KR101603539B1 - 택솔을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 균주 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 택솔(taxol)을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 (Colletotrichum dematium) 균주, 상기 균주를 배양하여 택솔을 생산하는 방법, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 택솔 생산용 미생물 제제 및 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 균주에 의해 생산되는 택솔은 암 치료용 의약품으로 사용될 수 있을 것이다.

Description

택솔을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 균주 및 그 용도{Colletotrichum dematium strain producing taxol and uses thereof}
본 발명은 택솔을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 균주 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 택솔(taxol)을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 (Colletotrichum dematium) 균주, 상기 균주를 배양하여 택솔을 생산하는 방법, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 택솔 생산용 미생물 제제 및 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
1960년대에 미국 국립암연구소(NCI)가 항암 활성물질 탐색을 위한 대규모 선별 프로그램을 진행하던 중, 미국 서해안에 자생하는 태평양 주목 (Taxus brevifolia) 껍질의 추출물이 항암 활성이 있음을 발견하였고, 1972년 이 추출물에서 디테르펜 알칼로이드 (diterpene alkaloid)인 택솔 (taxol)을 분리하였다. 이후 1979년 택솔의 탁월한 항암효과가 주목받기 시작하였고 1992년 난소암 치료제로 상업화, 1993년에는 미국식품의약국(FDA)으로부터 항암제로 승인받았다. 또한 1997년에는 카포시 종양 (Kaposi's sarcoma)에 사용 승인을 그리고 1999년에는 비소세포성 폐암에 사용 승인을 받았다. 택솔은 1990년대 이후 가장 널리 사용되는 항암제로서 1998년 세계 시장에서 1조 4천억 원어치의 제품이 사용되었으며 매년 28%의 속도로 판매량이 증가하고 있는 항암제이다. 우리나라에서도 2002년 기준으로 가장 많이 수입된 완성 의약품으로 단일 품목으로 285억의 수입액을 기록하고 있다. 또한, 현재 여러 약물과의 복합처방에 관한 임상시험이 180여 건 진행 중이므로 택솔에 대한 수요는 앞으로도 크게 늘어날 전망이다.
택솔은 암세포의 DNA와 RNA의 합성에는 영향을 주지 않고 DNA 분자 자체에도 손상을 주지 않으면서 튜불린 (tubulin)에 선택적으로 작용한다. 튜불린 중합을 가로막아 방추사가 형성되지 않도록 함으로써 암세포의 성장을 세포분열 중기에 멈추게 하여 암세포를 죽인다. 지금까지의 임상실험에서 택솔은 난소암·유방암·폐암·위암에 탁월한 효과가 있다고 보고되었다. 그 밖에도 식도암·전립선암·결장암·방광암·임파선종양·간종양·중추신경종양·뇌종양 등에도 효과가 좋은 것으로 밝혀졌다. 이러한 다양한 암 종류에 대한 항암효과가 보고된 택솔의 공급을 경제적으로 늘리기 위한 많은 연구가 이루어졌지만, 만족할 만한 성과가 달성되지 않은 실정이다. 주목나무를 벌목 및 인공 재배한 후 식물체로부터 직접 추출하여 택솔을 얻는 방법은 기후와 계절, 정치적인 문제 등 외부 인자에 의한 영향을 받아 원료의 안정된 공급이 어렵고 식물체에 존재하는 유용물질의 함량이 작고 생장속도가 느려 많은 양의 물질을 얻기가 힘들고 식물세포배양을 통한 생산은 높은 생산비용에 비해 낮고 불안정한 생산량 때문에 여전히 한계가 있다. 또한 합성을 통한 택솔의 생산법이 1994년에 발표되었는데, 비록 택솔의 화학적 전체 합성이 성공되었지만 화학합성은 20단계 이상이 필요하고 여러 단계의 생산량이 매우 낮아 산업화는 거의 불가능한 것으로 알려졌다. 따라서 최근에는 주목나무 (주로 Taxus baccata 또는 Taxus yunnanensis)의 니들(needle)로부터 탁소이드 (taxoid) 중간생성물인 10-deacetylbaccatin Ⅲ을 분리하거나, T. baccata 종의 잎에서 baccatin Ⅲ를 분리해 반합성하는 방법으로 대부분의 택솔을 생산하고 있지만 이 역시 매우 번거로운 여러 단계를 거쳐야하는 단점이 있어 여전히 택솔 생산이 복잡한 것은 틀림없다. 최근 들어 많은 식물내생균 및 식물병원균인 곰팡이에서 택솔이 생성된다는 것이 밝혀지고 있다. 이렇듯 미생물 및 주목에서 택솔이 생성되는 과정에서, 택사디엔 (Taxadiene, taxa-4(5),11(12)-diene)이 택솔 생성 경로 도입 전구체로 작용함이 알려져 있는데, 택사디엔은 제라닐제라닐 2인산염 (geranylgeranyl diphosphate)을 고리화시키는 택사디엔 합성효소 (taxadiene synthase)에 의해서 반응이 유도되는 것으로 알려져 있다.
한편, 한국공개특허 제1995-0025105호에는 페스탈로티옵시스속의 균주를 이용한 '곰팡이 배양에 의한 택솔(taxol)의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제1996-0041373호에는 슈도모나스속의 균주를 이용한 '택솔 생산 미생물로부터 항암물질 택솔의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 택솔을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 균주 및 그 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 PDB 배지에서 택솔을 생산하는 능력이 있는 1종의 콜레토트리쿰 데마티움 균주를 선별하였고, 상기 균주를 배양하여 균주 및 배양액의 추출물로부터 LC-MS 분석법 (liquid chromatography-mass spectrometry)을 이용하여 택솔 생산을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 택솔을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 (Colletotrichum dematium) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 택솔 생산용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 균체 및 배양액으로부터 택솔을 회수하는 단계를 포함하는 택솔 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주는 항암효과가 있는 택솔을 생산해내는 균주로, 고부가가치 물질 생산을 위한 대사제어 기술 개발에 기여할 수 있고, 택솔 생합성 과정에 필요한 물질 대사 기작의 조절을 통해 높은 수득률로 택솔을 대량으로 생산할 수 있는 새로운 방안으로 기대된다. 또한, 본 발명의 콜레토트리쿰 균주는 우리나라에서 가장 피해가 큰 식물병원균 중 하나로, 이 균주가 식물병원균을 벗어나 택솔을 생산하는 토종 유용 생물자원으로 등재될 수 있으므로 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 PDA (Potato dextrose agar) 배지에서 본 발명의 콜레토트리쿰 데마티움 균주를 배양한 모습을 확인한 사진이다.
도 2는 택솔 생산 곰팡이를 스크리닝하기 위한 택사디엔 합성효소 (Taxadiene synthase) 유전자에서 프라이머의 위치를 나타낸 것과 이를 이용하여 콜레토트리쿰 데마티움 균주의 DNA로부터 택사디엔 합성효소 유전자를 중합효소연쇄반응을 통해 증폭한 밴드를 보여주는 결과이다.
도 3은 도 2에서 확인된 PCR 산물을 시퀀싱 및 블라스트 (blastN) 분석을 수행하여 주목나무 (Taxus brevifolia)의 택사디엔 합성효소 유전자와 동일한 유전자가 본 발명의 선별된 균주의 유전체에 존재함을 확인한 결과이다.
도 4는 콜레토트리쿰 데마티움 균주에서 추출한 택솔을 LC-MS 분석법 (liquid chromatography-mass spectrometry)을 이용하여 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 택솔 (taxol)을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 (Colletotrichum dematium) 균주를 제공한다.
콜레토트리쿰 데마티움 균주는 식물 탄저병의 원인균이나, 본 발명의 상기 콜레토트리쿰 데마티움 균주는 택솔 생합성 경로의 첫 단계에서 작용하는 택사디엔 합성효소 (taxadiene synthase) 유전자를 가지고 있으며, 배양을 통해 택솔을 생산하는 것을 특징으로 한다. 상기 콜레토트리쿰 데마티움 균주를 한국농업미생물자원센터(KACC)에 2014년 5월 12일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC93197P).
본 발명은 또한, 본 발명의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 택솔 생산용 미생물 제제를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 콜레토트리쿰 데마티움 균주이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 균주를 배양하고, 균체 및 배양액으로부터 택솔을 회수하는 단계를 포함하는 택솔 생산 방법을 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 콜레토트리쿰 데마티움 균주이며, 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있다. 또한, 균체 및 배양액으로부터 택솔을 회수하는 방법은 배양된 균사를 그라인더로 갈아 배양액과 같이 에틸아세테이트를 통해 추출하여 LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry)을 통해 회수할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 택솔 생산 방법에 있어서, 본 발명의 균주를 이용한 택솔 생산량은 2~3 ㎍/100mL 배양액, 더욱 구체적으로 2.35 ㎍/100mL 배양액이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 택솔을 함유하고 있으므로 택솔에 의해 조절되는 질환을 치료할 수 있다. 본 발명의 콜레토트리쿰 데마티움 균주는 택솔을 생산하며, 생산된 택솔은 난소암, 유방암, 폐암, 위암식도암, 전립선암, 결장암, 방광암, 임파선종양, 간종양, 중추신경종양, 뇌종양과 같은 암 질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 암의 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있는 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 섭취량에 관계없이 체내에 안전하게 흡수된다. 투여량 또는 섭취량은 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 인체에 투약하는 경우, 화학적으로 합성된 택솔 함유 의약품에 비해 부작용의 우려가 없다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에도 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라, 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 과립제, 피복정, 정제, 캡슐제, 탕제, 엑기스제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 캡슐제는 피복물질 (coating material)과, 피복되는 내부의 핵물질 (core material)로 이루어진다. 본 발명의 캡슐제에서 핵물질은 본 발명의 균주와 택솔을 함께 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 캡슐제에서 핵물질을 둘러싸는 피복물질은 흡수성, 분산성, 점착성이 우수한 수용성 다당류를 사용한다.
본 발명에서 사용가능한 수용성 다당류는 전분, 한천, 카라기난, 알긴산, 알긴산나트륨 (sodium alginate), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmetacrylate), 소맥단백, 대두단백을 비롯하여, 메틸셀룰로오스 (methylcellulose), 하이드록시프로필셀룰로오스 (hydroxylpropylcellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 (hydroxyl-propylmethylcellulose) 등의 셀룰로오스 유도체, 잔탄검 (xanthan gum), 아라비아검 (arabic gum), 로커스트콩검 (locust bean gum), 구아검 (guar gum), 타마린드검 (tamarind gum), 타라검 (Tara gum), 카라야검 (karaya gum), 트라가칸검 (tragacanth gum), 가티검 (ghatti gum) 등의 검류, 그리고 젤란 (gellan), 잔탄 (xanthan), 펙틴 (LM, HM type), 덱스트란 (dextran), 글루칸 (glucan), 글루코만난 (glucomannan), 아라비노갈락탄 (arabino galactan), 퍼셀레란 (furcelleran), 풀루란 (pullulan), 글루코사민 (glucosamine), 젤라틴 (gelatin), 카제인 (casein) 중 선택된 하나 이상이 될 수 있다.
본 발명의 캡슐제 제조시 코팅물질의 양은 용도 및 목적에 따라 그 양을 적절하게 가감할 수 있으며, 핵을 기준으로 하여 일반적으로 사용되는 범위인 1~80 중량% 범위의 양으로 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 캡슐제는 필요에 따라 유화제, 보호제 및 가소제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 캡슐제의 제조 방법은 통상적으로 사용되는 캡슐화 방법 중 적절한 방법을 택하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 택솔 생산 곰팡이 탐색
1-1. 곰팡이 균주의 탐색
택솔 생산 곰팡이 균주를 스크리닝하기 위해 식물병원성 진균인 콜레토트리쿰 데마티움 KACC40013 균주를 농업유전자원센터로부터 분양받았다. 택솔 생합성 경로의 첫 단계에서 작용하는 택사디엔 합성효소 (TS, taxadiene synthase) 유전자를 이용하여 택솔을 생산하는 곰팡이가 있는지 스크리닝하기 위해, 게노믹 DNA를 추출하였고, 이를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. TS 유전자를 증폭하기 위하여, 정방향 프라이머 M1a (5'-TGCAACGAAAATCTCAACCA-3', 서열번호 1)와 역방향 프라이머 TS2R (5'-TCCCATCTCTTTACTCCCTCA-3', 서열번호 2)을 이용하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동 하였고, DNA 밴드가 증폭되었음을 확인하였다(도 2).
1-2. DNA 염기서열 분석을 이용한 택사디엔 합성효소 유전자 확인
PCR 후 증폭된 DNA 밴드를 유전자 배열결정 품질 (quality)을 좋게 하기 위하여 TAKARA MiniBest Agarose Gel extraction kit(TAKARA, 일본)를 사용하여 정제한 후 시퀀싱에 사용하였다. DNA 시퀀싱은 자동 염기서열 분석기 (ABI Prism 3730xl DNA sequencer, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 분석하였다. 시퀀싱 분석 결과 얻어진 DNA 염기서열의 상동성 분석은 미국국가생물공학센터(NCBI)의 BLAST N 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast/)을 이용하여 수행하였다. 그 결과, 주목나무 (Taxus brevifolia)에서 밝혀진 택솔 생합성 경로에서 첫 번째로 필요한 효소인 택사디엔 합성효소 유전자(Accession No.: U48796)와 100% 상동성을 나타내었고 이로써 콜레토트리쿰 균주에 택솔 생합성 관련 유전자가 존재함을 알 수 있었다(도 3).
실시예 2. 콜레토트리쿰 데마티움 KACC40013 균주에서 물질 추출
본 발명의 콜레토트리쿰 균주가 실제로 택솔을 생산할 수 있는지 확인하기 위해 2차 대사산물을 추출하였다.
콜레토트리쿰 데바티움 KACC40013 균주의 곰팡이 균사를 PDB (Patato Dextrose Broth) 배지에 접종하여 24℃, 150rpm에서 2주간 배양하였다. 배양된 균사는 그라인더를 이용하여 갈아 배양액과 같이 추출에 이용하였다. 추출에는 동량의 에틸아세테이트를 첨가한 후, 24℃, 150rpm에서 12시간 교반한 후 원심분리 (3,000rpm, 10분, 4℃)하여 상층액만 분리하였다. 분리한 상층액은 회전증발기(Rotary evaporator)를 이용하여 에틸아세테이트를 제거해준 후 최종적으로 메탄올 1㎖에 녹인 후 주사기 필터 (나일론 멤브레인 필터, 0.45㎛)를 사용하여 여과한 후 분석에 이용하였다.
실시예 3. 콜레토트리쿰 균주에서 택솔 생산 확인
상기 실시예 2의 추출물을 이용하여 LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry, Waters 2695-2998-3100, 미국)를 통해 택솔의 존재 유무를 분석하였다(도 4). 분석에 사용한 표준 화학물질은 파클리탁셀 (paclitaxel, Sigma-aldrich, 미국)로써, 이 물질을 표준으로 하여 보유시간 (retention time)과 질량스펙트럼 (mass spectrum)을 얻었다(도 4A). 콜레토트리쿰 데마티움 균주 배양을 통해 얻은 추출물의 최초 분석 결과에서 13.9분경의 보유시간에서 파클리탁셀과 비슷한 피크가 검출되어, 이 피크의 질량스펙트럼을 구해 보았을 때 그 결과가 파클리탁셀의 결과와 같게 확인되었다(도 4B). 이러한 파클리탁셀의 배경 (background) 수준을 낮추고, 또한 추출물 내의 높은 농도의 파클리탁셀을 보고자 700㎎의 추출물을 실리카 카트리지 (WAT 051900, Waters, 미국)를 사용하여 한번 더 정제과정을 수행하고 분석에 이용하였다. 정제에는 디클로로메탄/에틸아세테이트 (dichioromethane/Ethyl acetate, 70:30 v/v) 용매를 사용하였고, 질소 가스를 이용하여 완벽하게 건조한 후 메탄올에 재용해한 후 나일론 멤브레인 필터(0.45㎛)를 이용하여 여과시켰다. LC-MS에 20㎕의 시료를 주입하고 분석하였다. 이 결과로 낮은 배경 대비 순수한 파클리탁셀을 얻는 것이 보여졌고, 이 파클리탁셀은 표준과 같은 질량스펙트럼을 얻을 수 있었다(도 4C). 상기 모든 결과를 종합할 때, 콜레토트리쿰 데마티움 균주가 택솔을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
농업생명공학연구원 KACC93197P 20140512
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yeungnam University <120> Colletotrichum dematium strain producing taxol and uses thereof <130> PN14117 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgcaacgaaa atctcaacca 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcccatctct ttactccctc a 21

Claims (5)

  1. 택솔(taxol)을 생산하는 콜레토트리쿰 데마티움 (Colletotrichum dematium) 균주 (KACC93197P).
  2. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 포함하는 택솔 생산용 미생물 제제.
  3. 제1항의 콜레토트리쿰 데마티움 균주를 배양하고, 균체 및 배양액으로부터 택솔을 회수하는 단계를 포함하는 택솔 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양액 중의 택솔의 양은 2~3 ㎍/100mL 배양액인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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