KR20230032214A - 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법 - Google Patents

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권영희
최원일
김희규
김경옥
허윤선
김주형
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충청북도 (관리부서:충청북도 농업기술원)
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Abstract

본 발명은 오미자의 액아 부위로부터 신초 형성 유도용 배지에서 치상하여 신초를 생육하는 단계; 상기 생육된 신초를 유식물체 분화용 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계; 상기 유식물체를 발근 유도용 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및 상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계;를 포함하는 오미자의 대량증식을 위한 조직배양 방법에 관한 것으로, 본 발명의 조직배양 방법을 이용하면 기본 배지에서 배양하는 것 보다 신초 형성율, 유식물체 분화율 및 발근율이 우수하므로 오미자를 효율적으로 대량 증식할 수 있다.

Description

액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법{Method for micropropagation of Schizandra chinensis using axillary bud culture}
본 발명은 오미자의 액아배양을 이용해 오미자를 대량증식하는 방법에 관한 것이다.
오미자(Schizandra chinensis)는 낙엽활엽성의 넝쿨성 다년생 식물로 중국과 우리나라의 태백산, 지리산 등 깊은 산속에서 자생하며, 꽃은 자웅동주 단성화이고 잎은 새로 뻗은 줄기에서 호생하며 과실은 구형의 장과이며, 8~9월에 결실하고 과색은 홍자색(성숙과)으로 지름 1cm 정도의 적색 공모양이다. 열매는 단맛, 짠맛, 쓴맛, 신맛, 매운맛 등 5가지 맛을 함유하고 있으며, 리그난 화합물이 중요한 유효성분으로 시잔드린 A, B, C, 시잔드롤 A와 B, 고미신 B, C, D, F, G, 시잔드렐 A와 B 등을 함유하고 있다. 오미자의 약리 효능은 혈압조절작용, 피로회복 촉진작용, 혈당량 낮춤 작용 등이 밝혀졌으며, 특히 자양강장제로 오래전부터 이용되어왔는데 정신적 스트레스를 많이 받은 사람에게 정신 신경을 이완시켜주고 머리를 맑게 해주어 정신 집중도를 높여준다.
관행 오미자의 묘목 번식법인 실생(實生, 종자 번식), 접목(接木, 눈 또는 눈이 붙은 줄기(접수)와 뿌리가 있는 줄기 또는 뿌리(대목)에 접착시켜 접붙이 묘를 생산하는 방법), 분주법(吸枝, 땅속줄기에서 자라나와 뿌리가 형성된 후 지상으로 나타나 모체에서 분리되어 독립된 개체로 되는 것), 삽목(揷木, 식물의 영양기관의 일부를 모체로부터 분리시켜 흙 또는 모래에 꽂아 발근, 발아시켜 독립의 식물체로 하는 번식시키는 법)등의 방법은 증식율이 낮고 불균일하다. 영양번식의 경우 대량번식이 어려운 반면, 실생번식법은 대량생산이 가능하지만 타화수정을 우량종의 유전성을 유지하기 어려운 단점이 있다. 따라서 고품질의 우량 오미자 묘목을 안정적으로 생산하고 국내에 보급하기 위해서는 관행적인 번식 방법의 문제점을 개선할 수 있는 효율적인 오미자의 묘목 생산 기술의 개발이 필요하다.
국내 자생종으로 흑오미자(Schizandra nigra Max.)와 남오미자(Kadsura japonica Dunal.) 두 가지는 식용으로 쓰이지만, 한약재로는 쓰이지 않고 있으며 현재 국내 재배는 거의 이루어지지 않고 있다. 오미자 품종으로는 2002년 처음 등록한 '청순'품종을 많이 재배하고 있다.'청순'품종은 지방 수집종으로 영양계 분리육종으로 육성한 품종으로 영양번식으로만 우량한 유전성을 유지할 수 있다. 따라서 고품질 오미자 안정생산 기반 확립을 위한 우량묘 대량증식 기술이 그 어느 때보다도 요구되고 있다. 이에 따라 오미자 청순 품종의 유전적 안전성이 보장 가능하고 우량묘의 효율적인 생산을 위해서는 조직배양 대량생산이 필수적이다.
식물의 눈, 잎, 줄기, 뿌리 등의 조직을 인공적인 기내 환경에서 배양하여 온전한 식물체로 생산하는 기술을 조직배양이라고 하는데, 온도 및 습도가 조절되는 배양실 안에서 유리병이나 시험관 등의 배양 용기 내에 식물체가 자랄 수 있는 양분을 넣고 오염이 없는 무균상태에서 식물체를 키우는 기술이다. 이러한 조직배양 기술은 계절에 상관없이 연중 묘목 생산이 가능하여 적정한 배양조건이 확립되면 기내 식물체를 일시에 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.
식물체는 여러 종류의 기관 즉, 뿌리, 줄기, 잎, 화기 등으로 구성되어 있는데 모든 기관이 분화능을 가지고 있으나, 기관의 종류에 따라 분화능력에 차이가 있기 때문에 적절한 배양기관의 선정이 대단히 중요하다. 식물이 가지고 있는 고유의 분화능력을 전형성능(totipotency)이라 하는데, 단세포 혹은 식물 조직 일부분으로부터 완전한 식물체가 재생되는 능력을 말한다. 모든 세포가 전형성능을 지니고 있지만, 세포 조직의 분화 정도, 채취 부위, 배지의 조성, 배양 환경 등에 따라 발현되는 결과는 현저히 차이가 있으므로, 식물의 종류 또는 품종의 종류에 따른 배양 조건의 최적화가 필요하다.
특히, 식물의 조직이나 기관이 기내 즉, 배양 시험관이나 유리병과 같은 배양용기 상태라는 특수한 환경에서 생장 증식하기 위해서는 여러 영양분이 필요한데, 영양분의 요구도는 식물의 종류에 따라 또는 배양조직이나 기관의 종류에 따라서 차이가 나므로 배양하고자 하는 식물이나 조직의 특성에 맞게 배지를 개발하여야 한다.
식물의 조직배양을 위한 배지가 제조되고 개발된 것은 Murashige와 Skoog(1962)에 의해서 인데, MS 배지라고 불리는 이 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형있게 배합한 배지로서 식물 조직배양 시 기본 배지로 널리 사용되고 있다. 이러한 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 최적의 배지 조성을 선택하여 배양하여야 하며, 이 때 기본 배지 이외에도 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제 등을 첨가하거나 농도 및 일부 성분의 함량을 번화시켜 사용하는 것이 필요하다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 오미자의 액아 즉, 잎과 줄기 사이(액)에서 나오는 눈 부위를 기내에서 배양하여 액아로부터 신초 형성 및 어린 식물체(유식물체) 분화를 유도한 후 이를 외부환경에서 적응시키는 기외 순화 과정을 통하여 효율적으로 증식하는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 1) 오미자의 액아 부위로부터 아스코르브산(Ascorbic acid), 글루타민(Glutamine), BAP(6-Benzylaminopurine), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 신초 형성 유도용 DKW(Driver and Kuniyuki Walnut) 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;
2) 상기 생육된 신초를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 티아민 HCl(Thiamine HCl), BAP(6-Benzylaminopurine), NAA(Naphthaleneacetic acid), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 유식물체 분화용 MS(Murashige & Skoog Medium) 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
3) 상기 유식물체를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), IBA(indole butyric acid), GA3, PPM, 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelrite)를 포함하는 발근 유도용 1/2MS 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
4) 상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계를 포함하는 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 1) 오미자의 액아 부위로부터 아스코르브산(Ascorbic acid), 글루타민(Glutamine), BAP(6-Benzylaminopurine), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 신초 형성 유도용 DKW(Driver and Kuniyuki Walnut) 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;
2) 상기 생육된 신초를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 티아민 HCl(Thiamine HCl), BAP(6-Benzylaminopurine), NAA(Naphthaleneacetic acid), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 유식물체 분화용 MS(Murashige & Skoog Medium) 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
3) 상기 유식물체를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), IBA(indole butyric acid), GA3, PPM, 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelrite)를 포함하는 발근 유도용 1/2MS 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
4) 상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계를 포함하는 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법을 제공한다.
본 발명의 오미자 액아의 기내배양, 신초 형성, 유식물체의 분화 및 발근유도 후 식물체를 생산하는 조직배양 방법은 배양 단계별 최적의 배지 조성을 선발하였고 이를 통해 연중 오미자 대량생산이 가능하다.
도 1은 오미자의 액아를 이용한 조직배양 단계를 나타낸 순서도이다.
도 2는 배양 부위인 액아를 나타낸 도이다.
도 3은 액아로부터 신초 형성을 나타낸 도이다.
도 4는 유식물체 증식을 나타낸 도이다.
도 5는 발근 배양이 된 것을 나타낸 도이다.
도 6은 기외 순화가 된 것을 나타낸 도이다.
도 7은 순화단계에서부터 2개월된 식물체를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 1) 오미자의 액아 부위로부터 아스코르브산(Ascorbic acid), 글루타민(Glutamine), BAP(6-Benzylaminopurine), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 신초 형성 유도용 DKW(Driver and Kuniyuki Walnut) 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;
2) 상기 생육된 신초를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 티아민 HCl(Thiamine HCl), BAP(6-Benzylaminopurine), NAA(Naphthaleneacetic acid), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 유식물체 분화용 MS(Murashige & Skoog Medium) 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
3) 상기 유식물체를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), IBA(indole butyric acid), GA3, PPM, 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelrite)를 포함하는 발근 유도용 1/2MS 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
4) 상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계를 포함하는 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법을 제공한다.
상기 신초 형성 유도용 DKW 배지는, DKW 배지 5.0 내지 5.8 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.01 내지 0.5 g/L, 글루타민(Glutamine) 0.1 내지 0.5 g/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.8 내지 1.2 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 아가(Agar) 9 내지 13 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.
상기 신초 형성 유도용 DKW 배지는, DKW 배지 5.3 내지 5.7 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid, (A4118, MBcell)) 0.01 내지 0.3 g/L, 글루타민(Glutamine) 0.2 내지 0.4 g/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.9 내지 1.1 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 아가(Agar) 10 내지 12 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.
상기 유식물체 분화용 MS 배지는, MS배지 4.0 내지 4.8 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.08 내지 0.12 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.08 내지 0.12 g/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.2 내지 0.6 ㎎/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.5 내지 1.5 mg/L, NAA 0.05 내지 0.4 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.5 내지 4.0 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 아가(Agar) 9 내지 13 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.
상기 유식물체 분화용 MS 배지는, MS배지 4.2 내지 4.6g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.09 내지 0.11 g/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.3 내지 0.5 ㎎/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.8 내지 1.2 mg/L, NAA 0.1 내지 0.3 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 내지 3.0 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L, 아가(Agar) 10 내지 12 g/L를 첨가하여 제조된 것일 수 있다.
상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는, 1/2 MS 배지 1.8 내지 2.6g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.01 내지 0.3 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.08 내지 0.12 g/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.01 내지 0.2 g/L, IBA 1 내지 5 mg/L, GA3 0.1 내지 0.5 mg/L, PPM 0.8 내지 1.2 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 40 내지 60 g/L, 겔라이트(Gelrite) 4.0 내지 4.8 g/L을 첨가하여 제조된 것일 수 있다.
상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는, 1/2 MS 배지 2.0 내지 2.4g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.09 내지 0.11 g/L, 플로로글루시놀 (Phloroglucinol) 0.02 내지 0.1 g/L, IBA 2 내지 4 mg/L, GA3 0.2 내지 0.4 mg/L, PPM 0.9 내지 1.1 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 45 내지 55 g/L, 겔라이트(Gelrite) 4.2 내지 4.6 g/L을 첨가하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 오미자 대량증식 방법에 있어서, 각 단계 배지의 pH는 5 내지 6일 수 있다.
본 발명의 신초를 생육하는 단계에서, 신초 형성 유도용 배지는 DKW(Driver and Kuniyuki Walnut) 배지를 기본 배지로 사용할 수 있다. 상기 DKW 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형있게 배합한 배지로써 식물 조직배양 시 기본 배지로 널리 사용되는 배지이다. 상기 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 최적의 배지 조성을 선택할 수 있다. 이 때 첨가 및 함량이 변화되는 구성물은 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 DKW 배지에 첨가되는 여러 형태의 당류는 탄수화물 합성 능력이 없는 배양 조직의 에너지원으로 작용함, 조직배양 시 사용되는 당의 종류에는 수크로오스(sucrose), 글루코오스(glucose), 프럭토오스(fructose), 말토오스(maltose) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 중에서 수크로오스(sucrose)는 물에 용해되고 고압 멸균되는 과정에서 단당류인 글루코오스와 프럭토오스로 분해되며, 배양체의 세포막에서 방출되는 인버테이즈(invertase, 역전효소; 이당류인 수크로오스를 단당류인 프럭토오스와 글루코오스로 가수분해하는 효소)나 세포외효소(Eextracellular enzyme)에 의해 가수분해 되면서 배양체가 흡수하기 용이한 형태로 바뀌기 때문에 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 배양단계 및 배지 조성에 따라 기본 배지에 첨가되는 수크로오스의 농도가 달라질 수 있다.
유식물체 분화용 배지 또는 발근 유도용 배지는 MS(Murashige & Skoog) 배지 또는 1/2 MS 배지를 기본 배지로 사용할 수 있다.
상기 MS(Murashige & Skoog) 배지는 식물조직 배양시 기본배지로 널리 사용되는 배지로 다른 배지에 비해 NH4NO3(20.6mM)와 KNO3(18.8mM)의 비율이 높은 것이 특징이다. MS 배지는 질산태질소/암모니아태 질소의 몰비(mole ratio)가 약 2 배로서 질산태 질소를 더 많이 포함하고 있으며, 총질소 함량은 60mM로서 다른 배지에 비해 현저히 높다. 상기 기본 배지를 바탕으로 식물의 종류 및 배양 목적에 따라 농도 및 일부 성분의 함량을 변화시켜 최적의 배지조성을 선택할 수 있다. 이 때 첨가 및 함량이 변화되는 구성물은 특정 무기염류, 탄소원, 기타 유기물, 비타민류 및 생장조절제가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 MS 배지에 첨가되는 여러 형태의 당류는 탄수화물 합성 능력이 없는 배양 조직의 에너지원으로 작용하며, 조직배양 시 사용되는 당의 종류에는 수크로오스(Sucrose), 글루코오스(Glucose), 프럭토오스(Fructose), 말토오스(Maltose) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 중 수크로오스(Sucrose)는 물에 용해되고 고압 멸균되는 과정에서 단당류인 글루코오스와 프럭토오스로 분해되며, 배양체의 세포막에서 방출되는 인버테이즈(Invertase, 역전효소; 이당류인 수크로오스를 단당류인 프럭토오스와 글루코오스로 가수분해하는 효소)나 세포외효소에 의해 가수분해 되면서 배양체가 흡수하기 용이한 형태로 바뀌기 때문에 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 배양단계 및 배지 조성에 따라 기본배지에 첨가되는 수크로오스의 농도는 달라질 수 있다.
본 발명의 식물생장조절제(plant growth regulators)는 식물생장에 관여하는 식물호르몬을 총칭하는데, 옥신류(Auxin)류, 사이토키닌(Cytokinin)류, 지베렐린(Gibberellin)류, 앱시스산(Abscisic acid) 등이 포함된다. 식물 조직배양 시에도 적정한 종류와 농도의 생장조절제가 배지에 첨가되어야만 배양의 목적에 맞게 배양체가 생육 및 분화할 수 있다.
상기 옥신(Auxin)류는 고등식물의 줄기와 뿌리에서 세포분열에 주로 관여하는 필수적인 호르몬으로 직접적인 세포분열 제어능력은 사이토키닌류 보다 약하므로 배양체의 활발한 생육 및 증식을 유도하기 위해서는 사이토키닌류와 혼용하여 사용하는 것이 일반적이며, 조직배양시 주로 뿌리 형성을 유도하기 위하여 일차적으로 사용될 수 있다. 옥신의 종류에는 나프탈렌아세트산(Naphthaleneacetic acid; NAA), 인돌아세트산(indolacetic acid, IAA), 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 및 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 사이토키닌(Cytokinin)류는 핵산(Nucleic acid)을 구성하는 퓨린 염기(Purin base) 중 하나인 아데닌(Adenine)의 유도체로 주로 세포분열을 자극하고 촉진하는데, 식물의 종류 및 세포의 분화상태에 따라 다르게 작용한다. 사용할 수 있는 사이토키닌은 키네틴(kinetin), 제아틴(zeatin), 벤질아데닌(benzyladenine, BA), 6-벤질아미노퓨린(6-benzylamino purine; 6-BAP 또는 BAP) 및 디페닐우레아(diphenyl urea)등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히 본 발명에서 사용된 사이토키닌 종류 중 하나인 키네틴은 세포분열시 DNA 합성을 증진시키며, BAP 또한 세포분열을 촉진한다. 특히 사이토키닌 종류 중 하나인 키네틴(Kinetin)은 세포분열 시 DNA 합성을 증진시키는 역할을 하며, 벤질아미노퓨린 (Benzylaminopurine, BAP) 또한 세포분열을 촉진하는 기능을 한다.
상기 옥신과 사이토키닌 외에도 식물체의 조직배양에 필요한 비타민으로는 티아민 HCl(Thiamine HCI), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 리보플라빈 (Riboflabin), 미오이노시톨(Myo-Inositol) 등 비타민 B 복합체가 있으며, 이는 기내 배양체의 생장을 촉진시킨다. 특히 티아민은 당류 대사작용(Carbohydrate metabolism)과 아미노산 생합성(Amino acid biosynthesis) 작용에 관여하고, 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl)은 세포의 생장을 촉진시키고, 노화를 방지해주는 작용을 한다.
니코틴산(Nicotinic acid)은 캘러스의 갈색 변화를 방지하는데 효과가 있으므로 장기간 계대배양을 할 때 넣어주면 효과적이다. 미오이노시톨(Myo-Inositol)은 세포분열과 생장을 촉진하는데 효과가 있다. 아스코르빈산은 비타민 C로써 식물 조직배양 기본 배지에 첨가하여 사용하는 경우 배양체에서 생기는 페놀 화합물(Phenolic compound)의 작용을 억제하여 배양 식물체의 갈변(Browning) 또는 흑변(Blackening)현상을 감소시키고 건전한 배양묘의 생산 효율을 높인다. 글루타민(L-glutamine)은 식물생장조절 효과를 가져 식물의 발달과정에 영향을 끼치는데, 아미노산(amino acid)과 아마이드(amide)류는 배지 내에서 1차적으로 유기질소(organic nitrogen)원으로 이용된다.
배양과정 중 식물체의 보호를 위해 항균제를 첨가할 수 있다. 상기 항균제는 메틸클로로이소티아졸론(Methylchloroisothiazolone), 메틸이소티아졸론 (Methylisothiazolinone), 크롤로메틸이소티아졸론(Chloromethylisothiazolone), 벤츠이소티아졸론(Benzisothiazolone), 옥틸이소티아졸론(Octylisothiazolone), 디클로로옥틸이소티아졸론(Dichlorooctylisothiazolone), 부틸벤츠이소티아졸론 (Butylbenzisothiazolone)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항균제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 다양한 병원균의 효소 활성을 저해하는 것으로 알려진 PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社)을 이용할 수 있다.
상기 PPM은 산업적으로 널리 활용되고 있는 이소티아졸론(Isothiazolone) 계의 항균제이다. 미생물의 호흡 기질 내 크렙스 회로(Krebs cycle) 및 전자전달계와 특이적으로 반응하여 항균 활성을 가지는 것으로 알려져 있으며, 특히 열에 안정적이므로 고압멸균이 가능하여 현재 다양한 식물의 산업적 배양 과정에서 사용되고 있다. 표 1의 배지에서도 1.0 ㎖/L의 PPM을 배지에 첨가하여 사용함으로써 배양 중인 식물체에는 약해(Phytotoxicity)가 나타나지 않으면서 공중 부유균이나 낙하균 등의 미생물에 의한 오염 발생빈도는 현저히 감소시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 재료의 준비
1-1. 식물재료
본 발명에서는 충청북도농업기술원 시험포장에 재식된 오미자 '청순'품종을 재료로 사용하였다. 액아 즉, 잎과 줄기 사이에서 나오는 눈 부위를 전정 가위로 2 내지 3cm 길이로 잘라 채취하여 잎을 제거한 후 흐르는 물에 30분간 표면 세척하였다. 이후, 클린벤치(clean bench, 무균 작업대)에서 70% 에탄올 150ml가 담긴 멸균 유리병(외경 81㎜, 높이 132㎜)에 30초간 침지하여 액아 마디 표면을 소독하고 2% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액 150ml이 담긴 멸균 유리병에서 15분 동안 침지하여 1회 소독한 후 꺼내어서 멸균된 증류수 150ml이 담긴 유리병에서 5분씩 3회 세척하여 준비하였다.
이후 클린벤치(무균 작업대)에서 세척 및 소독이 완료된 액아 부위의 양쪽 절단면을 메스 날로 1.5 내지 2.0cm로 잘라 위아래 방향(신초의 줄기 정단부위가 위로 가게 함)으로 신초형성 배지에 치상하였다.
<실험예 1> 액아 배양으로부터 신초 형성의 유도
클린벤치(무균 작업대)에서 세척 및 소독이 완료된 절간 부위의 양쪽 절단면을 메스 날로 1mm 정도 절단한 다음 절간의 위아래 방향(당초 신초의 줄기 정단부위가 위로 가게 함)에 맞게 표 1의 신초 형성용 배양배지에 치상하여 배양하였다.
표 1의 신초 형성용 배지는 무기염류와 비타민류 그리고 에너지원을 균형있게 배합한 배지로서 식물 조직배양 시 기본 배지로 널리 사용되는 DKW 배지(D0247, Duchefa) 5.58 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid, (A4118, MBcell)) 0.10 g/L, 글루타민(Glutamine, (MBcell)) 0.3 g/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 1 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 mg/L, 수크로오스(Sucrose, (S4842, MBcell)) 30 g/L, 아가(Agar) 11 g/L을 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.7로 조정하였다. 이후 배양용 유리 시험관(지름 25mm, 높이 150mm)에 10 내지 15ml씩 분주한 후 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm-2pressure, 15분)하여 사용하였다.
액아 배양으로부터 신초 형성 유도용 배지의 조성
성 분 명 함 량 비고
NH4NO3 1416.00 ㎎/L
MgSO4 361.49 ㎎/L
K2SO4 1559.00 ㎎/L
KH2PO4 265.00 ㎎/L
CaCl2 112.50 ㎎/L
Ca(NO3)2.2H2O 1664.64
ZnSO47H2O 17.00 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.39 ㎎/L
MnSO4H2O 33.80 ㎎/L
H3BO3 4.8 ㎎/L
FeNaEDTA 44.63 ㎎/L
CuSO45H2O 0.25 ㎎/L
Glycine 2.00 ㎎/L
Myo-Inositol 100.00 ㎎/L
Thiamine HCl 2.00 ㎎/L
Nicotinic acid 1.00 ㎎/L
Ascorbic acid 0.10 g/L
Glutamine 0.30 g/L
BAP 1.00 ㎎/L
PPM 1.00 ㎎/L 항균제
Sucrose 30.00 g/L
Agar 11.00 g/L
배지의 pH 5.7
제조된 신초 형성 배지에 액아를 포함한 줄기를 하나씩 치상하였으며, 명상태(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40μmol·m-2)에서 4주간 배양하였다. 4주 배양기간 동안 배지 또는 배양체가 갈색 또는 흑색으로 변하는 갈변(Browning) 또는 흑변(Blackening) 현상이 발생하는 경우 즉시 새로운 배지로 다시 옮겨주어 배양하였다.
상기 신초 형성 유도용 배지에서 4주간 배양한 후 절간 유래 신초 형성율을 조사하였고, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로오스(Sucrose), 아가(Agar)만을 첨가한 배지에 배양한 대조구와 비교하였다.
오미자 액아 배양의 신초형성 배지 생육특성(배양 8주)
식물생장조절제 (mg/L) 신초장
(㎝)		 엽수
(개/주)		 분지수
(개/주)		 생존율
(%)
배지종류 BAP IBA TDZ
MS 1 1.4 az 4.6 a 1.3 a 100.0 a
1.5 0.2 1.4 a 4.5 a 2.0 a 88.1 a
1 0.5 1.4 a 5.2 a 0.8 a 76.7 a
DKW 1 1.6 a 4.6 a 2.3 a 97.6 a
1.5 0.2 1.6 a 4.5 a 2.2 a 92.1 a
1 0.5 1.5 a 5.2 a 1.4 a 70.0 a
WPM 1 1.5 a 4.9 a 2.1 a 94.5 a
1.5 0.2 1.3 a 4.8 a 2.0 a 77.0 a
1 0.5 1.4 a 5.1 a 1.5 a 64.1 a
무처리(대조) 1.2 a 3.8 b 0.0 b 57.8 b
zMean separation by Duncan’s multiple range test at P ≤ 0.05
그 결과, 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP 뿐만 아니라 아스코르브산, 글루타민을 추가로 첨가한 배지를 사용하여 배양하는 경우 신초장 1.6cm, 엽수 4.6개/주, 분지수 2.3개/주 및 생존율 97.6%로 무처리 대비해 우수한 생육 특성을 보임을 확인하였다.
<실험예 2> 유식물체의 분화 유도
액아 배양으로부터 형성된 신초의 생육을 유도하는 배양과정을 거친 다음에는 신초를 신장시키고 생장속도를 빠르게 하여 어린 식물체(유식물체)로 분화시키는 배양 단계가 필요하다. 유식물체로 분화시키기 위해 표 3의 배지로 신초를 옮겨 치상하여 4주간 배양하였으며, 4주 후 새로운 배지로 옮겨 주어 완전한 식물체의 형성을 유도하였다.
유식물체 분화 유도용 배지는 MS(Murashige & Skoog Medium, Duchefa)배지 4.4g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.10 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.10 g/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.4 ㎎/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 1 mg/L, NAA 0.2 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 2.0 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 30 g/L, 아가(Agar) 11 g/L를 첨가하여 혼합 제조한 후 배지의 pH를 5.7로 조정하였다. 이후, 식물 배양용 유리병(Plant culture vessle, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121, 1.2 kgf.cm-2 pressure, 15분)하여 사용하였다.
유식물체의 분화 유도용 배지 조성
성 분 명 함 량 비고
NH4NO3 1650.00 ㎎/L
MgSO4 370.0 ㎎/L
KNO3 1900.00 ㎎/L
KH2PO4 170.00 ㎎/L
CaCl2 332.02 ㎎/L
CoCl26H2O 0.025 ㎎/L
ZnSO47H2O 8.60 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.25 ㎎/L
MnSO4H2O 16.90 ㎎/L
H3BO3 6.20 ㎎/L
KI 0.83 ㎎/L
FeNaEDTA 36.70 ㎎/L
CuSO45H2O 0.025 ㎎/L
Glycine 2.00 ㎎/L
Myo-Inositol 200.00 ㎎/L
Thiamine HCl 0.50 ㎎/L
Nicotinic acid 0.50 ㎎/L
Pyridoxine HCl 0.50 ㎎/L
Ascorbic acid 0.10 g/L
BAP 1.00 ㎎/L
NAA 0.20 ㎎/L
PPM 2.00 ㎎/L 항균제
Sucrose 30.00 g/L
Agar 11.00 g/L
배지의 pH 5.7
유식물체를 배양병 4개씩 치상하여 명상태(23±2℃, 16/8h 명암주기, 40μmol·m-2)에서 4주간 배양하였으며, 4주 후 다시 새로운 유식물체 분화용 배지가 들어있는 배양용 유리병에 옮겨 주어 8주 동안 배양함으로써 완전한 유식물체의 형성을 유도하였다.
상기 8주간의 2회 계대 배양 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, 수크로오스(sucrose), 아가(Agar) 만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.
오미자 액아배양 유식물체 분화 생육특성(배양 16주)
식물생장조절제 (mg/L) 신초장
(cm)		 신초수
(개/주)		 엽수
(개/주)		 유식물체 생존율
(%)
배지 종류 BAP 2ip Zeatin NAA IBA
MS 1.3 cz 1.1 bc 6.8 c 95.1 a
1 0.2 2.0 a 1.4 a 12.1 a 99.7 a
1 0.2 1.3 bc 1.1 bc 9.6 b 95.1 a
1 0.5 1.9 a 1.2 abc 11.8 a 100.0 a
WPM 1.6 ab 1.3 ab 8.0 bc 92.3 a
1 0.2 1.6 ab 1.1 abc 7.9 bc 89.9 a
1 0.2 1.4 bc 1.0 c 7.4 c 92.3 a
1 0.5 1.5 bc 1.1 bc 7.6 c 100.0 a
무처리(대조) 1.2 c 1.0 c 5.9 d 95.2 a
zMean separation by Duncan’s multiple range test at P ≤ 0.05.
그 결과 표 3 및 도 4 에 나타난 바와 같이 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조절제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 NAA와 사이토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP(6-Benzylaminopurine)를 첨가하여 신초로부터 유식물체로의 분화 과정을 빠르게 촉진시켰을 뿐만 아니라 아스코르빈산, 티아민 HCl, 미오이노시톨 추가로 첨가하여 유식물체 8주후 생육특성에서는 무처리 대비해 선발된 배지는 신초장 2.0cm, 신초수 1.4개/주, 엽수 12.1개/주, 유식물체 생존율 99.7%로 우수하였다(표 4). 상기 생장조절물질로 유식물체의 건강하고 왕성한 생육을 유도함으로써 오미자의 액아 유래 신초로부터 어린 식물체의 분화 및 생육을 증진시킴을 확인하였다.
<실험예 3> 유식물체의 발근 유도
상기 유식물체 배지에서 4주 간격 계대 배양한 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 표 5의 조성으로 제조된 배지를 사용하여 배양하였다. 발근 유도용 배지는 1/2 MS(Murashige & Skoog Medium, Duchefa)배지 2.2g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.10 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.10 g/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.05 g/L, IBA 3 mg/L, GA3 0.3 mg/L, PPM 1.0 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 50 g/L, 겔라이트(Gelrite) 4.4 g/L을 혼합 첨가한 배지에서 암조건에서 7일 배양한 다음, MS배지 2.2g/L에 수크로오스(Sucrose) 30 g/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 mg/L, 겔라이트(Gelrite) 4.4 g/L를 첨가하여 혼합 제조한 후, 배지의 pH를 5.7로 조정하였다. 이후, 식물 배양용 유리병(Plant culture vessel, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 100㎖씩 분주한 후 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm-2pressure, 15분)하여 사용하였다.
발근 유도용 배지 조성(1단계, 암배양 1주)
성 분 명 함 량 비고
NH4NO3 825.00 ㎎/L
MgSO4 185.0 ㎎/L
KNO3 950.00 ㎎/L
KH2PO4 85.00 ㎎/L
CaCl2 166.01 ㎎/L
CoCl26H2O 0.0125 ㎎/L
ZnSO47H2O 4.30 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.125 ㎎/L
MnSO4H2O 8.45 ㎎/L
H3BO3 3.10 ㎎/L
KI 0.415 ㎎/L
FeNaEDTA 18.35 ㎎/L
CuSO45H2O 0.0125 ㎎/L
Glycine 1.00 ㎎/L
Myo-Inositol 150.00 ㎎/L
Thiamine HCl 0.05 ㎎/L
Nicotinic acid 0.25 ㎎/L
Pyridoxine HCl 0.25 ㎎/L
Ascorbic acid 0.10 g/L
Phloroglucinol 0.05 g/L
GA3 0.3 ㎎/L
IBA 3 ㎎/L
PPM 2.00 ㎎/L 항균제
Sucrose 50.00 g/L
Gelrite 4.40 g/L
배지의 pH 5.7
발근 유도용 배지 조성(2단계, 명배양 16/8h 명암주기 8주)
성 분 명 함 량 비 고
NH4NO3 825.00 ㎎/L
MgSO4 185.0 ㎎/L
KNO3 950.00 ㎎/L
KH2PO4 85.00 ㎎/L
CaCl2 166.01 ㎎/L
CoCl26H2O 0.0125 ㎎/L
ZnSO47H2O 4.30 ㎎/L
Na2MoO42H2O 0.125 ㎎/L
MnSO4H2O 8.45 ㎎/L
H3BO3 3.10 ㎎/L
KI 0.415 ㎎/L
FeNaEDTA 18.35 ㎎/L
CuSO45H2O 0.0125 ㎎/L
Glycine 1.00 ㎎/L
Myo-Inositol 50.00 ㎎/L
Thiamine HCl 0.05 ㎎/L
Nicotinic acid 0.25 ㎎/L
Pyridoxine HCl 0.25 ㎎/L
Sucrose 30g/L
배지의 pH 5.7
유식물체 발근 배지가 들어있는 배양용 유리병(Plant culture vessel, 외경 65㎜, 높이 130㎜)에 유식물체를 4개씩 치상하였으며, 암상태에서 7일간 배양하다가 생장조절제가 없는 배지조건에서 명상태(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40 μmol·m-2)에서 8주간 배양하였다. 8주 후 유식물체의 생육특성을 조사하였으며, 기본 MS 배지에 동일한 농도의 PPM, Sucorse, Gelrite 만을 첨가한 배지를 대조구로 사용하여 배양 결과를 비교하였다.
오미자 발근 배양 생육특성(배양 24주)
배지 식물생장조절제
(mg/L)		 발근율
(%)		 신초장
(cm)		 뿌리수
(개/주)		 뿌리길이
(cm)		 유식물체 생존율
(%)
IAA IBA NAA
1/2MS 10 35.2 az 2.4 a 3.1 a 3.0 a 80.8 a
3 70.7 a 2.7 a 4.0 a 3.2 a 84.1 a
1 28.9 a 2.5 a 4.7 a 1.5 a 83.3 a
무처리 0.0 b 1.3 b 0.0 b 0.0 b 87.5 a
zMean separation by Duncan’s multiple range test at P ≤ 0.05.
* 1단계 배지조건(암배양, 1주) → 2단계 무처리 배지조건 배양(명배양 16/8h 명암주기, 8주)
그 결과, 도 5 및 표 5, 표 6 에 나타낸 바와 같이 무처리 배지는 발근이 전혀 유도되지 않았으며, 1/2MS 배지에 식물의 뿌리 형성을 유도하는 옥신(Auxin) 계통의 IBA를 첨가한 배지를 사용하여 배양한 경우 발근율 70.7%, 뿌리수 4.0 개/주, 뿌리 길이 3.2cm 및 생존율 84.1%로 우수한 생육 특성을 보이는 것을 확인하였다(표 7).
이를 통해 발근 배지 내 집적된 페놀 화합물을 흡수하고 식물체 고유의 특성을 회복시켜 기외 순화(배양 식물체를 외부 환경에 적응시키는 것) 시 배양 식물체의 적응력을 높여주는 역할을 하는 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol) 및 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 등 부가적으로 첨가함으로써 오미자의 어린 식물체의 뿌리 형성을 촉진하는 것을 확인하였다.
<실험예 4> 기외 순화
뿌리가 완전히 형성되어 배양용 유리병에서 배양 중인 어린 식물체는 배양 용기에서 꺼내어 외부환경으로 적응하는 기외 순화 과정을 거쳐야만 완전한 식물체의 형태를 갖출 수 있다. 따라서 기외 순화를 위하여 배양용 유리병에서 뿌리가 형성된 오미자의 유식물체를 꺼낸 다음 유식물체의 뿌리에 배양 배지가 남아있지 않도록 부드럽게 깨끗이 물로 씻어낸 후, 펄라이트:버미큘라이트가 1:1(v:v)로 혼합된 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 옮겨 심었다. 화분에 심은 어린 식물체는 배양실과 유사한 환경(23±2℃, 16/8h light/dark photoperiod, 40~50 μmol·m-2, 공중습도 60±5%)의 순화실에서 4주 정도 키운 다음, 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 유리 온실 또는 비닐하우스에서 공중습도를 서서히 낮춰주면서 4주 정도 경화시켜 가면서 키웠다. 기외 순화 1개월 후부터는 유식물체의 상태를 확인하면서 공중 습도를 천천히 낮춰주면서 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.
오미자 기외 순화 생육특성
기외순화
기 간		 초장
(cm)		 신초수
(개/수)		 엽수
(개/주)		 줄기 직경
(mm)		 생존율
(%)		 측지
측지수 직경
1개월 6.4±1.0 1.0±0.0 8.6±0.7 2.4±0.1 88.0 0.1±0.1 0.2±0.1
2개월 13.2±3.6 1.0±0.0 9.3±1.2 2.3±0.1 95.8 0.1±0.1 2.1±0.0
그 결과, 표 8 및 도 7에서 나타난 바와 같이, 유묘가 기외 순화되는 것을 확인했으며, 기외순화 기간에 따른 생존율은 1개월 88.0%, 2개월 95.8%으로 생육 특성이 양호하였다. 액아로부터 배양한 상기 유묘는 도 7에서와 같이 정상적인 어린 묘로 자라는 것을 확인하였다.
상기 실시예의 모든 처리는 완전 임의배치로 3회 반복하여 측정하였으며, 실험 결과의 분석은 PC용 통계패키지인 COSTAT (CoHort software, Berkeley, CA, USA)를 이용하여 분산분석 (ANOVA)을 실시한 후 Duncan'Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 p <0.05 수준에서 검정하였다.

Claims (8)

1) 오미자의 액아 부위로부터 아스코르브산(Ascorbic acid), 글루타민(Glutamine), BAP(6-Benzylaminopurine), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 신초 형성 유도용 DKW(Driver and Kuniyuki Walnut) 배지에 치상하여 신초를 생육하는 단계;
2) 상기 생육된 신초를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 티아민 HCl(Thiamine HCl), BAP(6-Benzylaminopurine), NAA(Naphthaleneacetic acid), PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社), 수크로오스(Sucrose) 및 아가(Agar)를 포함하는 유식물체 분화용 MS(Murashige & Skoog Medium) 배지에서 배양하여 유식물체로 분화시키는 단계;
3) 상기 유식물체를 아스코르브산(Ascorbic acid), 미오이노시톨(Myo-Inositol), 플로로글루시놀(Phloroglucinol), IBA(indole butyric acid), GA3, PPM, 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelrite)를 포함하는 발근 유도용 1/2MS 배지에서 배양하여 발근을 유도하는 단계; 및
4) 상기 발근이 유도된 유식물체를 기외 순화시키는 단계를 포함하는
액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 신초 형성 유도용 DKW 배지는,
DKW 배지 5.0 내지 5.8 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.01 내지 0.5 g/L, 글루타민(Glutamine) 0.1 내지 0.5 g/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.8 내지 1.2 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.8 내지 1.2 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 아가(Agar) 9 내지 13 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 신초 형성 유도용 DKW 배지는,
DKW 배지 5.3 내지 5.7 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid, (A4118, MBcell)) 0.01 내지 0.3 g/L, 글루타민(Glutamine) 0.2 내지 0.4 g/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.9 내지 1.1 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.9 내지 1.1 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L 및 아가(Agar) 10 내지 12 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 유식물체 분화용 MS 배지는,
MS배지 4.0 내지 4.8 g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.08 내지 0.12 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.08 내지 0.12 g/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.2 내지 0.6 ㎎/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.5 내지 1.5 mg/L, NAA 0.05 내지 0.4 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 0.5 내지 4.0 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 28 내지 32 g/L 및 아가(Agar) 9 내지 13 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 유식물체 분화용 MS 배지는,
MS배지 4.2 내지 4.6g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.09 내지 0.11 g/L, 티아민 HCl(Thiamine HCl) 0.3 내지 0.5 ㎎/L, BAP(6-Benzylaminopurine) 0.8 내지 1.2 mg/L, NAA 0.1 내지 0.3 mg/L, PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology社) 1.0 내지 3.0 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 29 내지 31 g/L, 아가(Agar) 10 내지 12 g/L를 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는,
1/2 MS 배지 1.8 내지 2.6g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.01 내지 0.3 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.08 내지 0.12 g/L, 플로로글루시놀(Phloroglucinol) 0.01 내지 0.2 g/L, IBA 1 내지 5 mg/L, GA3 0.1 내지 0.5 mg/L, PPM 0.8 내지 1.2 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 40 내지 60 g/L, 겔라이트(Gelrite) 4.0 내지 4.8 g/L을 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
제1항에 있어서,
상기 발근 유도용 1/2 MS 배지는,
1/2 MS 배지 2.0 내지 2.4g/L에 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.09 내지 0.11 g/L, 미오이노시톨(Myo-Inositol) 0.09 내지 0.11 g/L, 플로로글루시놀 (Phloroglucinol) 0.02 내지 0.1 g/L, IBA 2 내지 4 mg/L, GA3 0.2 내지 0.4 mg/L, PPM 0.9 내지 1.1 mg/L, 수크로오스(Sucrose) 45 내지 55 g/L, 겔라이트(Gelrite) 4.2 내지 4.6 g/L을 첨가하여 제조된 배지인 것을 특징으로 하는, 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 DKW 배지, MS 배지 또는 1/2 MS 배지의 pH는 5 내지 6인 것을 특징으로 하는, 액아배양을 이용한 오미자의 대량증식 방법.
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