植株的茎尖约30mm，用自来水冲洗后，用70％酒精消毒10秒，再用2％次氯酸钠消毒5分钟，最后用无菌蒸馏水洗净；(2)在解剖镜下剥取长约0.5mm的茎尖，在26-28℃、黑暗下，培养在添加2.0mg/L 2，4-D、3.0％蔗糖和0.8％琼脂、pH5.8的MS培养基上，培养4-8周后即形成理想的胚性愈伤组织；(3)将胚性愈伤组织用孔径100μm的不锈钢网筛破碎成细胞团，然后转移到装有2.0mg/L 2，4-D和3％蔗糖、pH5.8的20mL MS培养基的100mL三角瓶中，放在100转/分钟的水平摇床上，在26-28℃、每天13小时光照、光照强度500lux下进行培养，每隔7天继代培养1次，继代培养10次后用于辐照处理。
2、取继代培养3天的胚性悬浮细胞5g，用辐射剂量为100Gy的60Coγ-射线进行辐照处理，剂量率为1.2Gy/分钟。
3、将辐照处理后的胚性悬浮细胞用含有2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基培养5-7天。其中，培养条件是在26-28℃，每天13小时光照、光照强度为500lux，在水平摇床上、转速为100转/分钟下振荡培养。
4、将胚性悬浮细胞在含有2.0mg/L 2，4-D、3.0％NaCl的MS液体培养基中筛选培养4周后，转至含有2.0mg/L 2，4-D、2.0％NaCl的MS液体培养基中培养1周后，转至含有2.0mg/L 2，4-D、1.0％NaCl的MS液体培养基中培养1周后，再转至含有2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基中培养2周后，共获得75个直径为0.6-1.2mm的耐盐细胞团。培养条件均为水平摇床、转速为100转/分钟振荡培养，26-28℃，每天13小时、500lux光照。
5、将获得的耐盐细胞团转移到含有2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基上，在26-28℃、黑暗条件下静置培养4周，细胞团增殖形成胚性愈伤组织和体细胞胚。
6、将具有体细胞胚的胚性愈伤组织在含有1.0mg/L ABA、3.0％NaCl的MS固体培养基中培养4周后，转至添加1.0mg/L ABA、2.0％NaCl的MS固体培养基上培养1周后，转至添加1.0mg/L ABA、1.0％NaCl的MS固体培养基上培养1周后，再转至含有1.0mg/L ABA的MS固体培养基上培养4周，共获得36个耐盐胚性愈伤组织，并且体细胞胚发芽形成小植株，获得40株再生植株。培养条件均为26-28℃，每天13小时光照、光照强度为3000lux。
7、将再生的小植株在MS基本培养基上培养4周，形成完整的再生植株。培养条件为26-28℃，每天13小时光照、光照强度为3000lux。
8、将再生的完整植株培养在含有2.0％NaCl的MS培养基上，培养条件为26-28℃，每天光照13小时、光照强度为3000lux，筛选除去假阳性耐盐植株，获得19株耐盐植株。
9、将获得的耐盐植株移栽到装有1∶1的蛭石和土的移栽盆中，在80％-90％的空气相对湿度下，全部成活。在温室中，将这19株植株(系)进一步用含有1.0％NaCl的霍格兰溶液水培5周，水培温度为26-28℃，温室自然光照，再次筛选除去假阳性耐盐植株。
10、将获得的耐盐植株栽入含有1.0％NaCl的土壤中，在26-28℃，温室自然光照培养14周，最后获得7株耐盐突变体。

Claims (10)

1、一种筛选甘薯耐盐突变体的方法，其特征是：它包括以下步骤：
(1)将继代培养的甘薯胚性悬浮细胞，用辐射剂量为70-100 Gy的60Coγ-射线进行辐照处理，剂量率为1-1.2Gy/分钟；
(2)将辐照处理后的甘薯胚性悬浮细胞用含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS液体培养基培养3-5周后，转至含有1.5-2.5mg/L2，4-D、质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS液体培养基中培养1-3周后，再转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS液体培养基中培养；
(3)将获得的直径为0.5-2.0mm的细胞团转移到含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS固体培养基中，在25-28℃、黑暗条件下进行静置培养，使细胞团增殖形成胚性愈伤组织和体细胞胚；
(4)将具有体细胞胚的胚性愈伤组织在含有0.5-2.0mg/L ABA、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS固体培养基上培养3-5周后，转移至含有0.5-2.0mg/L ABA、质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS固体培养基上培养1-3周后，再转至含有0.5-2.0mg/L ABA的MS固体培养基上培养，使体细胞胚发芽形成再生小植株；
(5)将再生的小植株培养在MS基本培养基上，使其形成完整的再生植株；
(6)将再生的完整植株培养在含有质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS培养基上，筛选除去假阳性耐盐植株；
(7)将获得的耐盐植株移栽到土壤中，使其成活；
(8)将成活的植株进一步用含有质量百分含量为0.5％-1.0％的NaCl的霍格兰(Hoagland)溶液水培3-5周，再次筛选除去假阳性耐盐植株，得到甘薯耐盐突变体。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，还包括在用含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS液体培养基进行筛选培养之前，进行如下培养步骤：将辐照处理后的甘薯胚性悬浮细胞先在含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS液体培养基中培养5-7天。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的培养条件均为在25-28℃、每天10-15小时光照进行振荡培养；所述振荡培养的条件为转速为100转/分钟；所述光照的光照强度为400-700lux；
所述步骤(2)中，将辐照处理后的甘薯胚性悬浮细胞用含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS液体培养基培养3-5周后，转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS液体培养基中培养1-3周后，转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D、1.0％NaCl的MS液体培养基中培养1周后，再转至含有1.5-2.5mg/L 2，4-D的MS液体培养基中培养。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)和(6)中的培养条件均为在25-28℃、每天10-15小时光照；所述光照的光照强度为3000-4000lux。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(8)中的水培温度为25-28℃。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述继代培养的甘薯胚性悬浮细胞为继代培养8-14次的甘薯胚性悬浮细胞。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述继代培养的甘薯胚性悬浮细胞为继代培养2-5天的甘薯胚性悬浮细胞。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述耐盐细胞团的直径为0.5-1.5mm；
所述步骤(4)中，将具有体细胞胚的胚性愈伤组织在含有0.5-2.0mg/L ABA、质量百分含量为2.0％-3.5％的NaCl的MS固体培养基上培养3-5周后，转移至含有0.5-2.0mg/L ABA、质量百分含量为1.0％-2.0％的NaCl的MS固体培养基上培养1-3周后，转至含有0.5-2.0mg/L ABA、1.0％NaCl的MS固体培养基中培养1-3周后，再转至含有0.5-2.0mg/L ABA的MS固体培养基上培养，使体细胞胚发芽形成再生小植株。
9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)中，成活培养的空气相对湿度为80％-90％。
10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述甘薯为栗子香或徐薯18。
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