CN109392721A - 一种诱导甘薯植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导甘薯植株再生的方法。所述方法包括选取田间生长的健康、茁壮的甘薯植株，进行剥取茎尖、诱导胚性愈伤、诱导体细胞胚和体细胞胚成苗四个阶段，实现甘薯植株再生。在体细胞胚的诱导过程中，采用含有NAA 0～0.1mg/L、6‑BA 0.2～0.5mg/L、ABA 0.1～0.5mg/L和活性炭0～0.2％且NAA与活性炭不同时为0的MS培养基进行诱导，使徐紫薯8号从剥取茎尖诱导胚性愈伤到形成再生苗仅用了160d。本发明方法不仅缩短了甘薯植株再生的时间，而且为快速获得和繁殖脱毒苗奠定了技术基础，保证了甘薯种苗良好的品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导甘薯植株再生的方法，属于生物技术领域。
背景技术
甘薯作为重要的粮食、饲料、工业原料以及新型能源作物，广为种植。甘薯种类繁多，例如徐紫薯8号，紫皮深紫肉，高产稳产，夏薯产量在2300公斤/亩左右，春薯在 3500公斤/亩左右；抗旱性和耐盐性好；花青素含量高，可以预防癌症，改善心血管疾病类，预防肠道疾病，抗衰老等；蒸薯食味好；开发用途广，茎叶可食用、茶用和作为绿化用苗，薯块宜鲜食或加工紫薯全粉、薯泥、紫薯粉丝、紫薯酒和紫薯醋等。目前由于甘薯病毒病的影响，能否快速获得大量健康种苗成为限制其推广应用的主要因素。
甘薯胚性愈伤组织可以由体细胞胚胎发生途径再生植株，是甘薯转基因利用的主要受体材料。中国专利201110146697.X公开了一种甘薯胚性愈伤长期继代增殖的组培方法，利用茎尖分生组织培养过程中诱导形成的胚性愈伤进行形态筛选继代，达到长期保存和扩增胚性愈伤的目的，具体为在茎尖分生组织脱分化诱导出愈伤后，筛选可保持胚性的结构致密、近球形的胚性愈伤，剔除鱼雷胚、子叶胚和结构松散的非胚性愈伤，移入含有1～3mg/L 2，4-D的MS固体培养基中培养每45d后，待胚性愈伤长至5～8mm，选择颗粒致密的心形和球形胚性愈伤部分，再重复上述方法培养，最后将增殖的胚性愈伤组织转移到含1.0mg/L ABA的MS固体培养基中光照下培养3～4周，体细胞胚发育并成长为小植株。该方法试验周期长，对操作技术要求较高，不适于大规模推广。中国专利201710430208.0公开了一种用甘薯叶柄进行愈伤组织诱导和分化的方法，将叶柄剪成长度为1～2cm的切段，接种到MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L无菌培养基上，然后将培养20天得到的愈伤转接到MS+2,4-D 0.01mg/L+KT 1.0mg/L的分化培养基上培养得到甘薯组培苗。但是上述方法存在以下问题：(1)用叶柄诱导胚性愈伤诱导率较低，适用性窄；(2)如果用非脱毒植株的叶柄作为外植体会导致获得的愈伤组织和分化出的组培苗带有病毒；(3)将培养的愈伤直接转入分化培养基成苗周期长，繁殖效率低，不适合短时间获得大量甘薯苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养周期短、快速获得健康的甘薯苗的诱导甘薯植株再生的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种诱导甘薯植株再生的方法，具体步骤如下：
(1)外植体的准备：选取田间生长健康、茁壮的甘薯植株，在植株顶端剪取1.5～2cm的健康茎尖作为外植体；
(2)外植体的灭菌：将剪取的茎尖洗涤干净，无菌条件下，依次用70％酒精和0.1％的升汞消毒，再用无菌水洗干净；
(3)愈伤组织的诱导：剥取茎尖生长点，置于胚性愈伤诱导培养基中，诱导形成胚性愈伤组织；
(4)体细胞胚的诱导：将诱导好的胚性愈伤组织转移至含有NAA 0～0.1mg/L、6-BA0.2～0.5mg/L、ABA 0.1～0.5mg/L和活性炭0～0.2％且NAA与活性炭不同时为0的MS 培养基中，诱导至形成体细胞胚；
(5)植株成苗：将体细胞胚转移至MS培养基中，培养至成苗。
在本发明的实施例中，所述的甘薯为徐紫薯8号。
在本发明的实施例中，所述的MS培养基采用本领域常规使用的MS培养基，可以为：pH值为5.9，琼脂8g/L。
在本发明的实施例中，步骤(2)中，70％酒精消毒时间为30s，0.1％的升汞消毒时间为3min。
在本发明的实施例中，步骤(3)中，胚性愈伤组织的诱导时间为30天。
在本发明的实施例中，步骤(3)中，所述的胚性愈伤诱导培养基为含有2mg/L 2,4-D 和3％蔗糖的MS培养基。
在本发明的实施例中，步骤(4)中，体细胞胚的诱导时间为16天。
在本发明的实施例中，步骤(5)中，植株成苗的培养时间为45天。
在本发明的实施例中，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有NAA 0.1mg/L、6-BA 0.2mg/L、ABA 0.5mg/L的MS培养基。
在本发明的实施例中，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有6-BA 0.5mg/L、ABA 0.5mg/L和0.2％活性炭的MS培养基。
在本发明的实施例中，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有6-BA 0.2mg/L、ABA 0.1mg/L和活性炭0.1％的MS培养基。
在本发明的实施例中，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有NAA 0.1mg/L、6-BA 0.2mg/L、ABA 0.5mg/L和活性炭0.2％的MS培养基。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
与普通的体细胞胚诱导培养基或其他类型培养基相比，本发明的诱导培养基对体细胞胚的诱导时间短，且诱导率高；与普通的诱导体细胞胚培养基(例如MS培养基)相比，诱导体细胞胚的组合培养基植株成苗所用时间大幅度缩短，且成苗诱导率较高。
附图说明
图1为各培养基诱导形成的胚性愈伤组织。
图2为各体细胞胚诱导培养基诱导形成的体细胞胚。
图3为体细胞胚诱导培养基诱导形成的体细胞胚的成苗。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
下述实施方式中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中利用徐紫薯8号茎尖离体培养下获得甘薯植株。
在本发明中，MS培养基采用本领域常规使用的MS培养基。在以下实施例中， MS培养基的组成为：KNO3 1900mg/L、NH4NO3 1650mg/L、KH2PO4 170mg/L、 MgSO4·7H2O 370mg/L、CaCl2·2H20 440mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、 MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2 0.025mg/L、Na2EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、肌醇100 mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L琼脂8g/L。高压灭菌前调节pH为5.9，121℃灭菌20min。
实施例1
1.试验培养基灭菌和培养条件
培养室的温度28℃，光照强度2000Lux，光照13h/d。
2.无菌材料的处理
将剪取的1.5～2cm的茎尖在纯水中摇晃洗涤8次后，置于超净工作台上，用70％酒精浸泡30s，再用0.1％的升汞消毒3min，最后用无菌水洗涤3～4次，备用。
3.愈伤组织的诱导：将灭菌好的甘薯茎尖在显微镜下剥取茎尖分生组织，放置在用正交法确定的2,4-D、6-BA、KCl和蔗糖不同组合的MS培养基上，正交试验水平和设计分别如表1和表2所示。
表1胚性愈伤组织诱导的正交设计因素水平
表2正交试验确定的胚性愈伤诱导的培养基组合
| 培养基编号 | 2,4-D(mg/L) | 6-BA(mg/L) | KCl(wt％) | 蔗糖(wt％) |
| 1 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 2 | 0 | 0.1 | 1 | 2 |
| 3 | 0 | 0.2 | 2 | 3 |
| 4 | 1 | 0 | 1 | 3 |
| 5 | 1 | 0.1 | 2 | 1 |
| 6 | 1 | 0.2 | 0 | 2 |
| 7 | 2 | 0 | 2 | 2 |
| 8 | 2 | 0.1 | 0 | 3 |
| 9 | 2 | 0.2 | 1 | 1 |
表3胚性愈伤诱导结果
注：“+”表示长势一般，“++”表示长势好
本实施例利用正交试验共设计了9种诱导胚性愈伤的培养基(表2)。胚性愈伤诱导率最高的是8号培养基(MS+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.1mg/L+蔗糖3％)，其次是7号培养基(MS+2,4-D 2mg/L+KCl 2％+蔗糖2％)，最后没有诱导成功胚性愈伤的培养基为1 号、2号、3号、5号、6号和9号培养基。在本实施例中，不含有2,4-D或者6-BA浓度过高的培养基均不能诱导胚性愈伤组织的发生，蔗糖浓度过低也不利于胚性愈伤的发生。
极差越大说明该因素水平的改变对实验结果影响越大。从极差值R可见 RA>RD>RB>RC，实验中各因子的作用主次顺序是：A>D>B>C，即2,4-D>蔗糖>6-BA>KCl。但通过方差分析可知四个因素之间差异不显著(表4)。本实施例研究的是不同培养基对胚性愈伤的诱导，因此选取指标水平大的作为最优方案。表4中，均值排序为A3>A2>A1， B1>B2>B3，C1>C3>C2，D3>D2>D1，因此最优方案为A3B1C1D3即2,4-D 2mg/L+蔗糖3％。
表4方差分析
注：“-”表示差异不显著。
实施例2
1.试验培养基灭菌和培养条件
培养室的温度28℃，光照强度2000Lux，光照13h/d。
2.无菌材料的处理
将剪取的茎尖在纯水中摇晃洗涤8次后，置于超净工作台上，用70％酒精浸泡30s，再用0.1％的升汞消毒3min，最后用无菌水洗涤3～4次，备用。
3.愈伤组织的诱导
将灭菌好的甘薯茎尖在显微镜下剥取茎尖分生组织放置在MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖3％的培养基中，诱导培养。
4.体细胞胚的诱导
甘薯胚性愈伤转移至用正交法确定的包含四种因素(NAA、6-BA、ABA、活性炭) 各三个水平的9种不同MS培养基中(表5、表6)。
表5体细胞胚的诱导因素水平表
表6正交实验确定的不同培养基组合
由表7可见，5号培养基(MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+ABA 0.5mg/L)胚性愈伤体胚化的诱导率均高于其他培养基，是表现最好的。其次是3号培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+ABA 0.5mg/L+活性炭0.2％)和2号培养基(MS+6-BA 0.2mg/L+ABA 0.1 mg/L+活性炭0.1％)。9号培养基(MS+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+ABA 0.1mg/L)胚性愈伤体胚化的诱导率最差。
表7胚性愈伤体胚化的诱导结果
| 列号 | A | B | C | D | 诱导率(％) | 长势 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 36 | ++ |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 63 | +++ |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 66 | +++ |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 53 | ++ |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 93 | ++++ |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 56 | ++ |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 30 | + |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 46 | ++ |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 23 | + |
| 均值1 | 55.00 | 39.67 | 46.00 | 50.67 | ||
| 均值2 | 67.33 | 67.33 | 46.33 | 49.67 | ||
| 均值3 | 33.00 | 48.33 | 63.00 | 55.00 | ||
| 极差 | 34.33 | 27.67 | 17.00 | 5.33 |
注：“+”代表长势程度，+长势较差，++长势一般，+++长势好，++++长势很好
极差越大，说明这个因素水平的改变对实验结果影响很大。极差最大的因素的是该因素的水平改变对实验结果的影响最大。从极差值(R)可见RA>RB>RC>RD，实验中各因子的作用主次顺序是：A>B>C>D，即NAA>6-BA>ABA>活性炭。因考虑到缺乏误差列，D因素的偏差平方和值最小，看做误差来对待。方差分析结果(表8)显示，因素 A(NAA)和因素B(6-BA)是影响细胞体细胞胚发生的主要因素，因素C(ABA)和因素D(活性炭)为影响体细胞胚发生的次要因素，差异显著。
本实施例体现了不同培养基对胚性愈伤体胚化的诱导，因此选取指标水平大的作为最优方案。表7中均值A2>A1>A3，B2>B3>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1，因此最优方案为 A2B2C3D3，即NAA 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+ABA 0.5mg/L+活性炭0.2％。
表8方差分析
| 变异来源 | 自由度 | 偏差平方和 | F比 | F<sub>0.05</sub> | 显著性 |
| A | 2 | 1814.89 | 37.64 | 19.00 | * |
| B | 2 | 1201.56 | 24.92 | 19.00 | * |
| C | 2 | 566.89 | 11.756 | 19.00 | - |
| D | 2 | 48.22 | 1.00 | 19.00 | - |
| 误差 | 2 | 48.22 |
注：“*”表示差异显著，“-”表示差异不显著。
实施例3
1.试验培养基灭菌和培养条件
培养室的温度28℃，光照强度2000Lux，光照13h/d。
2.无菌材料的处理
将剪取的茎尖在纯水中摇晃洗涤8次后，置于超净工作台上，用70％酒精浸泡30s，再用0.1％的升汞消毒3min，最后用无菌水洗涤3～4次，备用。
3.愈伤组织的诱导：将灭菌好的甘薯茎尖在显微镜下剥取茎尖分生组织，放置含有 2,4-D 2mg/L的MS培养基上，诱导培养。
4.体细胞胚的诱导：将诱导好的胚性愈伤转移至含有NAA 0.1mg/L、6-BA 0.2mg/L和ABA 0.5mg/L的MS培养基上。
5.植株再生：将实施例2中诱导体细胞胚的9种培养基上的体细胞胚都转至MS 培养基上，诱导成苗。表9结果显示诱导体细胞胚的2号培养基和5号培养基中的体细胞胚再生成苗的比例最高，分别为61.1％和77.8％，长势也最好。
表9徐紫薯8号成熟胚成苗的统计结果
| 组号 | 体细胞胚团数 | 诱导结果 | 诱导率(％) | 长势 |
| 1 | 14 | a,b,c,d | 21.4 | ++ |
| 2 | 18 | a,b,c | 61.1 | ++++ |
| 3 | 18 | a,b,c | 33.3 | +++ |
| 4 | 18 | a,b,c | 38.8 | +++ |
| 5 | 18 | a,b,c | 77.8 | ++++ |
| 6 | 18 | a,b,c,d | 21.2 | ++ |
| 7 | 12 | b,c,d | 25 | ++ |
| 8 | 18 | b,c,d | 5.6 | ++ |
| 9 | 9 | d | 0 | + |
注：a表示芽，b表示根，c表示植株苗，d表示成熟胚玻璃化。
Claims (10)
1.一种诱导甘薯植株再生的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)外植体的准备：选取田间生长健康、茁壮的甘薯植株，在植株顶端剪取1.5～2cm的健康茎尖作为外植体；
(2)外植体的灭菌：将剪取的茎尖洗涤干净，无菌条件下，依次用70％酒精和0.1％的升汞消毒，再用无菌水洗干净；
(3)愈伤组织的诱导：剥取茎尖生长点，置于胚性愈伤诱导培养基上，诱导形成胚性愈伤组织；
(4)体细胞胚的诱导：将诱导好的胚性愈伤组织转移至含有NAA 0～0.1mg/L、6-BA 0.2～0.5mg/L、ABA 0.1～0.5mg/L和活性炭0～0.2％且NAA与活性炭不同时为0的MS培养基中，诱导至形成体细胞胚；
(5)植株成苗：将体细胞胚转移至MS培养基中，培养至成苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甘薯为徐紫薯8号。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MS培养基的pH值为5.9，琼脂8g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，70％酒精消毒时间为30s，0.1％的升汞消毒时间为3min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，胚性愈伤组织的诱导时间为30天；步骤(4)中，体细胞胚的诱导时间为16天；步骤(5)中，植株成苗的培养时间为45天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的胚性愈伤诱导培养基为含有2mg/L 2,4-D和3％蔗糖的MS培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有NAA 0.1mg/L、6-BA 0.2mg/L、ABA 0.5mg/L的MS培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有6-BA 0.5mg/L、ABA 0.5mg/L和0.2％活性炭的MS培养基。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有6-BA 0.2mg/L、ABA 0.1mg/L和活性炭0.1％的MS培养基。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，体细胞胚的诱导培养基为含有NAA 0.1mg/L、6-BA 0.2mg/L、ABA 0.5mg/L和活性炭0.2％的MS培养基。
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