CN115812603A - 一种茅栗体细胞胚再生体系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物组织培养领域，具体而言，涉及一种茅栗体细胞胚再生体系的建立方法。所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，包括以下步骤：将茅栗的幼胚胚尖接种至诱导培养基中进行第一培养，得到胚性愈伤组织；将所述胚性愈伤组织转移至发育培养基中进行第二培养，得到成熟的子叶胚；将所述成熟的子叶胚转移至萌发培养基中进行第三培养；所述诱导培养基中，2,4‑D的浓度为0.9～3.6μM，6‑BA的浓度为0.55～2.2μM。所述的方法成功获得了茅栗体细胞胚再生体系，茅栗子叶胚的萌发率在9％左右。

Description

一种茅栗体细胞胚再生体系的建立方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，具体而言，涉及一种茅栗体细胞胚再生体系的建立方法。

背景技术

茅栗(Castanea seguinii Dode)是起源于我国的重要壳斗科栗属植物，树冠矮小，常用作板栗的砧木。5-7月开花，9-11月结果，分布于中国大别山以南、五岭南坡以北各地。茅栗的果实中富含淀粉、糖类、蛋白质、脂肪、多种维生素和矿物质，风味隽美，香甜可口，具有较丰富的营养价值。其次，茅栗的根具有重要的药用价值，具有安神，消食健胃，清热解毒的功效，可以用于失眠，消化不良，肺结核，肺炎，丹毒，疮毒等症状。

植物体细胞胚发生是指从体细胞组织获得胚胎的体外培养方法，是一种可以用于各种植物相关学科的生物技术工具。目前，植物组织培养再生植株的主要方式之一就是通过体细胞胚发生途径。这一途径对植物细胞的分化、发育、全能性表达、品种改良、突变体筛选等方面的研究提供了良好的实验体系，在理论和实际应用中都具有重大的意义。目前茅栗的再生体系尚未建立。

茅栗作为板栗的近缘种再生能力强，同时茅栗的童期短，当年开花当年结果。因此建立茅栗的再生体系，可以弥补板栗在种质改良中遇到的瓶颈，加快板栗育种进程。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个方面，涉及一种茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，包括以下步骤：

将茅栗的幼胚胚尖接种至诱导培养基中进行第一培养，得到胚性愈伤组织；将所述胚性愈伤组织转移至发育培养基中进行第二培养，得到成熟的子叶胚；将所述成熟的子叶胚转移至萌发培养基中进行第三培养；

所述诱导培养基中，2,4-D的浓度为0.9～3.6μM，6-BA的浓度为0.55～2.2μM。

板栗的再生体系中萌发率低，约为2％，或者不萌发，且在育种过程中存在童期长等问题。而茅栗作为板栗的近缘种再生能力强，同时茅栗的童期短，当年开花当年结果。因此建立茅栗的再生体系，可以弥补板栗在种质改良中遇到的瓶颈，加快板栗育种进程。

本发明以茅栗未成熟子叶胚的胚尖为试验材料，进行体细胞胚的诱导、发育、成熟与萌发，从而建立茅栗的体细胞胚再生体系，为品种改良和种质创新提供重要的平台。所述茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，成功获得了茅栗体细胞胚再生体系，茅栗子叶胚萌发率在9％左右。

优选地，所述诱导培养基包括以下组分：木本植物培养基2.0～2.5g·L^-1(例如2.0g·L^-1、2.1g·L^-1、2.2g·L^-1、2.3g·L^-1、2.4g·L^-1或2.5g·L^-1)、NN维生素1×10⁹～2×10⁹mg·L^-1、水解酪蛋白0.8～1.2g·L^-1(例如0.8g·L^-1、0.9g·L^-1、1.0g·L^-1、1.1g·L^-1或1.2g·L^-1)、2,4-D 0.9～3.6μM(例如0.9μM、1.1μM、1.3μM、1.5μM、1.7μM、1.9μM、2.1μM、2.3μM、2.5μM、2.7μM、2.9μM、3.1μM、3.3μM或3.6μM)、6-BA0.55～2.2μM(例如0.55μM、0.7μM、0.9μM、1.1μM、1.3μM、1.5μM、1.7μM、1.9μM或2.2μM)、蔗糖28～32g·L^-1(例如28g·L^-1、29g·L^-1、30g·L^-1、31g·L^-1或32g·L^-1)和植物凝胶2.8～3.2g·L^-1(例如2.8g·L^-1、2.9g·L^-1、3.0g·L^-1、3.1g·L^-1或3.2g·L^-1)。

诱导培养基中2,4-D和6-BA的浓度直接影响了，胚性愈伤组织是否会出现褐化，增殖是否正常，对于后期萌发率也产生了影响，因此，诱导培养基中2,4-D和6-BA的浓度成为，能否成功建立茅栗体细胞胚再生体系的关键技术。

优选地，所述发育培养基包括以下组分：木本植物培养基2.0～2.5g·L^-1、NN维生素1×10⁹～2×10⁹、水解酪蛋白0.8～1.2g·L^-1、谷氨酰胺0.3～0.7g·L^-1、蔗糖58～62g·L^-1和植物凝胶3.3～3.7g·L^-1。

优选地，所述萌发培养基包括以下组分：木本植物培养基2.0～2.5g·L^-1(例如2.0g·L^-1、2.1g·L^-1、2.2g·L^-1、2.3g·L^-1、2.4g·L^-1或2.5g·L^-1)、NN维生素1×10⁹～2×10⁹mg·L^-1、吗啡乙磺酸0.2～0.8g·L^-1(例如0.2g·L^-1、0.4g·L^-1、0.6g·L^-1或0.8g·L^-1)、聚乙烯吡咯烷酮0.2～0.8g·L^-1(例如0.2g·L^-1、0.4g·L^-1、0.6g·L^-1或0.8g·L^-1)、蔗糖28～32g·L^-1(例如28g·L^-1、29g·L^-1、30g·L^-1、31g·L^-1或32g·L^-1)、6-BA0.3～0.7μM(例如0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM或0.7μM)和植物凝胶2.8～3.2g·L^-1(例如2.8g·L^-1、2.9g·L^-1、3.0g·L^-1、3.1g·L^-1或3.2g·L^-1)。

第三培养阶段在萌发培养基中进行，本发明针对茅栗选用特定的萌发培养基，能够缩短茅栗子叶胚的萌发时间，提高萌发率。

优选地，所述诱导培养基的pH为5.50～5.58(例如5.50、5.52、5.54、5.56或5.58)。

优选地，所述发育培养基的pH为5.50～5.58(例如5.50、5.52、5.54、5.56或5.58)。

优选地，所述萌发培养基的pH为5.50～5.58(例如5.50、5.52、5.54、5.56或5.58)。

优选地，所述第一培养的温度为23～25℃(例如23℃、24℃或25℃)。

优选地，所述第一培养的时间为54～58天(例如54天、55天、56天、57天或58天)。

优选地，所述第一培养为暗培养。

优选地，所述第二培养的温度为23～25℃(例如23℃、24℃或25℃)。

优选地，所述第二培养的时间为21～28天(例如21天、23天、25天或28天)。

优选地，所述第二培养为暗培养。

优选地，所述第三培养的温度为23～25℃(例如23℃、24℃或25℃)。

优选地，所述第三培养的时间为25～31天(例如25天、27天、29天或31天)。

优选地，所述第三培养的光周期为15～17h(例如15h、16h或17h)。

优选地，所述茅栗的幼胚胚尖取自茅栗未成熟的果实。

优选地，所述茅栗未成熟果实剥离幼胚胚尖前进行消毒。

优选地，所述消毒具体包括：

将所述茅栗未成熟果实在75％乙醇中消毒55～65s，在3％NaClO中消毒350～370s，无菌水漂洗25～35s，所述漂洗进行4～5次。

本发明提供的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，所用茅栗采自贵州省贵阳市乌当区林场。用于体细胞胚诱导试验的材料为茅栗未成熟果实，采集于盛花期后39-60天。此时的外植体不易发生褐化，提高茅栗体细胞胚再生体系的建立的成功率。

愈伤组织增殖倍数＝愈伤组织增殖重量/愈伤组织起始重量。

子叶胚萌发率＝芽点个数/子叶胚数量。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，成功获得了茅栗体细胞胚再生体系，茅栗子叶胚的萌发率在9％左右；优化了茅栗体细胞胚增殖过程的激素浓度，提高胚性愈伤组织的增殖能力，改善愈伤组织的状态；弥补板栗在种质改良中遇到的瓶颈，加快板栗育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为茅栗胚性愈伤组织在16组处理下7d和14d的生理变化图；

图2为茅栗胚性愈伤组织在CS1-16组处理下的增殖率分析；

图3为茅栗胚性愈伤组织在CS17-20组处理下的增殖率分析；

图4为茅栗胚性愈伤组织液体悬浮培养观察；

图5为茅栗子叶胚成熟；

图6为茅栗子叶胚光下培养与成苗；

图7为茅栗体细胞胚再生体系的建立过程示意图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

为了减轻茅栗胚性愈伤组织在诱导培养基上出现的褐化、增殖慢等不良反应，实现茅栗体细胞胚的连续发生，基于诱导培养基的配方，进一步优化诱导培养基中生长素2,4-D和6-BA的浓度；设置CS1-CS16共16个处理，不同处理间不同之处仅在于诱导培养基2,4-D和6-BA的浓度不同，具体信息见表1。采取固体培养方式，先将茅栗胚性愈伤组织用20、40和100目孔径的钢筛筛选出大小一致的胚性愈伤组织，选用40目钢筛上的胚性愈伤组织，每个处理放置30个愈伤团，重复三次，每个重复初始重量保持0.05g左右，23～25℃培养，每7天观察褐化率、增殖倍数、愈伤组织生长状态，观察14天，并统计分析数据。

表1

再采取液体悬浮培养，提高6-BA和2,4-D的浓度，其余与诱导培养基均相同，具体信息见表2。将茅栗胚性愈伤组织用20、40和100目孔径的钢筛筛选出大小一致的胚性愈伤组织，选用40目钢筛上的胚性愈伤组织，称取其初始重量0.1g左右置于不同处理下的培养基内悬浮培养7天后，观察褐化率、增殖倍数、愈伤组织生长状态，并统计分析数据。

表2

	6-BA(μM)	2,4-D(μM)
			CS17	2.2	5.4
CS18	2.2	7.2
			CS19	3.3	3.6
CS20	4.4	3.6

经过固体培养14天后，观察到CS1处理下的茅栗胚性愈伤组织很少，甚至有子叶型胚的出现，CS2-CS15处理下，茅栗体胚状态良好，但胚性愈伤组织数量少，还以体细胞胚的数量居多，无法实现茅栗胚性愈伤组织的不断增殖；结合其16组处理下增殖率的显著性差异分析，虽然CS16处理下的茅栗体细胞胚的增殖率没有其他处理的增殖率高，但其愈伤组织的状态良好，具有松散、淡黄色的形态，转化为体细胞胚的数量很少，可以保证胚性愈伤的持续增殖以及胚发生(如图1和图2)。

由于CS16处理的2,4-D和6-BA的浓度较高，更高浓度的2,4-D和6-BA会不会对茅栗体细胞胚的增殖效果更好，因此，再次设计出了表2中的2,4-D和6-BA的浓度，通过液体悬浮培养7天，比较它们的生理变化，筛选出最佳浓度。经过观察，CS17-20处理下，茅栗胚性愈伤组织褐化快，且增殖率低(图3)。说明更高浓度的2,4-D和6-BA并不能改善茅栗胚性愈伤组织褐化快，且增殖率低的问题。

实施例2

本实施例提供的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，包括以下步骤：

1、将采集回的茅栗未成熟果实及时从其刺蓬中剥离出来，提前准备好75％乙醇，3％NaClO，无菌水和以经过灭菌处理的空培养瓶；消毒和接种工作均在超净工作台中进行：将茅栗未成熟果实放置在空培养瓶中，75％乙醇消毒1min，3％NaClO消毒6min，无菌水漂洗30s，漂洗重复4次；

2、用尖头镊子小心将已经过消毒灭菌处理的茅栗未成熟果实的胚珠和幼胚胚尖剥离出来，并接种到诱导培养基上，放置于23～25℃的黑暗环境中培养，每月更换一次新鲜培养基；

诱导培养基包括：木本植物培养基2.3g·L^-1、NN维生素10⁹mg·L^-1、1g·L^-1水解酪蛋白、1.8μM 2,4-D、1.1μM 6-BA、30g·L^-1蔗糖、3g·L^-1植物凝胶，pH调至5.50～5.58；

3、将胚性愈伤组织或体细胞胚接种于发育培养基上，置于23～25℃环境下黑暗培养；当茅栗胚性愈伤组织或体细胞胚在发育培养基上培养21～28天后，会逐渐发育成子叶型胚；

发育培养基包括：木本植物培养基2.3g·L^-1、NN维生素10⁹mg·L^-1、1g·L^-1水解酪蛋白、0.5g·L^-1谷氨酰胺、60g·L^-1蔗糖、3.5g·L^-1植物凝胶，pH调至5.50～5.58；

4、茅栗体细胞胚在发育培养基内经过一段时间后会发育为成熟的子叶型胚，将成熟的子叶型胚放置于萌发培养基内，将其放置于23～25℃，16小时光周期的环境下培养，记录其萌发率；

萌发培养基包括：本植物培养基2.3g·L^-1、NN维生素10⁹mg·L^-1、0.5g·L^-1吗啡乙磺酸、0.5g·L^-1聚乙烯吡咯烷酮、30g·L^-1蔗糖、0.5μM 6-BA、3g·L^-1植物凝胶，pH为5.50～5.58。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于诱导培养基中2,4-D的浓度为3.6μM为、6-BA的浓度为2.2μM。

实施例4

本实施例与实施例1的区别仅在于诱导培养基中2,4-D的浓度为0.9μM为、6-BA的浓度为0.55μM。

综上可知，茅栗的未成熟果实可以诱导出胚性愈伤组织，没有诱导出非胚性愈伤，未成熟果实诱导出的体细胞多以球形胚为主。

当使用发育培养基时，即可观察到球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚的状态，且发育状态良好。将茅栗胚性愈伤组织或体细胞胚转移到固体发育培养基一周后，可以观察到大量球形胚形成，四周后，大部分可以经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚，最终发育为子叶形胚；将茅栗胚性愈伤组织或体细胞胚转移到液体发育培养基，悬浮培养一周后，可以观察到大量的球形胚和心形胚，且有少数鱼雷形胚的出现，两周后子叶胚数量明显(图4，a图为液体悬浮培养7d时的拍摄图，b图为液体悬浮培养14d时的拍摄图)。

当发育培养基中的体细胞胚发育为子叶胚且子叶形胚由最初的淡黄色、透明状变为白色、不透明致密状时，此时的体细胞胚为成熟胚，可放于萌发培养基上，用于后续的萌芽(图5)。

当使用基于萌发培养基时，茅栗体细胞胚发育好的子叶型胚生长状态良好。将茅栗子叶型胚放在萌发培养基上，置于光下培养7天后，白色、不透明致密状的子叶胚发育为绿色，21天后出现芽点，将其转移至含有萌发培养基的组培瓶中，不久后出现植株。经过对子叶胚的培养，目前计算出茅栗子叶胚的萌发率在9％左右(图6)。

中国茅栗体细胞胚的再生途径如图7，将茅栗幼胚胚尖作为外植体，在诱导培养基中培养大约56天，在此期间，可以观察到胚性愈伤组织，且胚性愈伤组织呈淡黄色颗粒状，细胞表面有光泽。将胚性愈伤组织转移至发育培养基，培养7天后，其表面会产生很多光滑的球形胚。在发育培养基中继续培养7～21天，可以观察到体细胞胚发育的不同形态，如心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚，继续培养后，子叶胚成熟。最后，将成熟胚转移至萌发培养基，21天后出现芽点，随后即可发育成完整植株。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (10)

1.一种茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

将茅栗的幼胚胚尖接种至诱导培养基中进行第一培养，得到胚性愈伤组织；将所述胚性愈伤组织转移至发育培养基中进行第二培养，得到成熟的子叶胚；将所述成熟的子叶胚转移至萌发培养基中进行第三培养；

所述诱导培养基中，2,4-D的浓度为0.9～3.6μM，6-BA的浓度为0.55～2.2μM。

2.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述诱导培养基包括以下组分：木本植物培养基2.0～2.5g·L^-1、NN维生素1×10⁹～2×10⁹mg·L^-1、水解酪蛋白0.8～1.2g·L^-1、2,4-D 0.9～3.6μM、6-BA 0.55～2.2μM、蔗糖28～32g·L^-1和植物凝胶2.8～3.2g·L^-1。

3.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述发育培养基包括以下组分：木本植物培养基2.0～2.5g·L^-1、NN维生素1×10⁹～2×10⁹、水解酪蛋白0.8～1.2g·L^-1、谷氨酰胺0.3～0.7g·L^-1、蔗糖58～62g·L^-1和植物凝胶3.3～3.7g·L^-1。

4.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述萌发培养基包括以下组分：木本植物培养基2.0～2.5g·L^-1、NN维生素1×10⁹～2×10⁹mg·L^-1、吗啡乙磺酸0.2～0.8g·L^-1、聚乙烯吡咯烷酮0.2～0.8g·L^-1、蔗糖28～32g·L^-1、6-BA0.3～0.7μM和植物凝胶2.8～3.2g·L^-1。

5.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述诱导培养基的pH为5.50～5.58；

优选地，所述发育培养基的pH为5.50～5.58；

优选地，所述萌发培养基的pH为5.50～5.58。

6.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述第一培养的温度为23～25℃；

优选地，所述第一培养的时间为54～58天；

优选地，所述第一培养为暗培养。

7.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述第二培养的温度为23～25℃；

优选地，所述第二培养的时间为21～28天；

优选地，所述第二培养为暗培养。

8.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述第三培养的温度为23～25℃；

优选地，所述第三培养的时间为25～31天；

优选地，所述第三培养的光周期为15～17h。

9.根据权利要求1所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述茅栗的幼胚胚尖取自茅栗未成熟的果实；

优选地，所述茅栗未成熟果实剥离幼胚胚尖前进行消毒。

10.根据权利要求9所述的茅栗体细胞胚再生体系的建立方法，其特征在于，所述消毒具体包括：

将所述茅栗未成熟果实在75％乙醇中消毒55～65s，在3％NaClO中消毒350～370s，无菌水漂洗25～35s，所述漂洗进行4～5次。

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