CN107287147A - 一种控制甘薯胚性愈伤组织增殖速度的方法 - Google Patents

一种控制甘薯胚性愈伤组织增殖速度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种控制甘薯胚性愈伤组织增殖速度的方法。本发明的方法包括植物材料的选取、胚性愈伤组织的诱导、胚性细胞悬浮培养系的建立和胚性细胞悬浮培养速度的控制。通过实验证明：本发明的方法工艺流程简单，且胚性愈伤增殖速度可以控制，不仅弥补胚性愈伤的增殖速度跟实际需求不符的技术难题，并且随时可为甘薯的诱变育种和转基因提供大量的胚性愈伤材料。

Description

一种控制甘薯胚性愈伤组织增殖速度的方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及一种控制甘薯胚性愈伤组织增殖速度的方法。
背景技术
甘薯是一种重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。近些年，随着全球石油供给形势的日益严重，生物质能源的开发和利用日益重要。甘薯单位面积淀粉产量高，被认为是生产燃料乙醇的理想原料。甘薯作为新型的能源用植物，其市场潜力巨大，它将在我国能源安全中扮演重要的角色。
甘薯在遗传上高度杂合，种内、种间杂交不亲和以及遗传资源匮乏，遗传基础狭窄，病虫害、病毒病危害严重，制约了甘薯品种的遗传改良。
近年来，利用生物工程(甘薯转基因、诱变育种等)改良甘薯的品质、抗病虫性等性状已引起广泛的重视。能否成功将这一方法应用于甘薯改良，其关键是建立高效的甘薯再生系。刘庆昌(1996)在农业生物技术学报发表文章对甘薯胚性悬浮培养的研究表明：悬浮培养24周后得到的细胞团，其植株再生率在栗子香、高自1号和高系14号均达到100％。悬浮28周后，栗子香和高自1号的植株再生率仍为100％，高系14号再生率为85.7％。悬浮37周后，栗子香、高自1号和高系14号的植株再生率分别降至45.8％、83.3％和79.2％。从上面结果可以看出甘薯胚性愈伤的胚性保持时间随着悬浮时间的延长再生率降低。这就需要每年都剥取茎尖诱导制备胚性愈伤，而胚性愈伤的增殖速度与实际需求也可能不完全符合。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种甘薯胚性细胞的悬浮培养方法。
本发明的甘薯胚性细胞的悬浮培养方法为如下(1)或(2)：
(1)将甘薯胚性愈伤组织在MS培养基中进行悬浮培养，得到甘薯胚性细胞；
所述(1)中的悬浮培养条件为以小于100rpm的转速进行振荡培养；
(2)将甘薯胚性愈伤组织在MS培养基中进行悬浮培养，得到甘薯胚性细胞；
所述(2)中的悬浮培养条件为以100rpm的转速进行振荡培养。
上述方法中，所述小于100rpm的转速可以为95rpm、90rpm、85rpm、80rpm、75rpm、70rpm、65rpm或60rpm等小于100rpm的转速。在本发明的具体实施例中，所述小于100rpm的转速为70rpm。
上述方法中，所述MS培养基是将2,4-D、蔗糖和MS基础培养基混匀得到的液体培养基；
所述2,4-D在所述MS培养基中的浓度为2.0mg/L；
所述蔗糖在所述MS培养基中的质量分数均为3.0％。
上述方法中，所述甘薯胚性愈伤组织是将甘薯茎尖组织进行诱导培养得到的。在本发明的具体实施例中，所述茎尖组织长约0.5mm。所述甘薯胚性愈伤组织是将甘薯茎尖组织在MS固体培养基中诱导培养得到的。所述MS固体培养基是将琼脂与上述MS培养基混匀得到的培养基，所述琼脂在所述MS固体培养基中的质量分数为0.8％。
上述方法中，所述悬浮培养条件为27±1℃，每日13h、500lux光照。
上述方法中，所述振荡培养为水平振荡培养。
上述方法中，所述甘薯选自地方品种、选育品种、品系或国外引进品种；所述甘薯的品种具体为鄂薯6号。
上述方法中，所述(1)中的悬浮培养方法，培养物约14天继代1次，6-10周可以使胚性愈伤组织生长至生长旺盛、增殖迅速、色泽亮黄、表面结构致密的胚性细胞悬浮状态；所述(2)中的悬浮培养方法，培养物约7天继代1次，4-8周可以使胚性愈伤组织生长至生长旺盛、增殖迅速、色泽亮黄、表面结构致密的胚性细胞悬浮状态。在实际应用中，实验人员可根据需要选择转速条件，来控制胚性愈伤组织的增殖速度。
本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的甘薯胚性细胞。
本发明还有一个目的是提供上述方法的新用途。
本发明提供了上述方法在控制甘薯胚性愈伤组织的增殖速度中的应用。
本发明还提供了上述方法在控制甘薯胚性愈伤组织的植株再生率中的应用。
上述方法或上述甘薯胚性细胞在甘薯植株再生中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种控制甘薯胚性愈伤组织增殖速度的方法。本发明的方法包括植物材料的选取、胚性愈伤组织的诱导、胚性细胞悬浮培养系的建立和胚性细胞悬浮培养速度的控制。通过实验证明：胚性愈伤组织在不同转速条件下具有不同的增殖速度和植株再生率，可通过控制转速大小来控制胚性愈伤组织的增殖速度和植株再生率。本发明的方法工艺流程简单，且胚性愈伤增殖速度可以控制，不仅弥补胚性愈伤的增殖速度跟实际需求不符的技术难题，并且随时可为甘薯的诱变育种和转基因提供大量的胚性愈伤材料。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的甘薯品种“鄂薯6号”：记载于“苏文瑾,王连军,雷剑等.激素组合对甘薯鄂薯6号茎尖愈伤组织诱导及植株再生的影响.湖北农业科学.2012年第51卷第23期”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
下述实施例中的MS基础培养基的配方如表1所示。
表1、MS基础培养基的配方(pH 5.8)
培养基组成 含量mg/L 药品mg/母液mL 稀释倍数 每升培养基加入量(mL)
NH4NO3 1650 —— —— ——
KNO3 1900 —— —— ——
KH2PO4 170 —— —— ——
MgSO4·7H2O 370 —— —— ——
CaCl2·2H2O 440 —— —— ——
MnSO4·4H2O 22.3 558 100 10
ZnSO4·7H2O 8.6 215/250 100 10
H3BO3 6.2 620 1000 1
KI 0.83 83 1000 1
Na2MoO4·2H2O 0.25 25/100 1000 1
CuSO4·5H2O 0.025 25 10000 0.1
CoCl2·6H2O 0.025 25/100 10000 0.1
Na2EDTA·2H2O 37.23 745 200 5
FeSO4·7H2O 27.85 557/100 200 5
甘氨酸 2.0 100/50 1000 1
盐酸硫胺素 0.4 20/50 1000 1
盐酸吡哆醇 0.5 25/50 1000 1
尼克酸 0.5 25/50 1000 1
肌醇 100 2500/250 100 10
实施例1、一种控制甘薯胚性愈伤组织增殖速度和植株再生率的方法
一、植物材料的获取
选取温室健壮无病的甘薯品种鄂薯6号为实验材料。
二、胚性愈伤组织的诱导
剥取长约0.5mm的甘薯品种鄂薯6号的茎尖组织，将其培养在MS-2固体培养基(PH5.8)上，培养条件为27±1℃，黑暗，培养6-10周后，茎尖分生组织陆续形成胚性愈伤组织。上述MS-2固体培养基(PH5.8)是将2,4-D、蔗糖、琼脂和MS基础培养基混匀得到的培养基，其中，2,4-D在MS-2固体培养基中的浓度为2.0mg/L，蔗糖在MS-2固体培养基中的质量分数为3.0％，琼脂在MS-2固体培养基中的质量分数为0.8％。
三、胚性细胞的悬浮培养
1、不同转速条件下的胚性细胞的悬浮培养
将步骤二得到的胚性愈伤组织转入添加30mL MS-1液体培养基(MS-1液体培养基是将2,4-D、蔗糖和MS基础培养基混匀得到的培养基，其中，2,4-D在MS-1液体培养基中的浓度为2.0mg/L，蔗糖在MS-1液体培养基中的质量分数为3.0％)的三角瓶(100mL)中，置于水平摇床进行水平振荡培养，培养条件为27±1℃，每日13h、500lux光照。根据摇床转速不同分为如下两个实验组：
(1)低转速组：置于水平摇床以70rpm的转速进行水平振荡培养；
(2)高转速组：置于水平摇床以100rpm的转速进行水平振荡培养。
2、不同转速条件下的胚性细胞的悬浮培养结果
(1)增殖速度
胚性愈伤组织在低转速组的条件下进行悬浮培养，培养物约14天继代1次，6-10周可以使胚性愈伤组织生长至生长旺盛、增殖迅速、色泽亮黄、表面结构致密的胚性细胞悬浮状态。胚性愈伤组织在高转速组的条件下进行悬浮培养，培养物约7天继代1次，4-8周可以使胚性愈伤组织生长至生长旺盛、增殖迅速、色泽亮黄、表面结构致密的胚性细胞悬浮状态。建立成功的胚性细胞悬浮在其生长过程中需要进行继代培养，在高转速组下需要7天继代一次，在低转速组下需要14天继代一次。说明胚性愈伤组织在不同转速条件下具有不同的增殖速度，可通过控制转速大小来控制胚性愈伤组织的增殖速度。
(2)植株再生率
将胚性愈伤组织转移到MS-3固体培养基(MS-3固体培养基是将ABA、蔗糖、琼脂和MS基础培养基混匀得到的培养基，其中，ABA在MS-3固体培养基中的浓度为1.0mg/L，蔗糖在MS-3固体培养基中的质量分数为3.0％，琼脂在MS-3固体培养基中的质量分数为0.8％)上进行诱导培养，诱导培养为27±1℃，每日13h、3000lux的光照。诱导培养2-4周后，将变绿的成熟体细胞胚转移至MS固体培养基(MS固体培养基是将蔗糖、琼脂与MS基础培养基混匀得到的培养基，蔗糖在MS固体培养基中的质量分数为3.0％，琼脂在MS固体培养基中的质量分数为0.8％)，培养条件为27+1℃，每日13h、3000lux的光照。培养4-8周后，即可再生出完整植株，培养条件为27+1℃，每日13h、3000lux的光照。
结果表明：鄂薯6号胚性愈伤组织在100rpm转速下，37周再生率仅为80％，文献中也提到甘薯胚性愈伤组织在100rpm转速的条件下悬浮37周后，部分材料的植株再生率显著降低。但鄂薯6号胚性愈伤组织在70rpm转速的条件下悬浮培养，由于生长速度较慢，37周再生率仍能达到100％，说明降低悬浮培养的转速有利于提高植株再生率。因此，可通过控制转速大小来控制甘薯胚性愈伤组织的植株再生率。
综上所述，甘薯胚性愈伤组织在不同转速条件下具有不同的增殖速度和植株再生率，可通过控制转速大小来控制胚性愈伤组织的增殖速度和植株再生率。

Claims (10)

1.一种甘薯胚性细胞的悬浮培养方法，为如下(1)或(2)：
(1)将甘薯胚性愈伤组织在MS培养基中进行悬浮培养，得到甘薯胚性细胞；
所述(1)中的悬浮培养条件为以小于100rpm的转速进行振荡培养；
(2)将甘薯胚性愈伤组织在MS培养基中进行悬浮培养，得到甘薯胚性细胞；
所述(2)中的悬浮培养条件为以100rpm的转速进行振荡培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述小于100rpm的转速为70rpm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述MS培养基是将2,4-D、蔗糖和MS基础培养基混匀得到的液体培养基；
或，所述2,4-D在所述MS培养基中的浓度为2.0mg/L；
或，所述蔗糖在所述MS培养基中的质量分数均为3.0％。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述甘薯胚性愈伤组织是将甘薯茎尖组织进行诱导培养得到的。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述悬浮培养条件为27±1℃，每日13h、500lux光照；
或，所述振荡培养为水平振荡培养。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述甘薯选自地方品种、选育品种、品系或国外引进品种；
或，所述甘薯的品种为鄂薯6号。
7.权利要求1-6中任一所述的方法制备得到的甘薯胚性细胞。
8.权利要求1-6任一所述的方法在控制甘薯胚性愈伤组织的增殖速度中的应用。
9.权利要求1-6任一所述的方法在控制甘薯胚性愈伤组织的植株再生率中的应用。
10.权利要求1-6任一所述的方法或权利要求7所述的甘薯胚性细胞在甘薯植株再生中的应用。
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