JPH03216123A

JPH03216123A - 培養植物体の増殖促進方法

Info

Publication number: JPH03216123A
Application number: JP2008985A
Authority: JP
Inventors: Sadami Miyazaki; 宮崎　貞巳; Kazuhiko Shimazaki; 島崎　一彦; Tatsuyuki Kimura; 木村　龍之
Original assignee: NITSUSEN KAGAKU KOGYO KK; Nissan Chemical Corp
Current assignee: NITSUSEN KAGAKU KOGYO KK; Nissan Chemical Corp
Priority date: 1990-01-17
Filing date: 1990-01-17
Publication date: 1991-09-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【発明の目的】

［産業上の利用分野］本発明は、ｊ／７ｖｉｔｒｏにおける無菌培養法により
培養されている植物体の組織を効率的に、かつ急速に増
殖させるための方法に関する。［従来の技術］（１）背景近年、最良品種の栄養体を大量生産する方法として、ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏにおける植物組織の無菌培養技術が広く
採用されている。植物体の組織を無菌的に摘出して培養
し、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ）、プロトコーム（ｐｒ
ｏｔｏｃｏｒｍ）　、ライゾーム（　ｒｈｉｚｏｍｅ）
又はカルス（ｃａｌｌｕｓ）等を生成させる技術が注目
を集めている。例えば、現在、ラン類を中心とした花弁
園芸作物、果樹等の木本性植物及び頭菜類では、組織培
養技術を応用して、対象植物組織を無菌的に摘出・培養
し、これらを増殖させた後、植物体の再生を促すという
段階を経る幼苗の大量生産が試みられている。しかし現
在の培養技術では、これらの組織から迅速に植物を再生
させる手段として、これら培養の大部分の段階において
、培地への植物ホルモンその他の生長調整物質の添加が
不可欠であると考えられている。｛２｝従来技術の問題点ところが、長期間植物ホルモン入りの培地で培養を継続
した場合植物体の変異が誘発され易く、■　培養中、組
織の器官形成能力が低下し植物体が再生されない。 ■　品種の重要形質が欠損する。等の当該植物ホルモン添加による変異が頻発し易い。こ
れらの変異現象は、幼苗の経済的生産に対し著しい障害
を与えるから、この問題は、本産業の直面する深刻な問
題の一つである。本発明者らは、上記問題を解決する目的で植物ホルモン
に替わる増殖促進手段につき組織的な研究を進めた結果
、先に、水溶性の銀塩が植物体の迅速かつ同調的再生に
有効であることを見出した（特願昭６３　−　２２６９
６８号）。以上の水溶性銀塩は、植物組織の再分化に対し顕著な効
果を示すが、植物体の活着率がやや低いという欠点を有
する（これは、恐らく銀塩の酵素阻害作用に因ると思わ
れる。）。［発明が解決しようとする課題］そこで本発明が解決しようとする課題は、上記先発明の
欠点であった活着率を改善することによって、植物体の
組織培養時における胚機体、プロトコーム、ライゾーム
又はカルス等の任意の生育段階において、植物体の再生
等の器官形成能力低下及び変異誘発を抑制しながら、迅
速かつ効率良く植物体を生産する技術を提供することで
ある。

【発明の構成】

［課題を解決するための手段］（１）概念本発明者らは、上述した活着率の低さという先発明の欠
点を改善する手段につき多くの実験を試みた結果、ここ
に水溶性銀塩で処理された植物組織をポリビニルピロリ
ドンを含む培養液中で培養することにより、水溶性銀塩
の特性を失わせることなしに活着率を著しく向上させう
る事実を見出した。本発明はこの知見に基づくものであ
る。（２］　　概要即ち、本発明に係る培養植物体増殖促進方法は、以上の
知見にに基づき、水溶性銀塩溶液で処理した植物体の組
織をポリビニルピロリドン（以下“ｐｖｐ’“と称する
）を含む培地中で培養することを要旨とする。敷祈すれ
ば、本発明は、胚又は胚機体、プロトコーム、ライゾー
ム又はカルス等の植物体の組織培養時における任意の生
育段階において、これらの組織を銀塩の水溶液で処理す
ると共に、組織をＰＶＰを含む培地中で培養することに
よって迅速かつ効率的にシュートの分化を促し、遺伝的
に均一な大量の幼苗の生産を短期間内に可能ならしめる
ための植物組織の培養法に係るものである。以下、発明に関連する主要な事項に付き説明する。（３）植物組織本発明剤の対象となる胚機体、プロトコーム、ライゾー
ム又はカルスとは、ラン類を中心とした花弁園芸作物、
果樹等の木本性植物、及び、薇菜類の諸器官く茎葉、花
器等）を培養して得られた組織を含む植物体を意味する
が、別段これらに限定されるものではない。４）水溶性銀塩本発明の客体である銀塩は、実質的に水に可溶性のもの
であれば何でもよく、好適な例として、例えば硝酸銀、
硫酸銀等の無機酸塩及びシュウ酸塩、酒石酸塩等の有機
酸塩その他、水に易溶性乃至難溶性の銀塩を例示できる
が、水に対する溶け易さ、入手の容易さ及び熱に対する
安定性などの点で硝酸銀が最も好ましい。しかし、塩化
銀又は臭化銀のような難溶性の銀塩類であっても、水に
１　ｐｐｍ程度以上溶けるものであれば、充分利用可能
である。（（５）　ＰＶＰｐＶＦ！　（化学名ボリ（Ｎ−ビニル−２−ビロリジノ
ン；一般名「ボビドン」）は、ラジカル触媒の存在下に
Ｎ−ビニル−２−ピロリジノン（モノマー）を塊状、溶
液又は懸濁重合させることにより得られる。このものは
、物理的にアルブミンに近い性質を有しており、第二次
世界大戦中、ドイツで代用血漿として盛んに利用された
程の無害な物質である。本物質は、ポリフェノール物質
（培養中生成する褐変物質）を特異的に吸着する作用を
有し、かつ熱に対し安定であるので、オートクレープ滅
菌が可能である。（６）培地上述の培地としては、ムラシゲ・アンド・スクーグ培地
、ハイボネツクス培地、ナドゾンＣ培地、ニツチ培地、
リンズマイヤー・スクーグ培地、ホワイト培地、バーシ
ン・アンド・ベント培地、Ｂ−５培地、ガムボルグ培地
などを用いる。炭素源としては、シヨ糖、グルコース、フルクトースな
どが単独で又は二種類以上の混合物として用いられる。炭素源は、培地中に約１〜５０ｇ／ρの濃度で存在すれ
ばよいが、好ましくは約５〜３０ｇ／ρである。培地のｐＨは４．０〜７．０に調整するのが適当であり
、特に４．８〜５．８の範囲が好ましい。これらの培地は、液体培地・固体培地のいずれでもよく
、培養温度は１５〜３０゜Ｃの範囲内、殊に１８〜２５
℃の温度で行われるのが望ましい。かつ、更に好ましく
は、培養は恒温条件下で約５００〜２０００ルックスの
光照射下で行われるのが望ましい。なお品種によっては、ココナッツミルク（約１〜２０重
量％）、バナナジュース（約１〜１０重量％）、トマト
ジュース（約１〜１０重量％）、ジャガイモジュースく
約１〜１０重量％）などを単独で、又は混合して使用し
た方が好ましい場合もある。更に必要により、培地成分
として、ゼアチン、カイネチン、ペンジルアミノフ゜リ
ン、２ｉＰ、４ＰＵなどの天然又は合成サイトカイニン
類や２．４−Ｄ、オーキシン、α−インドール酢酸、α
−インドール酪酸、α−ナフタリン酢酸、アブシジン酸
、ジベレリンなどの天然又は合成植物ホルモンの使用が
好ましいこともある。（７）培養法本発明剤を用いる組織培養においても、従来のと同じく
、無菌的に摘出した植物の組織を、無機・有機塩類及び
シヨ糖を含む培地上に置床して活着させたのち、それを
培地に移植し、胚裸体、プロトコーム・ライゾーム又は
カルス等の増殖を行う。次に、増殖したこれら組織を、滅菌済みの銀塩水溶液中
に浸漬し、滅菌水で水洗後、ＰＶＰを含む培地に移植、
培養して、これら組織から茎葉及び根を持つ完全なシュ
ートを形成させる。この場合、適当な水溶性銀塩の濃度
は、植物の種、品種、培養条件等により相違するが、通
常、浸漬液中帆０１〜１００ｐＰｍより好ましくは０．
１４０ｐｐｍの範囲内である。また培地中に溶解させる
ＰＶＰの濃度は、概ね０．１〜１％、好ましくは０．５
％付近である。［作用］本発明において、銀塩が胚又は胚裸体、プロトコーム、
ライゾーム又はカルスその他、植物体の組織培養時にお
ける任意の生育段階において、植物ホルモンに代わり、
これらの組織を迅速かつ効率的に増殖させてシュートの
分化を促し、突然変異のない遺伝的に均一な大量の幼苗
分化させる作用を奏するという事実の理論的説明として
、銀塩が植物組織におけるメチオニンの代謝系に何らか
の影響を及ぼし、例えばＳ−アデノシルメチオニン（Ｓ
ＡＭ）から１−アミノプ口パン−１−カルボン酸へのＡ
ＣＣ合成酵素の生産を阻害することに因るのではないか
と想像されることについては、既に先発明明細書中既述
した通りであるが、進んで、ＰＶＰがどのような機作で
銀塩処理組織の活着率を顕著に向上させるのかという理
由については説明が困難である。但し、これに関する蓋
然性のある一つの説明としては、ＰＶＰが複合体形成作
用を有するという事実から、このものが被処理組織に付
着する義援と複合体を形成し、組織の成長分化に有用な
酵素系への銀塩の有害な影響を阻止することを挙げるこ
とができよう。［実施例］以下、製造例及び使用例を示し、比較例と対照して発明
実施の効果を説明するが、例示は当然説明用のもので、
発明思想の限定を意図したものではない。造例１（銀塩水　液の調　例）試薬特級の硝酸銀を、蒸留水に夫々濃度０．１、１．０
及び１０ｐｐｍになるように溶かした水溶液各５００ｍ
ｌを調製し、各水溶液のｐＨを塩酸で５．５に調節後、
２００一容の広口三角フラスコに１００−づつ分注し、
アルミニウムキャップを施してから、オートクレープ中
、圧力１．２　ｋｇ／ｃｏ（、１２１℃の条件下で１５
分間加圧蒸気滅菌して放冷後、硝酸銀水溶液を調製した
。製゛告　２（培　の＝乳１例）ムラシゲ・アンド・スクーグ培地（ショ糖２０ｇ／！２
）に夫々ｐｖｐを０．５ｇ／！；ｌ、５　ｇ／ρ及び５
０ｇ／ρの濃度になるように溶かし、ｐ｝｛５ｉ．　５
に調製後、各々に寒天８ｇづつを加え、加熱、溶解させ
た後、１００ｍｌ容の培養瓶に３０−づつ分注し、プラ
スチックキャップを施してからオートクレープ中、圧力
１．２ｋｇ／ｃｆｆｌ　（１２１℃）の条件下に１５分
間、加熱滅菌後、放冷して試験用培地を得た。培養例１シュンランの新芽（長さ１５〜２５ｍｎ＋　）を採取し
てその外葉３〜４枚を取り除きウィルソン氏液で表面を
１５分間殺菌したのち、滅菌水で３回洗浄しその茎頂芽
及び腋芽を無菌的に切り出し、ムラシゲ・アンド・スク
ーグ寒天培地に置床して、２０℃の恒温条件下で培養し
てライゾームを形成させ、増殖させた。次いで、増殖したライゾームの先端部を約５ｍｎ＋の長
さに切り取り、上記各濃度の無菌硝酸銀水溶液中に夫々
０．５　＋　２、１２及び２４時間の各時間浸漬処理し
たのち、上記ＰＶＰ含有ムラシゲ　アンド．スクーグ培
地に置床して２０゜Ｃの恒温下で２ケ月間培養を行った
。なお対照として、上記ライゾームを硝酸銀で処理後、
ＰＶＰを含まないムラシゲ．アンド・スクーグ培地に置
床した区（対照区Ａ）と、硝酸銀で処理しないまま直接
ＰＶＰ含有ムラシゲ・アンド・スクーグ培地に置床した
区（対照区Ｂ）とにつき同様に培養試験を実施した。そ
の結果、ＰＶＰを培地中に含む区（発明区）では、培地
中にＰＶＰを含まない区（対照区Ａ）と比較して、硝酸
銀濃度の高低に拘らず約２倍の活着率を示した。特に、
硝酸銀濃度１〜１０ｐｐｍ−浸漬時間２時間、ｐｖｐ濃
度０．５％の培地置床区では、対照区と比較して、 ■　シュートの形成率：約２倍に増大、■　ライゾーム
の増殖及び進度：約１．５倍に増大、 ■　活着率：約８０〜９０％増大、 ■　重要形質の変異発生率；約２０％減少、という良好
な結果が得られた。培養例２デンファレ（ファレノプシス系デンドロビウム）の新芽
（長さ３〜５ｃｍ）を採取してウィルソン氏液）て裏面
を１５分間殺菌したのち、滅菌水で３回洗浄し、その茎
頂芽及び腋芽を無菌的に切り出し、ムラシゲ・アンド・
スクーグ寒天培地に置床して、２５゜Ｃの恒温条件下で
培養してプロトコームを形成させた。得られたプロトコームを、更にココナッツミルク（　１
５０ｇ／ρ）を含むムラシゲ・アンド・スクーグ液体培
地に移し、振盪培養機を用い、６０ｒｐｍの条件て振盪
培養してプロトコーム様体（Ｐ．Ｌ．Ｂ）を増殖させた
。このＰ．Ｌ．Ｂを分割し、培養例１と同様に硝酸銀処理
を行ったのち、ＰＶＰ含有ムラシゲ・アンド　スクーグ
寒天培地に置床し、２ケ月間、２５℃の恒温条件下に培
養した。なお対照として、ＰｖＰを含まないムラシゲ・
アンド・スクーグ寒天培地を用いて同様の試験を行った
。この結果、ＰＶＰ含有培地を用いた発明区ではいずれ
も良好な活着性が認められたが、特に硝酸銀濃度１〜ｌ
Ｑｐｐｌｌ１、浸漬時間２時間、ＰＶＰ濃度０．５％の
培地置床区では、対照区と比較して、 ■　シュートの形成率：約５０〜６０％増大、■　シュ
ートの仲度：約２〜３倍に増大、■　Ｐ．　Ｌ．　Ｂの
活着率：約６０〜８０％増大、■　重要形質の変異発生
率：約３０％減少、という良好な結果が得られた。

【発明の効果】

以上説明した通り、本発明は、胚又は胚機体、プロトコ
ーム、ライゾーム又はカルス等の植物体の組織培養時に
おける任意の生育段階において、これらの組織を処理す
ることによって迅速かつ効率的にシュートの分化を促し
、遺伝的に均一な大量の幼苗の生産を短期間内に可能な
らしめるため実用的な手段を提供し得たことにより、組
織培養産業の合理化及び発展に寄与しうる。

Claims

【特許請求の範囲】１　水溶性銀塩溶液で処理した植物体の組織をポリビニ
ルピロリドンを含む培地中で培養することを特徴とする
培養植物体の増殖促進方法。２　水溶性銀塩が硝酸銀である請求項１記載の方法。