KR100285788B1

KR100285788B1 - 탁수스종의 세포 배양에 의한 탁솔 및 탁산의 생산 증진 방법

Info

Publication number: KR100285788B1
Application number: KR1019940702908A
Authority: KR
Inventors: 벤카타라만 브린지; 프라카쉬 쥐. 카드카데; 크리스포터 엘. 프린스; 베리 에프. 슈브멜; 유진 제이. 캐인; 브래든 로치
Original assignee: 파이턴, 인코오포레이티드
Priority date: 1992-02-20
Filing date: 1993-02-22
Publication date: 2001-05-02
Also published as: ATE195146T1; ES2361150T3; EP0672162A1; ATE256197T1; EP1378574A1; AU3729193A; EP0960944B1; PT960944E; JPH07506721A; NZ249734A; KR100392036B1; JP2009183305A; US5407816A; EP1378574B1; CA2130745A1; EP0960944A1; AU672194B2; HK1003718A1; CA2130745C; JP2008131955A

Abstract

본 발명은 탁수스 종의 세포 배양물에 의한 탁솔 및 탁산의 증강된 생산 및 회수 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

탁수스(Taxus) 종의 세포 배양에 의한 탁솔 및 탁산의 생산 증진 방법

[발명의 배경]

[발명의 분야]

본 발명은 탁수스 종을 세포 배양시켜 탁솔 및 탁산의 생산을 증진시키고, 회수하는 방법에 관한 것이다.

[관련 기술]

[탁솔의 공급 문제점 및 가능한 해결책]

탁솔은 태평양 주목 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 껍질로부터 원초적으로 분리되는 디터페노이드 알칼로이드이다[참조: Wani et at. 1971].

탁솔에 대한 관심은 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에서 대규모 스크리닝 실험 계획 중 상기한 나무 껍질의 조추출물이 항종양 활성을 나타낸다는 것을 발견한 때부터 시작되었다. 그 이후의 임상 실험에서 탁솔은 고질성 난소암 및 유방 및 기타암에 특히 효과적인 것으로 확인되었다. 탁솔은 근본적으로 상이한 세포독성 메카니즘, 즉 마이크로튜블의 탈중합화를 억제하는 특성[참조: Rowinsky et al. 1990]으로 인하여 화학 치료 요법에서 하나의 돌파구로서 대두되었다.

탁솔 이용에 있어서 가장 위압적인 변수는 그의 수급 문제이다. 탁솔의 평균 수율은 마른 껍질 및 침상엽의 약 0.01 % 정도로 낮기 때문에 한 명의 환자를 치료하기 위해서는 100년된 태평양 주목 나무가 3 내지 6그루 필요하다(참조: witherup et at. 1990). 치료 및 시험을 위해 필요한 양의 탁솔을 생산하기 위해서는 수만 그루의 주목을 파괴하여야 할 것이다. 이제까지 전세계적으로 공급된 탁솔은 모두 북서 태평양 고대림에 밀집되어 있는 키가 작고 서서히 자라는 침엽수로부터 수확된 것이었다. 불행하게도 이러한 주목들은 벌목에 의해 거의 멸종의 위기에 이르렀다. 자연 보호가들은, 위험에 처한 북방 점박이 올빼미 및 기타 야생 동물의 서식지인 고대림에서 자라는 이러한 나무들의 대량 벌목에 성공적으로 반대하고 있다. 태평양 주목의 수가 감소함에 따라 의약 연구자들은 미래의 탁솔에 대한 희망을 새로운 대체 공급원에 두고 있다. 지금까지 고려되어 온 세가지 공급 방법은 화학 합성, 반합성 및 식물 세포 배양이다.

탁솔은 이제까지 전 화학 합성이 회피되어 왔던 거대하고, 구조적으로 복잡한 화학 분자이다. 따라서, 간단하고 입수 가능한 화학 약품으로부터 대규모로 합성하는 것은 차후 수년 안에 실용화될 전망이 없을 것 같다.

대량 생산을 위한 가능한 다른 방법은 반-합성으로서, 즉 농업적으로 생산된 탁솔 전구체 바카틴(baccatin)에 측쇄를 화학적으로 부가시키는 것이다. 측쇄의 합성에 관해서는 상당한 진보가 이루어졌다[참조: Denis et at. 1991]. 측쇄와 바카틴을 커플링하는 방법도 또한 개발되었다[참조: Denis et al, 1991, 미합중국 특허 제4,924,011호; Holtom 1991, 미합중국 특허 제5,015,744호]. 그러나 탁수스 수목의 침상엽으로부터 바카틴을 농업적으로 공급하는 것은 더 이상 미소한 양이 아니며, 바카틴 함량에 있어서, 이전의 보고[Denis et al. 1988, 0.1 중량%]는 최근의 보고[Witherup et at., 1990, 0.03 건조 중량%]보다 낙관적이었다는 사실에 비추어 재평가되고 있는 중이다. 요약해서, 전세계적으로 화학 치료제의 용도로 사용할 수 있는 양의 탁솔을 화학 합성 및 반합성 방식으로 공급하는 것은 보장 받지 못하고 있다. 여기에 탁솔 생산을 위한 대용 방법을 탐구 및 개발하는 이유가 있는 것이다.

본 발명은 탁솔 및 기타 탁산류를 공급하기 위한 식물 세포 배양에 기초한 생산 방법에 관한 것이다.

[식물 유래 화합물의 공급원으로서의 조직 배양]

여러가지 상이한 배양 조건하에 분열되고, 성장하며 2차 대사 산물을 생산할 수 있는 식물 세포의 능력은 다수의 그룹에 의해 충분히 입증되어 있다. 현재, 일본에서 두가지 화합물, 즉 쉬코닌(shikonin, 적색 안료 및 소염제) 및 진셍고사이드(ginsengoside, 동양 의약의 강장제)가 조직 배양 방법에 의해 생산되고 있다. 바닐린, 베르베린 및 로스마린산을 포함하는 많은 다른 공정들로 거의 상업화 단계에 이른 것으로 보고되어 있다[참조: Payne et al. 1991].

탁솔에 있어서 식물 세포 배양 공정의 잇점은 여러가지이다: (i) 세포 배양 공정은 제한이 없고 연속적이며 균일한 생성물의 공급을 보장하며, 해충이나 천재 지변 및 계절적 변동에 영향받지 않는다. (ii) 세포 배양을 대형 생물 반응기 중에서 수행할 수 있으며, 환경 조건을 조작함으로써 탁솔을 과량 생산하도록 유도할 수 있다. (iii) 세포 배양은 나무 껍질이나 침상엽에 비해 생산되는 화합물 스펙트럼이 단순하므로, 분리 및 정제 공정을 상당히 단순화시킬 수 있다. (iv) 세포 배양 공정은 농업 배양에 비해 수요의 빠른 변화에 신속히 대처할 수 있다. (V) 세포 배양은 탁솔외에, 반합성 방법에 의해 탁솔 및 기타 활성 유도체로 전환될 수 있는, 바카틴과 같은 탁산 전구체도 생산할 수 있다.

무균성 대규모 식물 세포 배양은 비용이 많이들므로, 세포 배양 공정은 빠른 세포 성장 및 높은 대사 물질 생산능에 의해 수지가 맞을 때만 상업화 될 수 있다. 각각의 식물 종 및 표적 대사 물질이 상이하며, 또한 각각의 특정 시스템에 대해 상이한 접근 방법이 필요하다. 본 발명은 탁솔 및 탁산을 생산하기 위하여, 급속히 성장하며 생산률이 높은 식물 세포 배양을 얻기 위한 독창적이고도 숙련된 방법에 관한 것이다.

[목질 식물 및 침염수의 조직 배양에 관련된 문제점]

관련 문헌들을 역사적으로 살펴보면, 초본성 식물이 배양시 비교적 용이하게 조작될 수 있는 반면, 목질 식물과 침엽수의 배양에는 많은 난점이 있었음을 알 수 있다.

2차 대사 산물을 생산하는 나자 식물 및 침염수 배양물의 성장은 일반적으로 느리다. 예를 들어, 쑤야 오씨덴탈리스(Thuja Occidentalis)의 배양물은 18일 배양 후 생물량이 단지 약 30 %만이 증가한 것으로 밝혀졌다[참조 : Berlin and Witte (1988)] 칼리트리스 드루몬디(Callitris drummondii)의 현탁 배양의 경우 21일간 배양한 후 20 내지 50 %의 생물량 증가를 보인 것으로 보고되어 있으며[참조 : Van Uden et al.(1990)], 나자 식물인 세팔로탁수스 해링토니아(Cephalotaxus harrirgtonia)의 현탁 배양의 경우 배가 시간이 약 10일인 것으로 보고되었다[참조 : Westgate et al.(1991)]. 보른맨(Bornman)에 의해 요약된 바와 같이(1983년), 전나무 현탁 배양(Picea abies)을 위한 배지 개발에 굉장한 노력이 경주되어 왔다. 이와 같이 집대성된 연구 결과는 나자 식물 현탁 배양이 빠른 속도로 성장될 수 있음을 증명하고 있으나, 이들에 대한 일반화된 방법은 존재하지 않으며 또한 상이한 세포주를 위한 배지 조성도 독립적으로 최적화되어야 함을 시사하고 있다.

나자 식물 배양에 있어서 2차 대사 산물 생산성에 관한 연구는 초본성 종에 비해 빠른 생합성을 유도하는 것이 곤란함을 지적하고 있다. 예를 들어, 세팔로탁수스 해링토니아 배양은 모식물의 경우의 약 1 내지 3 % 수준의 터르펜 알칼로이드를 생산하였다[참조 : Delfel and Rothfus 1977]. 성공적인 추출의 경우에도 모식물로부터 생산된 수준(약 0.04 건조 중량%의 총 알칼로이드)에 겨우 접근할 수 있었을 뿐이다. 반 우덴(Van Uden) 등은 포도필로톡신을 생산하기 위하여 침엽수 칼리트리스 드루몬디의 현탁 배양을 유도할 수 있었으나, 침상엽에 의해 생산된 것의 단지 10분의 1에 이르는 수준이었다. 쑤야 오씨덴탈리스가 상당량의 모노터르펜(10-20 mg/L) 및 디터르페노이드 데하이드로페루지놀(2-8 mg/L)을 생산하는 능력은 벌린(Berlin, 1988) 등에 의해 입증되었다. 그러나, 이러한 결과는 늦은 성장(18일에 30 %의 생물량 증가) 및 낮은 세포 밀도 배양(1당 5 내지 7 g의 건조 중량)에서 수득된 것이었다.

[탁솔 생산을 위한 세포 배양: 선행 연구]

나자 식물의 현탁 배양과 관련하여 신속한 생장 및 높은 생산성을 얻는 데 있어서의 난점은 탁솔 생산에 관한 다음 3개의 보고서에 반영되어 있다. 자지리(Zaziri) 등은 최근 (1991년) 탁수스 바카타 (Taxus baccata)의 칼루스 배양을 시도하였지만, 이들의 면역흡착 분석을 사용하여 어떠한 탁솔도 검출할 수 없었다. 위크레메신 (Wickremesinhe) 및 아르테카 (Arteca)는 1991년에 탁수스 메디아(Taxus media (cv. hickali))의 칼루스 배양물에 0.009 건조 중량%의 탁솔이 존재한다고 보고하였지만, 시간 배가, 세포 밀도 및 보고된 탁솔이 생산되는데 걸리는 시간 단위는 기재하고 있지 않다.

미합중국 특허 제5,019,504호 (Christen 등 1991)에는 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 세포 배양에 의한 탁산 및 탁산류 화합물의 생산 및 회수 방법이 기재되어 있다. 이 특허의 발명자는 탁솔 생산이 2 내지 4 주의 시간 단위내에 1 내지 3 mg/L의 수준으로 이루어지는 것으로 보고하였다. 또한, 이들은 세포 중량이 약 7 내지 12일의 배가 시간에 상응하여 "3-4 주 내에 5-10배" 증가하는 것으로 보고하였다.

연간 수십 내지 수백 Kg에 달하는 탁솔의 계획된 연간 수요를 충족시킬 수 있는 탁솔 생산을 위해 조직 배양 공정에는 성장율, 탁솔 생합성율 및 용적 생산성의 증가가 분명히 필요하다.

[발명의 요약]

본 발명자들은 탁솔 및 탁솔류 화합물, 또는 탁산이 공지된 모든 탁수스(Taxus) 종, 즉, 브레비폴리아 (brevifolia), 카나덴시스 (canadensis), 쿠스피다타(cuspidata), 바카타 (baccata), 글로보사 (globosa), 플로리다나 (floridana), 월리치아나 (wallichiana), 메디아 (media) 및 키넨시스 (chinensis)로부터 매우 고수율로 생산될 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 탁수스 키넨시스 (Taxus chinensis) 종이 단기간 내에 빠르게 성장하고 탁솔 및 탁산을 매우 큰 수율로 생산할 수 있음을 발견하였다.

크리스텐 (Christen) 등의 문헌에 기재된 발명 (1991)의 개선에 따라, 본 발명자들은 다른 탁수스 종으로부터의 신속하고 효과적으로 세포배양이 창시될 수 있고, 인공 영양 배지 상에서 성공적으로 성장할 수 있으며, 온전한 식물에서와 동일하게 화학치료요법에 효과적인 탁산 알카로이드가 세포 배양으로 생산될 수 있음을 발견하였다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 이미 보고된 시간보다 훨씬 더 짧은 기간 내에 탁솔을 얻을 수 있다. 본 발명자들은 탁수스 키넨시스 (Taxus chinensis) 종을 사용하여 다른 탁수스 종의 조직 배양으로부터 얻는 양보다 훨씬 많은 양의 탁솔을 생산할 수 있도록 세포를 조작할 수 있었다. 또한, 탁수스 키넨시스 (Taxus chinensis) 세포 배양의 생장율은 크리스텐 (Christen 등 (1991))에 기재된 탁수스 브레비폴리아의 경우 보다 3 내지 6배 정도 현저히 크다.

본 발명의 목적은 각종 탁수스 종으로부터의 신속하고 효과적인 세포 배양의 창시를 포함한다.

본 발명의 목적은 신속한 생장, 큰 세포 밀도, 및 높은 세포 생존성을 조성하기 위한 특수 환경 조건의 조성을 포함한다. 이러한 연구에서 보고된 생장 특성은 중요한 요인으로 선행 결과를 능가한다.

본 발명의 목적은 (a) 영양분 농도 ('생산 배지 조성')의 조심스런 조작, (b) 빛의 사용, (c) 주기적 배지 교환 프로토콜의 사용, (d) 유발제의 사용에 의해 탁솔 및 탁산의 생합성율 및 분비율을 증가 및 연장시키는 능력을 포함한다.

본 발명의 목적은 배지 조성 및 환경 조건을 변화시킴으로써 생산한 탁산의 프로필을 조작하는 능력을 포함한다. 특히, 지배적인 탁산 생성물로서 탁솔을 생산하도록 세포가 조작된다. 또한, 부산물인 세팔로만닌의 생산을 억제하고, 이로 인해 다음 과정의 비용이 많이들고 중요한 분리 및 정제 문제에 대해 훌륭한 생물학적 해결을 제공한다.

본 발명의 목적은 탁솔 이외에 약리학적 활성을 나타낼 수 있거나, 또는 약리학적 활성을 갖는 화합물로 변환되거나 전환될 수 있는 다른 각종 탁산을 생산하는 능력을 포함한다.

본 발명의 목적은 탁수스 키넨시스의 세포 배양을 유도하여 야생 식물에서 생산되는 것 (0.003 내지 0.03 건조 중량%, Xu 및 Liu 1991)보다 훨씬 큰 수준 (0.32 건조 중량%)으로 탁솔을 생산하는 능력을 포함한다.

[도면의 설명]

제1도는 배지 A에서의 전형적인 배치 생장 사이클 동안 탁수스 키넨시스 (Taxus chinensis) 현탁 배양주 K-1에서의 생물량의 증가를 나타낸다. 오차 막대는 중복 플라스크로부터 측정된 표준 편차를 나타낸다.

제2도는 15일 동안의 실험에서 탁솔(A) 및 총 탁산(B) 생산성에 대한 9일 및 12일 째의 배지 교환의 효과를 나타낸다. 각 박스 내의 숫자는 생성물이 생산되는 시간 간격(일)을 나타낸다. 세포 박스내의 어두운 부분은 실험 개시시에 세포 접종물에 존재하는 탁솔 또는 총 탁산을 나타낸다. 모든 처리는 중복 실시되었다. 탁수스 키넨시스 현탁 세포주 K-1를 표 2에서 설명된 배지 A에서 사용하였다.

제3도는 실시예 7.3에서 사용된 표준 그로-럭스(Gro-Lux) 램프(GTE 실바니아사 제품, 매사츄세츠주 댄버 소재)의 분광 특성을 나타낸다.

제4도는 탁수스 키넨시스 세포 현탁물 K-1에서의 탁산 생산성을 나타낸다. 10 내지 40분 동안의 크로마토그램 부분을 나타내었다. 선택된 탁산 피크의 다이오드 어레이 스캔은 227 nm에서의 특징적인 탁산 UV 흡수 스펙트럼을 나타낸다.

제5도는 탁수스 키넨시스 세포주 K-1에 의해 배지 C에서 장기간의 배양을 한후의 탁솔 및 탁산의 생산성을 나타낸다. 상단의 패널은 알려진 탁산 및 알려지지 않은 탁산에 대한 데이타를 표로 만든 것이고, 하단의 패널은 25 내지 42일 동안의 중가분의 탁솔 및 탁산 생산량을 나타낸다.

제6도는 세포 배양 상징액에서의 탁솔의 MS/MS 구조를 나타낸다. 패널 A는 진정한 탁솔의 이온 스프레이 APCI 질량 스펙트럼을 나타내고 패널 B는 모(parent) 피크의 자손(daughter) 이온 스펙트럼을 나타낸다 (m/z 871 = 탁솔 + NH₄ ⁺). 패널 C는 조세포 배양 추출물로부터 얻은 이온 스프레이 APCI 스펙트럼을 나타내고 탁솔의 m/z 854 및 871 특성을 나타낸다. 패널 D는 m/z 871의 대응하는 자손 스펙트럼을 나타내고 세포 배양 상징액에서의 탁솔의 존재에 대한 명백한 증거를 제공한다.

[발명의 상세한 설명]

식물은 오랫동안 제약 물질 및 특정 화학 물질의 중요한 공급원으로서 제공되어 왔다. 이들 생산물은 통상적으로 수확된 식물 재료의 추출을 통해 또는 화학 합성에 의해 얻어졌다. 탁솔은 최근에 천연 생산물의 스크리닝으로부터 출현된 가장 중요한 강력한 항암제 중의 하나가 되어 왔다.

본 명세서에서 사용된 탁솔 및 탁솔형 화합물, 또는 탁산이라는 용어는 탁산고리를 가진 화합물을 설명하는 데 교환가능하게 사용된다. 이러한 화합물은 스스로 항종양 활성을 가질 수 있거나 또는 생활성 화합물을 생산하는 것으로 변형될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "칼루스"란 용어는 구조적으로 미분화되고 고화된 배지에서 배양되는 배양 식물 세포의 집단을 설명하는데 사용된다. 본 명세서에서 사용된 "현탁 배양물"이란 용어는 액체 영양 배지에 분산된 구조적으로 미분화된 세포를 설명하는데 사용된다. 현탁 배양물은 여러 단계의 응집 상태에 있는 세포로 이루어진다. 본 발명에서 설명된 현탁액에는 직경이 수십 ㎛인 응집 크기의 범위(단일 세포 또는 몇개의 응집된 세포)에서 수천개의 세포로 이루어진 직경이 수 mm인 것으로 응집된 범위의 응집 크기가 존재한다.

본 발명에서 유용한 식물은 알려진 모든 탁수스 종, 즉, 브레비폴리아, 카나덴시스, 쿠스피다타, 바카타, 글로보사, 플로리다나, 월리치아나, 메디아 및 키넨시스로 부터 얻었다. 상세히 설명하면, 본 발명자는 배지로 소정의 화합물을 연속적으로 분비시키면서 단기간의 배양 시간내에 상당량의 탁솔 및 탁산을 생산할 수 있는 탁수스 키넨시스 종을 동정하였다.

본 발명자는 특정 탁솔 함량이 식물 종 및, 조직 및 특정 나무로부터 얻은 식물 종에 따라 다양하다는 것을 발견하였다. 탁솔을 고수율로 생산하는 것을 선택하는 것은 치료 용도를 위해 충분량의 탁솔을 제공하는 데 있어서 중요한 첫번째 단계이다.

[탁수스 세포주의 창시]

탁수스 식물은 북아메리카 전지역 및 다른 대륙에서 얻을 수 있다. 배양은 성장을 위한 적절한 탁수스 조직을 선택하는 것으로부터 시작된다. 칼루스를 얻기 위하여, 껍질, 형성층 조직, 침상엽, 줄기, 종자, 구과 및 뿌리를 비롯한 식물의 여러 조직이 선택될 수 있다. 그러나, 탁솔의 최적의 수율을 위해서는 식물의 침상엽 및 분열 조직이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 새로운 성장 침상엽 (예를 들면, 1 내지 3개월 된 것)이며, 그것은 일반적으로 더욱 밝은 녹색에 의해 확인될 수 있다. "새로운 성장"이란 용어는 1년 중의 성장 계절내에 일어나는 식물의 침상엽 생성을 의미하는데 광범위하게 사용된다.

배양물의 오염을 방지하기 위해서는 조직을 배양 배지로 도입하기 전에 표면 멸균하여야 한다. "클로록스"(CLOROX)(클로록스사에 의해 정해진 표백제의 상품명) 처리와 같은 종래의 멸균 처리 기술이 효과적이다. 또한, 세폭시틴, 벤레이트, 클록사실린, 암피실린, 젠타마이신 설페이트 및 포스포마이신과 같은 항생제가 식물 재료의 표면 멸균을 위해 사용될 수 있다.

[칼루스 생장]

배양물은 전형적으로 생장 형태, 생산성, 생산물 분포특징 및 기타 특성에서 가변성을 나타낼 것이다. 개개의 세포주가 선호하는 생장 배지 성분이 다르기 때문에 칼루스의 유도 및 증식에 각종 상이한 생장 배지를 사용할 수 있다.

적절한 배지 조성은 배양되는 종에 따라 달라진다. 다양한 종에 대해 바람직한 배지를 표 8에 나타내었다. 예를 들어, 다른 것을 사용할 수도 있지만, 탁수스 키넨시스 (Taxus chinensis)에 바람직한 두 가지 생장 배지는 A 및 D이다. 이 배지들은 바람직하게는 표 2에 나타낸 성분을 함유한다. 예를 들어, A 배지를 사용할 때 성장 호르몬 또는 조절제를 배지에 1 ppb 내지 10 ppm 사이, 바람직하게는 2 ppb 내지 1 ppm의 양으로 포함시킨다. D 배지를 사용할 때에는, 성장 호르몬 또는 조절제를 배지에 1 ppb 내지 10 ppm 사이, 바람직하게는 2 ppb 내지 2 ppm 의 양으로 포함시킨다. 다른 배지 성분의 양은 표 2에 지시된 농도의 0.1 내지 3배 범위의 농도로 포함시킬 수 있지만, 바람직하게는 표 2에 나타낸 정도로 포함시킨다.

[현탁 생장]

탁수스 현탁 배양물은 다른 식물 세포 배양과 같이 신속한 생장 속도 및 높은 세포밀도를 보일 수 있다. 그러나, 최적 조건은 세포주 각각에 따라 달라지며, 따라서 주어진 세포주에 대한 신속한 최적화로 이르는 방법이 고려되어야 한다.

각종 탁수스 종의 최초 배양물을 다량 및 미량양분, 유기염 및 성장 호르몬을 함유한, 표 3에 나타낸 배지에 전이시킴으로써 계대배양한다. 양은 일반적으로 다음 범위에 걸친다: 표 2에 나타난 각 배지 성분 농도의 10분지1 농도에서 출발하여 3배까지. 바람직한 농도는 표 2에 나타낸 것들이다.

액체 배양물은 공기에 노출시키며 바람직하게는 진탕하거나 온화하게 움직여주어 배지 내로 공기를 들여보낸다. 또는 튜브를 통하여 공기를 배양 용기 내로 들여보낼 수도 있다. 배양물을 20 내지 26℃ 사이의 온도에서 적절한 생장 조건으로 유지한다. pH는 약 3 내지 7, 바람직하게는 4 내지 6 사이일 수 있다. 배양은 완전 암흑에서 완전 조명 (좁은 대역 및(또는) 광폭 스펙트럼)에 이르는 광 조건 하에서 다양한 기간 동안 진행할 수 있다. 총 탁솔 생산성이 빛에 노출된 배양에서 가장 높기 때문에, 빛에 노출시키는 것이 바람직하다. 대표적인 조도 조건은 약 10,700 내지 32,100 룩스 (약 100 내지 약 3000 foot candle power) 사이이다.

현탁 배양은 2차배양 시점부터 1 내지 8주 동안 유지되며, 그 이후에는 배양 생장이 감퇴한다. 배양물은 여과와 같은 수단으로 생장 배지를 제거함으로써 회수한다. 회수된 배양물의 중량을 측정하고, 동결건조와 같은 수단으로 건조시키고, 미세한 분말로 분쇄한 다음 통상적인 용매 추출 기술을 사용하여 탁솔을 추출할 수 있다.

시간에 따른 생물량 증가량을 추적하거나 단순히 통상적인 2차배양 기간중 성장 지수를 추적함으로써 배가 시간을 측정하였다. 15-24 g/l의 최대 건조 중량 밀도를 얻었다. 각종 탁수스 종 현탁액의 생장 특성을 실시예 4에서 상세히하였다.

[분석 방법]

세포 및 배지로부터 탁솔 및 탁산을 추출하여 회수하는 방법은 통상의 기술들에 따르고 실시예 5에 상세하게 기재하였다. 면역-검정(ELISA) 기법은 시판되는 키트내에서의 하와이 바이오테크날러지에 의해 제공된 프로토콜을 대부분 따랐다. 고 성능 액체 크로마토그래피법은 실시예 5에서 제시한 바와 같이 실제 프로토콜을 다소 변형하였다. 본 발명에서 사용한 조건하에서, 탁산 피크가 명확하게 분리되었고, 그 결과 정밀한 탐지 및 정량 분석이 달성되었다. 함께 용리되는 비-탁산 성분의 존재 가능성 때문에, 대략의 탁산 피크의 분광학적 순도를 피크 면적의 적분 전에 이중 진공관상에 배열하여 체크하였다. 표준 탁산의 체류 시간을 실시예 5에 기재하고 시료 크로마토그램을 제4도에 나타낸다.

[생산 배지 조건]

상기한 바와 같이, "영양 배지"라는 용어는 식물 세포 칼루스의 배양 및 현탁 배양에 적합한 배지를 의미한다. "영양 배지"라는 용어를 일반적으로 사용하며 이는 "생장 배지" 및 "생산 배지"라는 용어를 포함하여 사용된다. "생장 배지"라는 용어는 배양된 세포를 급성장시킬 수 있는 영양 배지를 의미한다. "생산 배지"라는 용어는 배양된 세포에서 탁솔 및 탁산을 생합성하는 데 유용한 영양 배지를 의미한다. 생장은 생산 배지에서 일어날 수도 있고, 생산은 생장 배지에서도 일어날 수도 있으며, 적절한 생장 및 생산을 단일 영양 배지에서 일으킬 수도 있다.

영양 배지내 특정한 유형의 첨가제를 본 발명에서는 구체적인 명칭으로 언급하기로 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "갈변 억제제"라는 용어는 세포 배양 동안에 색소가 생성되는 것을 막기 위하여 영양 배지에 첨가한 성분을 의미한다. 이들 색소는 일반적으로 세포 생장, 생존성 및 생산성에 유해한 것으로 보이는 페놀계 및 관련 화합물들이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생합성 전구 물질"이라는 용어는 세포에 의해 대사되어 탁솔 및 탁산으로 혼입하기 위하여 영양 배지에 첨가한 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대사 억제제"라는 용어는 특정의 생합성 경로를 방해하기 위하여 영양 배지에 첨가한 화합물을 의미한다. 예를 들어, 대사 억제제는 초기의 생합성 전구 물질에 있어서 탁솔 생성과 경쟁하는 다른 경로를 차단함으로써 탁솔 생합성을 향상시키는 데에 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어인 자극제 또는 활성제는 특정 생합성 경로, 예를 들면 탁솔 생합성을 유도하는 경로를 자극 또는 활성화하기 위하여 영양 배지에 첨가되는 화합물을 설명하기 위해 시용한다. 본 명세서에 사용되는 첨가제의 작용 기작은 완전하게 이해되지 않았다.

현탁 배양액에서의 2차 대사 물질 생성이 생장과 함께 동시에 발생하는 경우, 이 대사 물질을 생장 연관형이라고 부르며, 양호한 생장과 높은 수준의 생산을 달성하기에 단일 배지 조성이 충분할 수 있다. 많은 다른 시스템에서, 신속한 생장 및 높은 산물 생성이 동시에 발생되지 않는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 경우, 생장 및 생산 시기가 분리되고, 각 시기에 대한 배지가 독립적으로 개발되었다(Payne 등에 의해 1991년에 보고됨). 탁수스 키넨시스(Taxus chinensis)에서의 탁솔 및 탁산 생성의 경우, 생장과 신속한 산물 생성은 분리되며, 각각을 위한 배지가 독립적으로 개발되어 왔다. 그러나, 상기 배양을 위해서 단일 생장/생산용 배지가 제조될 수 있다. 본 발명에 따라 개발된 생산용 배지는 탁솔 및 탁산 총 생성을 증가시키고, 탁솔 생성쪽으로 세포 생합성을 유도한다. 또한, 세팔로만닌과 같은 간섭 부산물의 생성이 나무 껍질 조직에 비해 극히 적다. 또한 본 발명에 따라 개발된 생산용 배지는 세포 생존 및 생합성을 연장시키고, 더우기 상당량의 생성물을 세포외 배지로 분비시키기도 한다. 이러한 특성은 탁솔 제조를 위한 효율적인 상업적 규모의 공정에 있어서 극히 중요하다.

다른 배지들이 사용될 수 있지만, 각 종에 대한 바람직한 생산 배지는 표 5에 기재되어 있는 배지다. 예를 들어, 다른 것이 사용될 수 있지만, 탁수스 키넨시스에 대한 바람직한 생산용 배지는 B 및 C이다. 이러한 배지는 바람직하게는 표 2에 기재된 성분을 함유한다. 이러한 배지는 바람직하게는 다수 및 소수의 무기염류, 유기물 및 성장 호르몬 또는 성장 조절제를 함유한다. 그 함량은 일반적으로 표 2에 기재한 각 배지 성분 농도의 1/10 내지 3배 범위를 갖는다. 그러나, 바람직한 수준은 표 2에 기재한 것이다.

배지 B가 사용되는 경우, 성장 조절제는 0.1 ppm 내지 20 ppm, 바람직하게는 1 ppm 내지 10 ppm 양으로 배지에 혼입된다. 배지 C를 사용하는 경우, 성장 조절제는 바람직하게는 0.1 ppm 내지 0.5 ppm의 양으로 혼입된다.

상기 배지에서, 다른 통상적인 염 조성물(예를 들면 유기물, 비타민, 아미노산, 전구체, 활성제, 억제제)의 치환, 각종 성분, 성장 조절제의 첨가 또는 제거 또는 비율의 변경 등과 같은 변형이 이루어질 수 있다.

비휘발성 용해 영양분 외에, 가스상 성분, 주로 산소, 이산화탄소 및 에틸렌(식물 호르몬)은 생장 및 산물 생성에 중요한 역할을 한다. 두 변수가 중요하다. 생장 및 탁솔 형성에 유리한 용존 가스 농도는 반응기 수행 조건을 지시하기 때문에 분명히 중요하다. 또한, 소비 또는 생산 속도는 반응기 설계에 고려될 필요가 있으며, 이에 따라 최적 특정 농도를 유지할 수 있다.

호흡에서의 중요성 외에, 산소는 2차 생합성 속도에 크게 영향을 줄 수 있다. 2차 생합성 경로에서 산소 요구 단계에 대한 높은 포화 상수가 반응기에서 높은 산소 수준에 세포를 놓이도록 하기 위해서 필요할 수 있다. 높은 생장 속도를 유지하는데 있어서 CO₂공급의 중요성이 보고되어 있다. 식물 호르몬인 에틸렌은 2차 대사를 포함하여, 식물 생장 및 발생의 모든 면에 있어서, 다면적인 역할을 수행한다.

[유발제]

세포 배양에서 탁솔 및 다른 관련 탁산의 수율을 증가시키기 위해서, 발명자는 다수의 방법을 수행하였다. 생산성을 증가시키기 위해 사용된 방법 중 하나는 소위 유발제(elicitor)의 사용이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 유발제는, 식물 또는 식물 세포 배양물에 사용되는 경우 2차 대사물질 생성의 증가를 가져오는 생물학적 및 비생물학적 기원의 화합물에 대해 사용된다(Eilert 1987; Ebel 1984; 및 Darvill 등. 1984). 여러 다른 화합물들이 그들의 기원 및 세포 대사시 작용 형식에 의존하여 유발제로 사용할 수 있다. 상기 연구에서, 본 발명자들은 크게 두 종의 유발제 즉, i) 일반적으로, 진균류, 세균 및 효모의 선택군으로부터의 세포벽 추출물 또는 여과물을 포함하는 생물성 유발제 및 그의 정제 분획 2) 화학 자극제(stress agent) 및 생물 기원성 일부 화합물을 포함하는 비생물성 유발제를 사용하였다(표 1에 기재된 유발제 참조).

크리스텐(Christen) 등 (1991)은 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 현탁액에 의한 탁솔 생산용 진균성 유발제 및 특정 화합물의 사용을 보고하였다; 그러나, 유발제 처리에 의한 탁솔 축적 수준의 증가는 상술하지 않았다.

일반적으로, 두종의 유발제는 효과적이었지만, 단 발생된 유발(세포 배양물에서의 탁산 축적 및 배지로의 분비) 정도가 유발제마다, 및 종마다 상이하였다. 키토산 글루타메이트, 리케난(lichenan), 페룰산(ferulic acid) 및 벤조산에서 가장 높은 생산 증가가 달성되었다. 키토산 및 리케난은 미생물의 세포벽 기원의 복합 다당류이다. 키토산은 단독으로 사용되는 경우 배지에서 불용성이고, 독성이 있어, 영구적인 세포 손상의 원인이 된다. 한편, 키토산 글루타메이트는 배지에서 용이하게 용해되어 세포 생존에 영향을 주지 않는다. 페룰산 및 벤조산은 생물 기원의 합성 화합물이며, 일반적으로 생물학적 시스템에서 산화방지제로서 사용된다.

유발제는 다양한 방식으로 용존 기체와 상호작용한다. 산소 요구량은 유발시 변화할 수 있다. 상처 반응으로서의 호흡률의 증가가 식물 세포 배양시에 통상적으로 관찰된다. 중요한 것은, 유발제가 에틸렌을 통해 그의 작용을 매개할 수 있다는 것이다. 이러한 경우에, 미생물 유발제 제제를 에틸렌으로 치환하여 유발제 제제중 다른 미생물 성분과 관련된 독성을 없애는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에서는 유발제 및 대사 자극제를 사용하여, 배양 시기 및 배지 조성의 함수로서 유발제 특이성 및 농도, 시기 조정, 및 지속 기간을 평가함으로써 조직 배양에서의 탁솔 생산 및 분비를 최대화시킬 수 있다.

[생산성 향상을 위한 급속 배지 교환]

실시예 7.3에서 설명한 바와 같이, 매 3일마다 폐 배지의 제거 및 신선한 배지의 보충으로 세포외 생성물의 양을 증가시킬 뿐만 아니라 총 탁산 및 탁솔 생산량을 현저히 증가시킬 수 있다.

배지 교환의 자극적 효과는 생성물의 동일계 제거에 따라 피드백 억제 및 생성물 변성을 방지하는 것에 기인한 것일 수 있다. 현탁 배양물 중의 이차적 대사체 생성 및 분비에 대한 동일계 생성물 제거의 이러한 긍정적인 효과는 무엇보다도 로빈스(Robins)와 로즈(Rhodes)(1986) 및 아사다(Asada)와 슐러(Shuler)(1989)에 의해 개시되었다. 폐 배지의 주기적인 제거는 상기 잇점들을 결부시키며, 더우기 배지로부터 기타 비탁산성 억제 성분(예컨대, 페놀계 성분)을 제거시킴으로써 이차 생합성을 억제하는데 기여할 수 있다.

활성 생합성이 진행되고 있는 세포에 신선한 배지를 보충하는 것은 소모되어 버린 필수 영양분을 공급함으로써 또한 생산량을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 미아사까(Miyasaka) 등(1986)은 단순히 배지에 수크로오스를 첨가함으로써 살비아 밀티오르히자(Salvia miltiorhiza)의 정지기 세포를 자극하여 디터펜(diterpene) 대사체, 크립토탄쉬논, 및 페루기놀을 얻을 수 있었다. 아마도, 생합성은 정지기에서의 탄소 한계치로 인해 중단된 것으로 보인다. 본 작업에서 사용된 주기적인 배지 교환 프로토를은 상기 요인 중 어느 하나로 인한 결과로서 이익이 될 수 있었다.

교환된 배지의 양, 교환 빈도, 및 보충되는 배지의 조성은 변화시킬 수 있음을 이해해야 한다.

주기적인 배지 교환에 의해 생합성 및 분비를 자극하는 능력은 상업적인 공정을 연속식, 반연속식 또는 주입배치식으로 효율적으로 디자인 및 조업하는데 중요한 의미를 갖는다.

[광선]

고등 식물의 경우, 광선은 온전한 식물 및 세포 배양 모두에 있어서 이차 대사의 효능있는 인자이다. 광선의 강도 및 파장 모두가 중요하다[시버트 (Seibert) 및 카드카드(kadkade), 1980]. 예컨대, 플라바노이드 및 안토시아닌의 생합성에서는 통상 고 강도의 연속광이 선호되나, 기타 대사체의 경우는 암재배 배양이 바람직할 수 있다. 배양 세포의 그린화(greening) 및 광합성 능력의 증가는 또한 생성물 형성 또는 생성물 분포를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 연구에서는 특정의 좁은 밴드(band) 광원 및 넓은 밴드를 사용하였다. 실시예 7,3에서 나타낸 바와 같이, 광선에의 노출은 탁솔 축적량 및 배지로의 분비를 증가시킬 수 있다. 탁솔 생성에 대한 광선의 자극적인 효과는 탁산의 생합성에 대한 특이 조절 메카니즘이 존재함을 제안한다. 광수용체의 성상 및 광 유도 자극의 생화학적 특성은 아직 분명하게 밝혀지지 않았다.

[공정 조작 방식]

식물 세포 배양 공정에 대한 조작 방식은 영양분, 세포, 및 생성물이 시간에 따라 첨가 및 제거되는 방식을 의미한다[파인(Payne) 등, 1991]. 모든 영양분이 처음에 공급되고 세포 및 생성물로 이루어지는 배양 내용물이 배양 기간의 말기에 수확되는 경우, 이 조작 방식을 "일단계 배치식 공정"이라고 한다. 이 배치식 공정이 두 단계의 순차적인 상, 즉 생장 및 생산 상으로 분리되고 배지가 이 두 단계 도중에 교환될 경우, 이 조작 방식을 "이단계 배치식 공정"이라고 한다.

"공급-배치"의 수행에서, 일단계 또는 이단계의 배치 배양 과정 동안 특정한 배지 첨가제 및 영양소가 간헐적으로 또는 연속적으로 공급된다.

연속적인 세포 생장 및 생산을 위해, 신선한 배지를 첨가하면서 배치 배양 내용물의 모두가 아닌 실질적인 부분을 수거하는 경우, 이 공정은 "반복되는 유출 및 공급" 작업과 유사하며, "반(semi)연속 공정"이라 한다.

신선한 배지가 연속적으로 공급되는 경우, 유출 배지는 연속적으로 제거되며, 이 공정을 "연속적"인 것이라 한다. 세포가 반응기내에 남아있는 경우, 이 공정을 "환류식"이라 한다. 세포가 유출 배지와 함께 연속적으로 제거되는 경우, 이 연속 공정을 "연속 배양 장치"라 한다.

이들 다양한 공정 수행 방식은 본 명세서에 설명된 탁솔 생산 시스템과 상용 가능하다는 것을 이해해야 한다.

[실시예]

하기의 실시예는 본 발명을 수행하는데 사용되는 물질 및 방법을 상술한다. 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 어떤 방법으로든 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

칼루스(Callus) 창시

다수의 야생 및 재배 식물로부터 탁수스(Taxus) 식물 재료의 표본을 수집하였다. 표본이 실험실에 도착하자마자 처리하거나 또는 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.

재료를 우선 희석된 비누 용액중에서 세척하고, 물중에서 헹구고, 표면을 10분동안 클로록스(CLOROX) 용액(10 %의 차아염소산염, pH 7)중에서 살균시켰다. 이어서 무균 조건하에서 무균수로 3회 세척하였다. 이어서 침상을 1 %의 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 용액중에서 100 mg/l의 아스코르브산으로 절단하였다. 침상을 절단 말부와 함께 배지 E 중에 방치하였다(표 2 참조), 배지 플레이트당 30 내지 40 개의 이식 조직을 배양하였다. 이식 조직을 포함하는 플레이트를 어둠 속에서 24 ± 1 ℃에서 배양시켰다. 플레이트를 감염 미생물의 출원에 대해서 매일 관찰하고, 나타난 위치에서, 감염되지 않은 침상을 제거하여 배지 E의 신선한 플레이트중에 두었다. 실질적인 칼루스 형성을 관찰하고 칼루스를 20일 째에 이식 조직으로부터 단리하여 표 3에 기재된 다양한 칼루스 증식 배지상에 두었다. 예를 들어, 탁수스 키넨시스(Taxus chinensis)의 칼루스를 배지 D로 옮겼다(표 2 참조). 본 형성 방법은 매우 효율적이었고, 낮은 감염율 및 90 % 이상의 이식 조직에서 높은 칼루스 유도 횟수를 나타내었다. 탁수스 브레비폴리아(Taxus brivifolia), 탁수스 카나덴시스(Taxus canadensis), 탁수스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 탁수스 바카타(Taxus baccata), 탁수스 글로보사(Taxus globosa), 탁수스 플로리다나(Taxus floridana), 탁수스 월리치아나(Taxus wallichiana), 탁수스 메디아(Taxus media), 탁수스 키넨시스(Taxus chinensis)의 배지를 형성시키는 데에도 동일한 방법이 사용되었다.

[실시예 2]

칼루스 증식

칼루스를 일단 이식 조직으로부터 제거하고, 이를 어둠 속에서 24 ± 1 ℃에서 배양하였다. 칼루스의 건강한 부분을 매 10일마다 신선한 배지로 옮겼고, 이 이동 횟수가 갈변을 예방하고 칼루스를 오래 유지하는데 극히 중요함을 발견하였다. 다양한 종의 칼루스에 대한 바람직한 성장 및 유지 배지를 표 3에 요약하였다.

[실시예 3]

현탁물 창시

1 g 중량의 신선한 칼루스 재료를 각 종에 적합한 25 ml의 액상 배지(표 3 참조)를 함유한 125 ml의 엘린마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 넣었다. 예를 들어, 탁수스 키넨시스에 대해서 배지 D를 사용하였다. 플라스크를 실리콘 기포 캡(뉴저지주 벨코사 제품)으로 덮고 어둠 속에서 24 ± 1 ℃에서 120 rpm의 회전 진탕기상에 배치시켰다. 현탁 배양액을 약 3 내지 10일 내에 형성시켰다. 우선, 미라클로쓰(miracloth) 여과지(Calbiochem사 제품)을 포함하는 부크너(buchner)관을 통해 플라스크의 내용물을 흡인 여과시켜 배지를 교환하고, 신선한 배지중에 모든 생체 물질을 재현탁시켰다. 세포 성장에 대하여, 1 - 2 g(습윤 중량)의 세포를 25 mL의 신선한 배지를 포함하는 새로운 125 ml의 플라스크로 서서히 옮긴 후 이어서 매주 계대배양(subculture)하였다.

[실시예 4]

현탁 세포의 생장

대표 종들의 현탁액 배양중의 표준 성장율 및 세포 밀도를 구하고 표 4에 기재하였다.

상세한 예로서, 탁수스 키넨시스 세포주 K-1의 경우 시간에 비례하는 생체물질(습윤 및 건조 중량)의 증가를 제1도에 나타내었다. 성장 곡선상에서 생체 물질이 가장 빠른 증가를 보이는 점의 기울기를 취하여 최대 성장율을 측정하였다. 탁수스 키넨시스의 세포 배양물은 2.5일의 최대 배가 시간으로 성장하였다. 이 성장율은 탁수스 종의 현탁 배양에 대한 기존의 보고보다 크게 높은 것이었다. 예를 들면, 문헌[크리스틴과 그외(Christen et at.), 1991]은 3 내지 4주 동안 배양한 후 5 내지 10배의 생체 물질이 증가한 것으로 기재하고 있는데, 이는 탁수스 브레비폴리아 현탁액의 평균 배가 시간이 7 내지 12일인 것으로 바꾸어 말할 수 있다.

고밀도에서의 세포 배양 능력은 세포 배양 공정의 용적 생산성을 최대화하는 데 중요하다. 탁수스 브레비폴리아의 배지는 리터당 1 g의 건조 중량(문헌[크리스틴과 그외(Christen et al.), 1991]에 제공된 데이터로부터 계산한 것) 미만의 세포 밀도를 나타낸 반면, 탁수스 키넨시스의 현탁액은 18일간의 성장후 리터당 8 내지 20 g의 건조 중량에 이르는 밀도를 나타내었다. 세포를 아세톤 중의 0.05 % 형광 디아세테이트 용액으로 염색하고(Widholm, 1972), 역상 형광 현미경(0lympus IMT-2, 일본) 상에서 청색 광으로 여기시켰을때 녹색 형광 세포의 수를 측정함으로써 세포 생존율을 측정하였다. 생존 세포율은 성장기 전체에 걸쳐 90 % 이상이었다.

높은 생존율을 유지하면서 급성장 조건하에 세포를 고밀도로 배양하는 것은 탁솔 및 탁솔류 화합물을 생산하기 위한 식물 세포 배양 공정의 경제적인 운용에 중요한 선결 과제이다.

[실시예 5]

탁솔 및 탁산의 분석

5.1 엘리자(ELIZA)법

엘리자(ELIZA)법을 사용하여 세포주 중의 탁솔을 대규모 검색하였다(Hawaii Biotech), 이러한 방법은 높은 감도(0.1 ng/ml)를 제공하나, 다클론성 항체를 사용하므로 다른 탁산과의 교차 반응성이 관찰된다. 수집한 분획물을 예비(분석용 규모) HPLC한 결과 10-디아세틸탁솔, 7-크실로실-10-디아세틸탁솔, 세팔로만닌, 10-디아세틸-7-에피탁솔, 7-에피탁솔 및 다른 미확인 탁산과의 교차 반응이 관찰되었다. 이러한 교차 반응성에도 불구하고, 상기 방법은 탁산의 생성 검출에 극히 유용하고, 다량의 세포주를 신속히 검색할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이어서, 상당량의 탁산을 생성한 것으로 나타난 세포 추출물을 하기 설명한 HPLC 방법을 사용하여 정밀 분석하였다.

5.2 탁솔 및 관련 탁산의 추출

상징액으로부터 탁산을 추출하는 것은 배지중의 농도에 따라서 두가지 방법에 의해 수행하였다. 액체 배지중에 충분한 양의 탁산이 존재할 경우, 시료를 매우 신속하고 효율적으로 제조하였다. 배지(2 ml)를 완전히 건조시키고(진공하에서) 일정량의 메탄올(0.5-2.0 ml)을 가하였다. 이 혼합물을 초음파로 교반하여 시료가 완전히 용해 또는 분산되도록 하였다. HPLC로 분석하기 전에, 원심분리하여 고상물을 제거하였다. 정량 회수율은 0.1 mg/l 이하의 검출 수준에서 1 mg/l로 얻어졌다.

배양 상징액 중의 탁산의 농도가 낮을 경우, 배지를 동일한 부피의 메틸렌클로라이드와 이소프로필알콜 혼합물(IPA) (9:1 부피비)로 3 회 추출하였다. 유기층을 건조시켜 감소시키고, 일정량의 메탄올(50-250 ml) 중에서 재구성하였다. 전형적인 다중 추출 결과 0.6 mg/l 수준의 탁솔, 세팔로만닌, 및 바카틴 Ⅲ 90-95 %를 회수하였다.

수득한 세포를 급히 냉각시키고(-5 ℃), 진공 건조시키고 메탄올로 50 회 속슬레법으로 침출시켜 세포 물질을 추출하였다. 일반적으로 10-15 %가 분해된 70 내지 80 %의 탁산이 수득되었다. 고상 배지와 칼루스(callus)의 추출도 세포의 경우와 동일하게 행하였으나, 최총 메탄올 추출물을 항상 메틸렌클로라이드/IPA 대물 상에서의 분배를 행하였다.

5.3 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)법

고-탄소 부하 디페닐 칼럼(Supelco, 5 mM, 4.6 mm x 25 cm) 상에서 CM3500/CM3200 펌프, CM4100 가변 용적 오토샘플러 및 말단 486 개인용 컴퓨터에 연결된 SM5000 광 다이오드 배열 검출기로 이루어진 LDC 분석용 이중 구배 고압 혼합 시스템를 사용하여 고성능 액체 크로마토그래퍼(HPLC)로 분석하였다. 칼럼 온도를 엘덱스 CH150 칼럼 오븐을 사용하여 35 ℃로 조절하였다. 하기의 이중 구배 용리 계획에 따라 탁산을 HPLC로 정량 분석하였다.

시간 용출제 A(%) 용출제 B(%) 유속

0 75 25 1 ml/분

40 35 65 1 ml/분

42 25 75 1 ml/분

47 25 75 1 ml/분

50 75 25 1 ml/분

용출제 A = 트리플루오로아세트산으로 pH 3.5로 조절한 0.015 mM KH₂P0₄

용출제 B = 아세토니트릴

사용된 크로마토그래피법은 트리플루오로아세트산을 함유하는 인산염 완충액을 사용하고 보다 긴 구배를 사용한 것을 제외하고는 공지된 방법 [위더럽 (Witherup) 등(1989) 참조]에 따랐다. 이 차이에 의해 혼합물로부터 탁솔과 다른 탁산을 분할하는 데 상당한 개선이 이루어졌다. 탁산에 대해 관찰된 상대 체류 시간은 하기와 같다. 탁솔은 사용된 컬럼과 하드웨어에 따라 31분과 33분 사이에서 용출한다.

화합물 상대 체류 시간

10-데아세틸바카틴 Ⅲ 0.38

바카틴 Ⅲ 0.56

7-크실로실-10-데아세틸탁솔 C 0.80

10-데아세틸탁솔 C 0.87

세팔로만닌 0.94

10-데아세틸-7-에피탁솔 C 0.98

탁솔 C 1.00

7-에피탁솔 1.12

탁솔, 세팔로만닌 및 바카틴 Ⅲ의 체류 시간은 내쇼날 캔서 인스티튜트 (National Cancer Institute)로부터 입수한 공인 시료를 사용하여 측정하였다. 상기 다른 탁산들의 체류 시간은 하우저 케미칼 (Hauser Chemical)(Boulder CO)에의해 제공된 분석 표준 물질과 비교하였다. 공지된 탁산들은 체류 시간과 자외선 스펙트럼의 대비에 근거하여 동정하였다. 탁솔, 세팔로만닌 및 바카틴 Ⅲ의 정성 분석은 공인 물질로부터 측정한 반응 인자에 근거하였다. 10-데아세틸바카틴 Ⅲ의 정성 분석은 바카틴 Ⅲ에 대해 측정한 반응 인자를 사용하여 수행하였다. 나머지 탁솔 유도체들의 정성 분석은 탁솔에 대해 측정한 반응 인자에 근거하여 대략적으로 수행하였다.

각각의 표준 물질 10 ml를 전형적인 방법으로 주입 (처음에 이어 3 또는 4회 시료 주입후)하고, 3가지 성분 각각에 대한 면적을 적분하였다. 각 성분들의 반응 인자는 데이타의 선형 최소 자승법으로 얻었다. 각 시료 10 ml를 주입하고, 매 주입시 양은 표준 데이타 회귀법으로 계산하였다. 얻어진 결과는 리터 당 양 또는 건조 중량 %로 전환하였다. 제4도는 상징액 시료의 전형적인 크로마토그램이다.

5.4 탁솔의 MS/MS 확인

세포 배양 상징액 중의 탁솔은 유동 주입과 이온 분무 대기압 화학 이온화를 결합시킨 MS/MS법 (제6도에 도시)을 사용하여 확인하였다. 이하, 제6도에 나타낸 데이타를 얻기 위해 사용한 방법을 상세히 설명한다. 질량 분석계: 대기압 이온화원을 구비한 Sciex API 3 트리플 쿼드러폴 (triple quadrupole), 차단 기체로서 질소를 사용하고, CID 스펙트럼을 위한 충돌 기체로서 아르곤을 사용하였다. 인터페이스(Interface): 이온 증발 이온화에 의해 이온을 생성하는 이온 스프레이 인터페이스 (Electrospray). 분무(nebulizer) 기체로서는 제로(Zero) 공기를 사용하였다. LC 펌프: 5μL/분으로 작동하는 ABI 140B 이중 시린지 펌프. 용매: 50/50 아세토니트릴/H₂0 2mM NH₄0Ac + 0.1% 포름산. 주입 부피: 5 ㎕, 모든 유동 주입 분석에 의하여 얻은 스펙트럼. 이 방법은 세포 배양 시료 중의 탁솔의 존재에 대한 명백한 확인과 아울러, HPLC 결과와 현저히 일치하는 정성 분석 결과를 제공하였다.

[실시예 6]

다양한 종에 의한 탁솔 생산

다양한 탁수스 종의 세포 배양에 의해 제조된 탁솔을 표5에 요약하였다. 칼루스를 20일간 각 종마다 지정된 고체 배지 상에서 어두운 배양기 중에서 배양하였다. 세포 및 배지를 건조시키고 메탄올로 함께 추출하여 ELISA 또는 HPLC로 분석하였다. 탁수스(Taxus chinensis) 배양물의 분석 결과를 실시예 7 및 8에서 더 상세히 설명하였다.

[실시예 7]

7.1 생장 배지의 제조

탁솔 및 관련된 탁산의 생산은 배양 배지 A로 옮긴 후 2일 이내에 개시되었다. 최대 탁솔 생산량은 제15일에 플라스크 당 8.81 μg이었는데 이는 탁솔 0.44 mg/l에 해당한다. 이중 46.1%는 세포외 배지 내에 존재하였다. 제15일 총 탁산의 농도는 72.87 μg/플라스크, 또는 3.6 mg/l이었으며 이중 58.6%가 세포외 배지에 존재하였다. 형광 염색으로 측정한 세포 생존율은 항상 90%를 넘는 것으로 보아(실시예 4) 세포외 탁솔 및 탁산의 존재는 세포 용해보다는 분비에 의한 것으로 보인다. 세포가 탁솔 및 탁산을 분비하는 특성은 연속 조작의 중요한 면이 될 것이다.

7.2 생산성 향상을 위한 배지 교환

제9일에 배지 A를 무균적으로 흡입해내고 신선한 배지로 교환하고 제12일에도 이것을 반복하여 탁솔 및 탁산의 총 생산성을 상당히 향상시켰다. 제15일에 실험을 중지하고, 결과를 제2도에 나타내었다. 배지 교환에 의한 생산성의 상당한 증가를 표6에 요약하였다. 배지 교환에 의한 탁솔 및 탁산의 총 생산량은 비 처리 대조구보다 4.6배 많았다. 또한, 배지 교환 처리를 하지 않은 대조구와 비교할 때 탁솔 약 4.9배, 탁산 약 5.9배가 세포외 배지에서 회수되었다.

현저하게 탁솔 및 총 탁산 생산성을 향상시키고 또한 더우기, 세포외 생성물 축적을 유발하는 특성은 효율적이고 연속적으로 바이오 매스를 재사용하고 이후의 정제를 간단히 하는 공정에 중요하다.

7.3 생장 배지 내에서 탁산 생산에 대한 빛의 영향

빛은 식물 세포 배양에서 광합성 뿐만 아니라 다양한 제2차 대사에서 중요한 역할을 한다고 공지되어 있다[사이베르트 및 카드카데(Seibert and Kadkade 1980) 참조]. 실시예 4, 7.1 및 7.2에서 어두운 배양기 중에서 실험을 수행하였으나 본 실시예에서는 빛에 대한 탁수스 키넨시스(Taxus chinensis)배양의 반응을 기술하였다.

7일 배양한 탁수스 키넨시스 세포주 Kl 1g 습윤 중량을 125 ml들이 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 중에 25 ml의 배양 배지A(표2 참조) 중에서 배양하고 회전 진탕기 상에서 120 rpm에서 24 ± 1℃에서 배양하였다. 꼭같이 배양한 플라스크를 하나는 어두운 배양기 중에서 하나는 3 피트 떨어진 표준 그롤룩스(GroLux) 램프 하에 두었다. 램프의 스펙트럼 특성을 그림 3에 나타내었다. 결과를 표7에 나타내었다.

배양물을 빛에 노출하여도 총 탁산 수준 또는 세포외 축적량에는 영향이 없었다. 그러나 탁산 프로파일은 두 처리 배양물 간에 차이가 있었다. 예를 들면, 빛을 조사하며 배양한 세포에서는 어두운 배양기에서 배양한 세포에서 보다 2.8배 많은 탁솔을 생산하였다. 또한 세포외 탁솔의 비율은 어두운 배양기에서 배양한 것보다 상당히 높았다(76% 대 56%). 따라서 빛 처리, 특히 특정 스펙트럼에서의 빛 처리는 탁솔 생산을 위한 배양에서 극히 유용하였다.

[실시예 8]

유발제 (elicitors)

용어 유발제는, 식물 세포 배양물에 첨가할 경우 2차 대사를 증가시키는 생물학적(또는 생물적) 및 비생물학적(또는 비생물적) 기원의 화합물의 경우에 사용한다.

다수의 유발제가 유용한 것으로 판명되긴 하였지만, 대표적으로, 이를 테면, 키토산 글루타메이트의 사용이 본 명세서에 상세히 기술되어 있다. 키토산은 소수의 식물 세포 배양계에서 유발제로서의 사용이 이미 시도되어 왔긴 하지만, 예를 들면 갈변 및 생존능 상실과 같은 수반되는 독성 반응으로 인해 실제로는 사용되지 못하였다[참조: Beaumont 및 Knorr, 1987년], 실로 그러한 독성의 부반응은 문헌에 의하면 다수의 유발제의 일반적 결점이다. 독성의 부 반응을 수반하지 않으면서 특히 탁솔 및 탁산 생합성을 유발시키기 위해 키토산 글루타메이트와 같은 화학적으로 개질된 키토산의 사용은 새로운 시도 방법이다.

7 내지 8일 동안 배지 D 중에서 성장시킨 탁수스 키넨시스(Taxus chinensis) 세포주 K-1 현탁액을 미러클로쓰(miracloth) 필터(제조원: Calbiochem)가 장착된 멸균 부흐너(Buchner) 펀넬을 사용하여 무균 상태로 흡인 여과하였다. 습윤 중량 2 g의 세포를 125 ml들이 엘렌마이어 플라스크 중에서 배지 C (표 2 참조) 25ml 에 무균 상태로 옮겼다. 0.05 % 키토산 글루타메이트 용액을 새로 제조하여 0.22 μ카트리지 필터를 통해 살균 여과하였다. 이 용액 825 μL를 실험 초기에 플라스크에 가하는데, 이는 세포 건조 중량 g당 유발제 165 mg 농도에 상응한다. 플라스크를 암실에서 회전 진탕기 상 110 rpm 및 24 ± 1 ℃에서 배양시켰다. 플라스크를 15일 째에 분해 샘플링하여 성장을 관찰하고 세포 및 배지의 색상 및 세포 생존능을 기록하였다. 동결-건조된 샘플을 실시예 5에 기술한 바와 같이 탁솔 및 탁산에 대해 메탄올-추출하였으며 HPLC로 분석하였다. 이 실험 결과를 표 8에 명시하였다.

유발제로 처리하면 처리되지 않은 대조군에 비해 세포당 총 탁산 생성에 있어서 최적으로 개선(0.53 % 대 0.42 % 건조 중량 탁산)되었다. 유발제의 비독성 특성은 본 발명 및 대조군의 처리에서 관찰한 바 우수한 생존능(75 내지 80 %)에 의해 입증되었다. 실제로, 유발제 처리시 대조군과 비교하여 증가된 건조 중량이 반복적으로 관찰되었다(14.2 g/ℓ 대 10.1 g/l의 건조 중량). 세포 밀도의 증가로 인해 유발제로 처리시 총 탁산의 1.8배 이상이 증가하였다(이를 테면, 75.8 ml/L 대 대조군의 경우 42.4 mg/L).

유발제를 처리하면 탁솔 생합성이 증가하게 되는데, 이러한 증가는 세포 기준(0.098 % 대 0.054 건조 중량% 탁솔, 1.8배 증가) 및 역가 비교(13.9 mg/L 대 5.4 mg/L, 2.6배 증가)시 모두에서 나타난다. 분비 정도는 대조군과 비교한 바 유발제로 처리한 경우 더 높다(85 % 대 72 % 세포외 생성물).

본 명세서에 기술된 유발제 처리에 의해서 탁솔 생성이 증가하게 되고 생성물 프로필이 더 만족스럽게 되며 생성물 분비가 증진되고 세포 생존능이 유지된다. 이들 생성 특성은 탁솔 생성을 위한 세포 배양법의 경우 현저한 개선점을 나타낸다.

[실시예 9]

생산 배지 개발

실시예 6에 기술된 수준을 넘어서도록 탁솔 생성도를 증가시키기 위해, 영양순 수준을 조정하여 특정 "생산 배지"를 제형하였다. 7 내지 8일 지난, 배지 D에서 성장시킨 탁수스 키넨시스 세포주 K-1 현탁액을 미러클로쓰 필터가 장착된 멸균 부흐너 펀넬을 사용하여 무균 상태로 흡인 여과하였다. 500 mg 습윤 중량의 세포를 생산 배지 B 및 C (표 2 참조) 5 ml에 무균 상태로 옮겼다. 암실에서 회전 진탕기 상 100rpm 및 24±1 ℃에서 시간대를 18, 25 및 42일로 달리하여 배양시켰다. 처리물을 분해 샘플링하여 성장을 관찰하고 세포 및 배지의 색상 및 세포 생존능을 기록하였다. 동결 건조된 시료를 실시예 5에 기술한 바와 같이 탁솔 및 탁산에 대해 메탄올-추출하여 HPLC에 의해 분석하였다.

9.1 18일 배양의 결과

탁수스 키넨시스 세포 배양물은 개질된 배지 조성물에서 상당한 정도의 탁산 및 탁솔을 생성하였다. 이 데이타를 표 9에 요약하고, 샘플 크로마토그램을 제4도에 도시한다. 배지 B에서, 순수 탁솔 24.1 mg/l를 함유하는 총 탁산 99.8 mg/l를 생성하였다. 배지 C에서, 탁솔 21.3 mg/l를 함유하는 총 탁산 110 mg/l를 생성하였다. 건조 중량을 기준으로, 세포는 배지 B에서 0.18 건조 중량%의 탁솔을 생성하였고, 배지 C에서 0.065 건조 중량%의 탁솔을 생성하였다.

9.2 연장된 배양

25 및 42일 동안 탁수스 키넨시스 세포(세포주 K-1)을 연장 배양한 후의 탁솔 및 탁산의 생성을 배지 C에서 조사하였고, 결과를 제5도에 요약하였다. 하기와 같은 중요한 관찰 결과를 요약할 수 있다.

(i) 탁수스 현탁 배양물은 상당한 정도의 탁솔 및 기타 탁산을 생성할 수 있다. 42일 후에 0.32 건조 중량%의 탁솔 및 0.62 건조 중량%의 총 탁산을 함유하는 최고의 축적이 발생하였고, 이것은 최종 배지 용량을 기준으로 153 mg/l 탁솔 및 295 mg/l 총 탁산의 적정량에 해당한다. 직렬식 질량 분석기에 의한 샘플의 분석으로 제6도에 도시된 것 처럼 탁솔이 존재함을 확인하였다. MS/MS에 의한 정량은 HPLC와 잘 일치함을 나타낸다.

(ii) 25 및 42일 간의 탁솔 생합성 비율은 17일 동안의 선형 생성량으로 추측할때 대략 7.6 mg 탁솔/l/일이었다. 이 비율은 처음 25일의 생성 비율보다 상당히 높다. 25 및 42일 간의 총 탁산 생합성 비율은 12.3 mg/ℓ/일이었다.

(iii) 생성 배지 배합물은 실시예 7에 기재된 것과 같은 신속 성장 조건과 비교한 특이 탁솔 함량에 있어 45 배 이하의 증가를 유발할 수 있다.

(iv) 생성물 스텍트럼은 불필요한 탁산의 생성을 최소화하면서 목적하는 최종 생성물 탁솔에 대한 생합성에 집중되도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 총 탁산의 12.2 %를 구성한 탁솔이 있는 성장 배지(실시예 7.1 참조)와 대조적으로 25일 후에 탁솔은 총 탁산의 28%를 구성하였고, 42일 후에 탁솔은 총 탁산의 52%를 구성하였다. 생성물 프로파일을 조작하는 이 능력은 이후의 정제 및 생성물 정제-관련 조정 문제를 위한 중요한 영향을 가질 것이다. 예를 들면 탁산 부산물, 세팔로만닌(cephalomannine)의 생성을 억제하는 능력은 수피 조직으로부터 탁솔을 정제하는 것과 비교할 때 이후 정제를 매우 단순화할 수 있다.

(v) 탁수스 세포 배양물에서 상당한 양의 탁솔(42일 후에 87 %) 및 기타 탁산이 분비가 유도될 수 있다. 세포외의 탁솔 및 탁산의 존재가 세포 붕괴라기 보다는 분비에 기인한다는 것은 몇개의 별개의 관찰 결과로서 입증된다. : (a) 25 및 42 일 간에 계속해서 생합성이 일어나는 것은 세포가 생존해 있으며 활성이라는 것을 암시한다. 독립적인 관찰 결과는 생성 배지에서 18일 후에 70% 보다 큰 생존성이 관찰되었다는 것을 보여 주며, (b) 상이한 퍼센트의 상이한 탁산이 분비되었다는 것을 나타낸다. 세포가 붕괴되었다면, 상이한 탁산에 대해 배지에서의 퍼센트가 유사할 것으로 추측된다.

(vi) 세포외의 환경하의 풍부한 생성물 중에서 고비율로 탁솔을 번성시키고 생성할 수 있는 탁수스 세포주의 능력에는 특별한 가치가 없다.

(vii) 또한 이러한 결과가 얻어지는 탁수스 세포주는 높은 세포 밀도로 신속히 성장할 수 있고, 신속한 성장 조건하에서 20 세대 후에 보고된 생산력은 이의 안정성 및 상업적 잠재력을 보여준다.

본 명세서에 기재된 조건하에서 탁수스 키넨시스의 세포주에 의해 생성된 탁솔 및 탁산의 수준은 종래 보고된 결과 보다 35 내지 150배 높다. 예를 들면, Christen 등(1991)은 2 내지 4주의 배양 후 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 현탁 배양에 의해 1 내지 3 mg/l의 탁솔을 생성하였다고 보고하였다. Wickeramesinhe 및 Arteca(1991)는 탁수스 메디아(Taxus media)의 세포 배양물에서 0.009 건조 중량%의 탁솔을 생성하였다고 보고하였다.

요약하여, 데이타는 탁수스 키넨시스 배양물의 주의깊은 개시 및 선택, 및 특별히 배합된 성장 배지 조건이 높은 세포 밀도로 세포가 신속히 생장하는 것을 유발한다는 것을 보여준다. 이 세포가 생산 배지 조건으로 옮겨졌을 때, 세포는 고생존성을 유지하면서 연장된 기간 동안 상당한 수준의 탁솔 및 기타 탁산을 생합성 할 수 있고 분비할 수 있다. 또한 생산 배지와 함께 주기적 배지 교환: 빛 및 유발제를 도입함으로 상승적인 생산력 증가를 얻는다. 이러한 특성은 조직 배양법을 사용하여 탁솔 및 탁산을 생성하기 위한 효과적인 상업적 방법을 위한 중요한 선결 조건이다.

[참고문헌]

Claims

넓은밴드 또는 좁은밴드의 광의 연속적인 또는 단속적인 조사, 배양 동안 탁솔 및 탁산의 주기적인 제거, 배양물의 생장 및 생산 단계용의 동일하지 않은 영양 배지, 및 하나 이상의 유기 질소원, 탁솔의 생합성 전구체, 식물 호르몬, 식물 생장 조절제, 유발제, 활성제, 대사 또는 비대사 억제제 또는 갈변 방지제를 포함하는 하나 이상의 영양 배지의 존재를 하나 이상 포함하는 생장 및 생산물 생성 조건하의 하나 이상의 영양 배지에서 칼루스 및(또는) 현탁 배양물로부터 유래하는 탁수스 카나덴시스 (Taxus canadensis), 탁수스 쿠스피다타 (T. cuspidata), 탁수스 바카타 (T. baccata), 탁수스 글로보사 (T. globosa), 탁수스 플로리다나 (T. floridana), 탁수스 월리키아나 (T. wallichiana) 또는 탁수스 메디아 (T. media) 종의 세포를 현탁 배양으로 배양하고, 상기 세포 및 상기 세포 배양물의 상기 배지로부터 탁솔 및 탁산을 회수하는 것을 포함하는, 탁수스 카나덴시스 (Taxus canadensis), 탁수스 쿠스피다타 (T. cuspidata), 탁수스 바카타 (T. baccata), 탁수스 글로보사 (T. globosa), 탁수스 플로리다나 (T. floridana), 탁수스 월리키아나 (T. wallichiana) 또는 탁수스 메디아 (T. media) 종의 세포 배양물로부터 높은 수율로 탁솔 및 탁산을 회수하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 영양 배지가 피클로람을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 영양 배지에 유발제로서 키톤산 글루타메이트가 존재하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 영양 배지가 자극제를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 영양 배지에 대사 전구체 및(또는) 억제제로서 페닐알라닌이 존재하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 영양 배지가 산화방지제, 안정화제, 강화제, 라디칼 포촉제, 및(또는) 환원제를 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 영양 배지가 세포 배양 생장용 및 탁솔 및 탁산 생산용으로 동일한 것인 방법.
제1항에 있어서, 주기적인 영양 배지 교환을 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 주기적인 탁솔 및 탁산의 제거를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 1 단계 또는 2 단계의 배치 공정 또는 주입 배치 공정 또는 반연속 공정 또는 이들의 변형 방법을 사용하여 생장 및 생산물 형성이 달성되는 방법.