FR3031900A1 - Triptolide et ses derives dans le traitement des tumeurs et pathologies pre-cancereuses cutanees - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un composé sélectionné parmi le triptolide, ses dérivés, et les sels pharmaceutiquement acceptables du triptolide et de ses dérivés, ou une composition comprenant un tel composé pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention par voie topique d'une tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée.

Description

1 La présente invention concerne le triptolide, ses dérivés et leurs sels pharmaceutiquement acceptables pour leur utilisation dans le traitement et la prévention de tumeurs et pathologies pré-cancéreuses cutanées par voie topique. Les tumeurs et pathologies pré-cancéreuses cutanées constituent un grave problème de santé publique. Un certain nombre d'entre elles sont causées par des expositions fréquentes aux rayons UV et peuvent évoluer vers des formes cancéreuses mortelles. On distingue essentiellement deux types de tumeurs cutanées : 1) Les carcinomes se développent à partir de cellules de l'épiderme, soit de la couche basale (carcinome basocellulaire), soit des couches supérieures (carcinome spinocellulaire ou carcinome épidermoïde cutané (appelé « squamous cell carcinoma » en anglais)). Ce sont les plus fréquents, puisqu'ils représentent 90 % des cancers de la peau, dont 75 % pour les basocellulaires et 20 % pour les spinocellulaires. Les carcinomes basocellulaires ne développent jamais de métastases; les spinocellulaires assez rarement, principalement dans les ganglions lymphatiques proches de la tumeur.

Le développement des cancers suit généralement plusieurs étapes. Pour les carcinomes spinocellulaires, la tumeur débute souvent sous la forme d'une lésion localisée dans l'épiderme. En surface se forme une croûte (kératose actinique) ou une sorte d'eczéma (maladie de Bowen). C'est l'invasion du derme, plus profond, qui caractérise le stade de carcinome invasif. 2) Les mélanomes se développent à partir des mélanocytes qui sont les cellules qui fabriquent la mélanine, responsable de la pigmentation brune ou rouge de la peau. En effet, il existe deux types principaux de pigments : les bruns, qui confèrent le bronzage et une certaine protection contre les UV, et les rouges (peau rousse) qui ne protègent pas. Les sujets qui fabriquent essentiellement des pigments rouges ne bronzent pas et sont, de ce fait, plus à risque de cancers de la peau. Les mélanocytes sont normalement présents dans l'épiderme, associés aux cellules épidermiques de la partie profonde de l'épiderme. Le « grain de beauté », ou naevus, est une lésion bénigne qui correspond à une accumulation de mélanocytes dans le derme, ce qui explique sa couleur brune ou rouge. Les mélanomes sont beaucoup plus rares, mais peuvent se développer chez des sujets jeunes. Il faut les détecter et les traiter 3031900 2 rapidement, car ils peuvent diffuser dans tout le corps et donner des métastases très difficiles à traiter. La kératose actinique (KA) est une pathologie dermatologique encore appelée kératose solaire. C'est une hypertrophie des couches cornées de l'épiderme. La KA est 5 le premier stade conduisant au développement du carcinome épidermoïde et est donc considérée comme une lésion « pré-cancéreuse ». Bien que la grande majorité des KA soient bénignes, certaines études rapportent qu'environ 10% peut se transformer en carcinome épidermoïde. 40 à 60% des carcinomes épidermoïdes proviennent de KA non traitées. Environ 2 à 10% des carcinomes épidermoïdes s'étendent à des organes 10 internes et menacent le pronostic vital. La KA survient aux endroits du corps qui sont souvent exposés au soleil (notamment les UVB). Celle-ci touche principalement la population caucasienne. Par exemple, la 15 prévalence de la kératose actinique en Australie est estimée à environ 40%. Aux Etats- Unis, on estime à plus de 8,2 millions les patients atteints de KA. Le coût annuel estimé pour traiter la KA aux Etats-Unis est environ 1 milliard $ US en 2002. Différentes possibilités thérapeutiques existent pour le traitement de la KA: la cryothérapie, la chirurgie, la thérapie photodynamique topique (PDT), le laser, le 20 curetage et l'électrocoagulation, les applications topiques contenant de l'imiquimod, du 5-fluorouracile, de mébutate d'ingenol ou du diclofénac. Le traitement est à adapter en fonction de la localisation de la KA et de ses caractéristiques. Cependant, ces divers traitements sont parfois sans succès et certains d'entre eux peuvent laisser des traces irréversibles et inesthétiques. Il existe donc toujours un 25 réel besoin de traitements alternatifs, efficaces et rapides de la KA induisant un nombre d'effets secondaires limité. Le triptolide (TRP) de formule (I) ci-dessous et ses dérivés, notamment de type diterpène, sont des molécules pouvant être extraites de plantes médicinales chinoises 30 de la famille Celastaceae notamment de la plante Tripterygium wilfordii. 3031900 3 (I) Triptolide Les inventeurs ont de façon surprenante mis en évidence l'efficacité du triptolide 5 dans la prévention et le traitement de tumeurs ou de pathologies pré-cancéreuses cutanées, en particulier de la kératose actinique. Les inventeurs ont par ailleurs montrés que le triptolide était efficace par voie topique et ce avec un taux de passage transcutané faible. La présente invention porte donc sur un composé sélectionné parmi le triptolide, 10 ses dérivés, les sels pharmaceutiquement acceptables du triptolide et de ses dérivés, et leurs mélanges pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention par voie topique d'une tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée. La présente invention porte, en outre, sur une composition topique comprenant au moins un composé selon l'invention, et au moins un excipient pharmaceutiquement 15 acceptable pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée. La présente invention porte, en outre, sur une méthode de traitement et/ou de prévention d'une tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée par administration topique à un patient en ayant besoin d'une quantité efficace d'un composé ou d'une 20 composition selon l'invention. La présente invention porte par ailleurs sur l'utilisation d'un composé ou d'une composition selon l'invention pour la fabrication d'un médicament topique pour le traitement et/ou la prévention de tumeurs ou pathologies pré-cancéreuses cutanées. Dans la présente invention, on entend désigner par « pharmaceutiquement 25 acceptable » ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine. On entend désigner par « sel pharmaceutiquement acceptable » d'un composé, 30 un sel qui est pharmaceutiquement acceptable, comme défini ici, et qui possède l'activité pharmacologique souhaitée du composé parent.

3031900 4 Les sels pharmaceutiquement acceptables comprennent notamment : (1) les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptable formés avec des acides inorganiques pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et 5 similaires ; ou formés avec des acides organiques pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2-hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide 10 maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2-naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide ptoluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires, et (2) les sels d'addition de base pharmaceutiquement acceptable formés 15 lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique pharmaceutiquement acceptable telle que la diéthanolamine, l'éthanolamine, N-méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires ; ou avec une base inorganique 20 pharmaceutiquement acceptable telle que l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de sodium et similaires. Il pourra s'agir d'un sel de sodium lorsque le composé comporte une fonction acide.

25 Par « dérivé du triptolide » selon l'invention, on entend tous dérivés du triptolide présentant une efficacité équivalente ou supérieure à celui-ci. L'efficacité du triptolide et de ses dérivés pourra notamment être mesurée par l'évaluation de l'effet de ceux ci sur la variation du nombre de lésions de kératose actinique lors d'un test d'efficacité tel que notamment celui présenté dans les exemples ci-dessous. Par « efficacité 30 équivalente », on entend que le dérivé du triptolide aura une efficacité comprise entre 50 et 100%, préférentiellement entre 80 et 100% de celle du triptolide. Par conséquent, par « efficacité équivalente ou supérieure », on entend que le dérivé du triptolide aura une efficacité supérieure ou égale à 50%, préférentiellement 80%, de celle du triptolide. Des dérivés du triptolide selon la présente invention sont notamment décrits dans 35 les articles Ma et al., (2007) Phytochemistry 68 :1172-1178.

3031900 5 Dans un mode de réalisation, les dérivés du triptolide sont sélectionnés dans le groupe comprenant ou consistant en le triptonide, le tripdiolide, le triptolidénol, le 16- hydroxytriptolide, le triptriolide, le 12-epitriptriolide, le 14-epi-triptolide, le tripchlorolide et le dérivé PG-490-88 notamment décrit sous forme de son sel sodique dans Liu, Q et 5 al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 319 :980-986, de formule ci-dessous : C 3 0 avec R = CO2H PG-490-88 Dans un autre mode de réalisation, le dérivé du triptolide selon l'invention pourra être des métabolites terpénoides actifs tels que notamment ceux cités dans Brinker et 10 al. (2007) Phytochemistry 68:732-766, dont le wilforine, l'euonine et la cangorinine. Notamment, les dérivés du triptolide selon l'invention seront choisis parmi les dérivés du triptolide de type diterpène, à savoir dans le groupe comprenant ou consistant en le triptonide, le tripdiolide, le triptolidénol, le 16-hydroxytriptolide, le triptriolide, le 12-epitriptriolide, le 14-epi-triptolide et le dérivé PG-490-88.

15 Dans un autre mode de réalisation le composé selon l'invention est le triptolide, le dérivé PG-490-88 ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, notamment le triptolide ou le sel de sodium du dérivé PG-490-88. Dans un autre mode de réalisation le composé selon l'invention est le triptolide ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, notamment le triptolide.

20 Le triptolide, ses dérivés et leurs sels pharmaceutiquement acceptable selon l'invention peuvent être obtenu de toutes les façons connues par l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent contenir du triptolide et/ou un ou plusieurs de ses dérivés et/ou leur sels pharmaceutiquement acceptable sous forme purifiée ou sous forme d'extrait, qui peut être par exemple brut ou enrichi.

25 Par « forme purifiée », on entend, au sens de la présente invention, un composé comprenant au moins 90% en poids, notamment au moins 95% en poids, notamment au moins 99% en poids de triptolide, d'un de ses dérivés ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux-ci.

3031900 6 Par exemple, le triptolide, ses dérivés et leurs sels pharmaceutiquement acceptables sous forme purifiée peuvent être obtenus par synthèse chimique (Miller NA, et al. Chem Commun (Camb).

2008 Mar 14;(10):1226-8.). Alternativement le triptolide, ses dérivés et leurs sels pharmaceutiquement acceptables sous forme 5 purifiée peuvent être obtenus par extraction et purification à partir de plantes de la famille Celastaceae, notamment de plantes du genre Tripterygium telles que Tripterygium wilfordii ou Tripterygium regeli. La purification peut être réalisée par chromatographie liquide. Une méthode d'obtention de triptolide purifié à plus de 95% est notamment décrite dans Ma et al. 10 (2007) Phytochemistry 68 :1172-1178. Dans un autre mode de réalisation, le triptolide, ses dérivés et leurs sels pharmaceutiquement acceptables selon l'invention peuvent être sous forme d'extrait après extraction de plantes de la famille Celastaceae, notamment de plantes du genre Tripterygium telles que Tripterygium wilfordii ou Tripterygium regeli. Cet extrait peut 15 être brut ou enrichi en triptolide, en un de ses dérivés, et/ou en un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables. L'extrait peut alors comprendre éventuellement des composants (dont des composants actifs) issus de la plante autres que le triptolide, ses dérivés et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. L'« extrait brut » est l'extrait directement obtenu à partir des plantes. Par « extrait enrichi », on entend 20 notamment un extrait dans lequel la quantité de triptolide, d'un de ses dérivés, et/ou d'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables est supérieure à 30% en poids, notamment supérieur à 50% en poids par rapport à un extrait brut. Notamment un extrait enrichi en triptolide selon l'invention peut être obtenu par le procédé décrit dans la demande de brevet W02011/054929.

25 Les extraits purifiés, bruts ou enrichis selon l'invention peuvent être obtenus à partir de n'importe quelle partie des plantes de la famille Celastaceae, notamment les racines. Alternativement, ils peuvent être obtenus par des cultures de cellules végétales de ces plantes. Dans le cas de cultures de cellules végétales, cet extrait pourra notamment être obtenu à partir du surnageant desdites cultures cellulaires (tel 30 que notamment décrit dans W02011/054929). Dans un mode de réalisation, le composé selon l'invention, c'est-à-dire le triptolide, un de ses dérivés ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, est sous forme purifiée. Par « tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée », on entend en particulier 35 les tumeurs ou pathologies pré-cancéreuses cutanées sélectionnées dans le groupe 3031900 7 comprenant ou consistant en les tumeurs ou pathologies pré-cancéreuses UV-induites, les métastases et les lymphomes T cutanés. Dans un mode de réalisation la tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée UV-induite est notamment sélectionnée dans le groupe comprenant ou consistant en la 5 kératose actinique, le carcinome baso-cellulaire, le mélanome et le cancer épidermoïde (ou squamous cell carcinoma). Dans un autre mode de réalisation la pathologie pré-cancéreuse cutanée UV-induite selon l'invention est la kératose actinique. L'ensemble de ces tumeurs ou pathologies pré-cancéreuses cutanées est bien 10 connu de l'Homme de l'art qui saura facilement les reconnaitre et les différencier les unes des autres. Notamment, la kératose actinique pourra être caractérisée par l'apparition de lésions de kératose actinique. Par « lésion de kératose actinique », on entend une hypertrophie des couches supérieures de l'épiderme résultant en un épaississement 15 de la couche cornée. Le stade initial se caractérise par l'apparition de taches érythémateuses aux limites imprécises, de taille variable (de l'ordre du centimètre) et de surface rugueuse. A un stade plus avancé, l'épaississement de la couche cornée s'accentue (hyperkératose jaune ou brunâtre, qui saigne si on essaie de la détacher). Habituellement le diagnostic est clinique, mais un examen histologique (biospie 20 cutanée) permet de poser un diagnostic définitif (par la présence d'hyperkératose ortho- et parakératosique, d'un épiderme atrophique ou hyperacanthosique fait de kératinocytes dysplasiques avec nombreuses atypies nucléaires). Des lésions microscopiques, uniquement visibles en histologie, précèdent l'apparition de lésions macroscopiques (visibles à l'oail nu).

25 Par « métastases » selon l'invention on entend les métastase de localisation cutanée de tout type de tumeur, par exemples les métastases des tumeurs du sein, du poumon, ou de mélanome. Par « traitement » selon la présente invention, on entend l'inhibition de l'évolution, plus particulièrement la régression, préférentiellement la disparition de la 30 tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée selon l'invention. Par « prévention » selon la présente invention, on entend empêcher ou retarder l'apparition de la tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée selon l'invention. Le traitement ou la prévention selon l'invention s'entend chez l'Homme ou l'animal.

3031900 8 Lorsque la pathologie pré-cancéreuse selon l'invention est la kératose actinique on entend en particulier par « traitement de la kératose actinique », l'inhibition de l'apparition de nouvelles lésions de kératose actinique, l'inhibition de l'évolution des lésions de kératose actinique existantes (notamment de microscopiques à 5 macroscopiques), l'inhibition de la croissance des lésions de kératose actinique macroscopiques existantes, la régression des lésions de kératose actinique existantes, et/ou la disparition des lésions de kératose actinique existantes Par « topique » selon l'invention on entend que le composé ou la composition selon l'invention seront administrés par application à la surface de la peau ou des 10 muqueuses. La composition topique selon l'invention pourra notamment se présenter sous toutes les formes permettant une application topique : crème, gel, onguent, patch etc. Préférentiellement, la composition selon l'invention sera sous forme de crème. Dans un mode de réalisation, la composition topique selon l'invention comprend 15 du triptolide et/ou un ou plusieurs de ses dérivés à une concentration comprise entre 0,001% et 2% en poids par rapport au poids de la composition finale, par exemple comprise entre 0,01 et 1% ou entre 0,01 et 0,1% Dans un autre mode de réalisation la composition topique selon l'invention comprend du triptolide à une concentration comprise entre 0,001% et 2% en poids par 20 rapport au poids de la composition finale, par exemple comprise entre 0,01 et 1% ou entre 0,01 et 0,1%. Dans un autre mode de réalisation le triptolide et/ou un ou plusieurs de ses dérivés est administré à une dose comprise entre 5 pg et 1,5 mg/cm2 de peau, par exemple entre 10 pg et 1mg/cm2.

25 Le composé ou la composition selon l'invention sera administrée 1 à plusieurs fois par jour, la durée du traitement pouvant être variable selon la gravité de la tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée à traiter et sera facilement ajustable par l'Homme du métier ou le praticien. Dans un mode d'administration la composition ne sera pas administrée plus de 1, 2, 3, 4 ou 5 fois, par exemple plus de 3 fois.

30 Par « excipient pharmaceutiquement acceptable » selon l'invention, on entend un excipient compatible avec les autres ingrédients de la composition et qui ne produit aucun effet adverse, allergique ou autre réaction indésirable quand il est administré à un animal ou un humain. Par « excipient » selon l'invention, on entend notamment un ou plusieurs 35 tensioactifs, par exemple macrogols, hydroxy stéarates, ester d'acides gras éthoxylés, 3031900 9 alcool gras éthoxylés ; un ou plusieurs solvants, comme par exemple l'octyldodécanol, propylèneglycol dicaprylocaprate ; un ou plusieurs polymères hydrosolubles, par exemple la PVP, l'acide hyaluronique ou le hyaluronate de sodium ; un ou plusieurs épaississants comme par exemple les gommes naturelles ou hémi-synthétiques ; un 5 ou plusieurs gélifiants par exemple des carbomères ; une ou plusieurs charges minérales par exemple l'oxyde de zinc, du talc, des argiles ; un ou plusieurs émulsifiants tels que l'alcool cétéarylique ; un ou plusieurs conservateurs, par exemple le phénoxyéthanol ; un ou plusieurs antibactériens ; un ou plusieurs antiseptiques ; un ou plusieurs agents antioxydants, par exemple l'acétate de tocophérol ; un ou plusieurs 10 chélatants, par exemple l'EDTA ; un ou plusieurs pigments ; un ou plusieurs parfums ; un ou plusieurs colorants ; un ou plusieurs agents d'ajustement du pH tels que des sels, des acides, des bases ; ou un mélange de ceux-ci. Dans un mode de réalisation la composition est telle que le ou les composés selon l'invention ne pénètrent pas à travers la peau. La pénétration à travers la peau 15 pourra être mesurée par test en cellule de diffusion statique de Franz (appelé en anglais « Franz static diffusion cell »), notamment comme décrit dans OECD guideline for the testing of chemicals (new guideline 428, skin absorption: in vitro method (13 April 2004)). On considère que les composés selon l'invention ne pénètrent pas dans la peau quand plus de 60%, par exemple plus de 80 ou 90% du ou des composés 20 selon l'invention administrés est non absorbé. LEGENDE DE LA FIGURE : Figure 1 Etude de l'effet du triptolide administré par voie topique à des souris 25 porteuses de lésions de kératose actinique.

3031900 10 EXEMPLES : Exemple 1 : Etude chez la souris 5 1. Matériels et méthodes 1. 1. Induction de la kératose actinique Des souris femelles non consanguines sans poil de souche SKH 1, âgées entre 6 et 8 semaines (Charles River Laboratories) sont exposées quotidiennement à des UVB 10 pendant 14 semaines. La dose d'UVB, vérifiée par un luminomètre, est de 50mJ/cm2/jour pendant 10 jours, puis de 55mJ/cm2/jour pendant 10 jours, et enfin de 60mJ/cm2/jour sur le reste de la période. La dose de 50mJ/cm2/jour a été préalablement déterminée comme étant la dose minimale érythémateuse pour cette souche de souris.

15 Les souris développent progressivement des lésions de kératose actinique microscopiques puis macroscopiques. Ces lésions ont été caractérisées au niveau histologique et anatomo-pathologique comme étant des lésions de kératose actinique, comparables aux lésions de kératose actinique observées chez l'homme. 20 1. 2. Produits utilisés Produits de référence/Validation du modèle Deux produits de référence, le mébutate d'ingénol (0.015%, Picato®) et le 5- fluorouracile (0.5%, Carac®), utilisés chez l'homme dans le traitement des lésions de kératose actinique, ont été administrés aux animaux (3 par groupes versus groupe 25 contrôle recevant le véhicule uniquement) par voie topique et ont démontré une activité curative dans ce modèle de kératose actinique chez la souris, validant pharmacologiquement la pertinence de ce modèle. Administration du triptolide Le triptolide (Sequoia Research Products, UK) est formulé dans un véhicule 30 constitué de 5% DMSO - 70% glycerol - 25% eau et administré aux animaux aux doses de 0,025% (soit 50pg par animal) et 0,075% (soit 150pg par animal). La composition contenant le triptolide est appliquée sur la peau sous la forme d'une application occlusive unique de 30h. Le pansement occlusif est retiré au bout de 30h, et les animaux sont suivis cliniquement pendant 4 semaines (semaines 17 à 20 après 3031900 11 le début de l'irradiation aux UVB). Comme contrôle placebo, le véhicule sans le triptolide est appliqué de la même manière. 1. 3. Protocole d'administration topique 5 Les compositions à évaluer (placebo ou comprenant le triptolide à 0,025 ou à 0,075%) sont administrées aux souris par voie topique afin d'évaluer leur effet curatif sur des lésions de kératose actinique déjà présentes à l'initiation du traitement, et leur effet préventif sur l'apparition de lésions macroscopiques. A l'initiation du traitement (Semaine 17 après le début de l'exposition aux UVB), 10 seules les souris présentant des lésions visibles de kératose actinique sont sélectionnées et randomisées entre les groupes traités et contrôles en fonction du nombre de lésions macroscopiques. Les groupes comprennent entre 3 et 4 souris. L'exposition aux UVB est interrompue à l'initiation des traitements. Les produits sont administrés de façon occlusive dans des chambres de 19mm 15 de diamètre (soit 2.83 cm2) posées et fixées sur une zone déterminée de chaque souris à l'aide de bandes adhésives. 1. 4. Evaluation de l'efficacité des traitements Suivi clinique 20 Les animaux sont pesés trois fois par semaine entre les semaines 17 et 21. Les faces dorsales, latérales droite et gauche, de chaque animal sont photographiées une fois par semaine afin de suivre l'évolution des lésions de kératose actinique. Les lésions de kératose actinique sont comptées, au sein de la zone traitée d'une part, et en dehors de cette zone d'autre part, et ce comptage permet de suivre la progression 25 des lésions et l'efficacité des traitements. Analyse histologique Des zones de peau traitées et non traitées de chaque animal sont biopsiées en fin d'étude (semaine 21) pour une analyse histologique et immuno-histo-chimique. La présence de lésions de kératose actinique est ainsi validée histologiquement et 30 comparée entre les groupes. Le niveau de prolifération des cellules épidermiques est évalué par un marquage Ki67. 35 3031900 12 2. Résultats 2.1 Suivi clinique Le traitement topique est parfaitement toléré et le triptolide n'a aucun effet sur le 5 poids des animaux. Ceci indique que le triptolide par cette voie d'administration est fort bien toléré par les animaux. 2.2. Evolution du nombre de lésions de kératose actinique Les résultats de l'étude sont représentés dans les tableaux 1 (Nombre de lésions 10 par souris et en moyenne avant et après le traitement) et 2 (Variation en % du nombre de lésions par souris et en moyenne avant et après le traitement). Les nombres de lésions moyens par groupe sont par ailleurs représentés en figure 1. Nombre de lésions de kératose Nombre de lésions de kératose actinique avant le début du traitement (semaine 17) actinique en fin d'étude (semaine 21) Groupe Animal Lésions en dehors de la zone de traiteme nt Lésions dans la zone traitée Moyenn e lésions en Moyenn e lésions zone traitée Lésions en dehors de la zone de traiteme nt Lésion s dans la Moyenne lésions en dehors de zone de traitement Moyenn e lésions zone traitée dehors de zone de traiteme nt zone traitée Véhicule 1 9 6 6,3 4,7 12 10 10,3 8 2 4 4 10 7 3 6 4 9 7 Triptolid e 50pg 4 0 3 5,5 4,5 2 1 12 0,5 5 11 8 26 1 6 11 1 19 0 7 0 6 1 0 Triptolid e 150pg 8 3 5 4,8 6,8 4 0 8 1 9 3 13 9 3 10 11 6 14 1 11 2 3 5 0 Tableau 1 : Nombre de lesions par souris et moyennes avant et après le 15 traitement 3031900 13 Variation du nombre de lésions au cours de l'étude (en `)/0 par rapport au début de l'étude) Groupe Animal En dehors Dans la Moyenne Moyenne zone traitée de la zone traitée zone traitée en dehors de la zone traitée Véhicule 1 33 67 78 72 2 150 75 3 50 75 Triptolide 50pg 4 200 -67 127 -89 5 136 -88 6 73 -100 7 100 -100 Triptolide 150pg 8 33 -100 103 -90 9 200 -77 10 27 -83 11 150 -100 Tableau 2 : Variation en % du nombre de lésions par souris et moyennes avant et après le traitement Le nombre de lésions de kératose actiniques augmente systématiquement entre 5 la semaine 17 et la semaine 21 dans les zones non traitées et ce pour tous les groupes. Cela reflète l'apparition de nouvelles lésions au cours de cette période ainsi que l'évolution de lésions microscopique encore en semaine 17 vers des lésions macroscopiques (Figure 1) On peut constater que dans le groupe contrôle (traité avec le véhicule), le nombre 10 de lésions macroscopiques de kératose actinique des zones traitées augmente entre la semaine 17 et semaine 21 et ce de façon équivalente à l'augmentation observées dans les zones non traitées (respectivement +72 et +78%, Tableau 2). Comme attendu, le véhicule n'a donc aucun effet curatif sur les lésions de kératose actinique. En revanche, dans les deux groupes traités avec le triptolide, le nombre de 15 lésions macroscopiques de kératose diminue fortement dans les zones traitées (diminution de 89 et 90% pour les doses de 50 et 150pg respectivement, tableau 2). Il faut noter que le triptolide permet à la fois la disparition des lésions existantes (prouvées par la réduction systématique du nombre de lésion après traitement) et l'absence d'apparition de nouvelles lésions ou d'évolution de lésions microscopiques 20 en macroscopiques contrairement aux zones non traitées et aux contrôles.

3031900 14 Cette réduction importante du nombre de lésions après application du triptolide reflète la grande efficacité de celui-ci dans le traitement de la kératose actinique. Cette efficacité semble comparable à celle observée avec les produits de référence, à savoir le mébutate d'ingénol et le 5-fluorouracile.

5 Par ailleurs, au niveau clinique, l'effet du triptolide se caractérise par l'induction, dans les jours suivants le traitement, d'une érosion de l'épiderme au niveau de la zone traitée, suivie d'une re-epithélialisation de cette zone. Cet effet est comparable à celui observé avec les produits de référence, à savoir le mébutate d'ingénol et le 5- fluorouracile. 10 2.3. Analyse histologique de l'effet du triptolide L'efficacité clinique du triptolide est par ailleurs confirmée au niveau histologique après sacrifice des animaux et réalisation de biopsies cutanées. En effet, aucune lésion de kératose actinique n'est observée en fin d'étude dans les biopsies faites au 15 sein des zones traitées. Un épiderme normal est observé avec un tissu dermique cicatriciel. Une faible fraction de cellules épidermiques présente un marquage Ki67 positif dans un épiderme normal, par marquage immuno-histo-chimique avec un anticorps anti-Ki67. L'augmentation du nombre de cellules épidermiques en prolifération (et donc 20 Ki67 positives) est une caractéristique histologique de la KA (acanthose). Ainsi les souris du groupe contrôle présentent une forte proportion de cellules Ki67 positives. Une forte diminution du nombre de cellules en prolifération est observée au niveau de l'épiderme des zones traitées avec le triptolide, comparativement au groupe contrôle. 25 2. 4. Dosage du triptolide dans le plasma Le triptolide a été dosé par spectrométrie de masse dans la peau et le plasma de souris (n=2) traitées par voie topique à la dose de 0.2% (soit 400pg par animal), de façon occlusive comme décrit plus haut. La quantité de produit dans le plasma est inférieure à la limite basse de détection de la méthode (soit inférieure à 1Ong/m1) dans 30 le plasma, alors qu'environ 2100 ng/g sont détectés dans la peau traitée. Le triptolide s'accumule donc dans le peau et présente un passage transcutané très faible voire nul, ce qui est un point très important et favorable pour une utilisation par voie locale.

35 3031900 15 Exemple 2 : Etude sur peau humaine 1. Matériel et méthode 5 1.1. Cellule de diffusion statique de Franz La cinétique et le degré de pénétration du Triptolide à travers la peau humaine, a été déterminé par le protocole connu sous le nom courant de « Franz static diffusion cell » (OECD guideline for the testing of chemicals: new guideline 428, skin absorption: in vitro method (13 April 2004)). Les cellules de Franz servent à déterminer, ex vivo, la 10 pénétration cutanée de substances exogènes. Cette technique mesure effectivement la vitesse de passage à travers les différentes couches de la barrière cutanée des molécules constituant le principe actif déposé à la surface de la peau. Une composition contenant la molécule à étudier est déposée dans la chambre dite « donneuse » du dispositif. La molécule diffuse ensuite à travers une membrane (la peau en 15 l'occurrence) et est collectée dans la chambre dite « réceptrice ». En pratique, le fragment de peau est déposé sur une cellule de diffusion, appelée cellule de Franz. La face profonde du derme est en contact avec une solution réceptrice qui est censée remplacer le liquide interstitiel de la peau. Une formulation contenant la molécule étudiée est déposée au-dessus de la peau. A intervalle de temps régulier, la solution 20 réceptrice est prélevée afin de doser la molécule qui a traversé la peau dégraissée et une nouvelle solution lui est alors substituée. Le dosage de substances présentes dans la phase réceptrice prélevée permet de déterminer la quantité de molécules ayant traversée la peau. La peau utilisée dans la présente expérience est celle de donneurs humains. L'analyse implique l'extraction liquide/liquide, avec comme étalon interne 25 l'Hydrocortisone, suivi de l'analyse par couplage LC-MS/MS. 1.2. Compositions et protocole d'application Les compositions utilisées sont décrites dans le tableau 3 ci-dessous. La formulation placebo sert de contrôle.

30 3031900 16 Formulation Composition A : avec triptolide Placebo (selon l'exemple 1) Quantité de formulation 20 mg 20 mg appliquée par cellule (2 cm2) Quantité de triptolide appliquée sur la peau - 8 pg Epaisseur de la peau (pm) 275 ± 61.4 251 ± 48 Nombre de cellules par 3 3 formulation Nombre de donneurs par 3 3 formulation (n = 3 par donneur) (n = 1 par donneur) Lavage avec coton tige 1X, coton tige 2X imbibé de PEG400/Ethanol (50/50; p/p), 2 X coton tiges Lavage de la formulation 24 h après application Fluide récepteur (RF) Eau/Ethanol (80/20; v/v) Echantillonage du RF 24 h Tableau 3 : Compositions et protocole sur peau humaine 2. Résultats : 5 Les résultats de la distribution percutanée du Triptolide sont présentés dans le tableau ci-dessous qui montre la distribution du Triptolide dans chaque compartiment (exprimée en % de la dose appliquée) : Compartiment cutané Composition A Non absorbé (%) 83.70 Total peau (%) 0.49 (Epiderme E + Derme partiale D) Fluide récepteur (RF) 0.55 (%) Totale absorption (`)/0) 1.05 (E + D + RF) Récupération totale (%) 84.75 Tableau 4 : Distribution percutanée du triptolide 10 Comme attendu, aucune trace de triptolide n'est détectée après application de la formule placebo.

3031900 17 Après application de la composition A, La moyenne de la récupération totale est environ 85 % de triptolide. Ce résultat est courant au vu de la technique et acceptable considérant d'une part de l'utilisation de triptolide non marqué aux radioéléments et d'autre part des marges d'erreur cumulées de chacun des compartiments.

5 En conclusion, les résultats montrent une absorption faible du Triptolide après 24 heures d'application (environ 1.1% de la dose appliquée est considéré comme biodisponible). Cette quantité correspond à la dose retrouvée dans la peau (épiderme+derme) et dans le milieu récepteur (RF). Le Triptolide est connu pour être très réactif et également toxique à forte dose. Ce résultat de faible taux de passage en 10 systémique est surprenant et inattendu et permet d'envisager une application topique sans risque du Triptolide chez l'homme.

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Composé sélectionné parmi le triptolide, ses dérivés et les sels pharmaceutiquement acceptables du triptolide et de ses dérivés, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention par voie topique d'une tumeur ou pathologie pré- cancéreuse cutanée.
2. 2. Composé pour son utilisation selon la revendication 1, dans lequel le dérivé du triptolide est sélectionné dans le groupe constitué par le triptonide, le tripdiolide, le triptolidénol, le 16-hydroxytriptolide, le triptriolide, le 12-epitriptriolide, le 14-epi-triptolide, le tripchlorolide et le dérivé PG-490-88.
3. 3. Composition topique comprenant un ou plusieurs composé(s) selon la revendication 1 ou 2, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une tumeur ou pathologie pré- cancéreuse cutanée.
4. 4. Composition topique pour son utilisation selon la revendication 3, dans laquelle le composé est le triptolide ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.
5. 5. Composition topique pour son utilisation selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle le ou les composé(s) est présent au sein d'un extrait obtenu d'une plante de la famille Celastaceae.
6. 6. Composition topique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans laquelle le ou les composé(s) sont à une concentration comprise entre 0,01% et 2% en poids par rapport au poids de la composition finale.
7. 7. Composé pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2 ou composition topique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel la tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée est sélectionnée parmi les tumeurs et pathologies pré-cancéreuses cutanées UV-induites, les métastases et les lymphomes T cutanés. 3031900 19
8. 8. Composé ou composition topique pour son utilisation selon la revendication 7, dans lequel la tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée UV-induite est sélectionné dans le groupe constitué par la kératose actinique, le carcinome basocellulaire, le mélanome et le carcinome épidermoïde.
9. 9. Composé ou composition topique pour son utilisation selon la revendication 8, dans lequel la tumeur ou pathologie pré-cancéreuse cutanée UV-induite est la kératose actinique.