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ALLGEMEINER STAND DER
TECHNIK
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A. GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft Verfahren
für die
verbesserte Herstellung und Gewinnung von Taxol und Taxanen durch
Zellkulturen von Taxus chinensis.
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B. STAND DER TECHNIK
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Das Taxolbeschaffungsproblem
und mögliche
Lösungen
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Taxol ist ein Diterpenalkaloid, das
ursprünglich
aus der Rinde der Pazifischen Eibe, Taxus brevifolia isoliert wurde
(Wani et al. 1971).
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Das Interesse an Taxol kam auf, als
das National Cancer Institute (NCl) in einem großangelegten Screening-Programm
herausfand, dass rohe Rindenextrakte Antitumoraktivitäten zeigten.
Seitdem haben klinische Tests bestätigt, dass Taxol extrem wirksam
gegen hartnäckige
Ovarialkarzinome und gegen Brustkrebs und andere Krebsarten ist.
Taxol wurde wegen seines grundlegend unterschiedlichen Zytotoxizitätsmechanismus,
d. h. durch die Hinderung der Depolymerisation von Mikrotubuli (siehe
Rowinsky et al. 1990), als ein Durchbruch in der Chemotherapie bezeichnet.
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Die entmutigendste Variable in der
Taxolgleichung ist bisher die Beschaffung. Es werden drei bis sechs 100
Jahre alte Pazifische Eiben benötigt,
um einen Patienten zu behandeln, da die durchschnittliche Ausbeute an
Taxol gering ist – etwa
0,01% aus trockener Rinde und Nadeln (Witherup et al. 1990). Um
die Menge Taxol herzustellen, die für Behandlung und Tests notwendig
ist, würde
die Zerstörung
von Zehntausenden Eiben erfordern. Bisher stammt die gesamte weltweit
bereitgestellte Menge aus dem Ernten dieser niedrigen, langsam wachsenden
Koniferen, die in den alten Waldbeständen im pazifischen Nordwesten
der USA wachsen. Leider ist die Eibe durch Holzfällung nahezu ausgestorben.
Naturschützer
widersetzen sich erfolgreich jeder großangelegten Abholzung des Baumes,
der in den alten Waldbeständen
wächst,
die Zufluchtsort für
den gefährdeten Fleckenkauz
und andere wildlebende Tiere sind. Da die Zahl der Pazifischen Eiben
sinkt, setzt die medizinische Forschung ihre ganze Hoffnung für zukünftiges
Taxol auf neue, alternative Beschaffungsquellen. Drei Quellen, die
in Betracht gezogen wurden, sind die chemische Synthese, Semisynthese
und Pflanzenzellenkultur.
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Taxol ist ein großes, strukturell komplexes
chemisches Molekül,
das sich bisher der kompletten chemischen Synthese entzogen hat.
Daher ist eine großtechnische
Synthese aus einfach verfügbaren
Chemikalien in den kommenden Jahren wahrscheinlich keine realisierbare
Option.
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Eine mögliche Option für die großtechnische
Herstellung ist die Semisynthese, d. h. die chemische Fixierung
einer Seitenkette an den landwirtschaftlich hergestellten Taxolvorläufer, Baccatin.
In der Synthese der Seitenkette sind erhebliche Fortschritte zu
verzeichnen (Denis et al. 1991). Es wurden Verfahren zum Ankuppeln
der Seitenkette an das Baccatin entwickelt (Denis et al. 1990, US-Patentschrift
4,924,011; Holton 1991, US-Patentschrift 5,015,744). Jedoch ist
die landwirtschaftliche Bereitstellung von Baccatin aus Nadeln von
Taxus-Schonungen
nicht gerade einfach, und sie wird gerade angesichts der Tatsache
neu bewertet, dass frühere
Berichte (Denis et al. 1988, 0,1% nach Gewicht) über den Baccatin-Gehalt optimistischer
waren als neuere (Witherup et al. 1990, 0,03% Trockenmasse). Zusammenfassend
ist die Fähigkeit
zur chemischen Synthese und Semisynthese für die Beschaffung von Taxol
für den
weltweiten chemotherapeutischen Einsatz nicht gesichert. Es gibt
schwerwiegende Gründe
für die
Erforschung und Entwicklung alternativer Herstellungsmittel.
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Diese Erfindung betrifft die Entwicklung
eines Pflanzenzellenkultur-basierten Verfahrens für die Bereitstellung
von Taxol und anderen Taxanen.
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Gewebekulturen als eine
Quelle für
Chemikalien pflanzlichen Ursprungs
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Die Fähigkeit von Pflanzenzellen,
sich unter einer Vielzahl unterschiedlicher Kulturbedingungen zu
teilen, zu wachsen und sekundäre
Stoffwechselprodukte herzustellen, wurde von einer Reihe von Gruppen
ausführlich
demonstriert. Derzeit werden in Japan zwei Verbindungen, Shikonin
(ein roter Farbstoff und entzündungshemmend)
und Ginsengoside (ein Tonikum in der orientalischen Medizin) durch
Gewebekulturverfahren hergestellt. Berichten zufolge stehen viele
weitere Verfahren kurz vor der Vermarktung, einschließlich Vanillin, Berberin
und Rosmarinsäure
(siehe Payne et al. 1991).
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Die Vorteile eines Pflanzenzellenkulturverfahrens
für Taxol
sind vielfältig:
(i) ein Zellkulturverfahren stellt eine unbegrenzte, kontinuierliche
und einheitliche Produktbeschaffung sicher und ist keinen Schädlingen, Katastrophen
und saisonalen Schwankungen ausgesetzt, (ii) Zellkulturen können in
großen
Bioreaktoren gezüchtet
werden und können
durch das Manipulieren der Umweltbedingungen zu einer Überproduktion
von Taxol induziert werden, (iii) Zellkulturen erzeugen im Vergleich
zu Rinde oder Nadeln ein einfacheres Verbindungsspektrum, wodurch
Trennung und Reinigung erheblich vereinfacht werden, (iv) ein Zellkulturverfahren kann
sich rasch an schnelle Bedarfsänderungen
anpassen, besser als landwirtschaftsbasierte Verfahren, (v) neben
der Beschaffung von Taxol könnten
mit einem Zellkulturverfahren außerdem Taxan-Vorläufer wie
Baccatin hergestellt werden, die semisynthetisch in Taxol und andere
aktive Derivate umgewandelt werden könnten.
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Da die aseptische, großtechnische
Pflanzenzellenzüchtung
schon an sich teuer ist, wird ein Zellkulturverfahren erst dann
kommerziell relevant, wenn diese Kosten durch rasches Zellwachstum
und hohe Metabolitenproduktivität
ausgeglichen werden. Jede Pflanzenspezies und der jeweilige Zielmetabolit
sind unterschiedlich, und für
jedes einzelne System sind unterschiedliche Ansätze notwendig. Diese Erfindung
konzentriert sich auf kreative und fachgerechte Ansätze für die Herstellung
schnell wachsender und hochproduktiver Pflanzenzellenkulturen für die Taxol-
und Taxan-Herstellung.
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Probleme mit Gewebekulturen
von Holzgewächsen
und Koniferen
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Ein historischer Überblick über die Literatur lässt darauf
schließen,
dass sich krautförmige
Pflanzen in Kulturen relativ einfach handhaben ließen, während Kulturen
von Holzgewächsen
und Koniferen nur schwierig hergestellt werden konnten.
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Das Wachstum von Gymnospermen- und
Koniferenlkulturen, die sekundäre
Stoffwechselprodukte erzeugen, war im Allgemeinen gering. Zum Beispiel
fanden Berlin und Witte (1988) heraus, dass Kulturen von Thuja occidentalis
ihre Biomasse in 18 Tagen nur um etwa 30% erhöhten. Van Uden et al. (1990)
berichtete von einer Biomassezunahme von 20– 50% in 21 Tagen für Suspensionen
von Callitris drummondii. Westgate et al. (1991) berichtete von
einer Verdopplungszeit von etwa 10 Tagen für Suspensionen des Gymnosperms Cephalotaxus
harringtonia. Wie von Bornman (1983) zusammengefasst, wurde ein
enormer Aufwand in die Entwicklung eines Mediums für Fichtensuspensionen
(Picea abies) gesteckt. Diese kollektive Arbeit veranschaulicht,
dass Gymnospermensuspensionen tatsächlich zu einem raschen Wachstum
in der Lage sind, dass allerdings keine allgemeinen Regeln angewandt
werden können
und dass Mediumformulierungen für
unterschiedliche Zelllinien unabhängig voneinander optimiert
werden müssen.
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Ein Überblick über die sekundäre Metabolitenproduktivität unter
den Gymnospermenkulturen deutet auch auf die Schwierigkeit im Vergleich
zu krautartigen Spezies hin, eine schnelle Biosynthese zu induzieren. Zum
Beispiel erzeugten Kulturen von Cephalotaxus harringtonia Terpenalkaloide
auf einem Niveau von nur 1% bis 3% von der in der Mutterpflanze
enthaltenen Menge (Delfel and Rothfus 1977). Selbst bei erfolgreicher Auslösung war
Heinstein (1985) lediglich in der Lage, die in der Mutterpflanze
erzeugten Levels zu erreichen (etwa 0,04% Trockenmasse Gesamtalkaloide).
Van Uden et al. (1990) waren in der Lage, Suspensionskulturen der
Konifere Callitris drummondii so zu induzieren, dass diese Podophyllotoxin
erzeugen, allerdings nur auf Levels von einem Zehntel von dem, was
durch die Nadeln erzeugt wird. Die Fähigkeit von Thuja occidentalis, erhebliche
Levels an Monoterpenen (10–20
mg/l) und das Diterpen Dehydroferruginol (2–8 mg/l) zu erzeugen, wurde
von Berlin et al. (1988) überzeugend
veranschaulicht. Diese Ergebnisse wurden jedoch mit einer langsam
wachsenden (30% Biomassezunahme in 18 Tagen) Kultur mit geringer
Zelldichte (5 bis 7 Gramm Trockenmasse pro Liter) erzielt.
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Zellkultur für die Taxol-Herstellung:
Vorleistungen
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Die Schwierigkeiten beim Erreichen
eines schnellen Wachstums und einer hohen Produktivität, auf die man
bei Gymnospermensuspensionen stieß, spiegeln sich in den drei
bisher zur Taxol-Herstellung veröffentlichten
Berichten wider. Jaziri et al. (1991) führten kürzlich die Anregung von callus-Kulturen
von Taxus baccata durch, waren allerdings unter Verwendung ihrer
Immunsorbensuntersuchung nicht in der Lage, ein Taxol aufzufinden.
Wickremesinhe and Arteca (1991) beschrieben die Gegenwart von 0,009%
Trockenmasse Taxol in callus-Kulturen von Taxus media („Hicksii"), aber Einzelheiten über Verdopplungszeiten,
Zelldichten und die Zeitspanne, über
die besagtes Taxol hergestellt wurde, wurden nicht angegeben.
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US-Patentschrift 5,019,504 (Christen
et al. 1991) beschreibt die Herstellung und Gewinnung von Taxan
und Taxan-ähnlichen
Verbindungen durch Zellkulturen von Taxus brevifolia. Diese Autoren
beschrieben eine Taxol-Herstellung auf einem Level von 1 bis 3 mg/l
in einer zwei- bis vierwöchigen
Zeitspanne. Sie beschrieben außerdem
eine Zellmassesteigerung vom „5-
bis 10-fachen in 3–4
Wochen", was einer
Verdopplungszeit von etwa 7 bis 12 Tagen entspricht.
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Steigerungen in den Wachstumsraten,
den Taxol-Biosyntheseraten und der volumetrischen Produktivität sind eindeutig
notwendig, bevor ein Gewebekulturverfahren für die Taxol-Herstellung die
geplante Jahresnachfrage von bis zu Hunderten von Kilogramm Taxol
pro Jahr bereitstellen kann.
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KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
das in den Ansprüchen
dargelegte Verfahren.
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Die Erfinder haben herausgefunden,
dass Taxol und Taxol-ähnliche
Verbindungen oder Taxane mit einer sehr hohen Ausbeute aus Taxus
chinensis hergestellt werden können.
Insbesondere fanden die Erfinder heraus, dass die Spezies Taxus
chinensis innerhalb eines kurzen Zeitraums zu schnellem Wachstum
und der Herstellung extrem hoher Levels von Taxol und Taxanen in
der Lage ist.
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Als Verbesserung der in Christen
et al. (1991) beschriebenen Erfindung haben die Erfinder hierin
herausgefunden, dass Zellkulturen von Taxus chinensis schnell und
effizient angeregt und auf künstlichen
Nährmedien
erfolgreich gezüchtet
werden können,
und dass die gleichen chemotherapeutisch aktiven Taxan-Alkaloide
in der Zellkultur hergestellt werden wie in der intakten Pflanze.
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Weiters ist es durch die Verfahren
dieser Erfindung möglich,
Taxol in einer viel kürzeren
Zeitspanne herzustellen, als dies bisher beschrieben wurde. Mit
der Spezies Taxus chinensis waren die Erfinder in der Lage, Zellen
so zu manipulieren, dass die Ausbeute an Taxol bei weitem die Menge übertraf,
die aus Gewebekulturen der anderen Taxus-Spezies gewonnen wurden.
Darüber
hinaus ist die Wachstumsrate der Taxus chinensis Zellkulturen wesentlich
höher,
das 3- bis 6-fache, als für
Taxus brevifolia, wie in Christen et al. (1991) beschrieben.
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Zu den Aufgaben dieser Erfindung
gehört
die schnelle und effiziente Anregung der Zellkulturen von Taxus
chinensis.
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Zu den Aufgaben dieser Erfindung
gehört
die Schaffung spezieller Umweltbedingungen zur Begünstigung
schnellen Zellwachstums, hoher Zelldichten und hoher Zelllebensfähigkeit.
Die in dieser Studie beschriebenen Wachstumseigenschaften übertreffen
vorhergehende Ergebnisse um einen wesentlichen Faktor.
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Zu den Aufgaben dieser Erfindung
gehört
die Fähigkeit,
hohe und verlängerte
Raten der Taxol- und Taxan-Biosynthese und -Sekretion zu induzieren,
und zwar durch: (a) vorsichtige Manipulation der Nährstoffkonzentrationen
(,Herstellungsmediumformulierung'),
(b) den Einsatz von Licht, (c) die Verwendung periodischer Mediumaustauschprotokolle,
(d) die Verwendung von Auslösern.
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Zu den Aufgaben dieser Erfindung
gehört
die Fähigkeit,
das Profil der hergestellten Taxane durch Veränderung der Medienformulierungen
und Umweltbedingungen zu manipulieren. Insbesondere wurden Zellen dazu
gebracht, Taxol als das vorherrschende Taxan-Produkt zu erzeugen.
Zudem wurde die Herstellung des Nebenproduktes Cephalomannin unterdrückt und
bietet so eine elegante biologische Lösung für ein teures und wichtiges
nachgelagertes Separations- und Reinigungsproblem.
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Zu den Aufgaben dieser Erfindung
gehört
die Fähigkeit,
verschiedene Taxane außer
Taxol herzustellen, die selbst pharmakologische Aktivität zeigen
könnten
oder in Verbindungen mit pharmakologischer Aktivität modifiziert
und umgewandelt werden können.
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Zu den Aufgaben dieser Erfindung
gehört
die Fähigkeit,
Zellkulturen von Taxus chinensis für die Herstellung von Taxol
(0,32% Trockenmasse) in solchen Mengen zu induzieren, die die aus
wilden Pflanzen (0,003 bis 0,03% Trockenmasse, Xu and Liu 1991)
hergestellten weit übertreffen.
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BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1.
Biomassezunahme in einer Taxus chinensis Suspensionskulturlinie
K-1 über
einen typischen Chargenwachstumszyklus in Medium A. Fehlerbalken
stellen die in Duplikatkolben gemessene Standardabweichung dar.
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2.
Auswirkung des Mediumaustauschs am 9. & 12. Tag auf die Taxol- (A) und Gesamt-Taxan-
(B) Produktivität
in einem 15-Tages-Experiment. Die Zahlen in jedem Kästchen stehen
für das
Zeitintervall (Tage), in dem das Produkt hergestellt wurde. Der
verdunkelte Abschnitt der intrazellulären Kästchen stellt das Taxol oder
die Gesamt-Taxane dar, die zu Beginn des Experiments im Zellimpfgut
vorhanden waren. Alle Behandlungen wurden in doppelter Ausfertigung
durchgeführt.
Die Taxus chinensis Suspensionszelllinie K-1 wurde mit Medium A wie in Tabelle
2 dargelegt verwendet.
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3.
Spektralcharakteristik einer Standard-Gro-Lux-Lampe (GTE Sylvanis,
Danvers, MA) verwendet in Beispiel 7.3.
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4.
Taxan-Herstellung in Taxus chinensis Zellsuspension K-1. Gezeigt
wird der Abschnitt des Chromatogramms von 10 bis 40 Minuten. Diodenarray-Scans
ausgewählter
Taxan-Höchstwerte
zeigen ein charakteristisches Taxan-UV-Absorptionsspektrum mit einem
Höchstwert
bei 227 nm.
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5.
Taxol- und Taxan-Herstellung nach verlängerter Züchtung in Medium C mit Taxus
chinensis Zelllinie K-1. Die obere Tafel ordnet die Daten für die bekannten
und unbekannten Taxane tabellarisch, während die untere Tafel die
zunehmende Taxol- und Taxan-Herstellung in der 25- bis 42-Tages
Zeitspanne zeigt.
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6.
MS/MS-Bestätigung
von Taxol in Zellkulturüberstand.
Tafel A zeigt das Ionenspray-APCI-Massenspektrum von authentischem
Taxol und Tafel B zeigt das Tochterionenspektrum der Ausgangslinie
im Massenspektrum (m/z 871 = Taxol + NH4
+). Tafel C stellt das Ionenspray-APCI-Spektrum
von einem Zellkulturrohextrakt dar und zeigt m/z 854 und 871 charakteristisch
für Taxol.
Tafel D zeigt das entsprechende Tochterspektrum von m/z 871 und
ist der eindeutige Beweis für
die Gegenwart von Taxol im Zellkulturüberstand.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Schon seit langem dienen Pflanzen
als Quellen für
Arzneimittel und spezielle Chemikalien. Normalerweise wurden diese
Produkte durch Extraktion des geernteten Pflanzenmaterials oder
durch chemische Synthese gewonnen. Taxol ist zu einem der wichtigsten
potentiellen Krebsbekämpfungsmittel
geworden, wie sich kürzlich
beim Screening der Naturprodukte abzeichnete.
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Wie hierin verwendet, sind die Begriffe
Taxol und Taxol-ähnliche
Verbindungen oder Taxane gegenseitig austauschbar verwendet, um
eine Verbindung mit einem Taxan-Ring zu beschreiben. Diese Verbindungen können selbst
anti-neoplastische Aktivität
aufweisen oder können
zu bioaktiven Verbindungen modifiziert werden.
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Wie hierin verwendet, dient der Begriff „callus" der Beschreibung
einer Masse gezüchteter
Pflanzenzellen, die strukturell undifferenziert ist und auf verfestigtem
Medium gezüchtet
wird. Wie hierin verwendet, dient der Begriff „Suspensionskultur" der Beschreibung
strukturell undifferenzierter Zellen, die in einem flüssigen Nährmedium
verteilt werden. Es versteht sich, dass Suspensionskulturen Zellen
in unterschiedlichen Aggregatzuständen enthalten. In den in dieser
Erfindung beschriebenen Suspensionen findet sich eine Spanne von
Aggregatgrößen, mit
Größen von
zehn bis hundert Mikrometern im Durchmesser (Einzelzellen oder Wenigaggregatzellen)
bis hin zu Aggregaten mit vielen Millimetern im Durchmesser, bestehend
aus vielen Tausenden Zellen.
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Das für diese Erfindung notwendige
Pflanzenmaterial wurde aus Taxus chinensis gewonnen. Die Erfinder
haben insbesondere herausgefunden, dass die Spezies Taxus chinensis
in der Lage ist, innerhalb einer kurzen Züchtungszeitspanne signifikante
Mengen Taxol und Taxane zu produzieren, wobei die gewünschten Verbindungen
kontinuierlich ins Medium abgesondert werden.
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Die Erfinder fanden heraus, dass
der spezifische Taxol-Gehalt mit der Pflanzenspezies variiert, und innerhalb
der Pflanzenspezies mit der Gewebequelle und spezifischen Bäumen. Die
Auswahl einer Quelle mit hoher Ausbeute für die Taxol-Herstellung ist
ein wichtiger erster Schritt in Richtung Bereitstellung ausreichender
Mengen Taxol für
die therapeutische Verwendung.
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Beginn von Taxus-Zelllinien
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Taxus-Pflanzenmaterial kann in gesamt
Nordamerika sowie auf anderen Kontinenten gewonnen werden. Die Kultur
wird durch Auswahl von geeignetem Taxus-Gewebe zum Wachstum begonnen.
Gewebe aus jedem Teil der Pflanze, einschließlich Rinde, Kambium, Nadeln,
Stämme,
Samen, Zapfen und Wurzeln kann zum Induzieren des callus verwendet
werden. Jedoch werden für
die optimale Ausbeute an Taxol Nadeln und meristemische Regionen
der Pflanzenteile bevorzugt. Am meisten bevorzugt werden frisch
gewachsene Nadeln (z. B. ein bis drei Monate alt), die im allgemeinen
durch ein helleres Grün
identifiziert werden können.
Der Begriff „frisch
gewachsen" soll
allgemein die Pflanzennadelproduktion innerhalb der Wachstumssaison
diesen Jahres bedeuten.
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Um eine Kontamination der Kultur
zu verhindern, sollte das Gewebe vor der Einführung in das Kulturmedium oberflächensterilisiert
werden. Jede konventionelle Sterilisierungstechnik, wie die Behandlung
mit CLOROX (eine Schutzmarke im Besitz des Unternehmens CLOROX für Bleichen)
wäre effektiv.
Außerdem können anti-mikrobielle
Wirkstoffe wie Cefoxitin, Benlate, Cloxacillin, Ampicillin, Gentamycinsulfat
und Phosphomycin zur Oberflächensterilisierung
von Pflanzenmaterial verwendet werden.
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Callus-Wachstum
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Die Kulturen zeigen typischerweise
Schwankungen in der Wachstumsmorphologie, Produktivität, den Produktprofilen
und weiteren Eigenschaften. Da individuelle Zelllinien in ihren
Präferenzen
für Wachstumsmediumkomponenten
variieren, können
viele verschiedene Wachstumsmedien für die Induzierung und Proliferation
des callus verwendet werden.
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Die angemessene Zusammensetzung des
Mediums variiert mit der gezüchteten
Spezies. Die bevorzugten Medien für die verschiedenen Spezies
sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Zum Beispiel sind die beiden bevorzugten Wachstumsnährmedien
für Taxus
chinensis A & D,
obwohl natürlich
auch andere verwendet werden können.
Diese Medien enthalten bevorzugt die in Tabelle 2 aufgeführten Inhaltsstoffe.
Wenn zum Beispiel Medium A verwendet wird, sind Wachstumshormone
oder Regulatoren mit einer Menge zwischen 1 ppb bis 10 ppm und vorzugsweise
bei 2 ppb bis 1 ppm im Medium enthalten. Wird Medium D verwendet,
sind die Wachstumshormone oder Regulatoren auf einem Level zwischen
1 ppb bis 10 ppm und bevorzugt bei 2 ppb bis 2 ppm enthalten. Die
Mengen anderer Inhaltsstoffe des Mediums können auf einem Level von 1/10tel
bis dem 3-fachen der in Tabelle 2 angegebenen Konzentration enthalten
sein, allerdings ist der bevorzugte Gehalt der in Tabelle 2 angegebene
Wert.
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Suspensionswachstum
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Taxus-Suspensionskulturen sind wie
andere Pflanzenzellenkulturen zu schnellen Wachstumsraten und hohen
Zelldichten in der Lage. Jedoch variieren die optimalen Bedingungen
von einer Zelllinie zur anderen und entsprechend müssen Verfahren
in Betracht gezogen werden, die zu einer schnellen Optimierung für jede beliebige
Zelllinie führen.
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Die Startkulturen verschiedener Taxus-Spezies
werden durch Übertragung
in die in Tabelle 3 aufgeführten
Medien subkultiviert, die Makro- und Mikronährstoffe, organische Salze
und Wachstumshormone enthalten. Die Mengen liegen im Allgemeinen
innerhalb der folgenden Spannen: beginnend mit 1/10tel bis dem 3-fachen
der Konzentration jedes in Tabelle 2 aufgeführten Mediuminhaltsstoffes.
Das bevorzugte Niveau ist das in Tabelle 2 aufgeführte.
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Die flüssigen Kulturen werden Luft
ausgesetzt und vorzugsweise geschüttelt oder anderweitig leicht bewegt,
um Luft in das Medium einzubringen, oder es kann auch Luft durch
Röhrchen
in die Kulturgefäße eingeleitet
werden. Die Kulturen werden unter angemessenen Wachstumsbedingungen
bei einer Temperatur zwischen 20° bis
26°C gehalten.
Der pH-Wert kann zwischen etwa 3 bis 7 liegen, vorzugsweise zwischen
4 bis 6. Die Kultur kann für
verschiedene Zeitspannen unter Lichtbedingungen zwischen totaler
Dunkelheit und totalem Licht gezüchtet
werden (Schmalband und/oder Breitspektrum). Da die Gesamt-Taxol-Herstellung in den
Kulturen am höchsten
ist, die Licht ausgesetzt sind, wird dieses Verfahren bevorzugt.
Die typischen Lichtintensitätsbedingungen
liegen zwischen etwa 100 bis etwa 3000 „foot candle power" [entspricht etwa
1000 bis etwa 32000 1x].
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Die Suspensionskulturen werden ab
dem Zeitpunkt der Subkultivierung 1 bis 8 Wochen gezüchtet, danach
nimmt das Kulturwachstum ab. Die Kulturen werden durch Entfernung
des Wachstumsmediums durch Filtrierung geerntet. Die geerntete Kultur
wird gewogen und durch Lyophylisation getrocknet, zu einem feinen Pulver
gemahlen und das Taxol kann durch Verwendung konventioneller Lösemittelextraktionstechniken
extrahiert werden.
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Die Verdopplungszeiten wurden während der
routinemäßigen Subkultur
durch Überwachung
der zeitabhängigen
Biomassezunahme sowie durch einfache Überwachung des Wachstumsindex
gemessen. Die maximale Trockenmassedichte von 15–24 Gramm pro Liter wurde erreicht.
Die Wachstumseigenschaften verschiedener Taxus-Spezies-Suspensionen
sind in Beispiel 4 herausgearbeitet.
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Analytische Verfahren
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Die Verfahren für die Extraktion und Gewinnung
von Taxol und Taxanen aus Zellen und Medium folgen konventionellen
Verfahren und sind in Beispiel 5 detailliert beschrieben. Das Immuntestverfahren
(ELISA) folgte weitgehend den durch Hawaii Biotechnology im auf
dem Markt erhältlichen
Test-Kit bereitgestellten Protokollen. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Verfahren
wurden aus bestehenden Protokollen leicht modifiziert, wie in Beispiel
5 ausgearbeitet. Unter den in dieser Erfindung verwendeten Bedingungen
wurde eine klare Auflösung
von Taxan-Spitzenwerten erreicht, was zu einer exakten Erkennung
und Quantifizierung führte.
Aufgrund der Möglichkeit
der Koeluierung von Nicht-Taxan-Komponenten wurde die spektrale
Reinheit jedes vermeintlichen Taxan-Spitzenwertes vor der Integration von
Spitzenwertbereichen durch Diodenarray geprüft. Die Verweilzeiten von Taxan-Standards
sind in Beispiel 5 aufgeführt
und ein Beispiel-Chromatogramm findet
sich in 4.
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Herstellungsmediumbedingungen
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Wie hierin verwendet, dient der Begriff „Nährmedium" der Beschreibung
eines Mediums, dass für
die Züchtung
von Pflanzenzellen-callus und Suspensionskulturen geeignet ist.
Der Begriff „Nährmedium" ist allgemeiner
Natur und umfasst sowohl „Wachstumsmedium" als auch „Herstellungsmedium". Der Begriff „Wachstumsmedium" dient der Beschreibung
eines Nährmediums,
welches das rasche Wachstum gezüchteter
Zellen begünstigt.
Der Begriff „Herstellungsmedium" bezieht sich auf
ein Nährmedium,
welches die Taxol- und Taxan-Biosynthese in gezüchteten Zellen begünstigt.
Es versteht sich, dass das Wachstum in einem Herstellungsmedium
und dass die Herstellung in einem Wachstumsmedium stattfinden kann,
und dass sowohl optimales Wachstum als auch Herstellung in einem
einzigen Nährmedium
stattfinden kann.
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Auf bestimmte Klassen von Zusatzstoffen
im Nährmedium
wird sich in dieser Erfindung mit speziellen Namen bezogen, welche
hier definiert sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „bräunungsverhütendes Mittel" auf Komponenten,
die dem Nährmedium
zugefügt
werden, um die Bildung von Pigmenten während der Zellkultivierung
zu verhindern. Zu diesen Pigmenten gehören Phenole und verwandte Verbindungen, bei
denen allgemein beobachtet wird, dass sie eine schädliche Auswirkung
auf Zellwachstum, Lebensfähigkeit und
Produktbildung haben. Wie hierin verwendet, dient der Begriff „biosynthetische
Vorläufer" der Beschreibung
von Verbindungen, die dem Nährmedium
zugefügt
werden, die durch die Zellen metabolisiert und in Taxol und Taxane
eingebracht werden. Wie hierin verwendet, dient der Begriff „Stoffwechselinhibitoren" der Beschreibung
von Verbindungen, die dem Nährmedium
zugefügt
werden, die die spezifischen Biosynthesewege unterbrechen. Ein Stoffwechselinhibitor
kann zum Beispiel verwendet werden, um die Taxol-Biosynthese zu verbessern,
indem ein anderer Weg blockiert wird, der wegen eines frühen biosynthetischen
Vorläufers
mit Taxol als konkurriert. Wie hierin verwendet, dient der Begriff
Stimulator oder Aktivator der Beschreibung von Verbindungen, die
dem Nährmedium
zugefügt
werden, die spezifische Biosynthesewege stimulieren oder aktivieren,
zum Beispiel diejenigen, die zur Taxol-Biosynthese führen. Es
versteht sich, dass der Aktionsmechanismus der hierin beschriebenen
Zusatzstoffe nicht komplett verstanden wird.
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Wenn in einer Suspensionskultur gleichzeitig
zum Wachstum sekundäre
Metabolitenbildung stattfindet, wird der Metabolit als wachstumszugehörig bezeichnet
und eine einzige Medienformulierung kann ausreichend sein, um gutes
Wachstum und Herstellung auf hohem Niveau zu erreichen. In vielen
anderen Systemen wurde herausgefunden, dass rasches Wachstum und
hohe Produktbildung nicht gleichzeitig stattfinden. In diesen Fällen sind
Wachstums- und Herstellungsphasen getrennt und für jede Phase wird unabhängig ein
Medium entwickelt (rückblickend
besprochen in Payne et al. 1991). Im Falle der Taxol- und Taxan-Herstellung
in Taxus chinensis wurden Wachstum und rasche Produktbildung getrennt
und es wurden jeweils unabhängige Medien
entwickelt. Es versteht sich jedoch, dass für diese Kultur auch ein einziges
Wachstums-/Herstellungsmedium formuliert werden kann. Die hier entwickelten
Herstellungsmedien erhöhen
nicht nur die Gesamt-Taxol- und -Taxan-Bildung, sondern richten
auch die zelluläre
Biosynthese auf die Taxol-Herstellung aus. Außerdem ist die Produktion von
störenden
Nebenprodukten wie Cephalomannin im Vergleich zu Rindengewebe minimal.
Die hier entwickelten Herstellungsmedien fördern auch die verlängerte Zelllebensfähigkeit
und Biosynthese und verursachen zusätzlich die Sekretion signifikanter
Produktlevels in das extrazelluläre
Medium. Diese Eigenschaften sind enorm wichtig im Betreiben eines
effizienten Herstellungsprozesses für die Taxol-Herstellung.
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Obwohl auch andere Medien eingesetzt
werden können,
sind die bevorzugten Herstellungsmedien für die verschiedenen Spezies
die in Tabelle 5 aufgeführten.
Zum Beispiel sind die bevorzugten Herstellungsmedien für Taxus
chinensis B & C,
obwohl andere verwendet werden können.
Diese Medien enthalten vorzugsweise die in Tabelle 2 aufgeführten Inhaltsstoffe.
Diese Medien enthalten vorzugsweise primäre und sekundäre anorganische
Salze, organische Verbindungen und Wachstumshormone oder Wachstumsregulatoren.
Die Mengen liegen allgemein innerhalb der folgenden Spannen, beginnend
mit dem 1/10tel bis dem Dreifachen der Konzentration jedes in Tabelle
2 angegebenen Mediuminhaltsstoffes. Die bevorzugten Levels sind
allerdings die in Tabelle 2 angegebenen.
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Wenn Medium B verwendet wird, sind
die Wachstumsregulatoren in einer Menge zwischen 0,1 ppm bis 20
ppm und vorzugsweise zwischen 1 ppm bis 10 ppm im Medium enthalten.
Wird Medium C verwendet, sind die Wachstumsregulatoren vorzugsweise
in Mengen von 0,1 ppm bis 5 ppm im Medium enthalten.
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Es versteht sich, dass an diesem
Medium Modifikationen vorgenommen werden können, wie zum Beispiel die
Substitution anderer konventioneller Salzverbindungen (wie organische
Verbindungen, Vitamine, Aminosäuren,
Vorläufer,
Aktivatoren und Inhibitoren), Hinzufügen oder Entfernung verschiedener
Komponenten, Wachstumsregulatoren oder Veränderung der Verhältnisse.
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Zusätzlich zu nichtflüchtigen
gelösten
Nährstoffen,
gasförmigen
Komponenten, spielen primär
Sauerstoff, Kohlendioxid und Ethylen (ein Pflanzenhormon) eine kritische
Rolle bei Wachstum und Produktbildung. Zwei Parameter sind wichtig.
Die Konzentrationen gelöster
Gase, die Wachstum und Taxol-Bildung begünstigen, sind eindeutig wichtig,
da sie die Reaktorbetriebsbedingungen bestimmen. Außerdem müssen die
Verbrauchs- oder Herstellungsraten in den Reaktoraufbau einfließen, damit
die optimalen spezifizierten Konzentrationen aufrechterhalten werden
können.
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Neben seiner Bedeutung für die Respiration
kann Sauerstoff auch eine enorme Auswirkung auf die sekundäre Biosyntheserate
haben. Eine hohe Sättigungskonstante
für einen
sauerstofferfordernden Schritt bei einem sekundären Biosyntheseweg kann es
erforderlich machen, dass Zellen im Reaktor hohen Sauerstofflevels
ausgesetzt werden. Die Bedeutung der CO2-Zugabe
bei der Aufrechterhaltung hoher Wachstumsraten wurde dokumentiert.
Ethylen, ein Pflanzenhormon, spielt eine pleiotrope Rolle in allen
Aspekten des Pflanzenwachstums und der Entwicklung, einschließlich des
sekundären
Stoffwechsels (siehe z. B. Payne et al. 1991).
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Auslöser
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Um die Ausbeute von Taxol und anderen
verwandten Taxanen in Zellkulturen zu verbessern, haben die Erfinder
eine Reihe von Versuchen durchgeführt. Einer dieser Ansätze, der
zur Steigerung der Produktivität eingesetzt
wurde, ist die Verwendung sogenannter Auslöser. Hier wird der Begriff
Auslöser
für Verbindungen biologischen
und nicht biologischen Ursprungs verwendet, die eine Steigerung in
der sekundären
Metabolitenherstellung verursachen, wenn sie bei Pflanzen oder Pflanzenzellenkulturen
angewendet werden (Eilert 1987; Ebel 1984; und Darvill et al. 1984).
Viele unterschiedliche Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Herkunft
und ihrer Wirkungsweise mit dem Zellstoffwechsel als Auslöser agieren.
In diesen Studien verwendeten die Erfinder zwei Hauptarten von Auslösern: 1)
Biotische Auslöser,
die normalerweise Zellwandextrakte oder Filtrate aus einer ausgewählten Gruppe
von Pilzen, Bakterien und Hefen enthalten sowie deren gereinigte Fraktionen.
2) Abiotische Auslöser,
die chemische Stressagenzien enthalten, sowie einige Verbindungen
biologischen Ursprungs (siehe in Tabelle 1 aufgeführte Auslöser).
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Christen et al. (1991) beschreibt
die Verwendung von Pilzauslösern
und ausgewählter
Verbindungen für
die Herstellung von Taxol durch Suspensionen von Taxus brevifolia;
die Erhöhungen
des Levels der Taxol-Akkumulation aufgrund der Auslöserbehandlungen
wurden jedoch nicht spezifiziert.
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Im Allgemeinen waren beide Auslöserarten
effektiv, obwohl sich der Umfang, in dem die Auslösung stattfand
(Taxan-Akkumulation in Zellkulturen sowie ihre Sekretion in das
Medium) von Auslöser
zu Auslöser und
von Spezies zu Spezies unterschied. Die höchste Produktionssteigerung
wurde mit Chitosanglutamat, Lichenan, Ferulasäure und Benzoesäure erzielt.
Chitosan und Lichenan sind komplexe, aus mikrobiellen Zellwänden stammende
Polysaccharide. Chitosan allein verwendet ist ein unlösliches
Medium, und es ist toxisch und verursacht bleibenden Zellschaden.
Chitosanglutamat andererseits ist in Medium leicht löslich und
beeinflusst die Lebensfähigkeit
von Zellen nicht. Ferula- und Benzoesäure sind synthetisierte Chemikalien
biologischen Ursprungs und werden im Allgemeinen als Antioxidanzien
in biologischen Systemen verwendet.
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Auslöser interagieren auf unterschiedlichste
Weise mit gelösten
Gasen. Bei der Auslösung
können sich
die Sauerstoffanforderungen ändern.
Erhöhungen
der Respirationsraten als eine Verletzungsreaktion werden bei PflanzenZellkulturen
häufig
festgestellt. Von Bedeutung ist, dass Auslöser ihre Wirkung über Ethylen
vermitteln können.
In diesen Fällen
kann es wünschenswert
sein, ein mikrobielles Auslöserpräparat durch Ethylen
zu ersetzen und vielleicht die mit anderen mikrobiellen Komponenten
im Auslöserpräparat verbundene Toxizität zu verhindern.
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Auslöser und metabolische Stressagenzien
können
gemäß dieser
Erfindung verwendet werden, um die Taxol-Herstellung und -Sekretion
in Gewebekultur zu maximieren, indem die Auslöserspezifität und -konzentration, Zeitwahl
und Dauer, als eine Funktion des Kulturalters und der Medienzusammensetzung
bewertet werden.
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Schneller
Mediumaustausch zur Produktivitätssteigerung
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Wie in Beispiel 7.3 dokumentiert,
trugen das Entfernen von verbrauchtem Medium und das Auffüllen von
frischem Medium alle 3 Tage zu einer wesentlichen Steigerung der
Gesamt-Taxan und -Taxol-Herstellung sowie zu einer Erhöhung der
Mengen an extrazellulärem
Produkt bei.
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Die Stimulationswirkungen des Mediumaustauschs
können
aufgrund der Entfernung des Produktes vor Ort aufgetreten sein,
wodurch eine Feedback-Verhinderung und Produktverschlechterung umgangen
werden würde.
Derartige positive Auswirkungen der Produktentfernung vor Ort bei
sekundärer
Metabolitenherstellung und -sekretion in Suspensionskulturen wurden
u. a. von Robins and Rhodes (1986) und Asada and Shuler (1989) dokumentiert.
Die periodische Entfernung des verbrauchten Mediums beinhaltet die
obengenannten Vorteile und kann durch die Entfernung anderer, Nicht-Taxan-Hemmkomponenten (wie
Phenolverbindungen) aus dem Medium zusätzlich zur Unterdrückung der
sekundären
Biosynthese dienen.
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Das Hinzufügen von frischem Medium zu
Zellen, die gerade aktiv die Biosynthese durchlaufen, kann die Herstellung
auch durch die Bereitstellung essentieller Nährstoffe, die erschöpft sind,
steigern. Zum Beispiel waren Miyasaka et al. (1986) in der Lage,
Salvia miltiorhiza Zellen der stationären Phase so zu stimulieren, dass
sie die Diterpenmetaboliten, Kryptotanahinon und Ferruginol einfach
durch Zugabe von Saccharose zum Medium herstellten. Vermutlich hatte
die Biosynthese aufgrund der Kohlenstofflimitierung in der stationären Phase
aufgehört.
Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Protokoll des periodischen
Mediumaustauschs hätte
als ein Ergebnis jedes beliebigen der obengenannten Faktoren von
Nutzen sein können.
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Es versteht sich, dass die Menge
des ausgetauschten Mediums, die Häufigkeit des Austauschs und die
Zusammensetzung des aufgefüllten
Mediums variiert werden kann.
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Die Fähigkeit, Biosynthese und Sekretion
durch periodischen Mediumaustausch zu stimulieren, hat wichtige
Auswirkungen für
das Design und das Betreiben eines effizienten technischen Verfahrens
im kontinuierlichen, halbkontinuierlichen oder Fed-Batch-Modus.
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Licht
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Für
höhere
Pflanzen ist Licht ein einflussreicher Faktor für den sekundären Stoffwechsel
sowohl für die
intakte Pflanze als auch für
Zellkulturen. Sowohl die Intensität als auch die Wellenlänge des
Lichts ist von Bedeutung (Seibert and Kadkade 1980). Zum Beispiel
werden die Flavanoid- und Anthocyanin-Biosynthese normalerweise
durch kontinuierliches Licht hoher Intensität begünstigt, während im Dunkeln gezüchtete Kulturen
für andere
Metaboliten bevorzugt sein können.
Eine Erhöhung
des grünen
Farbstoffs oder der photosynthetischen Kapazität gezüchteter Zellen kann auch die
Produktbildung oder das Produktspektrum steigern. Die Studien der
Erfinder beziehen die Verwendung von Breitband – sowie von spezifischen Schmalband-Lichtquellen
ein. Wie in Beispiel 7.3 gezeigt, kann die Lichtexposition zu einer
erhöhten
Taxol-Akkumulation sowie -Sekretion in das Medium führen. Die
Stimulationswirkung von Licht auf die Taxol-Herstellung deutet auf
die Existenz einzigartiger Kontrollmechanismen für die Biosynthese von Taxanen
hin. Die Art des Photorezeptors und die biochemischen Eigenschaften
der lichtinduzierten Stimulation sind noch unklar.
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Weisen des Arbeitsganges
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Die Wirkungsweise für ein Pflanzenzellenkulturverfahren
bezieht sich auf die Art und Weise, wie Nährstoffe, Zellen und Produkte
zeitbezogen hinzugefügt
oder entnommen werden (Payne et al. 1991). Werden alle Nährstoffe
zu Beginn zugeführt
und die Zellen und Produkt enthaltenen Kulturinhalte am Ende des
Kulturzeitraumes entnommen, wird die Wirkungsweise als ein „einstufiges
Chargenverfahren" bezeichnet.
Wird ein Chargenverfahren in zwei sequentielle Phasen, eine Wachstums-
und eine Herstellungsphase, geteilt, bei dem das Medium zwischen
den beiden Phasen ausgetauscht wird, wird die Wirkungsweise als
ein „zweistufiges Chargenverfahren" bezeichnet.
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In einem „Fed-Batch-Verfahren" werden im Verlauf
einer einstufigen oder einer zweistufigen Chargenkultur entweder
periodisch oder kontinuierlich bestimmte Mediumzusatzstoffe und
Nährstoffe
bereitgestellt.
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Wird ein wesentlicher Teil des Inhaltes
der Chargenkultur (jedoch nicht alles) entnommen, gleicht das Verfahren,
unter Zugabe von frischem Medium für fortgeführtes Wachstum und Herstellung,
einem „wiederholten
Abzug- und Auffüll-" Verfahren und wird
als „halbkontinuierliches
Verfahren" bezeichnet.
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Wird kontinuierlich frisches Medium
zugeführt,
und abfließendes
Medium kontinuierlich entfernt, wird das Verfahren als „kontinuierlich" bezeichnet. Werden
Zellen innerhalb des Reaktors zurückbehalten, wird das Verfahren
als ein „Perfusionsmodus" bezeichnet. Werden
mit dem abfließenden
Medium kontinuierlich Zellen entfernt, wird das kontinuierliche
Verfahren als ein „Chemostat" bezeichnet.
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Es versteht sich, dass diese unterschiedlichen
Weisen des Arbeitsganges mit dem hierin beschriebenen Taxol-Herstellungssystem
kompatibel sind.
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BEISPIELE
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Die folgenden Beispiele beschreiben
die bei der Ausführung
der Erfindung verwendeten Materialien und Verfahren näher. Die
Beispiele dienen der Veranschaulichung und schränken die Erfindung in keiner
Weise ein.
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Beispiel 1:
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Callus-Ausbildung
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Proben von Taxus-Pflanzenmaterial
wurden von einer Reihe wildwachsender und kultivierter Pflanzen gewonnen.
Die Proben wurden bei Ankunft im Labor verarbeitet oder bei 4°C gelagert
bis sie verwendet werden konnten.
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Zuerst wurde das Material in verdünnter Seifenlösung gewaschen,
in Wasser gespült
und die Oberfläche
für 10
Minuten n einer CLOROX-Lösung
(1% Hypochlorit, pH 7) sterilisiert. Unter sterilen Bedingungen wurde
das Material dann 3 Mal mit sterilem Wasser gespült. Nadeln wurden dann in eine
1% Polyvinylpyrrolidon- (PVP) Lösung
mit 100 mg/l Ascorbinsäure
geschnitten. Die Nadeln wurden mit dem geschnittenen Ende in Medium
E (siehe Tabelle 2) gegeben. Dreißig bis vierzig Explantate
wurden pro Mediumplatte gezüchtet. Explantate
enthaltende Platten wurden bei 24 + 1°C im Dunkeln inkubiert. Die
Platten wurden täglich
auf das Auftreten kontaminierender Mikroorganismen überwacht
und wo diese vorhanden waren, wurden nicht kontaminierte Nadeln
entfernt und in eine frische Platte mit Medium E gegeben. Es wurde
erhebliche callus-Bildung beobachtet und der callus wurde nach 20
Tagen vom Explantat getrennt und auf die verschiedenen in Tabelle 3
aufgeführten
callus-Proliferationsmedien aufgebracht. Zum Beispiel wurden die
calli von Taxus chinensis auf Medium D (siehe Tabelle 2) übertragen.
Dieser Ausbildungsvorgang war sehr effizient; er führte zu
einer niedrigen Kontaminationsrate und einer hohen Häufigkeit
der callus-Induktion von über
90% angeregten Explantaten. Das gleiche Verfahren wurde erfolgreich
eingesetzt, um Kulturen von Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus
cuspidata, Taxus baccata, Taxus globosa, Taxus floridana, Taxus
wallichiana, Taxus media und Taxus chinensis anzuregen.
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Beispiel 2:
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Callus-Proliferation
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Nachdem die Calli aus dem Explantat
entfernt wurden, werden sie bei 24 + 1°C im Dunkeln gezüchtet. Gesunde
Teile des callus wurden alle 10 Tage in frisches Medium übertragen
und diese Übertragungshäufigkeit
stellte sich als extrem wichtig für die Vermeidung von Bräunung und
für eine
verlängerte
callus-Erhaltung heraus. Die bevorzugten Wachstums- und Erhaltungsmedien
für calli
verschiedener Spezies sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
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Beispiel 3:
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Suspensionsanregung
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1 g Frischmasse an callus-Material
wurde aseptisch in einen 125 ml Erlenmeyer-Kolben mit 25 ml flüssigem Medium geeignet für die jeweilige
Spezies (siehe Tabelle 3) eingeimpft. Zum Beispiel wurde Medium
D für Taxus
chinensis verwendet. Der Kolben wurde mit einer Silikonschaumkappe
(Bellco, NJ) bedeckt und bei 24 + 1°C im Dunkeln auf einem Rotationsschüttler mit
120 U/min platziert. Innerhalb von ca. 3 bis 10 Tagen bildeten sich
Suspensionskulturen. Anfänglich
wurde das Medium durch Saugfiltration des Kolbeninhaltes durch einen
Büchner-Trichter
mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) ausgetauscht und die gesamte
Biomasse wieder in frischem Medium suspendiert. Nach Zellwachstum
wurden generell 1–2
g (Frischmasse) der Zellen in einen neuen 125 ml Kolben mit 25 ml
frischem Medium übertragen
und danach wöchentlich
subkultiviert.
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Beispiel 4:
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Wachstum suspendierter
Zellen
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Die in Suspensionskulturen repräsentativer
Spezies erreichten typischen Wachstumsraten und Zelldichten sind
in Tabelle 4 aufgeführt.
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Als detailliertes Beispiel wird die
zeitabhängige
Zunahme der Biomasse (Frisch- und Trockenmasse) für die Taxus
chinensis Linie K-1 in 1 gezeigt.
Die maximale Wachstumsrate wurde mit dem Anstieg an Punkten der
schnellsten Biomassezunahme auf den Wachstumskurven gemessen. Zellkulturen
von Taxus chinensis wuchsen bei einer maximalen Verdopplungszeit
von 2,5 Tagen. Diese Wachstumsrate ist erheblich höher als
die zuvor für Suspensionskulturen
von Taxus-Spezies beschriebenen. Zum Beispiel beschrieb Christen et
al. (1991) eine 5- bis 10-fache Zunahme der Biomasse nach 3 bis
4 Kulturwochen, was umgerechnet eine durchschnittliche Verdopplungszeit
für Taxus
brevifolia Suspensionen von 7 bis 12 Tagen ergibt.
-
Die Fähigkeit, Zellen mit einer hohen
Dichte zu züchten,
ist wichtig für
die Maximierung der volumetrischen Produktivität eines Zellkulturverfahrens.
Während
Kulturen von Taxus brevifolia eine Zelldichte von weniger als 1
g Trockenmasse pro Liter erreichten (berechnet aus Daten, die in
Christen et al. (1991) dargestellt wurden), waren Suspensionen von
Taxus chinensis in der Lage, nach 18 Wachstumstagen Dichten von
bis zu 8 bis 20 g Trockenmasse pro Liter zu erreichen. Die Lebensfähigkeit
der Zellen wurde durch die Färbung
von Zellen mit einer 0,05%-Lösung
Fluorescein-Diacetat in Aceton (Widholm, 1972) und durch die Zählung der
Anzahl grüner
fluoreszierender Zellen bei Anregung mit blauem Licht in einem inversen
Fluoreszenzmikroskop (Olympus IMT-2, Japan) bestimmt. Die Lebensfähigkeit
der Zellen war während
der gesamten Wachstumsphase höher
als 90%.
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Die Fähigkeit, Zellen unter raschen
Wachstumsbedingungen zu hohen Zelldichten zu züchten, während eine hohe Lebensfähigkeit
erhalten bleibt, ist eine wichtige Voraussetzung für das wirtschaftliche
Betreiben eines Pflanzenzellenkulturverfahrens für die Herstellung von Taxol
und Taxol-ähnlichen
Verbindungen.
-
Beispiel 5:
-
Analyse von Taxol und
Taxanen
-
5.1. ELISA-Verfahren
-
Die ELISA-Analyse für Taxol
(Hawaii Biotech) wurde für
das großangelegte
Screening von Zelllinien verwendet. Dieses Verfahren bietet hohe
Empfindlichkeit (0,1 ng/ml), jedoch wird aufgrund der Verwendung eines
polyklonalen Antikörpers
eine Kreuzreaktivität
mit anderen Taxanen beobachtet. Vorbereitende (analytische) HPLC
mit Fraktionssammlung zeigte Kreuzreaktivität mit 10-Deacetyltaxol, 7-Xylosyl-10-Deacetyltaxol, Cephalomannin,
10-Deacetyl-7-Epitaxol, 7-Epitaxol sowie anderen nicht identifizierten
Taxanen. Trotz einer derartigen Kreuzreaktivität stellte sich dieses Verfahren
als extrem nützlich
für die
Erkennung der Taxan-Produktion heraus und erlaubte ein schnelles
Screening großer
Mengen von Zelllinien. Zellextrakte, die eine erhebliche Produktion
von Taxanen zeigten, wurden dann mit Hilfe des unten dargestellten
HPLC-Verfahrens detailliert analysiert.
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5.2. Extraktion von Taxol
und verwandten Taxanen
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Die Extraktion von Taxanen aus Überständen wurde
mittels zweier Verfahren durchgeführt, in Abhängigkeit von den in den Medien
vorhandenen Konzentrationen. Waren ausreichende Mengen von Taxanen
in flüssigen
Medien vorhanden, wurden sehr schnell und effizient Proben bereitet.
Die Medien (2 ml) wurden komplett getrocknet (in vacuo) und eine
gemessene Menge Methanol (0,5–2,0
ml) wurde hinzugefügt.
Diese Mischung wurde so lange ultraschallgerührt, bis eine komplette Auflösung oder
Dispersion der Probe erreicht war. Feststoffe wurden vor der HPLC-Analyse
durch Zentrifugieren entfernt. Quantitative Gewinnung wurde bei 1
mg/l Levels mit Erkennungslevels weit unter 0,1 mg/l erhalten.
-
War die Konzentration von Taxanen
in den Kulturüberständen gering,
wurde das Medium drei Mal mit einem gleichen Volumen einer Mischung
aus Methylenchlorid und Isopropylalkohol (IPA) (9 : 1 nach Vol.)
extrahiert. Die organische Schicht wurde bis zur Trockenheit reduziert
und in einem gemessenen Volumen Methanol (50–250 ml) rekonstituiert. Durch
Mehrfachextraktion wurden normalerweise 90–95% des Taxol, Cephalomannin
und Baccatin III auf 0,6 mg/l Levels gewonnen.
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Zellmaterialien wurden durch das
Gefrieren frisch gewonnener Zellen (–5°C) gefolgt von Vakuumtrocknung
und Methanol Soxhlet-Extrahierung für 50 Zyklen extrahiert. Allgemein
wurden 70 bis 80% der Taxane mit 10–15% messbarer Degradation
gewonnen. Die Extraktion von festen Medien und callus wurde identisch zum
Verfahren der Zellen erreicht, jedoch wurde immer Methylenchlorid/IPA-
zu Wasser-Aufteilung des abschließenden Methanolextrakts durchgeführt.
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5.3. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Verfahren
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Analytische Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) wurde auf einer kohlenstoffreich beladenen Diphenylsäule (Supeico,
5 mM, 4,6 mm × 25
cm) mit einem analytischen LDC Binärgradienten-Hochdruckmischsystem
bestehend aus CM3500/CM3200-Pumpen,
einem CM4100 Autosampler mit variablem Volumen und einem SM5000
Photodiodenarray-Detektor mit einer Schnittstelle zu einem 486er
PC für
alle Peripheriegeräte
durchgeführt.
Die Säulentemperatur
wurde mit einem Eldex CH150 Säulenofen
auf 35°C
reguliert. Die quantitative HPLC-Analyse von Taxanen wurde mit Hilfe
eines Binärgradienten-Elutionsschemas
wie folgt erreicht:
- Elutionsmittel A
- 0,015 mM KHP2O4, mit Trifluoressigsäure auf
pH 3,5 gebracht
- Elutionsmittel B
- Acetonitril
-
Die verwendeten chromatographischen
Verfahren ähneln
mehreren veröffentlichten
Verfahren (Witherup et al. 1989) mit der Ausnahme, dass ein Trifluoressigsäure enthaltender
Phosphatpuffer verwendet wurde und dass ein längerer Gradient eingesetzt
wird. Diese Unterschiede verbessern die Auflösung von Taxol und anderen
Taxanen aus der Mischung erheblich. Die für Taxane beobachteten relativen
Verweilzeiten sind unten angegeben. Taxol eluiert zwischen 31 und
33 Minuten abhängig
von der verwendeten Säule
und Hardware.
| Verbindung | Relative
Verweilzeit |
| 10-Deacetylbaccatin
III | 0,38 |
| Baccatin
III | 0,56 |
| 7-Xylosyl-10-Deacetyltaxol
C | 0,80 |
| 10-Deacetyltaxol
C | 0,87 |
| Cephalomannin | 0,94 |
| 10-Deacetyl-7-Epitaxol
C | 0,98 |
| Taxol
C | 1,00 |
| 7-Epitaxol | 1,12 |
-
Die Verweilzeiten von Taxol, Cephalomannin
und Baccatin III wurden mit Hilfe authentischer Proben bestimmt,
die vom National Cancer Institute bezogen wurden. Die Verweilzeiten
der anderen oben aufgeführten
Taxane wurden mit analytischen Standards verglichen, die durch Hauser
Chemical (Boulder, CO) bereitgestellt wurden. Die Identifizierung
bekannter Taxane basierte auf der Verweilzeit und Ultraviolett-Spektral-Vergleichen. Die
Quantifizierung von Taxol, Cephalomannin und Baccatin III basierte
auf Reaktionsfaktoren, die aus authentischen Materialien bestimmt
wurden. Die Quantifizierung von 10-Deacetylbaccatin III erfolgte
mittels des für
Baccatin III bestimmten Reaktionsfaktors. Die Quantifizierung der
verbleibenden Taxol-Derivate basierte konservativ auf dem für Taxol
gemessenen Reaktionsfaktor.
-
Jeder der Standards (10 ml) wurde
normal injiziert (zu Beginn, dann nach 3 oder 4 Proben) und es wurden
Bereiche für
jede der drei Komponenten integriert. Die Reaktionsfaktoren für jede der
Komponenten wurden durch lineare Analyse kleinster Quadrate der
Daten gewonnen. 10 ml jeder Probe wurden injiziert und die Menge
pro Injektion wurde basierend auf der Standarddatenregression berechnet.
Diese Ergebnisse wurden in Menge pro Liter oder Prozent Trockenmasse
umgerechnet. 4 illustriert
ein typisches Chromatogramm einer Überstandsprobe.
-
5.4. MS/MS Bestätigung von
Taxol
-
Die Identität von Taxol in Zellkulturüberstand
wurde mittels eines MS/MS-Verfahrens (wie in 6 gezeigt) bestätigt, das die Fließinjektion
mit Ionenspray-Atmosphärendruck-Chemikalienionisierung
koppelt. Einzelheiten zu den für
die Erfassung der in 6 dargestellten
Daten verwendeten Verfahren sind Folgende: Massenspektrometer: Sciex
API 3 Dreifach-Quadrupol mit einer Atmosphärendruck-Ionisierungsquelle.
Stickstoff wurde als Sperrgas (curtain gas) und Argon als Kollisionsgas
(collission gas) für
die CID-Spektren verwendet. Schnittstelle: Ionenspray-Schnittstelle
mit Produktion von Ionen durch Ionenevaporationsionisierung (Elektrospray).
Als Zerstäubergas
wurde Nullluft (zero air) verwendet. LC-Pumpe: ABI 140B Dualspritzenpumpenbetrieb
bei 5 μl/Minute.
Lösemittel:
50/50 Acetonitril/H2O 2 mM NH4OAc + 0,1%
Ameisensäure.
Injektionsvolumen: 5 μl,
alle Spektren gemessen durch Fließinjektionsanalyse. Dieses
Verfahren bot die eindeutige Bestätigung für die Gegenwart von Taxol in
Zellkulturproben sowie die Quantifizierung mit ausgezeichneter Übereinstimmung
zu den HPLC-Ergebnissen.
-
Beispiel 6:
-
Taxol-Herstellung durch
verschiedene Spezies
-
Das durch Zellkulturen verschiedener
Taxus-Spezies hergestellte Taxol ist in Tabelle 5 zusammengefasst.
Callus wurde im Dunkeln für
20 Tage auf dem angegebenen verfestigten Medium für jede Spezies
kultiviert. Die Zellen und das Medium wurden getrocknet und aus
beiden gemeinsam wurde mit Methanol extrahiert und entweder mit
ELISA oder HPLC, wie angegeben, untersucht. Die mit Taxus chinensis
Kulturen erhaltenen Ergebnisse werden in Beispiel 7 und 8 weiter
verarbeitet.
-
Beispiel 7:
-
7.1. Herstellung in Wachstumsmedium
-
Die Herstellung von Taxol und verwandten
Taxanen begann innerhalb der ersten 2 Tage nach Übertragung in Wachstumsmedium
A. Das Maximum an Taxol wurde am 15. Tag mit 8,81 μg/Kolben
festgestellt, was 0,44 mg/Liter Taxol entspricht. Davon befanden
sich 46,1% im extrazellulären
Medium. Am 15. Tag war die Gesamt-Taxan-Konzentration 72,87 μg/Kolben
oder 3,6 mg/Liter, wovon sich 58,6% im extrazellularen Medium befanden.
Die Lebensfähigkeit
der Zellen war immer größer als
90%, was durch Fluoreszenzfärbung (Beispiel
4) gemessen wurde, was darauf schließen lässt, dass die Gegenwart von
extrazellulärem
Taxol und Taxanen eher aufgrund von Sekretion entstand als durch
Zellauflösung.
Die Fähigkeit
von Zellen, Taxol und Taxane abzusondern wird ein wichtiger Aspekt
des kontinuierlichen Betriebes sein.
-
7.2. Mediumaustausch zur
Produktivitätssteigerung
-
Erhebliche Verbesserungen der Taxol-
und Taxan-Produktivität
wurden durch aseptische Absaugung von Wachstumsmedium A am 9. Tag
erzielt; dann wurde es durch frisches Medium ersetzt und der Vorgang am
12. Tag wiederholt. Das Experiment wurde am 15. Tag abgeschlossen
und die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
Die wichtigen Steigerungen der Produktivität aufgrund des Mediumaustausches
sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Die Gesamtmengen von hergestelltem
Taxol und Taxanen waren mit Mediumaustausch etwa 4,6-fach höher im Vergleich
zu Kontrollen ohne Behandlung. Wichtig ist, dass im Vergleich zu
Kontrollen ohne Mediumaustauschbehandlung etwa 4,9-fach mehr Taxol
und etwa 5,9-fach mehr Gesamt-Taxane im extrazellulären Medium
gewonnen wurden.
-
Die Fähigkeit zu einer deutlichen
Steigerung der Taxol- und Taxan-Produktivität und außerdem die Auslösung extrazellulärer Produktakkumulation,
sind wichtig für
das Betreiben eines effizienten, kontinuierlichen Verfahrens mit
Biomasse-Wiederverwendung und vereinfachter nachfolgender Reinigung.
-
7.3. Auswirkung von Licht
auf die Taxan-Herstellung in Wachstumsmedium
-
Es ist bekannt, dass Licht nicht
nur bei der Photosynthese eine wichtige Rolle spielt, sondern auch
bei verschiedenen Aspekten des sekundären Stoffwechsels in Pflanzenzellenkulturen
(Seibert and Kadkade 1980). Während
die in Beispiel 4, 7.1 und 7.2 beschriebenen Experimente im Dunkeln
durchgeführt
wurden, wird hier die Reaktion von Taxus chinensis Kulturen auf
Licht beschrieben.
-
Ein Gramm Frischmasse 7 Tage alter
Zellen der Taxus chinensis Linie K-1 wurde in einen 125 ml Erlenmeyer-Kolben
mit 25 ml Wachstumsmedium A (siehe Tabelle 2) eingeimpft und bei
24 ± 1°C auf einem
Rotationsschüttler
bei 120 U/min. inkubiert. Duplikatkolben wurden ins dunkle und unter
eine Standard-Gro-Lux-Lampe mit einem Abstand von 3 Fuß gestellt.
Die Spektraleigenschaften der Lampe werden in 3 gezeigt. Die Ergebnisse werden in Tabelle
7 gezeigt.
-
Die Lichtexposition der Kulturen
hatte keine Auswirkung auf die Gesamt-Taxan-Levels oder das Ausmaß der extrazellulären Akkumulation.
Jedoch unterschieden sich in den beiden Behandlungen die Taxan-Profile
erheblich. Zum Beispiel produzierten die im Licht gezüchteten
Zellen die 2,8-fach höhere
Menge an Taxol als die Zellen im Dunkeln. Der Anteil des extrazellulären Taxols
war auch erheblich höher
als bei der Behandlung im Dunkeln (76 % zu 56%). Der Einsatz der
Lichtbehandlung, besonders von spezifischer Spektralqualität, wäre so extrem
nützlich
in einem Zellkulturverfahren zur Taxol-Herstellung.
-
Beispiel 8:
-
Auslöser
-
Der Begriff Auslöser wird für Verbindungen biologischen
(oder Biotischen) und nichtbiologischen (oder abiotischen) Ursprungs
verwendet, die eine Erhöhung
im sekundären
Stoffwechsel verursachen, wenn sie den Pflanzenzellkulturen zugefügt werden.
-
Während
sich eine ganze Reihe von Auslösern
als nützlich
erwies, wird hier detailliert ein repräsentatives veranschaulichendes
Beispiel beschrieben, und zwar die Verwendung von Chitosanglutamat.
Als Chitosan kürzlich
versuchsweise als Auslöser
in einigen Pflanzenzellkultursystemen eingesetzt wurde, zeigte sich, dass
es durch die toxischen Begleiterscheinungen wie Bräunung und
der Verlust von Lebensfähigkeit
nicht zur Verwendung geeignet ist (Beaumont and Knorr 1987). Tatsächlich sind
derartige toxische Nebenwirkungen ein bekannter Nachteil vieler
der in der Literatur genannten Auslöser. Die Verwendung chemisch
modifizierten Chitosans wie Chitosanglutamat zur spezifischen Induzierung
der Taxol- und Taxan-Biosynthese unter Umgehung der toxischen Nebenwirkungen
ist ein neuartiger Ansatz.
-
Für
7 bis 8 Tage in Medium D gezüchtete
Suspensionen der Taxus chinensis Linie K-1 wurden mit Hilfe eines
sterilen Büchner-Trichters
mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) aseptisch sauggefiltert.
2 g Frischmassezellen wurden aseptisch in einem 125 ml Erlenmeyer-Kolben mit 25 ml
Medium C (siehe Tabelle 2) übertragen.
Eine Lösung
von 0,05% Chitosanglutamat wurde frisch zubereitet und durch einen
0,22 Mikron-Patronenfilter sterilfiltriert. 825 μl dieser Lösung wurden dem Kolben zu Beginn
des Experiments zugegeben, entsprechend einem Level von 165 mg Auslöser pro
Gramm Trockenmassezellen. Die Kolben wurden im Dunkeln bei 241°C auf einem
Rotationsschüttler
bei 110 U/min. inkubiert. Den Kolben wurden am 15. Tag zerstörend Proben
entnommen und die Beobachtungen zu Wachstum, Farbe der Zellen und
des Mediums und Zelllebensfähigkeit
wurden verzeichnet. Gefriergetrockneten Proben wurde für Taxol
und Taxane wie in Beispiel 5 beschrieben Methanol extrahiert und
sie wurden mittels HPLC analysiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind
in Tabelle 8 aufgeführt.
-
Die Auslöserbehandlung resultierte in
einer moderaten Verbesserung in der Gesamt-Taxan-Herstellung pro Zelle (0,53% zu
0,42% Trockenmasse Taxan) gegenüber
nichtbehandelten Kontrollen. Die nichttoxische Natur des Auslösers ist
aus der hohen Lebensfähigkeit
(75–80%)
ersichtlich, die in beiden Behandlungen beobachtet wurde. Tatsächlich wurde
im Vergleich zu den Kontrollen eine erhöhte Trockenmasse bei der Auslöserbehandlung
reproduzierbar beobachtet (14,2 g/l zu 10,1 g/l Trockenmasse). Die
höheren
Zelldichten ergaben einen 1,8-fach höheren Titer von Gesamt-Taxanen
in der Auslöserbehandlung,
d. h. 75,8 mg/l im Vergleich zu 42,4 mg/l für die Kontrolle.
-
Die Auslöserbehandlung führte zu
einer gesteigerten Taxol-Biosynthese, sowohl auf einer Pro-Zellen-Basis
(0,098% zu 0,054% Trockenmasse Taxol, ein 1,8-facher Anstieg) und
in einem Titervergleich (13,9 mg/l zu 5,4 mg/l, ein 2,6-facher Anstieg).
Das Ausmaß der
Sekretion war für
die Auslöserbehandlung
im Vergleich zur Kontrolle höher
(85% zu 72% extrazelluläres
Produkt).
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Die hier beschriebene Auslöserbehandlung
führt zu
einer erhöhten
Taxol-Produktion, einem günstigeren
Produktprofil, gesteigerter Produktsekretion und zur Erhaltung einer
hohen Zelllebensfähigkeit.
Diese Herstellungseigenschaften stellen eine erhebliche Verbesserung
für ein
Zellkulturverfahren zur Taxol-Herstellung dar.
-
Beispiel 9
-
Entwicklung des Herstellungsmediums
-
Bei einem Versuch, die Taxol-Produktivität über die
in Beispiel 6 beschriebenen Levels hinaus zu erhöhen, wurden die Nährstofflevels
verändert,
um spezielle ,Herstellungsmedien' zu
formulieren. 7 bis 8 Tage alte Suspensionen der in Medium D gezüchteten
Taxus chinensis Linie K-1 wurden mit Hilfe eines sterilen Büchner-Trichters
mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) antiseptisch sauggefiltert.
500 mg Frischmassezellen wurden aseptisch auf 5 ml der Herstellungsmedien
B und C (siehe Tabelle 2) übertragen.
Die Gefäße wurden
für unterschiedliche
Zeitspannen von 18, 25 und 42 Tagen bei 241°C auf einem Rotationsschüttler bei
110 U/min. im Dunkeln inkubiert. Den Behandlungen wurden zerstörend Proben
entnommen und die Beobachtungen zu Wachstum, Farbe der Zellen und
des Mediums und Zelllebensfähigkeit
verzeichnet. Gefriergetrockneten Proben wurde für Taxol und Taxane wie in Beispiel
5 beschrieben mit Methanol extrahiert und sie wurden mittels HPLC
analysiert.
-
9.1. Ergebnisse der 18-Tages-Kultivierung
-
Taxus chinensis Zellkulturen reagierten
auf veränderte
Mediumzusammensetzungen mit der Herstellung erheblicher Levels von
Taxanen und Taxol. Diese Daten sind in Tabelle 9 zusammengefasst
und ein Beispiel-Chromatogramm wird in 4 gezeigt. In Medium B, wurden 99,8 mg/Liter
der Gesamt-Taxane produziert, mit 24,1 mg/Liter reinem Taxol. In
Medium C wurden 110 mg/Liter der Gesamt-Taxane produziert, mit 21,3 mg/Liter
Taxol. Auf Trockenmassebasis produzierten die Zellen 0,18% Trockenmasse
Taxol auf Medium B und 0,065% Trockenmasse Taxol auf Medium C.
-
9.2. Verlängerte Züchtung
-
Die Taxol- und Taxan-Herstellung
nach verlängerter
Züchtung
von Taxus chinensis Zellen (Linie K-1) für 25 und 42 Tage wurde in Medium
C studiert; die Ergebnisse dafür
sind in 5 zusammengefasst.
Die folgenden wesentlichen Beobachtungen können zusammengefasst werden:
- (i) Taxus-Suspensionskulturen sind in der Lage,
erhebliche Levels von Taxol und anderen Taxanen zu produzieren.
Die höchste
Akkumulation trat nach 42 Tagen mit 0,32% Trockenmasse Taxol und
0,62% Trockenmasse Gesamt-Taxanen auf, was basierend auf dem abschließenden Mediumvolumen
Titern von 153 mg/l Taxol und 295 mg/l Gesamt-Taxanen entspricht.
Die Analyse dieser Probe durch Tandem-Massenspektrometrie bestätigte die
Gegenwart von Taxol wie in 6 gezeigt.
Quantifizierung durch MS/MS zeigte ausgezeichnete Übereinstimmung
mit HPLC.
- (ii) Die Rate der Taxol-Biosynthese zwischen Tag 25 und Tag
42 lag bei ca. 7,6 mg Taxol pro Liter pro Tag unter Annahme einer
linearen Produktion in der 17-Tages-Periode. Diese Rate ist erheblich
höher als
die Herstellungsrate in den ersten 25 Tagen. Die Rate der Gesamt-Taxan-Biosynthese
zwischen Tag 25 und 42 betrug 12,3 mg pro Liter pro Tag.
- (iii) Die Herstellungsmediumformulierungen können im Vergleich zu raschen
Wachstumsbedingungen wie sie in Beispiel 7 beschriebenen sind bis
zu 45-fache Erhöhungen
des spezifischen Taxol-Gehaltes induzieren.
- (iv) Das Produktspektrum kann durch die Ausrichtung der Biosynthese
auf das gewünschte
Endprodukt Taxol beeinflusst werden während die Produktion unerwünschter
Taxane minimiert wird. Zum Beispiel betrug der Taxol-Anteil am 25.
Tage 28% der Gesamt- Taxane
und am 42. Tag betrug der Taxol-Anteil 52% der Gesamt-Taxane im
Vergleich zum Wachstumsmedium (siehe Beispiel 7.1), in dem der Taxol-Anteil
nur 12,2% der Gesamt-Taxane
ausmachte. Diese Fähigkeit,
Produktprofile zu beeinflussen, wird wichtige Auswirkungen auf die
nachfolgende Reinigung und für
regulatorische Probleme bezüglich
der Produktreinheit haben. Zum Beispiel könnte die Fähigkeit, die Produktion des
Taxan-Nebenproduktes
Cephalomannin zu unterdrücken,
die nachfolgende Reinigung im Vergleich zur Reinigung von Taxol
aus Rindengewebe in hohem Maße
vereinfachen.
- (v) Taxus-Zellkulturen wurden zur Sekretion erheblicher Mengen
von Taxol (87% am 42. Tag) und anderen Taxanen induziert. Dass die
Gegenwart von extrazellulärem
Taxol und Taxanen eher auf Sekretion als auf Zellauflösung zurückzuführen ist,
wird durch mehrere unabhängige
Beobachtungen bekräftigt:
(a) zwischen dem 25. und 42. Tag fand weiterhin Biosynthese statt,
was darauf schließen
lässt,
dass die Zellen lebensfähig
und aktiv waren. In unabhängigen
Beobachtungen zeigte sich, dass nach 18 Tagen > 70% Lebensfähigkeit im Herstellungsmedium
vorhanden war; (b) unterschiedliche Prozentsätze verschiedener Taxane wurden
abgesondert. Hätten
sich Zellen aufgelöst,
hätte erwartet
werden können,
dass der Prozentsatz für die
verschiedenen Taxane im Medium ähnlich
ist.
- (vi) Die Fähigkeit
dieser Taxus-Zelllinie zu wachsen und in einer extrazellulären Umgebung
Taxol in hohen Raten zu produzieren ist besonders bemerkenswert.
- (vii) Die Taxus-Zelllinie, mit der diese Ergebnisse erzielt
wurden, ist außerdem
zu raschem Wachstum und hohen Zelldichten in der Lage und prägte die
verzeichnete Produktivität
nach 20 Generationen unter raschen Wachstumsbedingungen aus; was
ihre Stabilität
und ihr technisches Potential attestiert.
-
Die Levels des/der durch Zelllinien
von Taxus chinensis unter den hierin beschriebenen Bedingungen produzierten
Taxol und Taxane sind höher
als zuvor beschriebene Ergebnisse, und zwar um einen Faktor des 35-
bis 150-fachen. Zum Beispiel beschrieb Christen et al. (1991) die
Herstellung von 1 bis 3 mg/Liter Taxol durch Suspensionskulturen
von Taxus brevifolia nach 2 bis 4 Wochen Züchtung. Wickeramesinhe and
Arteca (1991) beschrieben die Herstellung von Taxol mit 0,009% Trockenmasse
in Zellkulturen von Taxus media.
-
Zusammenfassend zeigen unsere Daten,
dass mit vorsichtiger Initiierung und der Auswahl von Taxus chinensis
Kulturen sowie mit speziell formulierten Wachstumsmediumbedingungen
Zellen induziert werden können,
rasch zu hohen Zelldichten zu wachsen. Werden diese Zellen auf Herstellungsmediumbedingungen übertragen,
sind die Zellen für
längere
Zeiträume
zu Biosynthese in der Lage sowie zur Sekretion erheblicher Levels
von Taxol und anderen Taxanen, während
eine hohe Lebensfähigkeit
aufrechterhalten bleibt. Die Einbeziehung von periodischem Mediumaustausch,
Licht und Auslösern
in das Herstellungsmedium führt
zu weiteren synergistischen Produktivitätssteigerungen. Diese Eigenschaften
sind kritische Voraussetzungen für
ein effizientes technisches Verfahren für die Taxol- und Taxan-Herstellung
mit Hilfe der Gewebekulturtechnologie.
-
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-
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-
Tabelle 1.a. Liste der
für die
Auslösung
von Taxus chinensis Zellkulturen verwendeten Auslöser
-
I. Biotische Auslöser (Mikroorganismen)
-
- – Botrytis
cinerea
- – Phytophthora
megasperma
- – Pinellas
stripticum
- – Oligosporus
sp.
- – Pythium
mamillatum
- – Pythium
sylvaticum
- – Verticillium
dahliae
- – Verticillium
sp.
- – Penicillium
minioluteum
- – Phytophthora
lateralis
- – Cytospora
cincta
- – Cytospora
leucostoma
- – Alternaria
brassicicola
- – Alternaria
solani
- – Alternaria
cucumerina
- – Botrytis
squamosa
- – Cochliobolus
heterostrophus
- – Colletotrichum
trifolii
- – Colletotrichum
orbiculare
- – Colletotrichum
graminicota
- – Colletotrichum
gloeosporioides
- – Cylindrocladium
floridanum
- – Fusarium
crookwellense
- – Fusarium
heterosporium
- – Fusarium
oxysporum f. sp. conglutinans
- – Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici
- – Fusarium
oxysporum f. sp. pisi
- – Gibberella
zeae
- – Gaeumannomyces
raminis var. tritici
- – Geotrichum
sp.
- – Leptosphaeria
korrae
- – Nectria
haematococca MPVI
- – Mycosphaerella
pinodes
- – Ophiostoma
ulmi
- – Phoma
lingam
- – Phoma
pinodella
- – Phytophthora
infestans
- – Pythium
aristosporum
- – Pythium
graminicola
- – Pythium
ultimum
- – Rhizoctonia
solani
- – Sclerotinia
sp.
- – S.
nodorum D-45
- – Trametes
versicolor
- – Ustilago
maydis
- – Venturia
inaequalis
-
II. Biotische Auslöser (Mikrobielle
Fraktionen oder Produkte)
-
- – Chitosan
- – Lichenan
- – Glucomannan
- – Pleuran
- – Glucan
- – Carboxymethylglucan
- – Hydroxymethylglucan
- – Sulfoethylglucan
- – Mannan
- – Xylan
- – Mannobiose
- – Mannotriose
- – Mannopentaose
- – Mannotetraose
- – Cellulysin
- – Multifect
XL
- – Multifect
CL
- – Resinase
- – Pulpxyme
- – SP431
- – Pectinol
- – Rapidase
- – Klerzyme
- – Chitinase
-
III.
Abiotische Auslöser
(Chemische Stressagenzien sowie einige natürlich vorkommende Biochemikalien)
-
Tabelle
1.b. Liste der für
die Regulierung der Biosynthese von Taxol & Taxanen in T. chinensis Kulturen
verwendeten Vorläufer,
Inhibitoren & Stimulanzien
oder Aktivatoren.
-
Tabelle
2: Komponenten (mg/l) der für
die Züchtung
von Taxus-Kulturen verwendeten Medien von Phyton Catalytic.
-
-
Tabelle
3. Bevorzugte Bedingungen für
die callus-Proliferation verschiedener Taxus-Spezies. Die Inhaltsstoffe im
Hauptkulturmedium sind in Tabelle 2 aufgeführt.
-
Tabelle
4. Typische Wachstumseigenschaften von Taxus sp. Suspensionskulturen
-
Tabelle
5. Taxol-Herstellung bei verschiedenen Taxus-Spezies.
-
Tabelle
6. Verbesserungen in der Produktivität aufgrund der Mediumaustauschbehandlung.
Die Zahlen werden als die X-fache Verbesserung über den in einem 15-Tages-Chargenintervall
erzielten Levels ausgedrückt.
Taxus chinensis Zelllinie K-1 wurde in Medium A im Dunkeln gezüchtet.
-
Tabelle
7. Auswirkung der Standard-GroLux-Lichtbehandlung auf den Taxol-
und Taxan-Gehalt in 10 Tage alten Kulturen von Taxus chinensis Linie
K-1 gezüchtet
in Medium A. Die angegebenen Mengen sind als μg extrahiert aus 20 ml Suspension
ausgedrückt.
Das Zellwachstum war in beiden Behandlungen identisch (164 mg Trockenmasse
pro Kolben).
-
Tabelle
8. Vergleich von mit Chitosanglutamat behandelten zu nicht mit Auslöser behandelten
Suspensionen von Taxus chinensis Linie K-1 nach 15 Tagen Züchtung in
Medium C. Die angegebenen Taxan-Levels sind die Werte aus Zellen
und Medium zusammengefasst. % Extra bezieht sich auf den Prozentsatz
des extrazellulären Produktes.
-
Tabelle
9. Nährstoffmediumveränderungen
für gesteigerte
Taxan- und Taxol-Biosynthese
bei Taxus chinensis Suspensionslinie K-1. 500 mg Frischmassezellen
wurden pro 5 ml Medium eingeimpft und im Dunkeln für 18 Tage
inkubiert. Die produzierten Gesamt-Taxane (in Zellen und Medium zusammengefasst)
sind angegeben. Die Inhaltsstoffe in Medium B & C sind in Tabelle 2 aufgeführt.
