KR102347608B1

KR102347608B1 - 절간배양을 이용한 단삼의 기내 식물체 형성방법

Info

Publication number: KR102347608B1
Application number: KR1020190117986A
Authority: KR
Inventors: 권영희; 이정관; 김희규; 김경옥; 허윤선; 박재성
Original assignee: 충청북도 (관리부서:충청북도 농업기술원)
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2022-01-06
Also published as: KR20210036051A

Abstract

본 발명은 단삼의 절간 부위로부터 신초형성 유도용 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계; 상기 생육된 신초를 유식물체 분화용 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계; 상기 유식물체를 발근 유도용 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및 상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계; 를 포함하는 단삼의 대량 증식을 위한 조직배양 방법에 관한 것으로, 본 발명의 조직배양 방법을 이용하면 기본 배지에서 배양하는 경우보다 신초 형성율, 유식물체 분화율, 발근율이 우수하므로 단삼을 효율적으로 증식할 수 있다.

Description

절간배양을 이용한 단삼의 기내 식물체 형성방법{Method for in vitro plant formation of Salvia miltiorrhiza Bunge using internode culture}

본 발명은 단삼의 절간배양을 이용해 기내 식물체 형성하는 방법에 관한 것이다.

단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 꿀풀과(Lamiaceae)에 속하는 다년생 초본 식물로, 중국이 원산지이며 우리나라에서는 경북이나 강원도의 산지에 분포한다. 키는 40 ~ 80 cm 정도이고 식물 전체에 털이 치밀하게 나 있으며 뿌리가 인삼의 형태를 닮고 빛깔이 붉어서 단삼으로 명명되었다. 단삼은 물에 씻어 잔뿌리를 없앤 뒤 잘라서 햇볕에 말리거나 술로 볶아서 쓰는데, 단삼은 적갈색 또는 어두운 적갈색으로 거칠고, 세로 주름이며, 단삼 채집품은 뿌리줄기가 짧고 긴 원기둥 모양으로 1~2개 또는 여러 개로 갈라져 있다. 또한, 단삼 절편의 단면은 황갈색 또는 갈색으로 기름이 번들거리며, 질은 유연한 것이 좋고, 단삼 횡단면의 피부는 적갈색이며, 목 부는 회황색 또는 자갈색이고 유관속은 황백색이며, 방사상으로 배열되어 있다(식품의약품안전평가원에서 발간한 한약재관능검사 해설서).

단삼 성분에 대한 연구는 60년 이상 진행되고 있는데, 현재까지 110여 개 이상의 성분이 분리 또는 확인되었으며, 현대에 들어 다양한 약리작용이 밝혀지면서 많은 주목을 받고 있다. 삼칠근과 단삼의 혼합 추출물은 혈정 콜레스테롤 저하 및 동맥경화를 포함한 심장 및 혈관 질환 예방에 효과가 있음이 알려져 있으며(한국특허등록 제327894호), 단삼 분획물은 인지기능 장애 예방(한국특허공개 10-2007-0040209) 및 전립선암에 대하여 치료 효과(한국 특허공개 10-2012-0020639)가 있음이 보고된 바 있다.

단삼의 번식 방법으로는 씨앗과 종근(씨뿌리) 나눔이 있는데 씨앗은 끈적거려서 채취하기 어렵고 발아율이 낮으며, 수화까지 시간이 오래 걸려 주로 뿌리 나눔을 하지만 뿌리 양이 많지 않아 대량 번식에 한계가 있다. 따라서 단삼의 효율적인 생산을 위해서는 조직배양 대량생산이 필수적이다.

식물의 눈, 잎, 줄기, 뿌리 등의 조직을 인공적인 기내 환경에서 배양하여 온전한 식물체로 생산하는 기술을 “조직배양”이라고 하는데, 온도 및 습도가 조절되는 배양실 안에서 유리병이나 시험관 등의 배양용기 내에 식물체가 자랄 수 있는 양분을 넣고 오염이 없는 무균상태에서 식물체를 키우는 기술이다. 이러한 조직배양 기술은 계절에 상관없이 연중 묘목 생산이 가능하여 적정한 배양조건이 확립되면 기내 식물체를 일시에 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.

식물체는 여러 종류의 기관 즉 뿌리, 줄기, 잎, 화기 등으로 구성되어 있는데 모든 기관이 분화능을 가지고 있으나, 기관의 종류에 따라 분화능력에 차이가 있기 때문에 적절한 배양기관의 선정은 대단히 중요한데, 대부분 경정부(정단부, Shoot tip), 액아(곁눈, Axillary bud), 잎 절편(엽편, Leaf segment)등을 이용하여 배양한다. 식물이 가지고 있는 고유의 분화능력을 전형성능(全形成能, Totipotency)이라 하는데, 단세포 혹은 식물 조직 일부분으로부터 완전한 식물체가 재생되는 능력을 말한다. 모든 세포가 전형성능을 지니고 있지만 세포 조직의 분화 정도, 채취 부위, 배지의 조성, 배양 환경 등에 따라 발현되는 결과는 현저히 차이가 나므로, 식물의 종류 또는 품종의 종류에 따른 배양 조건의 최적화가 필요하다(대한민국 공개특허 제 10-2017-0122946호).

특히 식물의 조직이나 기관이 기내(器內, 배양 시험관이나 유리병과 같은 배양용기 상태)라는 특수한 환경에서 생장 증식하기 위해서는 여러 영양분이 필요한데, 영양분의 요구도는 식물의 종류에 따라 또는 배양조직이나 기관의 종류에 따라서 차이가 나므로 배양하고자 하는 식물이나 조직의 특성에 맞는 배지를 개발하여야 한다. 본격적으로 식물 조직배양을 위한 배지가 제조되고 개발된 것은 Murashige와 Skoog(1962)에 의해서인데, MS(Murashige & Skoog) 배지라고 불리는 이 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형 있게 배합한 배지이다. MS 배지뿐만 아니라 DKW 배지, Gamborg B5 배지, White 배지, WPM 배지 등도 식물 조직배양시 기본 배지로 널리 사용되고 있다. 이러한 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 최적의 배지조성을 선택하여 배양하여야 하며, 이 때 기본배지 이외에도 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제 등을 첨가하거나 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 사용하는 것이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 단삼의 절간 부위를 기내에서 배양하여 절간으로부터 신초 형성 및 유식물체 분화를 유도한 후 이를 외부환경에 적응시키는 기외 순화 과정을 통하여 효율적으로 증식하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 단삼의 절간 부위로부터 BAP(6-benzylamino purine), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 펩톤(Peptone), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose), 겔라이트(Gelrite)를 포함하는 신초형성 유도용 MS 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계(1단계);

상기 생육된 신초를 IAA(indolacetic acid), 키네틴(Kinetin), 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 질산은(AgNO₃), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂), Charcoal, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose), 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 유식물체 분화용 1/2 MS 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계(2단계);

상기 유식물체를 BAP(6-benzylamino purine), IBA(indole butyric acid) 및 NAA(Naphthaleneacetic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 질산은(AgNO₃), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂), Charcoal, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose), 겔라이트(Gelrite)를 포함하는 발근 유도용 1/2 MS 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계(3단계); 및

상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계(4단계); 를 포함하는 단삼의 기내 식물체 형성방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단삼의 절간 부위로부터 BAP(6-benzylamino purine), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 펩톤(Peptone), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose), 겔라이트(Gelrite)를 포함하는 신초형성 유도용 MS 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계(1단계);

상기 생육된 신초를 IAA(indolacetic acid), 키네틴(Kinetin), 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 질산은(AgNO₃), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂), Charcoal, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose),, 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 유식물체 분화용 1/2 MS 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계(2단계);

상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계(4단계); 를 포함하는 단삼의 기내 식물체 형성방법을 제공한다.

본 발명은 절간배양 방법을 이용한 단삼의 기내 식물체 형성방법에 관한 것으로, 단삼의 절간 부위로부터 단삼의 식물체를 형성하는데 최적의 배지조성을 확립하고, 각각의 최적의 배지조성을 가지는 배지에서 신초 형성, 유식물체 분화 및 발근을 유도한 후 이를 외부환경에 적응시키는 기외 순화과정을 통하여 효율적으로 단삼을 증식할 수 있다.

도 1은 단삼의 절간 부위를 이용한 조직배양 단계를 나타낸 순서도이다.
도 2는 단삼 식물체의 절간 부위를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 신초 형성용 배지에서 배양하여 단삼에서 형성된 신초를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 유식물체 분화용 배지에서 배양하여 단삼의 신초로부터 형성된 유식물체를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 발근 유도용 배지에서 배양하여 단삼의 유식물체로부터 형성된 뿌리를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 발근이 유도되어 뿌리가 형성된 단삼의 유식물체를 기외 순화시키는 것을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명을 이용하여 생육하여 개화가 된 단삼의 식물체를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 단삼의 절간 부위로부터 BAP(6-benzylamino purine), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 펩톤(Peptone), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose), 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 신초형성 유도용 MS 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;

상기 생육된 신초를 IAA(indolacetic acid), 키네틴(Kinetin), 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 질산은(AgNO₃), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂), Charcoal, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose),, 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 유식물체 분화용 1/2 MS 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;

상기 유식물체를 BAP(6-benzylamino purine), IBA(indole butyric acid) 및 NAA(Naphthaleneacetic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 질산은(AgNO₃), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂), Charcoal, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose), 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 발근 유도용 1/2 MS 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및

상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계; 를 포함하는 단삼의 기내 식물체 형성방법을 제공한다.

상기 신초형성 유도용 MS 배지는, MS 배지 4.0 내지 4.8 g/L에 BAP를 1.8 내지 2.2 mg/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.7 내지 1.1 mg/L, 펩톤(Peptone) 0.8 내지 1.2 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 3.6 내지 4.0 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.

상기 신초형성 유도용 MS 배지는, MS 배지 4.2 내지 4.6 g/L에 BAP를 1.9 내지 2.1 mg/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.8 내지 1.0 mg/L, 펩톤(Peptone) 0.9 내지 1.1 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 3.7 내지 3.9 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.

상기 유식물체 분화용 1/2 MS 배지는, 1/2 MS 배지 1.8 내지 2.6 g/L에 IAA(indolacetic acid) 0.3 내지 0.7 mg/L 및 키네틴(Kinetin) 0.8 내지 1.2 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.08 내지 0.12 g/L, 펩톤(Peptone) 0.8 내지 1.2 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.8 내지 1.2 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 900 내지 1100ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.6 내지 2.4mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.03 내지 0.07 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.27 내지 0.39 g/L, 활성탄(charcoal) 0.8 내지 1.2 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.0 내지 4.8 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.

상기 유식물체 분화용 1/2 MS 배지는, 1/2 MS 배지 2.0 내지 2.4 g/L에 IAA(indolacetic acid) 0.4 내지 0.6 mg/L 및 키네틴(Kinetin) 0.9 내지 1.1 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 펩톤(Peptone) 0.9 내지 1.1 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.9 내지 1.1 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 950 내지 1050ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.8 내지 2.2mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.04 내지 0.06 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.31 내지 0.35 g/L, 활성탄(charcoal) 0.9 내지 1.1 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.2 내지 4.6 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.

상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는, 1/2 MS 배지 1.8 내지 2.6 g/L에 BAP(6-benzylamino purine) 0.3 내지 0.7 mg/L, IBA(indole butyric acid) 0.8 내지 1.2 mg/L, NAA(Naphthaleneacetic acid) 0.3 내지 0.7 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.08 내지 0.12 g/L, 펩톤(Peptone) 0.8 내지 1.2 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.8 내지 1.2 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 900 내지 1100ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.6 내지 2.4mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.03 내지 0.07 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.27 내지 0.39 g/L, 활성탄(charcoal) 0.8 내지 1.2 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.0 내지 4.8 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.

상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는, 1/2 MS 배지 2.0 내지 2.4 g/L에 BAP(6-benzylamino purine) 0.4 내지 0.6 mg/L, IBA(indole butyric acid) 0.9 내지 1.1 mg/L, NAA(Naphthaleneacetic acid) 0.4 내지 0.6 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 펩톤(Peptone) 0.9 내지 1.1 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.9 내지 1.1 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 950 내지 1050ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.8 내지 2.2mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.04 내지 0.06 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.31 내지 0.35 g/L, 활성탄(charcoal) 0.9 내지 1.1 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.2 내지 4.6 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 단삼 생산방법에 있어서, 각 단계에서 배지는 MS(Murashige & Skoog) 배지를 기본 배지로 사용할 수 있다.

상기 배지의 pH는 5 내지 6일 수 있다.

상기 MS(Murashige & Skoog) 배지는 식물조직 배양시 기본배지로 널리 사용되는 배지로 다른 배지에 비해 NH₄NO₃(20.6mM)와 KNO₃(18.8mM)의 비율이 높은 것이 특징이다. MS 배지는 질산태질소/암모니아태 질소의 몰비(mole ratio)가 약 2배로서 질산태 질소를 더 많이 포함하고 있으며, 총질소 함량은 60mM로서 다른 배지에 비해 현저히 높다. 상기 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 최적의 배지조성을 선택할 수 있다. 이때 첨가 및 함량이 변화되는 구성물은 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제가 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 MS 배지에 첨가되는 여러 형태의 당류는 탄수화물 합성 능력이 없는 배양 조직의 에너지원으로 작용하며, 조직배양 시 사용되는 당의 종류에는 수크로오스(Sucrose), 글루코오스(Glucose), 프럭토오스 (Fructose), 말토오스(Maltose) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이 중 수크로오스(Sucrose)는 물에 용해되고 고압 멸균되는 과정에서 단당류인 글루코오스와 프럭토오스로 분해되며, 배양체의 세포막에서 방출되는 인버테이즈(Invertase, 역전효소; 이당류인 수크로오스를 단당류인 프럭토오스와 글루코오스로 가수분해하는 효소)나 세포외효소에 의해 가수분해 되면서 배양체가 흡수하기 용이한 형태로 바뀌기 때문에 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 배양단계 및 배지 조성에 따라 기본배지에 첨가되는 수크로오스의 농도는 달라질 수 있다.

본 발명의 단삼 생산방법에 있어서, 구체적으로 각 단계에서 배지는 MS 배지를 기본 배지로 사용하고, 생장조절제, 비타민류 등을 추가로 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

식물체의 조직배양에 필요한 비타민으로는 티아민 HCl(Thiamine HCI), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 리보플라빈(Riboflabin), 이노시톨(Inositol) 등 비타민 B 복합체가 있으며, 이는 기내 배양체의 생장을 촉진시킬 수 있다. 또한 아스코르브산(Ascorbic acid), 시트르산(Citric acid)은 배양체에서 생기는 페놀 화합물의 작용을 억제하여 배양 식물체의 갈변 또는 흑변 현상을 감소시키고 건전한 배양묘의 생산 효율을 높일 수 있다. 식물 조직배양 과정 중 발생할 수 있는 갈변 또는 흑변 현상은 배양체에서 생기는 페놀 화합물이 배지에 집적되면서 배지의 산도를 급격히 떨어뜨리고 배양체로 이동되는 배지의 영양분 흡수력이 떨어지면서 발생할 수 있으며, 이에 계대 배양(배양체를 새로운 배지로 바꾸어 다시 배양하는 것)을 자주 하거나 아스코르브산, 시트르산, 활성탄 등의 첨가물을 배지에 추가하여 상기 문제점을 해결할 수 있다.

본 발명의 단삼의 기내 식물체 형성방법에 있어서, 배양단계 및 배지 조성에 따라 기본배지에 첨가되는 비타민과 그 농도는 달라질 수 있다.

식물생장조절제(Plant growth regulators)는 식물 생장에 관여하는 식물호르몬을 총칭하는 것으로 식물 조직배양 시에도 적정한 종류와 농도의 생장조절제가 배지에 첨가되어야만 배양의 목적에 맞게 배양체가 생육 및 분화할 수 있다. 상기 식물생장조절제의 종류로는 옥신(Auxin)류, 사이토키닌(Cytokinin)류, 지베렐린(Gibberellin)류, 앱시스산(Abscisic acid)이 있으나, 식물생장에 관여하는 식물호르몬이라면 본 발명의 식물체 형성 방법에 이용되는 배지에 포함될 수 있다.

옥신(Auxin)류에 고등식물의 줄기와 뿌리에서 세포분열에 주로 관여하는 필수적인 호르몬인데, 직접적인 세포분열 제어 능력은 시토키닌 (Cytokinin)류보다는 약하므로 배양체의 활발한 생육 및 증식을 유도하기 위하여 시토키닌 (Cytokinin)류와 혼용하여 사용하는 것이 일반적이며, 조직배양시 주로 뿌리 형성을 유도하기 위하여 일차적으로 사용되는 경우가 많다. 옥신류인 Naphthaleneacetic acid(NAA), Indole Acetic Acid(IAA), Indole Butyric Acid(IBA), 2,4-D(2,4Dichlorophenoxyacetic acid) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 옥신(Auxin)류는 조직배양시 주로 뿌리 형성을 유도하기 위하여 일차적으로 사용될 수 있다. 옥신의 종류에는 NAA(Naphthaleneacetic acid; 나프탈렌아세트산), IAA(indolacetic acid, 인돌아세트산), IBA(indole butyric acid, 인돌부티르산) 및 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-디클로로페녹시아세트산) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 사이토키닌(Cytokinin)류는 핵산을 구성하는 퓨린 염기 중 하나인 아데닌(Adenine)의 유도체로 주로 세포분열을 자극하고 촉진한다. 식물 조직 배양시, 사이토키닌의 종류 및 농도에 따라서 식물체 종류별로 생육 반응이 각기 다르게 나타나므로, 배지 내 적정 첨가 조건을 조절하여 사용될 수 있다. 사이토키닌으로 키네틴(kinetin), 제아틴(zeatin), BA(benzyladenine), BAP(6-benzylamino purine, 6-벤질아미노퓨린, 6-BAP), TDZ(thidiazuron, 티디아주론) 및 디페닐우레아(diphenyl urea) 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 지베렐린(Gibberellin)류는 식물체의 신장(줄기 신장), 종자 발아, 개화, 착과, 열매 생장 촉진 등에 작용할 수 있다. 식물의 조직배양 시 지베렐린 종류를 적정 농도로 첨가하는 경우 종자 발아, 눈의 발달을 촉진시키고, 배양 식물체의 줄기를 신장시켜 키를 크게 하는 효과를 나타낼 수 있다.

배양과정 중 식물체의 보호를 위해 항균제를 첨가할 수 있다. 상기 항균제는 메틸클로로이소티아졸론(Methylchloroisothiazolone), 메틸이소티아졸론(Methylisothiazolinone), 크롤로메틸이소티아졸론(Chloromethylisothiazolone), 벤츠이소티아졸론(Benzisothiazolone), 옥틸이소티아졸론(Octylisothiazolone), 디클로로옥틸이소티아졸론(Dichlorooctylisothiazolone), 부틸벤츠이소티아졸론(Butylbenzisothiazolone)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항균제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 PPM을 포함할 수 있다.

PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社)은 다양한 병원균의 효소 활성을 저해하는 Isothiazolone 계의 항균제로, 미생물의 호흡 기질 내 크렙스 회로(Krebs cycle) 및 전자전달계와 특이적으로 반응하여 항균 활성을 나타내며, 특히 열에 안정적이므로 고압멸균이 가능하여 다양한 식물의 산업적 배양 과정에서 사용될 수 있다. PPM을 배지에 첨가하여 사용함으로써 배양 중인 식물체에는 약해(Phytotoxicity)가 나타나지 않으면서 공중 부유균이나 낙하균 등의 미생물에 의한 오염 발생빈도를 감소시킬 수 있다.

본 발명에서는 각 배양단계에서 특정 조성의 배지를 사용함으로서 식물체 형성을 극대화시킬 수 있다. 단삼의 기내 식물체 형성을 위한 최적의 식물생장조절제 처리 조건을 확인하기 위해, 단계별로 식물생장조절제를 종류별과 농도별로 처리하여 식물체 형성 정도를 비교하였다.

<신초형성 유도용 배지>

본 발명의 단삼의 기내 식물체 형성방법에 있어서, 신초형성 유도용 MS 배지는 BAP를 1.8 내지 2.2 mg/L를 포함할 수 있고, 바람직하게는 1.9 내지 2.1 mg/L를 포함할 수 있다.

상기 신초형성 유도용 MS 배지는, 티아민 HCl(Thiamine HCl), 펩톤(Peptone), PPM(Plant Preservative Mixture)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 단삼의 기내 식물체 형성을 위한 최적의 신초형성 유도용 배지 조성을 확인하기 위해 식물생상조절제를 종류별과 농도별로 처리한 결과, 신초형성 유도용 MS 배지의 경우 BAP 2 mg/L 처리군에서 대조군 대비 생존율 82.4%로 나타나 생육특성이 가장 좋음을 확인하였다(표 2 참조).

<유식물체 분화용 배지>

또한, 본 발명의 유식물체 분화용 1/2 MS 배지는 IAA(indolacetic acid) 0.3 내지 0.7 mg/L 및 키네틴(Kinetin) 0.8 내지 1.2 mg/L를 포함할 수 있고, 바람직하게는 IAA(indolacetic acid) 0.4 내지 0.6 mg/L 및 키네틴(Kinetin) 0.9 내지 1.1 mg/L를 포함할 수 있다.

상기 유식물체 분화용 1/2 MS 배지는 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂₎및 숯(Charcoal)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 단삼의 기내 식물체 형성을 위한 최적의 유식물체 분화용 배지 조성을 확인하기 위해 식물생상조절제를 종류별과 농도별로 처리한 결과, 1/2 MS 배지에 IAA 0.5 mg/L와 키네틴(kinetin) 1mg/L를 처리한 경우 유식물체 생존율 100%로 나타나 생육특성이 가장 좋음을 확인하였다(표 4 참조).

1/2MS배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 IAA 0.5mg/L와 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 키네틴(kinetin) 1mg/L를 처리하여 신초로부터 유식물체로의 분화 과정을 빠르게 촉진시켰을 뿐만 아니라 아스코르빈산, 티아민 HCl, 질산은 및 플로로글루시놀과 염화칼슘을 추가로 첨가한 경우 유식물체 생존율 100%로 나타났다. 상기 조건에서 단삼의 유식물체(어린 식물체)의 건강하고 왕성한 생육을 유도함으로써 단삼의 절간 유래 신초로부터 어린 식물체의 분화 및 생육을 증진시킴을 확인하였다(도 4 및 표 4 참조).

<발근 유도용 배지>

본 발명의 발근 유도용 1/2 MS 배지는 1/2 MS 배지에 BAP(6-benzylamino purine) 0.3 내지 0.7 mg/L, IBA(indole butyric acid) 0.8 내지 1.2 mg/L 및 NAA(Naphthaleneacetic acid) 0.3 내지 0.7 mg/L를 포함할 수 있고, 바람직하게는 BAP(6-benzylamino purine) 0.4 내지 0.6 mg/L, IBA(indole butyric acid) 0.9 내지 1.1 mg/L 및 NAA(Naphthaleneacetic acid) 0.4 내지 0.6 mg/L를 포함할 수 있다.

상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는, 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂₎및 숯(Charcoal)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 단삼의 기내 식물체 형성을 위한 최적의 발근 유도용 배지 조성을 확인하기 위해 식물생상조절제를 종류별과 농도별로 처리한 결과, 1/2 MS 배지에 BAP 0.5mg/L, IBA 1mg/L 및 NAA 0.5mg/L를 처리한 실험군에서 뿌리수와 뿌리길이가 가장 양호하게 나타나 뿌리 형성을 촉진하는 것을 확인하였다(표 6 참조).

배지에 첨가되는 미오이노시톨은 비타민 B복합체의 구성성분인 이노시톨형 성분으로 생체의 막 구성 성분이기도 하여 세포벽 생합성이나 다당류의 생합성에 사용되는 성분이며, 식물 조직배양에서는 생장촉진물질로써 사용되고 있어 식물의 캘러스 배양뿐만 아니라 배배양, 생장점배양 등에서도 활용되고 있다. 비타민 B 계통인 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl은 미오이노시톨과 마찬가지로 식물 조직배양에서 생장을 촉진시키는 효과를 나타내며, 특히 티아민은 당류 대사작용(carbohydrate metabolism)과 아미노산 생합성(amino acid biosynthesis) 작용에 관여하는 중요한 성분이다. 아스코르브산(Ascorbic acid)은 배양체에서 생기는 페놀 화합물의 작용을 억제하여 배양 식물체의 갈변 또는 흑변 현상을 감소시키고 건전한 배양묘의 생산 효율을 높일 수 있다. 식물 조직배양 과정 중 발생할 수 있는 갈변 또는 흑변 현상은 배양체에서 생기는 페놀 화합물이 배지에 집적되면서 배지의 산도를 급격히 떨어뜨리고 배양체로 이동되는 배지의 영양분 흡수력이 떨어지면서 발생할 수 있으며, 이에 계대 배양(배양체를 새로운 배지로 바꾸어 다시 배양하는 것)을 자주 하거나 아스코르브산, 활성탄 등의 첨가물을 배지에 추가하여 상기 문제점을 해결할 수 있다.

펩톤(peptone)은 유도단백질(誘導蛋白質)로, 수용성이며 열에 응고하지 않고, 황안염석(黃安鹽析)이나 다른 침전법으로도 침전하지 않는데, 여러 가지 펩티다아제에 의하여 다시 분해되어 아미노산이 되고 주로 질소원으로 사용된다.

플로로글루시놀(phloroglucinol)은 옥신의 광산화 반응을 억제시키는 상승제(synergist)로 배발생 조직 유도 및 증식 단계에서 체세포배 형성을 촉진시키는 효과가 있어 기관 형성이나 식물체 전환에 도움이 된다.

염화칼슘(CaCl₂)은 세포벽이나 막의 구조 유지에 작용하고, ATP가수분해효소 등으로 활성화제로서 또는 세포의 정보전달물질로서 역할을 하는데 배지 중에 Ca²⁺의 첨가량이 증가하면 세포가 덩어리가 이루려고 하는 경향이 증가하기 때문에 CaCl₂적정 농도의 추가하면 균일한 단세포를 획득하기 위해서 필요하다.

질산은(AgNO₃)은 식물 조직배양에서 에틸렌의 작용을 억제하여 식물의 생장과 발달을 조절함으로써 캘러스(Callus, 분화된 않은 부정형의 세포덩어리) 형성, 배(胚, Embryo) 발달, 신초 및 뿌리 생육 등 기관 분화를 촉진한다. 단삼과 같은 식물의 조직배양 시 배양체로부터 과다하게 누출되어 배지에 집적되는 페놀 화합물 때문에 급격히 산화(Oxidation) 현상이 발생하여 배지 및 배양체의 갈변(Browining) 또는 흑변(Blackening)이 급격히 일어나는 경우에는 배양 배지 내에 질산은(AgNO₃)을 첨가하면 갈변 및 흑변 현상의 발생을 억제할 수 있다.

다양한 병원균의 효소 활성을 저해하는 것으로 알려진 PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社)은 산업적으로 널리 활용되고 있는 Isothiazolone 계의 항균제이다. 미생물의 호흡 기질 내 크렙스 회로(Krebs cycle) 및 전자전달계와 특이적으로 반응하여 항균 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 특히 열에 안정적이므로 고압멸균이 가능하여 현재 다양한 식물의 산업적 배양 과정에서 사용되고 있다. 표 2의 배지에서도 1.0 ㎖/L의 PPM을 배지에 첨가하여 사용함으로써 배양 중인 식물체에는 약해(Phytotoxicity)가 나타나지 않으면서 공중 부유균이나 낙하균 등의 미생물에 의한 오염 발생빈도는 현저히 감소시킬 수 있었다.

활성탄(Activated charcoal)은 숯을 정제하여 분말화시킨 것으로 식물 조직배양 배지에 첨가하는 경우 기내 식물체에서 배출되거나 배지 내에 집적되어 있는 페놀 화합물을 흡수하며, 신초의 신장 및 발근을 촉진하고 식물체 고유의 특성을 회복하는 데 도움을 주며, 기내 배양 식물체의 유리질화(Vitrification, 조직배양 식물체의 해부학적, 형태적, 생리적 이상체) 현상을 감소시킨다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해서 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 단삼의 절간부위 채취 및 소독

충청북도농업기술원 시험포장에 재식된 단삼인 "다산" 품종의 절간 부위를 전정가위로 2~3cm 길이로 잘라 채취하여 잎을 제거하고, 실험실에서 흐르는 물에 30분간 표면 세척하였다. 클린벤치(무균작업대)에서 70% 에탄올 150㎖가 담긴 멸균 유리병(외경 81mm, 높이 132㎜)에 30초간 침지하여 절간 마디 표면을 소독하고 2% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액 150㎖가 담긴 멸균 유리병에서 15분 동안 침지하여 1회 소독한 후 꺼내어 멸균된 증류수 150㎖가 담긴 유리병에서 5분씩 3회 세척하여 준비하였다.

<실시예 2> 절간 부위로부터 신초형성 유도

클린벤치(무균작업대)에서 세척 및 소독이 완료된 절간 부위의 양쪽 절단면을 메스탈로 1㎜ 정도 절단한 다음 절간 길이의 1.5~2.0cm로 잘라 신초의 줄기 정단부위가 위로 가도록 위아래 방향으로 표 1의 성분을 포함하는 신초형성 배지에 치상하였다.

표 1의 신초 형성용 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형있게 배합한 배지로 식물조직 배양시 기본배지로 널리 사용되는 MS배지(Murashige & Skoog Medium, Duchefa) 4.4 g/L에 수크로오스(Sucrose) 30 g/L, 겔라이트(Gelrite) 3.8 g/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.9 ㎎/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 2.0 ㎎/L, 펩톤(Peptone) 1.0 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 ㎖/L 을 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.8로 조정하였다. 그런 다음 배양용 유리 시험관(지름 25㎜, 높이 150㎜)에 10~15㎖씩 분주한 후 고압멸균(121℃, 1.2 kgfㆍcm^-2pressure, 15분) 하여 사용하였다.

성 분 명	함 량	비고
NH₄NO₃	1650.00 ㎎/L
MgSO₄	370.0 ㎎/L
KNO₃	1900.00 ㎎/L
KH₂PO₄	170.00 ㎎/L
CaCl₂	332.02 ㎎/L
CoCl₂6H₂O	0.025 ㎎/L
ZnSO₄7H₂O	8.60 ㎎/L
Na₂MoO₄2H₂O	0.25 ㎎/L
MnSO₄H₂O	16.90 ㎎/L
H₃BO₃	6.20 ㎎/L
KI	0.83 ㎎/L
FeNaEDTA	36.70 ㎎/L
CuSO₄5H₂O	0.025 ㎎/L
Glycine	2.00 ㎎/L
Myo-Inositol	100.00 ㎎/L
Thiamine HCl	1.00 ㎎/L	(MS 배지내0.10+추가0.90)㎎/L
Nicotinic acid	0.50 ㎎/L
Pyridoxine HCl	0.50 ㎎/L
peptone	1.00 g/L
BAP	2.00 ㎎/L
PPM	1.00㎖/L
Sucrose	30.00 g/L
Gelrite	3.80 g/L
배지의pH	5.8

제조된 신초형성 배지에 절간을 하나씩 치상하였으며, 명상태(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40μmolㆍm^-2)에서 4주간 배양하였다. 4주 배양기간 동안 배지 또는 배양체가 갈색 또는 흑색으로 변하는 갈변(Browining) 또는 흑변(Blackening) 현상이 발생하는 경우 즉시 새로운 배지로 다시 옮겨주어 배양하였다. 신초형성 유도용 배지에서 4주간 배양한 후 절간 유래 신초 형성율을 조사하였고, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로스(Sucorse), 겔라이트(Gelrite) 만을 첨가한 배지에 배양한 대조구와 비교하였다.

배지 종류	식물생장조절제			신초형성율	신초수	신초장	생존율
	(mg/L)			(배양4주) %	(배양4주+4주) explant	(배양4주+ 4주) ㎝	(배양4주+ 4주) %
	BAP	IBA	TDZ	(배양4주) %	(배양4주+4주) explant	(배양4주+ 4주) ㎝	(배양4주+ 4주) %
MS	1	0	0	74.2 ab^z	4.2 a	4.5 a	75.4 ab
	2	0	0	77.8 a	4.0 a	5.0 a	82.4 a
	1	0.1	0	75.4 ab	4.1 a	4.5 a	74.3 ab
	0	0	1	70.2 bc	3.9 b	5.1 a	67.6 b
대조구				65.4 c	3.6 c	4.1 b	62.4 b

^zDMRT 5%

그 결과, 도 2 및 표 2에 나타낸 바와 같이 MS배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP 2mg/L 처리에서 배양하는 경우 대조군 대비 생존율 82.4%로 나타나 생육특성이 가장 좋음을 확인하였다.

<실시예 3> 유식물체 분화 유도

절간 배양으로부터 형성된 신초의 생육을 유도하는 배양과정을 거친 다음에는 신초를 신장시키고 생장속도를 빠르게 하여 어린 식물체(유식물체)로 분화시키는 배양단계가 필요하다. 유식물체로 분화시키기 위해 표 3의 성분을 포함하는 배지로 신초를 옮겨 치상하여 4주간 배양하였으며, 4주 후 새로운 배지로 옮겨 주어 완전한 식물체의 형성을 유도하였다. 유식물체 분화 유도용 배지는 1/2 MS(Murashige & Skoog Medium, Duchefa) 배지 2.2 g/L에 수크로스(Sucrose) 30 g/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.1 g/L, 펩톤(Peptone) 1.0 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 1.0 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 100.0 ㎎/L, 질산은(AgNO₃) 2.0 ㎎/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.05 g/L, 염화칼슘(CaCl₂)0.33 g/L, IAA 0.5 ㎎/L, 키네틴(Kinetin) 1.0 ㎎/L, 활성탄(Charcoal) 1.0 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 ㎖/L, 겔라이트(Gelrite) 4.4 g/L를 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.8로 조정하였다. 식물 배양용 유리병(Plant culture vessle, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 상기 배지를 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121℃, 1.2 kgfㆍcm^-2 pressure, 15분)하여 사용하였다.

성 분 명	함 량	비고
NH₄NO₃	825.00 ㎎/L
MgSO₄	185.0 ㎎/L
KNO₃	950.00 ㎎/L
KH₂PO₄	85.00 ㎎/L
CaCl₂	166.01 ㎎/L
CoCl₂6H₂O	0.0125 ㎎/L
ZnSO₄7H₂O	4.30 ㎎/L
Na₂MoO₄2H₂O	0.125 ㎎/L
MnSO₄H₂O	8.45 ㎎/L
H₃BO₃	3.100 ㎎/L
KI	0.415 ㎎/L
FeNaEDTA	18.35 ㎎/L
CuSO₄5H₂O	0.0125 ㎎/L
Glycine	1.00 ㎎/L
Myo-Inositol	150.00 ㎎/L	(MS 배지내 50.00 + 추가 100.00) ㎎/L
Thiamine HCl	1.05 ㎎/L	(MS 배지내 0.05 + 추가 1.00) ㎎/L
Nicotinic acid	0.25 ㎎/L
Pyridoxine HCl	0.25 ㎎/L
peptone	1.00 g/L
Ascorbic acid	0.10 g/L
AgNO3	2.00 ㎎/L
Phloroglucinol	0.05 g/L
CaCl ₂	0.33 g/L
IAA	0.50 ㎎/L
Kinetin	1.00 ㎎/L
Charcoal	1.00 g/L
PPM	1.00㎖/L
Sucrose	30.00 g/L
Gelrite	4.40 g/L
배지의 pH	5.8

유식물체를 배양병 4개씩 치상하여 명상태(23±2℃, 16/8h 명암주기, 40μmolㆍm^-2)에서 4주간 배양하였으며, 4주 후 다시 새로운 유식물체 분화용 배지가 들어있는 배양용 유리병에 옮겨 주어 8주 동안 배양함으로써 완전한 유식물체의 형성을 유도하였다. 8주간의 2회 계대 배양 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 1/2MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로오스(sucrose), 겔라이트(gelrite) 만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.

배지 종류	식물생장조절제				신초수	신초장	분지수	유식물체 생존율
	(mg/L)				(개/주)	(㎝)	(개/주)	(%)
	BAp	IAA	TDZ	Kinetin	(개/주)	(㎝)	(개/주)	(%)
1/2MS	0.5	0	0	0	1.0 a^z	5.2 ab	2.4 ab	94.0 ab
	0.5	0.5	0	0	1.1 a	4.9 c	2.0 b	72.8 c
	1	0	0	0	1.1 a	5.0 b	2.0 b	84.8 b
	1	0.5	0	0	1.2 a	5.3 ab	2.6 ab	78.9 c
	0	0.5	1	0	1.2 a	5.1 b	2.7 a	85.0 b
	0	0.5	0	1	1.2 a	5.6 a	2.8 a	100.0 a
대조구					1.0 a	4.9 c	2.5 ab	68.9 d

^zDMRT5%

그 결과 도 4 및 표 4에 나타난 바와 같이, 1/2MS배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 IAA 0.5mg/L와 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 키네틴(kinetin) 1mg/L를 처리하여 신초로부터 유식물체로의 분화 과정을 빠르게 촉진시켰을 뿐만 아니라 아스코르빈산, 티아민 HCl, 질산은 및 플로로글루시놀과 염화칼슘을 추가로 첨가한 경우 유식물체 생존율 100%로 나타났다. 상기 조건에서 단삼의 유식물체(어린 식물체)의 건강하고 왕성한 생육을 유도함으로써 단삼의 절간 유래 신초로부터 어린 식물체의 분화 및 생육을 증진시킴을 확인하였다.

<실시예 4> 유식물체의 발근 유도

상기 유식물체 배지에서 4주 간격 계대 배양한 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 표 5의 성분을 포함하는 배지를 사용하여 배양하였다. 발근 유도용 배지는 1/2 MS(Murashige & Skoog Medium, Duchefa)배지 2.2 g/L에 수크로스(sucrose) 30 g/L, 아스코르빈산(Ascorbic acid) 0.1 g/L, 펩톤(Peptone) 1.0 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 1.0 ㎎/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 100.0 ㎎/L, 질산은(AgNO₃) 2.0 ㎎/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.05 g/L, 염화칼슘(CaCl₂0.33 g/L, IBA 1.0 ㎎/L, NAA 0.5 ㎎/L, BAp 0.5 ㎎/L 활성탄(Charcoal) 1.00 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.00 ㎖/L, 겔라이트(Gelrite) 4.4 g/L를 첨가하여 혼합 제조한 후, 배지의 pH를 5.8로 조정하였다. 그런 다음 식물 배양용 유리병(Plant culture vessel, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·^-2pressure, 15분)하여 사용하였다.

성 분 명	함 량	비고
NH₄NO₃	825.00 ㎎/L
MgSO₄	185.0 ㎎/L
KNO₃	950.00 ㎎/L
KH₂PO₄	85.00 ㎎/L
CaCl₂	166.01 ㎎/L
CoCl₂6H₂O	0.0125 ㎎/L
ZnSO₄7H₂O	4.30 ㎎/L
Na₂MoO₄2H₂O	0.125 ㎎/L
MnSO₄H₂O	8.45 ㎎/L
H₃BO₃	3.100 ㎎/L
KI	0.415 ㎎/L
FeNaEDTA	18.35 ㎎/L
CuSO₄5H₂O	0.0125 ㎎/L
Glycine	1.00 ㎎/L
Myo-Inositol	150.00 ㎎/L	(MS 배지내 50.00 + 추가 100.00) ㎎/L
Thiamine HCl	1.10 ㎎/L	(MS 배지내 0.10 + 추가 1.00) ㎎/L
Nicotinic acid	0.25 ㎎/L
Pyridoxine HCl	0.25 ㎎/L
peptone	1.00 g/L
Ascorbic acid	0.10 g/L
AgNO3	2.00 ㎎/L
Phloroglucinol	0.05 g/L
CaCl ₂	0.33 g/L
IBA	1.00 ㎎/L
NAA	0.50 ㎎/L
BAP	0.50 ㎎/L
Charcoal	1.00 g/L
PPM	1.00 ㎖/L
Sucrose	30.00 g/L
Gelrite	4.40 g/L
배지의 pH	5.8

유식물체 발근 배지가 들어있는 배양용 유리병(Plant culture vessel, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 유식물체를 4개씩 치상하였으며, 명상태(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40 μmolㆍm^-2)에서 8주간 배양하였다. 8주 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, Sucorse, Gelrite 만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.

배지	식물생장조절제				신초장	엽수	분지수	뿌리수	뿌리길이
	(mg/L)				(cm)	(개/주)	(개/주)	(개/주)	(cm)
	BAP	IBA	IAA	NAA	(cm)	(개/주)	(개/주)	(개/주)	(cm)
1/2MS	0.2	1	0	0	3.9 b^z	24.8 a	2.1 ab	3.2 a	4.3 b
	0.2	1	0.5	0	4.0 a	23.0 ab	2.2 ab	2.1 ab	3.2 c
	0.5	1	0	0.5	4.2 a	25.2 a	2.5 a	3.3 a	5.0 a
대조구					3.0 c	20.6 b	1.9 b	1.4 b	3.5 bc

^zDMRT5%

그 결과, 도 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이 1/2MS 배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP 0.5mg/L와 식물의 뿌리 형성을 유도하는 옥신(Auxin) 계통의 IBA 1ml/L 및 NAA 0.5mg/L를 적정 농도로 첨가할 뿐만 아니라, 배지 내 집적된 페놀 화합물을 흡수하고 식물체 고유의 특성을 회복시켜 기외 순화(배양 식물체를 외부 환경에 적응시키는 것)시 배양 식물체의 적응력을 높여주는 역할을 하는 활성탄을 부가적으로 첨가함으로써 단삼의 어린 식물체의 뿌리 형성을 촉진하는 것을 확인하였다.

<실시예 5> 기외 순화

뿌리가 완전히 형성되어 배양용 유리병에서 배양 중인 어린 식물체는 배양 용기에서 꺼내어 외부환경으로 적응하는 기외 순화 과정을 거쳐야만 완전한 식물체의 형태를 갖출 수 있다. 따라서 기외 순화를 위하여 배양용 유리병에서 뿌리가 형성된 단삼의 유식물체를 꺼낸 다음 유식물체의 뿌리에 배양 배지가 남아있지 않도록 부드럽게 깨끗이 물로 씻어낸 후, 펄라이트:버미큘라이트가 1:1(v:v)로 혼합된 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 옮겨 심었다. 이후 2개월부터 3개월까지 원예용 상토:펄라이트가 2:1(v:v)로 혼합된 상토에 이식해서 화분에 심은 어린 식물체는 배양실과 유사한 환경(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40~50 μmolㆍm^-2, 공증습도 60±5%)의 순화실에서 1~2주 키운 다음, 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 유리 온실 또는 비닐하우스에서 공중습도를 서서히 낮춰주면서 1~2주 정도 경화시켜 가면서 키웠다. 기외 순화 1개월 후부터는 유식물체의 상태를 확인하면서 공중습도를 천천히 낮춰주면서 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.

기외 순화기간	신초장	신초수	엽수	생존율
기외 순화기간	(㎝)	(개/수)	(개/주)	(%)
1개월	4.2±1.2^z	2.5±0.5	14.2±2.3	90.0±0.9
2개월	5.4±0.3	2.8±0.7	17.3±2.3	86.0±0.9
3개월	6.3±1.3	2.2±0.4	43.3±8.2	100.0±0.0

^zEach value represents the mean±SE

그 결과, 도 6 및 표 7에서 나타난 바와 같이, 유묘가 기외 순화되는 것을 확인했으며, 절간으로부터 배양한 상기 유묘는 도 7에서와 같이 정상적인 어린 묘로 자라는 것을 확인하였다.

상기 실시예의 모든 처리는 완전 임의배치로 3회 반복하여 측정하였으며, 실험 결과의 분석은 PC용 통계패키지인 COSTAT (CoHort software, Berkeley, CA, USA)를 이용하여 분산분석 (ANOVA)을 실시한 후 Duncan'Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 p <0.05 수준에서 검정하였다.

Claims

단삼의 절간 부위로부터 BAP(6-benzylamino purine), 티아민 HCl(Thiamine HCl), 펩톤(Peptone), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 신초형성 유도용 MS 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계(1단계);
상기 생육된 신초를 IAA(indolacetic acid), 키네틴(Kinetin), 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 질산은(AgNO₃), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂), Charcoal, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 유식물체 분화용 1/2 MS 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계(2단계);
상기 유식물체를 BAP(6-benzylamino purine), IBA(indole butyric acid) 및 NAA(Naphthaleneacetic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 펩톤(Peptone), 티아민(Thiamine) HCl, 미오이노시톨(Myo-Inositol), 질산은(AgNO₃), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), 염화칼슘(CaCl₂), Charcoal, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelrite)을 포함하는 발근 유도용 1/2 MS 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계(3단계); 및
상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계(4단계); 를 포함하는 단삼의 기내 식물체 형성방법.
제1항에 있어서,
상기 신초형성 유도용 MS 배지는,
MS 배지 4.0 내지 4.8 g/L에 BAP를 1.8 내지 2.2 mg/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.7 내지 1.1 mg/L, 펩톤(Peptone) 0.8 내지 1.2 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 3.6 내지 4.0 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 단삼의 기내 식물체 형성방법.
제1항에 있어서,
상기 신초형성 유도용 MS 배지는,
MS 배지 4.2 내지 4.6 g/L에 BAP를 1.9 내지 2.1 mg/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.8 내지 1.0 mg/L, 펩톤(Peptone) 0.9 내지 1.1 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 3.7 내지 3.9 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 단삼의 기내 식물체 형성방법.
제1항에 있어서,
상기 유식물체 분화용 1/2 MS 배지는,
1/2 MS 배지 1.8 내지 2.6 g/L에 IAA(indolacetic acid) 0.3 내지 0.7 mg/L 및 키네틴(Kinetin) 0.8 내지 1.2 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.08 내지 0.12 g/L, 펩톤(Peptone) 0.8 내지 1.2 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.8 내지 1.2 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 900 내지 1100ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.6 내지 2.4mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.03 내지 0.07 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.27 내지 0.39 g/L, 활성탄(charcoal) 0.8 내지 1.2 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.0 내지 4.8 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 단삼의 기내 식물체 형성방법.
제1항에 있어서,
상기 유식물체 분화용 1/2 MS 배지는,
1/2 MS 배지 2.0 내지 2.4 g/L에 IAA(indolacetic acid) 0.4 내지 0.6 mg/L 및 키네틴(Kinetin) 0.9 내지 1.1 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 펩톤(Peptone) 0.9 내지 1.1 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.9 내지 1.1 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 950 내지 1050ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.8 내지 2.2mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.04 내지 0.06 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.31 내지 0.35 g/L, 활성탄(charcoal) 0.9 내지 1.1 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.2 내지 4.6 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 단삼의 기내 식물체 형성방법.
제1항에 있어서,
상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는,
1/2 MS 배지 1.8 내지 2.6 g/L에 BAP(6-benzylamino purine) 0.3 내지 0.7 mg/L, IBA(indole butyric acid) 0.8 내지 1.2 mg/L, NAA(Naphthaleneacetic acid) 0.3 내지 0.7 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.08 내지 0.12 g/L, 펩톤(Peptone) 0.8 내지 1.2 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.8 내지 1.2 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 900 내지 1100ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.6 내지 2.4mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.03 내지 0.07 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.27 내지 0.39 g/L, 활성탄(charcoal) 0.8 내지 1.2 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.0 내지 4.8 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 단삼의 기내 식물체 형성방법.
제1항에 있어서,
상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는,
1/2 MS 배지 2.0 내지 2.4 g/L에 BAP(6-benzylamino purine) 0.4 내지 0.6 mg/L, IBA(indole butyric acid) 0.9 내지 1.1 mg/L, NAA(Naphthaleneacetic acid) 0.4 내지 0.6 mg/L, 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 펩톤(Peptone) 0.9 내지 1.1 g/L, 티아민(Thiamine) HCl 0.9 내지 1.1 mg/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 950 내지 1050ml/L, 질산은(AgNO₃) 1.8 내지 2.2mg/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.04 내지 0.06 g/L, 염화칼슘(CaCl₂) 0.31 내지 0.35 g/L, 활성탄(charcoal) 0.9 내지 1.1 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 ml/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 겔라이트(Gelrite) 4.2 내지 4.6 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 단삼의 기내 식물체 형성방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 MS 배지 또는 1/2 MS 배지의 pH는 5 내지 6인 것을 특징으로 하는, 단삼의 기내 식물체 형성방법.