【発明の詳細な説明】
タフスス膜種の細胞培養によるタキソールおよびタキサンの増強された生産
技術分野
本発明はタフスス膜種(Taxus 5pecies )の細胞培養によるタキ
ソールおよびタキサンの増強された生産方法に関するものである。
背景技術
タキソール供給問題と可能な解決策
タキソールは最初はパシフィック・イユー(pacific yew ;北米太
平洋産屋のイチイ属の植物)、すなわちタフスス・プレヴイフオリア(Taxu
xbrevifolia) (Wani et al、 1971)の樹皮から
単離されたジテルベノイド・ア)vカロイドである。
タキソールに関心がもたれたのは、米国国立癌研究所(MCI )が大規模なス
クリーニング・プログラムにおいて粗樹皮抽出物が抗腫瘍活性を示すことを見い
だしたときが始めである。それ以来、臨床的試みでタキソールは難治の卵巣癌や
肺癌その他の癌に対して非常に有効であることが確認されている。タキソールは
その細胞毒性の機構が基本的に異なるため、即ち、微小管(m1crotubu
le )の脱型台の阻止によっているため、化学療法における突破口であるとさ
れている(Robinsky et al、1990参照)。
タキソール方程式におけるもっとも気持を挫けさせる変数はこれまでのところ供
給である。−人の患者を治療するのに樹齢300年ないし600年のパシフィッ
ク・イユーを必要とするが、これはタキソールの平均収率が乾燥樹皮および針葉
の約0.01%と低いがらである(Witherup et al、 1990
) 、治療および検査に必要な量のタキソールを生産するには数万本のイチイの
伐採を必要とする。これまで世界の供給のすべてが太平洋化西岸の太古の森林に
生育するこれらのずんぐりした成長の遅い針葉樹を収穫することにより得られて
いる。不運なことに、イチイは伐採搬出によりほぼ絶滅しかけている。保存論者
は、危険にさらされているキタブチフクロウ(Northern 5potte
d owl)その他の野生生物の隠れ家となっている太古の森林に生育する樹木
を大規模に犠牲にすることに対して成功裡に反対運動を展開している。パシフィ
ック・イユーの本数が減っているので、医療研究は将来のタキソールへの希望を
新しい代替供給源にかけている。これまで考慮された3つの供給源は化学合成、
半合成および植物細胞培養である。
タキソールはこれまで全化学合成ができながった大きな、複雑な構造をもつ化学
分子である。従って、簡単な入手可能な薬品から大規模合成することは来る二、
三年間に実行しえるオプションとなることはありそうにない。
大規模生産の可能なオンシ目ンとしては半合成、即ち、農業的に生産されたタキ
ソール前駆体、バッヵチン(baccatin) 、に側鎖を化学的に付着させ
ることである。この側鎖の合成について顕著な発展がなされた(Dennis
et al、 1991) 6側鎖をバッヵチンに結合する方法も開発された(
Dennis et al、 1990;米国特許第4,924,011号;
Ho1ton 1991 ;米国特許第5.015.744号)。しかしながら
、タフスス・プランテーションの針葉からバッカチンを農業的に供給することは
決してとるに足らないことではなく、現在では先の報告(Dennis et
al、 1991.0.1重量%)はバッカチン含有量について最近の報告(W
itherup et al。
1990.0.03重量%)よりもより楽観的であったことがら再評価されつつ
ある。要約すると、化学合成および半合成の世界的な化学療法用途にタキソール
を供給する能力は確保されていない。代替生産手段を探求開発する強い理由が存
在する。
本発明はタキソールや他のタキサンを供給するための植物細胞培養に基づく方法
の開発に関するものである。
植物由来の薬品の供給源としての組織培養種々の異なる培養方法における植物細
胞の分裂、成長および二次的中間代謝物を生産する能力は多数のグループによっ
て十分に証明されている。現在、2つの化合物、シコニン(5hikonin)
(赤色染料および抗炎症剤)とギンセンゴシド(ginsengoside)
(東洋医薬の強壮薬)が日本で組織培養方法により生産されている。他の多く
の方法は報告によると製品の市販が間近であり、これらにはヴアニリン(van
illin) 、ベルベリン(berberine ) 、ロスマリン酸(ro
smarinicacid)が含まれる(Payne et al、 1991
)。
タキソールに対する植物細胞培養方法には多くの利点がある。(i)細胞培養方
法は製品の無限、連続的かつ均一供給を保証する。(ii)細胞培養は大きなバ
イオリアクター内で行い環境条件を操作することによりタキソールの過剰生産を
誘発させることができる。
(iii)細胞培養は樹皮や針葉に比べて生産する化合物のスペクトルがより単
純であり、分離精製がかなり単純化する。(iv)細胞培養方法は農業に基づく
方法よりも需要の急速な変化に迅速に適応することができる。
(V)キソールを供給する以外にも細胞培養方法はタキソールその他の活性誘導
体に半合成的に転換することができるバッカチンのようなタキサン前駆体をも生
産することができる。
無菌大規模植物細胞培養は本来的に高価であり、細胞培養方法が商業的に適切と
なるのはこれらのコストが迅速な細胞成長と高い中間代謝物生産性によって相殺
される場合に限られる。あらゆる植物種および標的中間代謝物は異なっており、
異なるアプローチが特定の系ごとに必要となる。本発明はタキソールおよびタキ
サン生産のための迅速に成長し生産性の高い植物細胞培養を得るための創造的か
つ熟練したアプローチに焦点を合わせている。
木本植物および針葉樹の組織培養に伴う問題文献を歴史的に概観すると、草本植
物は培養において比較的容易に操作されてきたのに対して、木本植物および針葉
樹の培養を達成するのは困難であった。
二次的中間代謝物生産裸子植物−および針葉樹培養の成長は一般に低い。例えば
、BerlinおよびWitte(1988)はTsuja occident
alisの培養が18日間で約30%だけそれらのバイオマスな増加させたこと
を見い出した。Van Uden et al、(1990)はCa1litr
is drummondiiの懸濁培養について21日間でバイオマスの増加が
20−50%であることを報告した。Westgate et al。
(1991)は裸子植物Cephalotaxus harringtonia
の懸濁培養について約10日の倍加時間を報告した。Bornman(1983
)によりまとめられたように、とうひ属植物の懸濁培養(Picea abie
s )用の培地開発に向けて非常に多くの努力がなされた。この集合的仕事によ
り裸子植物の懸濁培養は実際に迅速な成長をすることができるが、一般的原則は
適用することができず、異なる細胞系統に対する培地処方は独立に最適化しなけ
ればならないが実証されている。
裸子植物培養の二次的中間代謝物の生産性を概観するとこれも草本種に比べて迅
速な生合成を誘発するのは困難であることを示している。たとえば、セファロタ
フスス バリントニア(Cephalotaxusharringtonia)
はテルペン・アルカロイドを親植物で見られるレベルの1%ないし3%のレベル
で生産した(Delfel and Rothfus 1977 ) 、成功し
たエリシテーション(elicitation )でさえも、He1nstei
n (1985)は親植物で生産されたレベルに近づくことができただけである
(約0.04乾燥重量%総アルカロイド)。
Van Uden et al、(1990)は針葉樹Callitrisdr
ummondi iの懸濁培養を誘導してポドフィロトキシン(podophy
llotoyj、n )を生産させることができたが、針葉により生産されるレ
ベルのわずか十分の−のレベルだけであった。Tsuja occidenta
lisの顕著なレベルのモノテルペン類(10−20mg/L )およびジテル
ベノイド・デヒドロフェルギノール(diterpenoiddehydrof
erruginol ) (2−8mg/L )を生産する能力はBerlin
et al、 (1988)により納得のゆくように実証されている。しかし
ながら、これらの結果は成長の遅い(18日間でバイオマスが30%増加)、低
細胞密度(1リットル当り5ないし7グラムの乾燥重量)の培養で得られたもの
である。
タキソール生産用細胞培養:従前の努力裸子植物懸濁培養における迅速な成長お
よび高生産性を達成することが困難であることはタキソール生産についてのこれ
までの3編の報告に反映されている。
Jaziri et al、(1991)は最近Taxus baccataの
カルス培養を誘導したが、彼らの免疫吸着アッセイを使用してタキソールを検出
することができなかった。
1icl(rHesinheおよびArteca(199])はTaxus m
edia(eV、 11icksii)のカルス培養中に0.009%の乾燥重
量のタキソールが存在することを報告したが、倍加時間、細胞密度、報告された
タキソールが生産される時間の尺度は示されていない。
米国特許第5.019.504号(Christen et al、 1991
)はTaxus brevifoliaの細胞培養によるタキサンおよびタキサ
ン様化合物の生産および回収を記載している。
これらの研究者は2ないし4週間の時間枠内で1ないし3 mg/Lのレベルの
タキソール生産を報告した。彼らはまた「3−4週間で5ないし10倍」の細胞
マスの増加を報告したが、これは約7ないし12日の倍加時間に相当する。
発明の開示
本発明者らはタキソール、タキソール様化合物またはタキサンはすべてのTax
us属の種即ち、プレヴイフォリア(brevifolia) 、カナデンシス
(canadensis) 、カスビダータ(cuspidata ) 、バッ
カータ(baccata ) 、グロボーサ(globosa ) 、フロリダ
ーナ(floridana ) 、ワリキアーナ(wallichiana )
、メディア(medfa )およびシネンシス(chinensis )から
非常に高収率生産することができることを見い出した。特に、本発明者らはTa
xuschinensis種は迅速に成長することができ、非常に高いレベルの
タキソールおよびタキサンを短期間に生産することができることを見い出した。
Christen et al、 (1991)に記載の発明を改良して、本発
明者らはここに異なるタフスス膜種からの細胞培養は迅速かつ効率的に誘導する
ことができると共に、人工栄養培地上にうまく成長させることができ、しかも同
じ化学療法的に活性なタキサン・アルカロイドが無傷の植物体におけるように細
胞培養中に生産されることを発見した。
さらに、本発明の方法により従前に報告されたよりもずっと短い時間枠内でタキ
ソールを得ることが可能である。Taxus chinensis種では、本発
明者らは細胞を操作して他のTaxus属種の組膜種養から得られる量をはるか
に越える量のタキソールを生産することができた。さらに、Taxus chi
nensis細胞培養の成長速度はChristen et al、 (199
1)に記載のTaxus brevifoliaに対するものよりも顕著に高(
,3ないし6倍である。
本発明の目的はTaxus属の種々の種(スペシーズ)からの細胞培養を迅速か
つ効率的に誘導することを含む。
本発明の目的は迅速な成長、高い細胞密度および高い細胞生存能力を助成する特
別の環境条件を形成することを含む。本発明で達成された成長特性は従前の結果
を顕著に上回っている。
本発明の目的は(a)栄養の濃度の注意深い操作、(b)光の使用、(C)定期
的な培地交換のプロトコルの使用、(d)エリジター(elicitors)の
使用によりタキソールとタキサンの迅速かつ長期間の生合成および分泌を誘導す
る能力を含む。
本発明の目的は培地処方と環境条件を変えることにより生産されるタキサンのプ
ロフィルを操作する能力を含む。特に、細胞は優勢なタキサン生産物としてタキ
ソールを生産するように馴らされた。さらに、副生産物であるセファロマンニン
(cephalomannine)の生産が抑制され、それにより高価かつ重要
な下流の分離精製問題に対するニレガントな生物学的解′決を与えている。
本発明の目的はそれ自体薬理作用を示すか、あるいは薬理作用を持つ化合物に修
飾または転換することができるタキソール以外の種々のタキサンを生産する能力
を含む。
本発明の目的はTaxus chinensisの細胞培養を誘導して野生の植
物体で生産されるレベル(0,003ないし0.03%乾燥重量、XuLiu
1991)をはるかに越えるレベルのタキソール(0,32%乾燥重量)を生産
するように誘導する能力を含む。
図面の簡単な説明
第1図は培地Aにおける典型的なバッチ成長サイクルに対するTaxus ch
inensis懸濁培養系統に−1のバイオマス増加を示す。誤差バーは2つの
フラスコから測定した標準偏差を表わす。
第2図は15日間の実験において第9日と第12日に行う培地交換のタキソール
(A)および総タキサン(B)の生産性への効果を示す。各ボックス内の数字は
生産物が生産される時間間隔(日数)を表す。セル内のボックスの塗りつぶし部
分は実験誘導時の接種細胞の中に存在するタキソールまたは総タキサンを表す。
処理はすべて二重に行った。第2表に示すようにTaxuschinensis
懸濁培養系統に−1を培地Aとともに使用した。
第3図は実施例7.3で使用した標準グローラックスランプ(GTE 5ylv
ania、 Danvers、 MA )のスペクトル特性を示す。
第4図はTaxus chinensis懸濁培養系統に−1におけるタキサン
生産を示す、10分ないし40分のクロマトグラムの部分を示す0選択されたタ
キサンのピークのダイオード・アレイ・スキャンは特徴的なタキサンのU■吸収
スペクトルを示し、ピークは227nmである。
第5図はTaxus chinensis懸濁培養系統に−1を培地C中で長期
間培養して生産されるタキソールとタキサンを示す。上方のパネルは既知および
未知のタキサンについてのデータを表にしたものであり、下方のパネルは25日
ないし42日の期間におけるタキソールおよびタキサン生産の増加量を表したも
のである。
第6図は細胞培養上清中のタキソールのMS/MS確認を示す。パネルAは真正
タキソールのイオンスプレーAPCIマススペクトルを示し、パネルBは親ピー
クの娘イオンスペクトルを示す(m/z871=タキソール十NH4,”)。パ
ネルCは粗細胞培養抽出物からのイオンスプレーAPCIマススペクトルを表し
、タキソールのm/z854および871特徴を示す。パネルDは対応する娘ス
ペクトルm/z871を示し、細胞培養上清中にタキソールが存在することの明
瞭な証拠を提示している。
発明を実施するための最良の形態
植物は長らく製薬および特殊薬品の材料源となってきた。これらの製品は典型的
には収穫された植物材料の抽出または化学合成により得られた。タキソールは最
近天然物のスクリーニングから出現したもっとも重要で可能性の高い抗ガン剤の
一つとなった。
本明細書において使用されるように、タキソールおよびタキソール様化合物、ま
たはタキサン、はタキサン環を有する化合物を記述するために互換的に使用され
る。これらの化合物はそれ自体抗新生作用を持っていてもよく、修飾されて生物
活性化合物を生じてもよい。
本明細書において使用されるように、「カルス」という用語は構造的に未分化で
あり固体培地上に培養される培養された植物細胞の塊を記述するのに使用される
。本明細書において使用されるように、「懸濁培養」という用語は液体栄養培地
中に分散された構造的に未分化の細胞を記述するのに使用される。懸濁培養は種
々の段階の集合状態にある細胞を含むと了解される。集合体のサイズの範囲は本
発明において記載されているサスペンションにおいて出会うが、サイズは直径数
十ミクロン(単一細胞または集合した数個の細胞)から数十個の細胞からなる直
径数ミリメートルの集合体までの範囲である。
本発明において有用な植物材料は既知のすべてのTaxus属の種即ち、プレヴ
イフォリア(brevifolia)、ナデンシス(canadensis)
、カスビダータ(cuspidata ) 、バッカータ(baccata )
、グロボーサ(globosa ) 、フロリダーナ(floridana
) 、ワリキアーナ(wallichiana ) 、メディア(media
)およびシネンシス(chinensis )から得られた。特に、本発明者ら
はタフスス・シネンシス(Taxus chinensis)を短かい培養時間
で顕著量のタキソールおよびタキサンを生産し、所望の化合物を培地中に連続的
に分泌する能力を有するものとして同定した。
本発明者らの見出したところによると、特定のタキソールの含有量は植物種によ
って変動し、同じ種内では組織源と特定の樹木個体によって変動する。高収率の
タキソール生産源を選択することは治療用途のタキソールを十分量提供するため
の重要な第一のステップである。
タフスス細胞系統の誘導
タフスス植物材料は全北米からおよび他の大陸からも集めることができる。培養
は適当なタフススの組織を成長のために選択することによって誘導される。この
植物の樹皮、形成層、針葉、茎、種子、きゅう果(cone)および根を含む任
意の部分からの組織をカルスを誘導するのに選択することができる。しかしなが
ら、タキソールの収率な最適にするためには、針葉および植物部分の分裂組織領
域が好ましい、最も好ましいのは新しく成長した針葉(例えば工ないし3力月令
)であり、これらは一般に浅緑色により同定することができる。「新しく成長し
たJ (new growth)という用語は広くその年の成長シーズン内の植
物の針葉生成を意味するものとして意図されている。
培養の汚染を防止するために、組織は培地に導入するに先立って表面滅菌しなけ
ればならない。任意の従来の滅菌技術例えば[クロロクラスJ (Chloro
x )(Chlorox社の所有する洗剤の商標)処理が効果的であろう。さら
に、セフオキシチン(cefoxitin )、ベンレート(benlate
) 、クロキサシリン(cloxacillin 、アンピシリン(ampic
Hlin) 、ゲンタマイシンサルフェート(gentamycin 5ulf
ate)、フォスフォマイシン(phosphomycin)のような抗微生物
剤を植物材料の表面滅菌に使用してもよい。
カルス成長
培養は典型的に成長形態、生産性、生産物プロフィルその他の特徴において変異
性を示す。個々の細胞系統は成長培地の構成成分に対する好みが異なるので、多
くの異なる成長培地をカルスの誘導および繁殖に使用することになるかも知れな
い。
適当な培地組成は培養する種によって変わる。異なる種に対する好ましい培地は
第3表にリストされている。例えば、他のものも使用することができるが、タフ
スス・シネンシス(Taxus chinensis )用の2つの好ましい成
長栄養培地はAとDである。これらの培地は第2表にリストされた成分を含有し
ているのだ好ましい。例えば、培地Aを使用するときは、成長ホルモンまたは調
節剤が培地中に1 ppbないし10ppm 、好ましくは2 ppbないし2
ppm、の量で導入される。培地りを使用するときは、成長ホルモンまたは調節
剤が培地中に19pbないし10ppm 、好ましくは2 ppbないし21)
I)IQ、のレベルで導入される。他の培地成分の量は第2表に示されている濃
度の10分の1ないし3倍であるが、第2表に示すレベルで導入するのが好まし
い。
サスペンション成長
タフスス懸濁培養は他の植物細胞培養と同様に迅速な成長速度および高細胞密度
の能力を有する。しかしながら、最適条件は細胞系統ごとに変動するため、与え
られた細胞系統に対する迅速な最適化に導(方法を考慮する必要がある。
種々のタフスス膜種の始原培養は第3表にリストされているマクロおよびミクロ
栄養、有機炭および成長ホルモンを含有する培地に移すことにより継代培養する
。量は一般に次の範囲である。すなわち、第2表に示す各培地成分の10分の1
の濃度から3倍の濃度までである。好ましいレベルは第2表にリストされている
ものである。
液体培養は空気に曝され、好ましくは振とうその他により穏やかに動かして空気
を培地に導入するか、あるいは管を通して空気を培養器に導入してもよい。培養
は適当な成長条件下20℃ないし26℃に維持される。
pHは約3ないし7、好ましくは4ないし6であってもよい。培養は完全な暗黒
から種々の期間の完全な明光(狭いバンドおよび/または広いスペクトル)の間
の範囲の光条件下で成長することができる。露光下の培養において総タキソール
生産が最も高いので、これが好ましい。典型的な光強度条件は約100ないし8
、000フツトカンデラ馬力(foot candle power )である
。
懸濁培養は継代培養から1ないし8週間維持されるが、その後培養の成長は減少
する。培養は成長培地を例えば濾過により除去することにより収穫される。収穫
された培養は秤量し、例えば凍結乾燥により乾燥し、微粉末に粉砕し、従来の溶
媒抽出技術を使用してタキソールを抽出することができる。
倍加時間はバイオマスの経時的増加をモニタすることにより、あるいは単に継代
培養中に成長指数をモニタすることにより測定されている。最大乾燥重量15−
24グラム/リツトルが達成された。種々のタフスス膜種サスペンションの成長
特性が実施例4に詳述さ細胞および培地からのタキソールとタキサンの抽出・回
収方法は従来の技法に従って行われ、実施例5に詳細に述べる。イムノアッセイ
(ELISA )技法は主に市販キット中のハワイ・バイオテクノロジー社によ
り供給されたプロトコルに従った。強力液体クロマトグラフィー法は実施例5に
詳述するように既存のプロトコルを少し変えた。本発明において使用した条件下
では、解偉度のよいタキサンのピークが得られ、精確な検出と定量ができた。非
タキサン成分が一緒に溶離する可能性があるため、タキサンと思われるピークご
とにスペクトルの純度をダイオードアレイにより検査してからピーク領域を統合
した。タキサン標準品の滞留時間を実施例5にリストする、サンプル・クロマト
グラムを第4図に含めた。
生産培地条件
本明細書において使用されるように、「栄養培地」という用語は植物細胞カルス
および懸濁培養の培養に適した培地を記述するのに使用される。「栄養培地」と
いう用語は一般的であり「成長培地」と「生産培地」の双方を含む。「成長培地
」という用語は培養細胞の迅速な成長に有利な栄養培地を記述するのに使用され
る。「生産培地」という用語は培養細胞のタキソールおよびタキサンの生合成に
有利な栄養培地を指称する。成長は生産培地で起きることがあり得るとともに、
生産が成長培地で起きることがあり得るし、単一の栄養培地中で最適の成長と生
産が起きることがあり得ることが了解される。
栄養培地の一定のクラスの添加物は本発明において特殊な名称で指称されており
、本明細書中に定義されている0本明細書中において使用されているように、「
抗褐変剤J (anti−browning agents)という用語は細胞
培養の間に色素が形成さへるのを防止するために栄養培地に添加される成分を指
称する。これらの色素には一般に細胞の成長、生存能力および生産物の形成に有
害な効果を有すると観察されているフェノール化合物およびそれらの関連化合物
が含まれる。本明細書中に使用されているように、「生合成前駆体」という用語
は栄養培地へ添加された化合物であって細胞により代謝・導入されてタキソール
およびタキサンになるものを記述するのに使用される。本明細書中に使用されて
いるように、「代謝阻害剤J (metabolicinhibitor )と
いう用語は栄養培地に添加された化合物であって特定の生合成経路を妨害するも
のを指称する。例えば、代謝阻害剤はタキソールと初期の生合成前駆体について
競争する異なる経路を阻止することによりタキソール生合成を高めるのに使用す
ることができる。本明細書中において使用されるように、スチムレータ(刺激剤
)またはアクチベータ(活性化剤)という用語は栄養培地に添加された化合物で
あって特定の生合成経路、例えばタキソール生合成に導く生合成経路を刺激また
は活性化するものを記述するのに使用される。上述の添加物の作用の機構は完全
には分かっていないことが了解される。懸濁培養において二次的中間代謝物の形
成は成長と同時に起きるならば、この中間代謝物は成長関連と呼ばれ、単一の処
方で良好な成長と高レベルの生産を達成するのに十分であることがある。他の多
くの系では、迅速な成長と高い生産物形成が同時には起きないことが見出されて
いる。そのような場合は、成長期と生産期が分離されており、各期用の培地が独
立に開発されている(Payne et al。
1991により再調査された)、、タフスス・シネンシスにおけるタキソールと
タキサンの生産の場合、成長と迅速な生産物形成は分離されており、独立の培地
がそれぞれについて開発されていた。しかしながら、単一の成長/生産培地をこ
の培養のために処方してもよい。
本発明において開発された生産培地は総タキソールおよびタキサン形成を増加さ
せるだけでなく細胞生合成をタキソール生産に振り向ける。さらに、セファロマ
ンニンのような阻害的副生物の生産が樹皮組織と比べて最小限である。本発明に
おいて開発された生産培地は、また、細胞の長期生存能力および生合成を促進し
、さらに高レベルの生産物を細胞外培地中に分泌させる。これらの特徴は効率的
な商業規模のタキソール生産方法の操作に非常に重要である。
他のものも使用することができるが、種々の種に対する好適な生産培地を第5表
に示す。例えば、他のものを使用することができるが、タフスス・シネンシス用
の好適な生産培地はBおよびCである。これらの培地は第2表にリストされた成
分を含有しているのが好ましい。個らの培地は主要および微量無機塩類、有機物
および成長ホルモンもしくは成長調整物質を含有しているのが好ましい。量は一
般に以下の、第2表に示す各培地成分の濃度の10分の1ないし3倍の範囲内で
ある。しかしながら、好適なレベルは第2表に示すものである。培地Bを使用す
る場合、成長調整物質は培地中にO,ippmないし20ppm 、好ましくは
1 ppmないし10ppmの量で導入される。培地Cを使用するときは、成長
調製物質はO,lppmないし5 ppmのレベルで導入するのが好ましい。
この培地に他の従来の塩組成物(例えば有機物、ビタミン、アミノ酸、前駆体、
アクチベータ、および阻害剤)の置換、種々の成分、成長調整物質の追加または
削除、あるいは割合の変更のような修飾をすることができる。
非揮発性の溶解された栄養物質以外に、気体状成分、主として酸素、二酸化炭素
、エチレン(植物ホルモン)が成長および生産物形成に重要な役割を果たしてい
る。2つのパラメータが重要である。成長とタキソール形成に有利な溶存ガス濃
度は明らかに重要である。それは該濃度がリアクタの操作条件を規定しているか
らである。さらに、消費または生産速度をリアクタ設計に取り入れて最適の特定
濃度が維持できるようにする必要がある。
呼吸における重要性以外に、酸素は二次的生合成速度に劇的な影響を及ぼすこと
ができる。二次的生合成経路の酸素要求工程に対する高飽和定数は細胞がリアク
タ内で高酸素レベルに曝されることを要求することがある。高成長速度を維持す
る際のCO□補給の重要性が文献に示されている。エチレン、植物ホルモン、は
二次的代謝を含めて植物成長および発生のすべての局面において多面発現的役割
を果たす(例えば、Payneet al、 1991参照)。
エリジター
細胞培養中のタキソールおよび他の関連タキサンの収率を改善するために、本発
明者らは数多くのアプローチを行った。生産性を高めるのに使用されたこれらの
アプローチの一つはいわゆるエリジターを使用することである。本明細書におい
て使用されるように、エリジターという用語は生物学的お起源よび非生物由来の
化合物であって植物または植物細胞培養に適用されたときにに二次的中間代謝物
生産の増加を引き起こすものに対して使用される(Eilert 1987;
Ebe11984、およびDarvill et at、 1984 ) o多
(の異なる化合物が起源と細胞の代謝に対する態様とに応じてエリジターとして
作用することができる。本発明においては、本発明者らは2種類の主要なエリジ
ター類=1)通常、選ばれたグループの真菌、バクテリア、酵母からの抽出物ま
たは濾過物並びにそれらの精製フラクションを含む生物エリジター類、2)化学
ストL・ス剤および生物由来の若干の化合物を含む非生物エリジター類を使用し
た(第1表にリストしたエリジター類参照)。
Christen et al、 (1991)は親近のエリジター類の使用お
よびTaxus brevifoliaのサスペンションによるタキソールの生
産のために選ばれた化合物を報告している。しかしながら、エリジター処理によ
るタキソール蓄積のレベルの増加は特に記されていない。
一般に、エリシテーション(細胞培養中にタキサンが蓄積することおよび培地中
へそれを分泌すること)が起きる程度はエリジターごとに、かつ種ごとに異なる
ものの、いずれの種類のエリジター類もともに有効である。最高の生産増加はグ
ルタミン酸キトサン、リケナン、フェルリン酸および安息香酸を用いて達成され
た。キトサンとリケナンは微生物の細胞壁由来の複合多糖類である。キトサンは
単独で使用すると培地に不溶性であり、毒性があり永久的な細胞障害を引き起こ
す。他方、グルタミン酸キトサンは培地に容易に溶解し、細胞の生存能力に影響
しない。フェルリン酸と安息香酸は生物由来の合成された薬品であり、一般に生
物学的系において抗酸化剤として使用される。
エリジター類は溶存ガスと多(の仕方で相互作用する。、a2素要求性はエリシ
ブ−ジョンをすると変わることがある。負傷反応としての呼吸速度の増加は植物
細胞培養において普通に観察される。重要なのは、エリジター類はエチレンを介
してそれらの作用を媒介する。そのような場合、微生物エリジター標品なエチレ
ンと置き換えて、多分このエリジター標品中の他の微生物成分と結びついた毒性
を予防することが望ましいことがある。
エリジターおよび代謝ストレス剤は、本発明に従い、エリジター特異性および濃
度、時機および継続時間を培養時間と培地成分の関数として算定することにより
タキソールの生産および組織培養中への分泌を最大にするために使用することも
できる。
生産性を向上させるための迅速な培地交換実施例7.3に記載したように、使用
済み培地の除去および新しい培地の補充を3日おきに行うと総タキサンおよびタ
キソールの生産が顕著に向上するのに寄与するとともに、細胞外生産物の量の増
加にも寄与する。
培地交換の刺激効果はその場生産物の除去によっていたことが考えられ、フィー
ドバック阻害および生産物の分解を防止するものと思われる。その場生産物の除
去の二次的中間代謝物の生産および懸濁培養への分泌に対するそのような積極的
効果は、就中、RobinsおよびRhodes (1986)ならびにAsa
daおよび5huler(1989)により報告されている。使用済み培地を定
期的に除去すると上述の利点が取り入れられ、さらに培地から他の非タキサン系
阻害成分(フェノール化合物のような)を除去することにより二次的生合成を抑
制するのに役立つことがある。
新しい培地を活発な生合成を行いつつある細胞に補充すると枯渇した必須栄養物
質を提供することにより生産を向上することもある。例えば、Miyasaka
etal、(1986)はサルヴイア・ミルチオリザ(Salviamilt
iorhiza )の定常期の細胞を刺激してジテルペン中間代謝物であるクリ
ブトタナヒノンとフェルギノールを生産させることができたが、これは単に培地
にスクロースを添加することによって行われた。推測では、定常期における炭素
の制限により生合成が停止したものと思われる。本発明において使用する定期的
培地交換プロ1−コルは上述のファクターの何れの結果としても有益であると考
えられる。
交換される培地の量、交換の頻度、および補充される培地の組成は変えることが
できるものと了解される。
定期的培地交換により生合成および分泌を刺激することができることは連続、半
連続またはフェッドーパッチ(fed−batch )方式の効率的な商業的方
法の設計および実施に対する重要な示唆を与える。
光
高等植物にとって光は無傷の植物および細胞培養のいずれにおいても二次的代謝
における有力なファクターである。光の強度と波長はともに重要である(Sei
bertおよびKadkade 1980) 、例えば、フラボノイドおよびア
ンドシアニン生合成は通常高強度連続光により促進されるが、暗所培養体は他の
中間代謝物にとって好ましいことがある。培養された細胞の緑化または光合成能
力の向上も生産物形成または生産物スペクトルを増加させる。本発明者らの研究
は広いバンドの光源および特定の狭いバンドの光源の使用を含む。
実施例7.3に示すように、露光するとタキソールの蓄積が増えるとともに培地
中への分泌が増加する。タキソール生産に対する光の刺激効果はタキサンの生合
成に対する得意な制御機構が存在することを示唆する。
光受容体の性質と光誘導促進の成果学的特徴は未だ明らかでない。
方法実施の態様
植物細胞培養方法に対する実施の態様は栄養物質、細胞および生産物が時間に関
して添加または除去される仕方をいう(Payne et al、 1991
)。
すべての栄養物質が最初に供給され、細胞と生産物を含む培養内容物が培養期間
末に収穫されるときは操作の態様は「一段階バッチ方法」と呼ばれる。バッチ方
法が2つの連続する期、成長期と生産期、に分割されこれら2つの期の間で培地
が交換されるときは、操作の態様は「二段階バッチ方法」と呼ばれる。
「バッチ」操作では、個々の培地添加物と栄養物質は一段階または二段階バッチ
培養の間中、定期的または連続的に供給される。
バッチ培養の内容物の全部ではないが実質的部分が収穫され、連続的成長および
生産のための新しい培地が添加されると、この方法は「反復的ドロー・アンド・
フィル(引き出しおよび充填)操作」に似るため「半連続的方法」と呼ばれる。
新しい培地を連続的に供給し、溢れた培地を連続的に除去すると、この方法は「
連続的」と呼ばれる。細胞がリアクタ内に保持されると、この方法は「潅流モー
ド」と呼ばれる。細胞が連続的に溢れた培地とともに除去されると、この方法は
「連続培養装置型」と呼ばれる。
これらの種々の操作方法のモードは上述のタキソール生産系と適合性を有するも
のと了解される。
(以下余白)
実施例
以下の実施例は、本発明を実施する上で用いられる材料と方法をさらに記載した
ものである。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、いかな
る場合においても本発明を限定するものではない。
実施例1:
カルス誘導
イチイ属(Taxus )植物材料を、い(つかの野生植物および培養植物から
採取した。これらの試料を研究室に到着した時に処理するか、もしくは使用する
まで4℃で保存した。
最初に材料を希釈石鹸溶液で洗浄し、かつ水ですすぎを行った後、クロロクラス
(Chlorox )溶液(1%ハイポクロライド、pH7)に10分間浸して
表面の滅菌を行った。滅菌条件下、材料を滅菌水を用いて3回すすいだ。次に、
100mg/Lのアスコルビン酸を含む1%ポリビニルピロリドン(pvp )
溶液中で針葉(needles )を切断した。そして、切断端とともに針葉を
培地E(第2表参照)に置いた。1枚あたり30ないし40の外植体(expl
ants)を含む培地プレートを、24±1℃、暗所でインキュベートした。こ
れらのプレートの観察を毎日実施し、微生物による汚染が生じているかどうかを
調べた。汚染が認められた場合、汚染されていない針葉を新鮮な培地Eのプレー
トに移しかえた。培養20日目までに実質的なカルス形成が観察された。カルス
を外植体から分離し、第3表に示す種々のカルス成長培地に置いた。例えば、タ
フスス・シネンシスのカルスは培地D(第2表参照)に移した。この誘導方法は
、たいへん効率が良く、低い汚染率で高頻度のカルス誘導が得られ、誘導処理し
た外植体のうち90%以上にカルスが認められた。同様の方法を、タフスス・ブ
レビフォーリア、タフスス・カナデンシス、タフスス・カスビダータ、タフスス
・バッカータ、タフスス・グロボーサ、タフスス・フロリダーナ、タフスス・ワ
リチアーナ、タフスス・メジア、およびタフスス・シネンシスに対してつづけて
用いた。
実施例2
カルスの増殖
カルスを外植体から除去するとともに、除去したカルスを24±1℃、暗所で培
養した。10日毎にカルスの健康な部分を新鮮培地に移した。この移植頻度は、
褐変を抑えることおよびカルスの維持期間を延ばすことにとってたいへん重要で
ある。種々のカルスにとって好ましい成長培地および維持培地を第3表にまとめ
た。
実施例3
懸濁培養の誘導
新鮮なカルス材料1gを、各種に適当な液体培地(第3表参照)を25m1含む
エルレンマイアーフラスコへ無菌的に移植した。例えば、タフスス・シネンシス
に対しては培地りを用いた。フラスコをシリコンフオームキャップ(ベルコ、エ
ムジェ−(Bellco、 NJ) )で塞いだ後、回転振どう機に置き、暗所
で24±1℃、120rpmの条件で振とうした。約3ないし10日で懸濁培養
が形成された。初期段階では、ミラクロスフィルタ(カルバイオケム(Calb
iochem)を有するブフナー漏斗によってフラスコの含有物を吸引濾過する
ことにより、培地の交換を行った。細胞の増殖段階では、通常、1〜2g(生重
量)の細胞を新鮮な培地が25m1入った新しい125m1フラスコへ移し、そ
の後退に一回の割合で植え継ぎを行った。
実施例4
懸濁細胞の増殖
代表的な種の懸濁培養における典型的な増殖速度および細胞密度を第4表に示す
。
詳細な例として、タフスス・シネンシス(Taxuschinensis )
Kl系統の生物量(生重量および乾燥重量)の経時的な増加を第1図に示す。最
大増殖速度は、増殖曲線でもっとも急激に生物量が増大した点での傾斜をとって
測定した。タフスス・シネンシスの細胞培養における増殖は、最大倍加時間が2
.5日であった。この増殖速度は、タフスス種懸濁培養に関して以前に報告され
ていたものよりも著しく高い。例えば、クリステンらの報告(Christen
et al、 (1991))によれば、培養3ないし4週間後で生物量が5
〜lO倍増加するが、これをタフスス・ブレビフォーリアの平均倍加時間として
換算すると7ないし12日となる。
高密度での培養細胞の能力は、細胞培養プロセスの容積生産性(volumet
rjc productivity )を最大限にする上で重要である。タフス
ス・ブレビフォーリアの培養において達成された細胞密度がJリットルあたりの
乾燥重量で1g以下であったのに対し、タフスス・シネンシスの懸濁培養では1
8日間の増殖で密度が1リツトルあたりの乾燥重量で8ないし2Q gまで達し
た。
細胞の生存率は、0.05%フルオレセインジアセテートを含むアセトン(Wi
dholm、 1972 )によって細胞を染色し、倒立虫光顕微鏡(オリンパ
スIMT−2、日本)でもって青色光励起により緑色の蛍光を発する細胞の数を
カウントすることによって決定した。細胞生存率は、増殖用の初めから終わりま
で90%以上であった。
急激な細胞増殖状態にあって高生存率を維持しながら高細胞密度まで細胞を培養
するための能力が、メタノールおよびメタノール様化合物を生産するための植物
細胞培養プロセスの経済的操作にとって重要な前提必要条件である。
実施例5
タキソールおよびタフススの分析
5.1.酵素免疫測定法
タキソール(ハワイ生物工学研究所提供)の酵素免疫測定法(ELISA )に
よる分析を拡大スケールの細胞系統のスクリーニングに用いた。この方法は高感
度(0,1ng/mL)であるが、ポリクロナール抗体を用いるため、他のタフ
ススとのクロス反応性が観察される。
分画コレクションを有する予備的な高速液体クロマトグラフィ (HPLC)は
、未同定のタフススと同様に、10−デアセチルタキソール、7キシロシルー1
0−デアセチルタキソール、セファロマンニン、10−デアセチル−7−ニビタ
キソール、7エビタキソールとの交差反応性を示した。そのようなりロス反応性
にもかかわらず、この方法はタフスス生産物の検出のために非常に有益であると
見出され、多数の細胞を迅速にスクリーニングすることを可能にした。タフスス
の明白な生成を示す細胞抽出をその後、以下に概要を示すHPLC手順を用いて
詳細に分析した。
5.2.タキソールおよび関連したタフススの抽出上清からのタフススの抽出を
、培地中の濃度に依存する2つの方法によって実行した。液体培地中にタフスス
が十分な量存在するとき、サンプルを非常に手早(かつ効率的に準備した。培地
(2mL)を完全に(真空で)乾燥させ、計量した量のメタノール(0,5−2
、0ml、)を加えた。サンプルの完全な溶解または分散を達成するまで、この
混合物を超音波的に撹拌した。
HL P C分析前に遠心分離によって固形物を除去した。十分な検出レベルが
O,1mg/Lであるにもかかわらず、量的な回収は、1mg/Lレベルで得ら
れた。
培養上清中のタフスス濃度が低いときは、その培地を、メチレンクロライドとイ
ソプロピルアルコール(IPA)との混合物(体積比で9:1)で3度抽出した
。抽出ごとの混合物の量は同一とした。乾燥性となるまで有機層を減少し、計量
した量のメタノール(50−250mL )中において組成を再構成した。
0.6mg/Lレベルでのマルチ抽出では、典型的にタキソール、セファロマン
ニンおよびバッカチンIIIの90−95%を回収した。
細胞材料を、入手しだての新鮮細胞を一5℃で冷凍させることによって抽出し、
続いて真空乾燥し、70〜80%のタフススに対する50サイクルのメタノール
ソックスレー抽出を行い、10−15%測定可能な分解物として回収した。固形
培地およびカルスの抽出を、細胞の抽出と同様に達成したが、最終的なメタノー
ル抽出物のメチレンクロライド/IPA混合物と水への分配を常に行った。
5.3.高速液体クロマトグラフィ法
分析的な高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を、CM3500/CM320
0ポンプ、CM4100可変量自動サンプラおよび総合周辺486パーソナルコ
ンピユータに連結した5M500007オトダイオードアレイ検出器からなるL
DC分析二値勾配高圧混合システムを備えた高炭素ロード(1oad)ジフェニ
ルカラム(5upelco製、5mM 、4.6mm X 25cm)で行った
。カラム温度を、Eldex CH150カラムオーブンで35℃に調整した。
タフススの定量的なHPLC分析を、次のような二値勾配溶出の略表を用いて達
成した。
時間 %溶出液A %溶出液B 流速
溶出液Aは、0.015mM ノKHiP04をトリフルオロ酢酸でpH3,5
に調製したものであり、溶出液Bはアセトニトリルである。
上記クロマトグラフィ法としては、トリフルオロ酢酸を含有するリン酸緩衝液お
よび長い勾配が用いられてきた以外は幾つかな公知の方法(ライザラップ(Wi
therup)ら、1989年)に似た方法を用いた。これらの違いは、混合物
からのタキソールおよび他のタフススの解像度を明白に改良するものである。タ
フススに関して観察された相対的な保持時間は以下に示される。タキソールは、
用いられるカラムおよびハードウェアに依存して31分と33分との間に溶出す
る。
化合物 相対的保持時間
lO−デ1セチルバフカチンIII 0.38ハツカチンIII 0.56
7キシロシルー10− 0.80
デア士チルタキソールC
10−デアヤチルタキソールG O,87七7707ンニン 0.94
10−デアセチル−7−
ニビタキソールG O,9g
タキソールC1,00
7エビタ〜ソール 1.12
タキソール、セファロマンニンおよびバッカチンIIIの保持時間を、国立ガン
研究所から入手した真正サンプルを用いて決定した。上記に掲げた他のタフスス
の保持時間を、ハウザー化学(Hauser Chemical(Boulde
r Co))によって提供された分析用標準品の保持時間と比較した。既知のタ
フススの同定は、保持時間および紫外線スペクトル比較を基礎とした。タキソー
ル、セファロマンニンおよびバッカチンIIIの定量は、真正材料から決定され
た応答因子を基礎とした。10−デアセチルバラ力チノIIIの定量は、バッカ
チンIIIに関して決定された応答因子を用いて行われた。残りのタキソール誘
導体の定量は、タキソールに関して測定された応答因子を基礎とした。
各標準品(lomL)を注入しく初期に標準品を注入した後に3または4のサン
プルを注入し)、上記3成分の各々の領域を合わせた。各成分に関する応答因子
は最小二乗法による分析データの直線によって得られた。10mLの各サンプル
を注入し、注入ごとの量を標準データの回帰曲線を基礎として算出した。これら
の結果をリッター当たりまたは乾燥重量%の量に換算した。第4図は、上清サン
プルの典型的なりロマトグラムを示す。
5.4.タキソールのMS/MS確認
細胞培養の上清中のタキソールの同定を、MS/MS法(第6図において示した
)を用いて確認した。その方法は、フローインジエクシ目ンをイオンスプレィ大
気圧での化学的イオン化に組み合わせるものである。第6図に掲げられたデータ
を得るために用いられた手順の詳細は次のようである。マススペクトロメータ二
人気圧イオン化源を備えた5ciex API 3のトリプル四重極質量分析計
を用いた。窒素をカーテンガスとして用い、アルゴンをCIDスペクトラのため
の衝突ガスとして用いた。インタフェース:イオン蒸発イオン化(Ion Ev
aporation Ionization (Electrospray))
によってイオンを生産するイオンスプレィインタフェースを用いた。ゼロエア(
Zero air)を霧吹きガスとして用いた。LCボンブユニ5μLフ
二重シリンジポンプを用いた。溶媒: 50150のアセトニトリル/H20を
2mMと、NH40Ac+ 0. 1%蟻酸を用いた。注入量=5μL0フロー
インジェクション分析によってとられた全スペクトラ。この方法は、細胞培養サ
ンプルにおけるタキソールの存在のための明確な確認を与え、HPLCによる結
果ときわめてよく一致する定量結果を与えた。
実施例6
種々のスペーシーズ(species:種)によるタキソール生産
種々のタフスス( Taxus )スベーシーズの細胞培養によって生産された
タキソールは第5表に要約されている。カルスを特定の固体培地上に各スペーシ
ーズごとに置き、20日間、暗所で培養した。細胞および培地を乾燥し、共にメ
タノール抽出し、上記に示したELISAまたはHPLCのいずれかの方法によ
って検定した。タフススキネシス(Taxus chinesis)培養で得ら
れた結果を実施例7および8にさらに詳述する。
実施例7:
7、1.成長培地中での生産
タキソールおよび同族のタフススの生産は、成長培地A中に送り込まれた最初の
2日間の内に始まった。
観察された最大タキソールは、155日目もので、8.81μg/フラスコであ
り、これは0.44mg/Lのタキソールに相当するものであった。その46.
1%はその細胞外の培地中に存在した。155日目おいて、テキサンの合計濃度
は、72.87μg/フラスコまたは3.6g/Lであり、その58.6%はそ
の細胞外の培地中に存在した。細胞の生育能力は蛍光染色法による測定で常に9
0%以上であり(実施例4)、これは細胞外のタキソールおよびタフススの存在
は細胞溶解が原因というよりはむしろ分泌によるものであったことを示唆してい
る。細胞がタキソールおよびタフススを分泌する能力は、連続運転の重要な局面
となるものである。
7.2.生産性促進のための培地交換
タキソールおよびタフススの生産性における大幅な改良は、9日目において成長
培地Aを無菌状態で吸い出し、新鮮な培地と交換して、122日目この手順を繰
り返すことによって、得られたものである。この実験は155日目中止し、その
結果は第2図に示した。培地交換による生産性の大幅な増加は、第6表にまとめ
られている。生産されたタキソールおよびタフススの合計量は、培地の交換をし
7た場合では、培地交換をしない場合に比較して、約4.6倍高かった。重要な
ことには、培地交換処理をしない場合に比較して、約4.9倍高いタキソール、
および約5.9倍高い合計タフススが、細胞外培地内において、回収された。
タキソールおよび合計タフスス生産性を大幅に促進し、そして、さらに細胞外の
生産物蓄積を引き起こす能力は、再使用バイオマスによる効果的な連続工程の運
転と簡略化された下流側の精製(downstreampurificatio
n)浄化とにとって重要である。
7.3.成長培地中のタフスス生産における光の効果光は、光合成にばかりでな
く、植物細胞培養物内での二次代謝の様々な局面においても、重要な役割を果た
すものとして、知られている( 5eibertおよびKadkade1980
年)。実施例4.7.l、および7.2に記載された実験は、暗所にて処理され
たが、Taxuschinensis培養物の光に対する反応をここに説明する
。
Taxus chinensis系統に−1の7日経過後のとりたての重量が1
グラムの細胞を、125m1のエルレンメイヤーフラスコ内の25m1成長培地
A(第2表参照)中に接種し、回転数12Orpmの旋転層とう器上で24±1
℃で培養した。同じ二つのフラスコの一方を暗所に置き、他方を3フイートの距
離にある標準GroLuxランプの点灯下に置いた。このランプの特性は第3図
に示した。
結果は第7表に示した。
培養物を光に曝しても、タフススの合計レベルまたは細胞外蓄積の量に影響しな
かった。しかし、タフススのプロフィールには、前記の二つの処理フラスコにお
いてはかなりな変化があった。例えば、光の中で培養した細胞は、暗所で培養し
た細胞のより2.8倍高いタキソールを生産した。また、細胞外タキソールの割
合は、暗所培養におけるものより、かなり高いものであった(76%対56%)
。したがって、光を用いた培養は、特に固有スペクトル特性で、タキソール生産
の細胞培養工程において、非常に有益となろう。
実施例8:
エリシタ−(elicitors )
エリジターという用語は、植物細胞培地に添加されると二次代謝の増加をもたら
す、生物学的な(または生体の)および非生物学的な(または非生体の)起源(
origin)の化合物に対して用いられる。
数多くのエリジターが有益であると判明しているが、ここでは、代表的な説明可
能な例を、すなわち、グルタミン酸チトサン(chitosan glutam
ate)を詳しく説明する。以前にチトサンがいくつかの植物細胞培養物システ
ムにおけるエリジターとして試みられたが、褐変などの有毒反応と生物活性の喪
失とが同時に生じて、その実用を不可能にしている( Beaumontおよび
Knorr19g7年)。実に、このような毒性側の反応は、文献中に報告され
ている多くのエリジターの一般的な欠点である。毒性側の作用を回避しながら、
グルタミン酸チトサンなどの化学修飾されたチトサンをタキソールおよびタフス
スの生合成を誘発するために特に用いることは、新規な研究方法である。
7から8日間、培地りの中で成長したTaxuschinensisラインに−
1の懸濁液を、マイクロクロス(Calbiochem社)フィルターが取り付
けられた殺菌されたバラフナ−漏斗を無菌状態で用いて、吸引濾過した。とりた
ての重量が2gの細胞を無菌状態で125m1のエルレンメイヤーフラスコ内の
25m1の培地C(第2表参照)中に転送した。グルタミン酸チトサンの0.0
5%溶液を新鮮な状態で調製し、0.22ミクロンのカートリッジフィルターに
より濾過滅菌した。この溶液の825μLを実験の開始時に前記フラスコに添加
した。
この溶液量は、細胞の乾燥重量1グラム当たりの165mgのエリジターのレベ
ルに対応している。このフラスコを暗所内の回転数11Orpmの旋転層とう器
上で24±1℃で培養した。このフラスコから155日目破壊的に試料採取し、
成長の観察、細胞と培地の色および細胞の生育能力を記録した。凍結乾燥試料を
、実施例5で説明したように、タキソールおよびタフススを得るために、メタノ
ール抽出し、HPLCにより分析した。
この実験の結果を第8表に示した。
エリジター処理では、非処理の場合より細胞当たりの合計タフスス生産において
幾分かの改善が得られた(タフススの乾燥重量で、0.42%に対して0.53
%)。
エリジターが非毒性であることは、両方の処理において観察された高い生育能力
(75〜80%)から明らかである。実際に、エリジター処理なしの場合に比べ
たエリジター処理での乾燥重量の増加は、繰り返し観察された(乾燥重量で、l
O,1g/Lに対して14.2g/L )。より高い細胞密度では、合計タフス
スの力価で、例えば、エリジター処理しない場合における42.4mg/Lに対
して、誘電体処理では75.8mg/Lのように、誘電体処理の場合の方が、1
.8倍大きい結果となった。
誘電体処理では、タキソールの生合成においては、細胞当たりのタキソールの乾
燥重量で、0.054%に対して0.098%で1.8倍の増加となり、力価の
比較においては、細胞当たりの力価で、5.4mg/Lに対して13.9mg/
Lで2.6倍の増加となり、両方とも増加する結果となった。分泌量については
、エリジター処理しない場合に比べてエリジター処理の方が高かった(細胞外生
産で、72%に対して85%)。
ここで説明したエリジター処理では、タキソール生産の増加、より好適な生産プ
ロフィール、生産物分泌の促進および高い細胞生育能力の維持が、得られる結果
となった。これらの生産特性は、タキソール生産における細胞培養工程の大幅な
改良がなされたことを、表している。
実施例9:
生産培地の開発
実施例6に記載した濃度を越えるようなメタノール生産性の増大を得るために、
養分濃度を操作して特別な「生産培地(production media)
Jを処方する。培地りで増殖する7ないし8日経過したタフスス・チネンシス細
胞系統に−1の懸濁液をミラクロスフィルタ(カルバイオケム(Calbioc
hem)が設けられた滅菌ブフナー漏斗を用いて無菌的に吸引濾過した。生重量
が500mgの細胞を無菌的に5mlの生産培地BおよびC(第2表参照)に移
した。容器を、暗所、24±1℃、110rpmの条件でもって回転振どう機に
より18.25、または42日間にわたってインキュベーションした。
このような処理を施したものに対して破壊的サンプリングを実施し、増殖、細胞
および培地の色、および細胞の生存率を観察記録した。凍結乾燥試料を、実施例
5に記載したようにメタノール処理してメタノールおよびタフサンの抽出を行い
、HPLCでもって分析した。
9.1.18日間培養の結果
タフスス・シネンシス細胞培養は、修正培地組成物に反応することによって顕著
な濃度からなるタフサンおよびメタノールを生産した。結果を第9表にまとめ、
また試料のクロマトグラムは第4図に示した。培地Bでは、精製メタノール24
.1mg/Lとともに全体で99、9mg/Lのタフサンが生成した。培地Cで
は、精製メタノール21.3mg/Lとともに全体で110mg/リットルのタ
フサンが生成した。乾燥重量に換算すると、細胞が生産したメタノールの乾燥重
量は、培地Bで0.18%、また培地Cで0.065%であった。
9.2.延長培養
培養期間を25および42日間として、タフスス・シネンシス細胞(K−1系統
)を培地Cで培養した場合のメタノールおよびタフサン生成を調べた。その結果
を、第5表にまとめた。以下のような重要な観察値を要約することができる。
(i) タフスス懸濁培養によって顕著な濃度からなるメタノールおよび他のタ
フサン類が生産可能である。
42日目で、最終培養液容積にもとづいた153mg/Lタクソールおよび29
5mg/L全タクサンの滴定量に一致する乾燥重量が0.32%のメタノールお
よび0.62%の全メタノールを有する最も高濃度の蓄積物が観察された。第6
図に示すように、タンデムマススペクトロメトリーによるこの試料の分析によっ
てメタノールの存在が確認された。MS/MSによる定量は、HPLCとたいへ
んよく一致した。
(ii) 25日目と42日目とのあいだの17日間にわたるメタノール生合成
速度は、この期間において生産が直線的に行われたと仮定した場合、約7.6m
gタクソール/L/日であった。この速度は、最初の25日間の生産速度により
も顕著に高い。25日目と42日目とのあいだにおける全タフサン生合成速度は
、12.3mg/L 7日であった。
(iii) 生産培地処方によって、実施例7に記載したような急増殖条件の場
合と比較して、特定のメタノール含有量を45倍まで増加させることができる。
(iv)生合成が要求最終産物メタノールに集中するように、生産物範囲を操作
することができる。例えば、メタノールがタフサン全体のうちたったの12.2
%しか占めていない増殖培地(実施例7.1参照)と比較して、メタノールがタ
フサン全体を占める割合が25日目では28%であり、45日目では52%であ
った。生産物範囲を操作するこのような能力は、下流側精製および生産物純度に
関連した制御的問題に対して重大な影響を及ぼすであろう。例えば、タフサンの
副産物であるセファロマンニンの生産を抑制する能力は、樹皮組織からのメタノ
ール精製と比較して下流側の精製を大いに単純化することができた。
(V) 大量のメタノール(42日目で87%)および他のタフサン類を分泌す
るために、タフスス細胞培養が誘導されてきた。細胞溶解によるよりもむしろ分
泌による細胞外メタノールおよびタフサンの存在かい(つかの別個の観察によっ
て確証される。すなわち、(a) 25目から45日口の間に連続した生合成が
起こる。このことは細胞が生存し、かつ活動的であることを示唆している。別個
の観察によれば、増殖培地での培養18日目量降に70%を下回る生存率が認め
られた。(b)異なるタフサンが異なる比率で分泌された。もし、細胞が溶解し
た場合、培地中の比率は異なるタフサン間で類似すると考えられる。
(vi)増殖し、かつタフソールを細胞外環境へ大量かつ高率に生産するタフサ
ン細胞系統の能力は、特に注目すべき価値がある。
(vii) それらの結果が得られたタフサン細胞系統は、高密度になるまで急
激に増殖することも可能である。また、急増殖条件下で20世代後に報告された
生産能を発現する。このことは、それの安定性および商業的潜在能力を証明する
ものである。
本願に記載した条件下でタフスス・チネンシスの細胞系統によって生産されるタ
フソールおよびタフサンの濃度は、以前報告されたものよりも高(,35ないし
150倍である。例えば、クリステンら(Christen etal、 (1
991))は、培養2ないし4週間後のタフスス・ブレビフォーリアの懸濁培養
によって、工ないし3 mg/Lのタフソールが生産されると報告している。ま
た、WLckeramesinhe and Arteca (1991)は、
タフスス・メジアの細胞培養で乾燥重量0.009%のタフソールが生産される
ことを報告している。
要約すると、われわれのデータは、タフスス・チネンシスの培養を注意深く誘導
し、かつ選択することによって、また増殖培地を特別に処方することによって、
細胞を高密度に達するまで急激に増殖させることができることを示している。こ
のような細胞を生産培地条件に移した場合、細胞は高生存率を維持する一方で顕
著な濃度からなるタフソールおよび他のタフサン類を期間を延ばして生合成およ
び分泌することができる。周期的な培地の交換、生産培地に光およびエリジター
を取り込むことによって、相乗的な生産性増大が得られる。これらの特性は、組
織培養技術を用いたタフソールおよびタフサン生産のための効率的な商業的プロ
セスにとって決定的な前提必要条件である。
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第1a表
タフスス膜種の細胞培養のエリシテーションに使用されるエリジター類のリスト
■、 生物エリジター類(微生物)
・ ボトリチス シネレア(W免見二y1j旦 cinerea)・ フィトフ
トラ メガスペル?(Ph to hthora 1免にユ旦旦旦二二上)・
ピネラス ストリブチウム(Pinellas st乙1旦11旦旦り・ オリ
ゴス不ラス sp、(Of工[0旦旦旦互US 旦P、)ピチウム マミアラツ
ム(旦L1万1旦コ mamiallatum)・ ピチウム シルバチクム(
ヒヱ1h1!31mヱユ119旦り・ ペルチシI功ム ダリアエ(Verti
cillium dahliae)・ ベルチシリウム sp、(Vertic
illium sp、)・ ペニシリウム ミニオルチウム(Penicill
ium minioluteum)・ フィトフトラ ラテラリス(旦丸しム旦
旦互ふhユニ旦 1ateralis)シトスポラ シンフタ(m立旦旦旦二旦
cincta)シトスポラ リューコストーマ(qL見ユ且2旦旦旦 1eu
costoma)・ アルクーナリア ブラフシシコラ(Alternaria
brassicico1旦)・ アルタ−リア ソラニ(Alternari
a 5olani)・ アルタ−リア ククメリナ(Alternaria c
ucumerina)eトリf1 スクアモ’j(Bユ1Lヱ11旦 色ユ旦且
二旦互旦)・ コクリオボラス へテロストロラス(Cochliobolus
heterostro hus)コレトトリクム トリ本すイ(Collet
otrichum trifo]ii)コレトトリクム オルビ+xラム(Co
lletotrichum orbiculum)コl/トトリクム クラミニ
コーラ(Calletotrichum raminicola)・ コレトト
リクム クロエオスボリオイデス(Colletotrichum 1oeos
oriojdes)・ ソリンドロクラジウム フロリダヌム(Clindr
ocladium floridanum)フサリウム りロオクウエレンス(
Fusarium crookwellense)・ フサ1功ム へテロスポ
リウム(Fusarium heteros orium)・ フサIB五 オ
キシスボルム f、sp、コンクルチナンス(Fusarjum 旦jΣm凹f
、sp、conglutinans)フサリウム 才〜シスボルム f、sp、
リコベルシシ(Fusarium 旦jμ二凹f、sp、1ycopersic
i)フサリウム オキシスボルム f、sp、ビジ(Fusarium ■jμ
m凹f、sp、pisi)ギベレラ ゼアエ(Gibberella zeae
)・ ガエウ7ンノミ士ス クラミニス バール、トリチシ(Gaeumann
om ces 7 var、tritici)・ ンエオトリクム sp、(G
eotrichum sp、)・ レブトスフ7エリア トラエ(L艷り見ユ旦
旦り旦旦エユ旦 torrae)・ 子シトリア ハエマトコフカ MPVI(
Nectria haematococca MPVI)・ ミコスファエレ5
ヒ/テス(牲ヱ立立Σ且り旦旦旦旦ユニ旦 止しユ立亘旦j)・ オフィオス
ト−7ウルミ(92F工立旦toma ulmi)・ ネーマ 1ルガム(ヒ扛
立二旦 1iユ且旦り*−マ ビ)デラ(Ph旦二旦 LLユ隻す旦11旦)・
フィトフトラ インフェスタンス(P庄L1立2h1亘9工旦 1nfest
an≦)・ フィチウム アリストスボルム(LLLh圭旦コ 1乙辷1■ト」
巴エエり・ フィチウム クラミニコーラ(ヒL1h1旦y raminico
la)・ フィチウム ウルチムム(% u l t i m u m )・
リゾクトニア ソシーニ(Rhizoctonia 5olani)・ スフレ
ロチニア sp、(Selerotinia sp、)S、ノドルム D−45
(S、nodorum D−45)トラメデス ベルシコロール(Tramet
es versicolor)・ ウスチラゴ マイディス(片旦旦1上旦且上
11y亘ユ亙)・ ペンテユリア イネクワリス(Venturia iユ旦
ユ旦旦ユニ旦)Il、生物エリジター類(微生物フラクションまたは生産物)
・キトサン(Chitosan)
リケナン(Lichenan)
・ グルコマンナン(Glucomannan)・ プルラン(Pleuran
)
・ クルカン(Glucan)
・ カルボキシメチルクルカン
・ ヒドロキシメチルクルカン
・ スルネエチルグルカン
・ マンナン(Mannan)
・ Nシラン(Xylan)
・ 7ンノビオース(Mannobiose)・ 7ンノトリオース(Mann
otriose)・ 7ンノベンタオース(Mannopentaose)7ン
ノテトラオース(Mannotetraose)・士ルリシン(Celluly
sin)・ マルチフェシト XL(Multifect XL)・ マルチフ
ェシト CL(Multifect CL)・ レジナーf (Resinas
e)・ パルプルシム(PuLpxyme)・ 5P431
・ ベクチノール(Pectinol)ラピターゼ(Rapidase)
クレルザイム(Klerzyme)
・ 4チナーゼ(Chitinase)IIl、非生物エリジター類(い(つか
の天然に産出する生化学品の他、化学ストレス剤)
・ アラキドン 酸
エライジン 酸
・ 環状AMP(Cyclic AM日フジブチリル環状AMP(Dibuth
yrl Cyclic AMP)・ メチルジャスモン
・ シス−ジャスモン
・ ミコナゾール(Miconazol)・ フェルリン 酸(Ferulic
acid)・ AMO−1618
・ トリトン X−100(Triton X−100)・ 安息香酸
・ サリチル酸
・ 漫食子酸プロピル
・ セサモール (Sesamol)
・ 塩化クロロコリン(Chlorocholine chloride)・
3.4−ジクロロフェノキシトリエチル(アミン)・ クロロエチル本ス本ン酸
・ ジエチルジチオカルバミン酸
・ ノル升ドロクアイアレチン 酸(Nordihydroguairetic
acid)・ ジチオトレイフト(Dithiothreitol)・ メタ
重亜硫酸ナトリウム
・ メタ重亜硫酸カリウム
・ d−アミノ−DL−フェニルアラニン・ 硫酸バナジル(Vanadyl
5ulfate)・ コニコナゾール(Uniconazol)・ バクロフト
ラゾール(Paclobutrazol)・ スペルミン(Spermine)
・ スペルミジン(Spermidine)・ プトレシン(Putresci
ne)・ カブバリ7 (Cadavarine)・ 硫酸プロタミン(Pro
tamine 5ulfate)・ SKF−7997
成長調整物質
(第2表)
本略号:ビクロラム(Picloraml(円、ナフタレン酢酸(N)、ベンジ
ルアデニン(BA)。
ジメチルアリルアミノプリン(2iPl、カイネチン(K)第4表 タフスス種
懸濁培養物の典型的成長特性種 培加時間 培加時間 密度 密度
T、jiffンシスfT、carmensis)nd”8.513260*未決
定
第5表 種々のタククス膜種のタキソール生産第6表 培地交換処理による生産
性の改良数字は15日バッチ間隔で達成されたレベルに対するト倍の改良として
表されている。
タフスス シネンシス(Taxus chinensisl細胞系統トlは、暗
所において培地Aで培養された。
タキソール 4.6 4.89
皐乏1タキサン類 4.55 5.94本細胞および培地中の総ν鳴の合計
第7表 培地A中で培養されたタフスス シネンシス細1N、tl(−1の10
日令培地中のタキソールおよびタキサン含有量に対する標準グロラックス(St
andard Groluxl光処理の効果に示された量は、懸濁液2−1から
抽出されたμgで表される。
細胞成長は両方の処理で同一である(フラスコ当り164■乾燥重量)照明 暗
所
総タキソール細胞および培地二8.8μg 3.13μg細ll包夕t9〜ソー
ル:76.40%56.20%総りNサン細胞および培地、 61.55μg
62.17μg細月包タt9八サン二 89% 84%第9表 タフスス シネ
ンシス懸濁11mV−J*X−1中のタキサンおよびタキソールの生合成の増化
のための栄養培地操作、生重量500■細胞は培地5ml当り接種され、18日
間暗所で培養された。生産された総タキサン類(細胞および培地の両者中で)が
記載されている。培地BおよびCの成分は第2表に挙げられている。
培地B 培地C
ハサンレベル (oral (m区/L)バフカチンIII(Baccatin
III)4.33.97−キンロンルlO〜ダ1七チルタNソール8.312.
9(ツーxylosy110−deacetyltaxol)セファ0マニンj
Cephaloeannine) 1.1 @37g10−デアヤチル7−エビ
タ〜ソール4.65.4(10−daacety17−epitaxollりN
ソール(taxoll 24,1 21.37−ニビタ〜ソールf7−epit
axol)1.32.8他の未同定タリン類 56.1 63.7総ハサン類
99.8mg/l 110+ng/1日数 二喧甲!」
細胞 培地 細胞 培地
対照区 処理区
FIG、 2A
細胞 培地 細胞 培地
対照区 処理区
FIG、2B
スキャン: 33.48
ニセぴj
(%)冨眼柊階
補正書の翻訳文提出書(特許法第184条の7第1項)1、国際出願番号
PCT/US93101576
2、発明の名称
3、特許出願人
住 所 アメリカ合衆国 14850−1257 ニューヨーク州 イサ力 ブ
ラウン ロード 95 ラングミュア ラブ 175
名 称 フィトン 力タリティック インコーホレイテッド国 籍 アメリカ合
衆国
4、代理人
〒107
東京都港区赤坂5丁目1番31号
第6セイコービル 3階
請求の範囲
1.栄養培地中でタフスス膜種のカルスおよび/または懸濁培養から由来する細
胞を成長および生産物形成条件下で培養する工程を含むタフスス膜種の細胞培養
体から高収率でタキソールおよびタキサン類を回収する方法であって、前記タキ
ソールおよびタキサン類は前記細胞培養体の前記細胞および/または前記培地か
ら回収されることを特徴とする方法。
2、下記工程を有することを特徴とするタフスス膜種のカルスおよび懸濁培養の
効率的な誘導と維持のための方法;
(a)カルス誘導のための適宜な植物部分、および懸濁培養のための適宜なカル
ス細胞系統を選択する工程:
(b)外植片、カルス、および懸濁液の活力を維持するための効率的な滅菌、イ
ンキュベーションおよび転移の手順を提供する工程、
(c)効果的な抗褐変剤およびカルスと細胞懸濁培養の連続した急速な成長のた
めのプロトコルを付与する工程;および
(d)効果的な誘導、増殖および維持栄養培地、および急速な成長、高い細胞密
度、および高い細胞生存率のための適宜な環境条件を提供する工程。
3、下記工程を有することを特徴とする細胞驕培養の総タキソールおよびタキサ
ン収率と回収を増強する方法;
(a)タフスス膜種のカルスおよび/または懸濁培養由来の細胞を栄養培地中で
細胞培養成長および生産物形成条件下で培養してタキソールおよびタキサンを生
産する工程;
(b)タキソールおよびタキサンの生合成を刺激し、それによって細胞内蓄積お
よび細胞外培地への生産物の分泌を増強する工程;および
(c)生産されたタキソールおよびタキサンを前記細胞および/または前記培地
から回収する工程。
4、細胞培養方法においてタキソールの生産を他の望ましくないタキサンの量に
関して操作する下記工程を含む方法;
(a)タフスス膜種のカルス組織および/または懸濁培養由来の細胞を栄養培地
中で細胞培養成長および生産物形成条件下で培養してタキソールおよびタキサン
を生産する工程;
(b)タキソールおよびタキサンの生合成を刺激し、それによって細胞内蓄積お
よび細胞外培地への生産物の分泌を増強する工程;
(c)タキソールおよび他のタキサンを前記細胞および前記培地から回収する工
程;
(d)前記細胞および前記培地から生産されたタキソールおよび他のタキサンの
レベルを評価する工程;および
(e)タキソールおよび他の望ましいタキサンの選好的生産を示し、同時にタキ
ソールおよびタキサンの生産と回収の間に他の望ましくないタキサンを抑制する
栄養培地を選択する工程。
5、前記タフスス膜種がタフスス プレヴイフォリア、タフスス 力ナデンシス
、タフスス バッカータ、タフスス グロボーサ、タフスス フロリダーナ、タ
フスス ワリキアーナ、タフスス メディア、およびタフスス シネンシスから
なる群から選ばれることを特徴とする請求の範囲第1項ないし第4項のいずれか
に記載の方法。
6、細胞成長およびタキソールおよびタキサンの生産への影響に関し環境条件を
変更しおよび評価する工程をさらに有することを特徴とする請求の範囲第1項な
いし第4項のいずれかに記載の方法。
7、前記培養が連続したもしくは断続した広帯域または狭帯域の光の中で培養さ
れることを特徴とする請求の範囲第1項ないし第4項に記載の方法。
8、前記栄養培地は炭水化物および/または他の炭素源を含むことを特徴とする
請求の範囲第1項ないし第4項のいずれかに記載の方法。
9、前記栄養培地が無機および/または有機窒素源を含むことを特徴とする請求
の範囲第1項ないし第4項に記載の方法。
10、前記栄養培地はマクロおよびミクロ塩類、微量元素尾よび/またはビタミ
ンその他の有機補充物質を含むことを特徴とする請求の範囲第1項ないし第4項
に記載の方法。
11、前記栄養培地が植物ホルモン、ホルモン代替物および誘導体、および/ま
たは合成成長調整物質を含むことを特徴とする請求の範囲第1項ないし第4項に
記載の方法。
12、前記栄養培地中に生物的または非生物的エリジターが存在することを特徴
とする請求の範囲第1項ないし第4項のいずれかに記載の方法。
13、前記栄養培地が生合成前駆体、代謝阻害剤、刺激剤および/または活性剤
を含むことを特徴とする請求の範囲第1項ないし第4項に記載の方法。
14、前記栄養培地が抗褐変剤、抗酸化剤、安定化剤、増強剤、ラジカルスカベ
ンジャー、および/または還元剤を含有することを特徴とする請求の範囲第1項
ないし第4項に記載の方法。
15、前記栄養培地が懸濁培養成長に対してとタキソールおよびタキサンの生産
に対してとで等しいことを特徴とする請求の範囲第1項ないし第4項に記載の方
法。
16、前記栄養培地が懸濁培養成長に対してとタキソールおよびタキサンの生産
に対してとで異なることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の方法。
17、周期的な栄養培地の交換をさら含むことを特徴とする請求の範囲第1項な
いし第4項に記載の方法。
18、定期的なタキソールおよびタキサンの回収をさら含むことを特徴とする請
求の範囲第1項ないし第4項に記載の方法。
19、成長および生産物形成が1段または2段のバッチ処理、またはフェッドパ
ッチ処理、または半連続処理、または連続処理、またはそれらの変形であること
を特徴とする請求の範囲第1項ないし第4項のいずれかに記載の方法。
20、タキソールおよびタキサンを高収率で生産することが可能なタフスス プ
レヴイフォリア、タフスス力ナデンシス、タフスス バッヵータ、タフスス グ
ロボーサ、タフスス フロリダーナ、タフスス ヮリキアーナ、タフスス メデ
ィアまたはタフスス シネンシスを含有する精製された細胞培養。
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(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IE、IT、LU、MC,NL、 PT、 S
E)、 AU、 CA、JP、 KR,KZ、PT
(72)発明者 カドカデ、プラカッシュ、ジー。
アメリカ合衆国 01752 マサチューセッツ州 マールバロ ランバート
サークル(72)発明者 プリンス、クリストファー、エル。
アメリカ合衆国 14850 ニューヨーク州イサ力 イースト ショア ドラ
イブ
(72)発明者 シューブメール、バリー、エフ。
アメリカ合衆国 14850 ニューヨーク州イサ力 ウォーターワゴン ロー
ド
(72)発明者 ケーン、ニージン、ジェイ。
アメリカ合衆国 14850 ニューヨーク州イサカ スレイタービル ロード
1820(72)発明者 ローチ、プレートン
アメリカ合衆国 14847 ニューヨーク州インターシーケン ルート969
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