ES2256887T3

ES2256887T3 - Produccion mejorada de taxanos mediante cultivos celulares de especies de taxus.

Info

Publication number: ES2256887T3
Application number: ES97926731T
Authority: ES
Inventors: Venkataraman Bringi; Prakash G. Kadkade; Christopher L. Prince; Braden L. Roach
Original assignee: Phyton Inc
Current assignee: Phyton Inc
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-27
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2017-05-27
Also published as: BR9709361A; HU0302357D0; ATE315097T1; US20130017582A1; EP1538214A1; DK0954596T3; HUP9901788A2; DE69735059D1; US8338143B2; CA2256357C; HU223267B1; KR20120138251A; KR20070094867A; BR9709361B1; JP2011212029A; EP0954596A1; AU727425B2; KR20000015952A; US20110086397A1; CA2638292A1

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA PROCEDIMIENTOS MEDIANTE LOS CUALES SE PUEDE PRODUCIR TAXOL, BACATINA II, Y OTROS COMPUESTOS DE TIPO TAXOL, O TAXANOS, CON UN RENDIMIENTO MUY ELEVADO, A PARTIR DE TODAS LAS ESPECIES DE TAXUS CONOCIDAS, P.EJ. BREVIFOLIA, CANADENSIS, CUSPIDATA, BACCATA, GLOBOSA, FLORIDANA, WALLICHIANA, MEDIA Y CHINENSIS. SE HA DESCUBIERTO QUE LAS MODIFICACIONES ESPECIFICAS DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO (ES DECIR COMPOSICIONES DE MEDIOS Y MODOS DE FUNCIONAMIENTO) INCREMENTAN EL RENDIMIENTO DE DIVERSOS TAXANOS A PARTIR DE CULTIVOS CELULARES DE TODAS LAS ESPECIES DE TAXUS. LOS AGENTES ESPECIALMENTE PREFERIDOS INCLUYEN COMPLEJO O ION DE PLATA, ACIDO JASMONICO (ESPECIALMENTE EL ESTER METILICO), REGULADORES DEL CRECIMIENTO RELACIONADOS CON LA AUXINA, E INHIBIDORES DE LA VIA METABOLICA DEL FENILPROPANOIDE, COMO EL ACIDO 3,4 - METILENDIOXI - 6 - NITROCINAMICO. DICHOS AGENTES INCREMENTADORES SE PUEDEN UTILIZAR SOLOS O COMBINADOS ENTRE SI O CON OTRAS CONDICIONES INCREMENTADORAS DEL RENDIMIENTO.SI EL RENDIMIENTO DE TAXANOS A PARTIR DEL CULTIVO DE CELULAS VEGETALES DE T. CHINENSIS SE INCREMENTA ESPECIALMENTE MEDIANTE LA UTILIZACION DE UNA O MAS DE DICHAS CONDICIONES, SE HA CONSTATADO IGUALMENTE QUE EL RENDIMIENTO DE TAXANOS PARA TODAS LAS ESPECIES DE TAXUS MEJORA CON LA UTILIZACION DE DICHAS CONDICIONES.

Description

Producción mejorada de taxanos mediante cultivos celulares de especies de Taxus.

Antecedentes de la invención A. Campo de la invención

Esta invención se dirige a métodos para la producción y recuperación mejorada de taxol, bacatina III y otros taxanos mediante cultivos celulares de especies de Taxus.

B. Técnica relacionada El Reto del Suministro de Taxanos

El taxol es un alcaloide diterpenoide aislado originalmente de la corteza del tejo del Pacífico, Taxus brevifolia (Wani y otros, 1971, J. Am. Chem. Soc., 93, 2325-2327). El interés en el taxol comenzó cuando the National Cancer Institute (NCI), en un programa de rastreo a gran escala, encontró que los extractos de corteza en bruto exhibían actividades antitumorales. Desde entonces, los experimentos clínicos han confirmado que el taxol es extremadamente eficaz contra cánceres ováricos refractarios y contra cánceres de mama y otros. El taxol ha sido declarado como un avance en la quimioterapia debido a su mecanismo de citotoxicidad fundamentalmente diferente, es decir, al inhibir la despolimerización de los microtúbulos (véase Rowinsky y otros, 1990, J. Natl. Cancer Inst., 82, 1247-1259).

Una variable desalentadora en la ecuación del taxol ha sido el suministro. El taxol derivado de corteza se ha interrumpido como la fuente primaria de fármaco comercial; se ha alcanzado producción a gran escala mediante semisíntesis, es decir, unión química de una cadena lateral al precursor derivado de la planta, 10-desacetilbacatina III. La síntesis total, aunque conseguida por laboratorios académicos, muestra pocas esperanzas como una ruta comercial viable para el taxol. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar fuentes económicas, medioambientalmente benignas y constantes de suministro para mantenerse a la altura de la creciente demanda de taxol.

Además del taxol, existe una necesidad urgente de desarrollar procedimientos para la producción comercial de moléculas de taxano relacionadas. Derivados de taxol tales como Taxotere ya se han introducido en el mercado mundial. Además, una ingente actividad de investigación se está enfocando al descubrimiento y al desarrollo de nuevos derivados de taxano con actividad ventajosa. Es probable que estos avances creen una necesidad continua de grandes cantidades de una molécula de "esqueleto" de partida apropiada a partir de la cual pudiera sintetizarse eficazmente cualquier derivado dado.

Un ejemplo de tal molécula es el precursor mencionado anteriormente, 10-desacetilbacatina III, que se usa como el punto de partida para taxol semisintético. Otra molécula de partida deseable para la producción semisintética de taxol y otros derivados es la bacatina III. La bacatina III normalmente no se acumula como un taxano principal en la planta y de ahí que no exista una fuente natural a gran escala fácil para esta molécula. Sin embargo, es un punto de partida muy deseable para la semisíntesis debido a su cercanía química con el taxol; por ejemplo, las etapas que se requieren para la acetilación de la posición 10 de la 10-desacetilbacatina III se evitan si la bacatina III es el punto de partida en vez de la 10-desacetilbacatina III.

Esta invención se refiere al desarrollo de procedimientos basados en cultivos celulares de plantas para la producción comercial de taxol, bacatina III y otros taxanos.

Cultivos Tisulares como una Fuente de Productos Químicos Derivados de Plantas

La capacidad de las células de plantas para dividirse, crecer y producir metabolitos secundarios bajo una variedad de diferentes regímenes de cultivo ha sido demostrada ampliamente por un número de grupos. En la actualidad, dos compuestos, la shikonina (un colorante rojo y un antiinflamatorio) y el ginsengósido (un tónico en la medicina oriental), se producen mediante procedimientos de cultivo tisular en Japón. Se dice que otros muchos procedimientos están cercanos a la comercialización, incluyendo la vainillina, la berberina y el ácido rosmarínico. (Véase Payne y otros, 1991, "Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems", Hanser Publishers, Munich).

Las ventajas de un procedimiento de cultivo de células de plantas para taxol, bacatina III y taxanos son muchas: (i) Un procedimiento de cultivo celular asegura un suministro ilimitado, continuo y uniforme de producto, y no está sometido a plagas, desastres y fluctuaciones estacionales, (ii) los cultivos celulares pueden cultivarse en grandes biorreactores, y pueden inducirse para sobreproducir el compuesto de interés manipulando las condiciones ambientales, (iii) los cultivos celulares producen un espectro de compuestos más simple en comparación con la corteza o las agujas, simplificando considerablemente la separación y la purificación, (iv) un procedimiento de cultivo celular puede adaptarse velozmente a cambios rápidos en la demanda mejor que los procedimientos basados en la agricultura, (v) además de suministrar taxol, bacatina III y otros precursores, un procedimiento de cultivo celular también podría producir compuestos de taxano que exhiban perfiles de bioactividad ventajosos, o que pudieran convertirse en otros derivados bioactivos.

Puesto que el cultivo de células de planta aséptico a gran escala es inherentemente costoso, un procedimiento de cultivo celular se hace comercialmente pertinente solo cuando estos costes son compensados por una alta productividad. Cada especie de planta y metabolito elegido como objetivo es diferente y son necesarios diferentes planteamientos para cada sistema particular. Esta invención se enfoca a planteamientos creativos y experimentados para obtener cultivos de células de plantas altamente productivos para la producción de taxol, bacatina III y taxanos.

Problemas con Cultivos Tisulares de Plantas Leñosas y Coníferas

Un examen histórico de la literatura sugiere que aunque las plantas herbáceas se han manipulado de forma relativamante fácil en cultivo, los cultivos productivos de plantas leñosas y coníferas se han conseguido solo con dificultad.

El crecimiento de cultivos de gimnospermas y coníferas que producen metabolitos secundarios ha sido generalmente bajo. Por ejemplo, Berlin y Whitte (1988, Phytochemistry, 27, 127-132) encontraron que los cultivos de Thuja occidentalis incrementaban su biomasa en solo alrededor de 30% en 18 días. Van Uden y otros (1990, Plant Cell Reports, 9, 257-260) presentaron un incremento de biomasa de 20-50% en 21 días para suspensiones de Callitris drummondii. Westgate y otros (1991, Appl. Microbiol.Biotechnol., 34, 798-803) presentaron un tiempo de doblamiento de alrededor de 10 días para suspensiones de la gimnosperma Cephalotaxus harringtonia. Según se resume por Bormnan (1983, Physiol. Plant. 57, 5-16), se ha dirigido una enorme cantidad de esfuerzo hacia el desarrollo de medios para suspensiones de picea (Picea abies). Este trabajo colectivo demuestra que las suspensiones de gimnospermas son en efecto capaces de crecimiento rápido, pero que no pueden aplicarse generalidades, y que las formulaciones de medios para diferentes líneas celulares deben optimizarse independientemente.

Un examen de la productividad de metabolitos secundarios entre cultivos de gimnospermas también apunta a la dificultad de inducir la biosíntesis rápida en comparación con especies herbáceas. Por ejemplo, los cultivos de Cephalotaxus harringtonia producían alcaloides terpénicos en un nivel de solo 1% a 3% del que se encontraba en la planta originaria (Delfel y Rothfus, 1977, Phytochemistry, 16, 1595-1598). Incluso durante una estimulación satisfactoria, Heinstein (1985, Journal of Natural Products, 48, 1-9) sólo fue capaz de aproximarse a los niveles producidos en la planta originaria (alrededor de 0,04% de alcaloides totales en peso seco). Van Uden y otros (1990) fueron capaces de inducir a que los cultivos de suspensión de la conífera Callitris drummondii produjeran podofilotoxina, pero sólo en niveles de un décimo de los producidos por las agujas. La capacidad de Thuja occidentalis para producir niveles significativos de monoterpenos (10-20 mg/l) y del diterpenoide deshidroferruginol (2-8 mg/l) ha sido demostrada convincentemente por Berlin y otros (1988). Sin embargo, estos resultados se obtuvieron con un cultivo que crece lenta-
mente (30% de incremento de biomasa en 18 días) y de baja densidad celular (de 5 a 7 gramos de peso seco por litro).

Cultivo de Células para la Producción de Taxanos

Las dificultades para alcanzar crecimiento rápido y alta productividad encontradas en suspensiones de gimnospermas se han reflejado generalmente en los informes hasta ahora sobre la producción de taxanos en cultivos celulares de Taxus.

Jaziri y otros (1991, J Pharm. Belg., 46, 93-99) iniciaron recientemente cultivos de callos de Taxus baccata, pero fueron incapaces de detectar taxol usando su ensayo de inmunoabsorción. Wickremesinhe y Arteca (1991, Plant Physiol., 96, (Suplemento) p. 97) dieron cuenta de la presencia de 0,009% en peso seco de taxol en cultivos de callos de Taxus media (variedad de cultivo hicksii), pero no se indicaban detalles de los tiempos de doblamiento, las densidades celulares y la escala temporal sobre la que se producía el taxol presentado.

La Patente de EE.UU. Nº 5.019.504 (Chirsten y otros, 1991) describe la producción y la recuperación de taxano y compuestos similares a taxano mediante cultivos celulares de Taxus brevifoia. Estos investigadores dieron cuenta de la producción de taxol a un nivel de 1 a 3 mg/l en un espacio de tiempo de dos a cuatro semanas. También dieron cuenta de un incremento en la masa celular de "5-10 veces en 3-4 semanas", lo que corresponde a tiempos de doblamiento de alrededor de 7 a 12 días.

EP-A-0683232 describe un método para producir taxanoditerpeno a partir de células de Taxus baccata. Los inventores dan cuenta de un rendimiento de taxol de 29,7 mg/l durante dos días de cultivo.

Mirjalili y otros (Biotechnol. Prog. 1996, 12, 110-118) dieron cuenta de que la producción de taxol a partir de células de Taxus cuspidata cultivadas se incrementaba 19 veces hasta 2,8 mg/l en 51 horas durante investigaciones sobre la interacción del etileno en rutas de transducción de señales de sistemas defensivos de plantas.

Se requieren incrementos significativos en las concentraciones y la productividad volumétrica de taxanos antes de que un procedimiento de cultivo celular de plantas económicamente viable para la producción de taxano pueda suministrar la demanda anual proyectada de muchos cientos de kilogramos al año.

Sumario de la invención

Los objetivos de esta invención incluyen la formulación de condiciones medioambientales especiales para fomentar el crecimiento rápido, altas densidades celulares y altas viabilidades celulares. (Las características de crecimiento presentadas en este estudio sobrepasan los resultados previos en un factor significativo).

Un objetivo de esta invención es producir taxanos a altas velocidades mediante la selección cuidadosa de líneas celulares, la elección y la manipulación cuidadosas de las condiciones del medio, la incorporación de agentes de mejora y la selección cuidadosa de los modos de poner en práctica el procedimiento.

Los objetivos de esta invención incluyen la capacidad para manipular el perfil de taxanos producidos alternando las formulaciones de los medios y las condiciones ambientales. En particular, un objetivo es alentar a las células para producir taxol o bacatina III como el producto de taxano predominante, y/o suprimir la producción del subproducto cefalomanina, proporcionando de ese modo una solución biológica elegante para un problema de separación y purificación aguas abajo costoso e importante. Estos y otros objetivos son cumplidos por una o más de las modalidades de esta invención.

Los inventores han descubierto que el taxol, la bacatina III y otros compuestos similares a taxol, o taxanos, pueden producirse con un rendimiento muy alto a partir de todas las especies de Taxus conocidas, por ejemplo, brevifolia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, wallichiana, media y chinensis. Además, mediante el método de esta invención, es posible obtener taxol, bacatina III y otros taxanos en un espacio de tiempo mucho más corto que el presentado previamente. En particular, los inventores encontraron que la especie Taxus chinensis es capaz de crecimiento rápido y de producir niveles extremadamente altos de taxol, bacatina III y taxanos en un corto período de tiempo. Con la especie Taxus chinensis, los inventores han podido manipular las células para dar taxol, bacatina III y taxanos en cantidades muy por encima de las cantidades obtenidas a partir de cultivos tisulares de las otras especies de Taxus.

Se ha descubierto que modificaciones particulares de las condiciones de cultivo (es decir, composición del medio y modos de puesta en práctica) mejoran el rendimiento de diversos taxanos a partir del cultivo celular de todas las especies de Taxus. Agentes de mejora particularmente preferidos incluyen ión o complejo de plata, ácido jasmónico (especialmente el éster metílico), reguladores del crecimiento relacionados con auxinas e inhibidores de la ruta fenilpropanoide, tales como ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico. Estos agentes de mejora pueden usarse solos o en combinación entre sí o con otras condiciones que mejoren el rendimiento. Aunque el rendimiento de los taxanos a partir del cultivo de células de planta de T. chinensis se mejora particularmente mediante el uso de una o más de estas condiciones, se ha encontrado que el rendimiento de los taxanos para todas las especies de Taxus se beneficia del uso de estas condiciones.

En una modalidad, esta invención proporciona un método para producir taxanos con altos rendimientos en cultivo celular de una especie de Taxus, que comprende cultivar las células de una especie de Taxus en cultivo en suspensión en uno o más medios nutrientes bajo condiciones de crecimiento y formación de producto, y recuperar uno o más taxanos de dichas células o dicho medio de dicho cultivo, o ambos, derivándose las células de cultivos callosos o en suspensión y conteniendo los medios nutrientes un inhibidor del metabolismo fenilpropanoide. Inhibidores adecuados del metabolismo fenilpropanoide incluyen ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico, ácido 3,4-metilendioxicinámico, ácido 3,4-metilendioxifenilpropiónico, ácido 3,4-metilendioxifenilacético, ácido 3,4-metilendioxibenzoico, ácido 3,4-trans-dimetoxicinámico, ácido 4-hidroxicinámico, ácido fenilpropiólico, fluorofenilalanina, 1-aminobenzotriazol, ácido 2-hidroxi-4,6-dimetoxibenzoico, SKF-525A, oxalato amónico, vinilimidazol, ácido dietiltiocarbámico y ácido sinápico.

En una modalidad preferida, al menos uno de los uno o más medios nutrientes usados en el método de esta invención también comprende otro agente de mejora que puede ser un inhibidor de la acción del etileno; ácido jasmónico o un éster de ácido jasmónico; o un regulador del crecimiento relacionado con auxinas. En modalidades particularmente preferidas, el otro agente de mejora es un inhibidor de la acción del etileno que es un compuesto que contiene plata, o un complejo de plata, o un ión plata. En otra modalidad particularmente preferida, el otro agente de mejora es ácido jasmónico o un éster alquílico del mismo y, más preferiblemente, el grupo alquilo esterificado al ácido jasmónico tiene de uno a seis átomos de carbono. En una modalidad aún más preferida, el agente de mejora es ácido jasmónico o un éster alquílico del mismo y el medio también contiene un compuesto que contiene plata, un complejo de plata o ión plata. En otra modalidad particularmente preferida más, el otro agente de mejora es un regulador del crecimiento relacionado con auxinas, tal como ácido indolacético, picloram, ácido \alpha-naftalenoacético, ácido indolbutírico, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 3,7-dicloro-8-quinolincarboxílico o ácido 3,6-dicloro-o-anísico.

En cualquiera de las modalidades anteriores, los uno o más medios nutrientes también pueden incluir un precursor de taxano, que puede ser \alpha-fenilalanina, \beta-fenilalanina o una mezcla de las mismas. En cualquiera de las modalidades anteriores, los uno o más medios nutrientes también pueden incluir glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico o una mezcla de estos aminoácidos, o uno o más medios nutrientes usados en el cultivo de estas células pueden incluir maltosa, sacarosa, glucosa y/o fructosa como una fuente de carbono, preferiblemente como la fuente de carbono primaria. En una modalidad, el medio nutriente es el mismo para el crecimiento del cultivo celular y para la producción de taxol y taxanos. En una modalidad alternativa, la producción de uno o más taxanos induce el cultivo cambiando la composición del medio nutriente. En una modalidad preferida, el medio del cultivo se intercambia periódicamente y típicamente el intercambio del medio lleva a cabo la retirada periódica de taxanos del cultivo. Preferiblemente, las células de dichas especies de Taxus se cultivan mediante un procedimiento de alimentación por partidas ("fed-batch").

Típicamente, el taxol o la bacatina III y/u otros taxanos se recuperan de dichas células o dicho medio de dicho cultivo celular, o ambos. Generalmente, el cultivo de especies de Taxus de acuerdo con la invención proporciona una productividad volumétrica media de taxanos que es al menos 15 m g/l/día promediada a lo largo del período de la producción de taxanos. La productividad volumétrica media de taxol es típicamente al menos 10 mg/l/día computada durante el período de producción de taxol. La productividad volumétrica media de bacatina III es típicamente al menos 15 mg/l/día computada durante el período de producción de taxanos.

Preferiblemente, las células cultivas de acuerdo con el método de esta invención son células de especies de Taxus, y las especies pueden ser T. brevifolia, T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. baccata, T globosa, T. floridana, T. wallichiana o T. media. Preferiblemente, las células de una especie de Taxus usada en el método de esta invención son células que producen taxol por encima del fondo mediante ELISA en cultivo calloso o cultivo en suspensión en medio que no contiene agentes de mejora. Más preferiblemente, las células de una especie de Taxus usada en el método de esta invención son células que producen taxanos en cultivo en suspensión a una productividad volumétrica media de 10 mg/l en un medio que contiene tiosulfato de plata, jasmonato de metilo y auxina.

Descripción de las figuras

Figura 1. Incremento de biomasa en una línea K-1 de cultivo en suspensión de Taxus chinensis sobre un ciclo de crecimiento discontinuo típico en Medio A. Las barras de error representan la desviación estándar medida a partir de matraces duplicados.

Figura 2. Efecto del intercambio de medio los días 9 y 12 sobre la productividad de taxol (A) y taxanos totales (B) en un experimento de 15 días. Los números de cada caja representan el intervalo de tiempo (días) durante el cual se producía el producto. La porción oscurecida de las cajas intracelulares representa el taxol o los taxanos totales que estaban presentes en el inóculo celular al comienzo del experimento. Todos los tratamientos se realizaron por duplicado. Se usó línea celular K-1 en suspensión de Taxus chinensis con Medio A como el elaborado en la Tabla 2.

Figura 3. Características espectrales de una lámpara Standard Gro-Lux (GTE Sylvania, Danvers, MA) usada en el Ejemplo 7.3.

Figura 4. Producción de taxanos en suspensión K-1 de células de Taxus chinensis. Se muestra la porción del cromatograma de 10 a 40 minutos. Las exploraciones de ordenación de diodos de picos de taxanos seleccionados muestran un espectro de absorción UV de taxanos característico, con un pico a 227 nm.

Figura 5. Producción de taxol y taxanos después del cultivo prolongado en Medio C mediante la línea celular K-1 de Taxus chinensis. El panel superior tabula los datos para los taxanos conocidos y desconocidos, mientras que el panel inferior muestra la producción incremental de taxol y taxanos en el período de tiempo de 25 a 42 días.

Figura 6. Confirmación por MS/MS de taxol en el sobrenadante de cultivo celular. El Panel A muestra el espectro de masas APCI de pulverización iónica de taxol auténtico y el Panel B muestra el espectro iónico descendiente del pico originario (m/z 871 = taxol + NH_{4}^{+}). El Panel C representa el espectro APCI de pulverización iónica de un extracto de cultivo celular en bruto y muestra m/z 854 y 871 característicos de taxol. El Panel D muestra el espectro descendiente correspondiente de m/z 871 y proporciona una evidencia inequívoca de la presencia de taxol en el sobrenadante de cultivo celular.

Descripción detallada de la invención

Las plantas han proporcionado durante mucho tiempo fuentes importantes de productos farmacéuticos y productos químicos especializados. Estos productos se han obtenido típicamente a través de la extracción de los materiales de plantas recogidas o mediante síntesis química. El taxol y los taxanos se han convertido en una de las clases más importantes de agentes anticancerígenos en emerger recientemente del rastreo de productos naturales.

Según se usan aquí, los términos compuestos similares a taxol, o taxanos, se usan de forma intercambiable para describir un compuesto diterpenoide con un anillo de taxano. Los taxanos pueden poseer ellos mismos actividad antineoplástica, o pueden modificarse para dar compuestos bioactivos. El término taxanos totales se refiere a todos los taxanos que exhiben una absorbancia UV característica según se describe en el Ejemplo 5 posteriormente.

Según se usa aquí, el término "callo" se usa para describir una masa de células de planta cultivadas que no está estructuralmente diferenciada, y se cultiva sobre medio solidificado. Según se usa aquí, el término "cultivo en suspensión" se usa para describir células estructuralmente no diferenciadas que están dispersadas en un medio nutriente líquido. Se entiende que los cultivos en suspensión comprenden células en diversas fases de agregación. Un intervalo de tamaños de agregados se encuentra en las suspensiones descritas en esta invención, con tamaños que varían desde decenas de micras de diámetro (células simples o pocas células agregadas) a agregados de muchos milímetros de diámetro, que consisten en muchos miles de células.

El material de plantas útil en esta invención puede obtenerse de cualquier especie de Taxus conocida, por ejemplo brevifolia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, wallichiana (también conocida como yunnanensis), media, fastigiata y chinensis (incluyendo las especies sinónimas, tales como sumatrama, celebica y speciosa, y la subespecie chinensis var. mairei). En particular, los inventores han identificado a la especie Taxus chinensis como capaz de producir cantidades significativas de taxol, bacatina III y taxanos con altas productividades volumétricas.

Ha sido encontrado por los inventores que el contenido de taxanos específico varía con la especie de planta, y dentro de la especie de planta con la fuente de tejido y los árboles específicos. Seleccionar una fuente y un cultivo de alto rendimiento para la producción de taxanos es una primera etapa importante para proporcionar cantidades suficientes de taxanos para uso terapéutico.

Puntos de Referencia para la Importancia Comercial

Puede usarse un número de puntos de referencia para calibrar el atractivo y la viabilidad comerciales de un procedimiento basado en cultivo de células de plantas dado para la producción de taxanos. Los puntos de referencia deben caracterizar y apuntalar los parámetros de comportamiento clave del procedimiento, incluyendo los costes de fermentación, la facilidad de recuperación aguas abajo y la capacidad de producción. Los puntos de referencia que se describirán aquí son la valoración del caldo y la productividad volumétrica.

La valoración del caldo se define como la concentración de producto en todo el caldo y se expresa habitualmente como miligramos de producto por litro de caldo (mg/ml). Por definición, la valoración de todo el caldo no distingue entre las porciones intracelulares y extracelulares del producto. La valoración del caldo se usa típicamente para caracterizar el comportamiento de un procedimiento discontinuo o de alimentación por partidas. Una valoración del caldo superior implica una mayor capacidad de producción para un volumen del reactor dado, y, simultáneamente, costes de producción unitarios inferiores. De forma similar, un producto de alta valoración habitualmente es más fácil de recuperar con alto rendimiento, conduciendo así a mejoras adicionales en los costes de producción unitarios.

La productividad volumétrica se define como la cantidad de producto producida por unidad de volumen de reacción por unidad de tiempo, y se expresa comúnmente en unidades de miligramos por litro al día. Para los propósitos de la producción de taxanos, la escala de tiempo se define como el espacio de tiempo durante el cual tiene lugar la producción a la escala de producción inmediatamente precedente a la recogida y la recuperación. La productividad volumétrica complementa a la valoración como un punto de referencia para procedimientos discontinuos y de alimentación por partidas, y habitualmente es útil para caracterizar procedimientos en los que el producto se retira durante la producción, por ejemplo, mediante intercambio de medio periódico u otro método de retirada. Una alta productividad volumétrica implica mayor capacidad de producción para un volumen de reactor dado a lo largo de un período de tiempo largo y, simultáneamente, costes de producción unitarios inferiores y mayor comportamiento global del procedimiento.

En ciertos casos, la productividad volumétrica se usa para calibrar la capacidad intrínseca de un procedimiento biológico - por ejemplo, en las primeras fases del desarrollo del procedimiento, es útil medir la productividad a lo largo de la parte más productiva del ciclo de producción, es decir, durante un corto período de tiempo cuando las velocidades de biosíntesis están en su máximo. Esto se denomina típicamente la productividad volumétrica instantánea máxima. Sin embargo, al calibrar el comportamiento de un procedimiento, el punto de referencia más apropiado es la productividad volumétrica media en la que la productividad se mide a lo largo de toda la fase productiva. Claramente, para alcanzar la productividad volumétrica media más alta, la productividad instantánea máxima debe mantenerse a través de la mayoría de la fase productiva. A no ser que se indique otra cosa, el término productividad volumétrica se refiere a la productividad volumétrica media, determinada para toda la fase de producción. Típicamente, la fase de producción se inicia mediante cambios en la composición del medio nutriente, bien reemplazando el medio de crecimiento por medio de producción o bien añadiendo agentes de mejora que inducen una mejora significativa en la producción de taxanos.

Iniciación de Líneas Celulares de Taxus

El material de plantas de Taxus puede recogerse de toda Norteamérica así como de otros continentes. El cultivo se inicia seleccionando el tejido de Taxus apropiado para el crecimiento. Puede seleccionarse tejido de cualquier parte de la planta, incluyendo la corteza, el cámbium, las agujas, los tallos, las semillas, las piñas y las raíces, para inducir el callo. Sin embargo, para un rendimiento óptimo de taxol, se prefieren las agujas y las regiones meristemáticas de partes de la planta. Lo más preferido son agujas de crecimiento reciente (por ejemplo, de uno a tres meses de edad) que generalmente pueden identificarse por un color verde más claro. El término "de crecimiento reciente" pretende significar ampliamente la producción de agujas de planta dentro de la estación de crecimiento del año.

Para prevenir la contaminación del cultivo, el tejido debe esterilizarse superficialmente antes de introducirlo en el medio de cultivo. Podría ser eficaz cualquier técnica de esterilización convencional, tal como CLOROX (una marca comercial propiedad de CLOROX Company para un blanqueador). Además, pueden usarse agentes antimicrobianos, tales como cefoxitina, benlato, cloxacilina, ampicilina, sulfato de gentamicina, y fosfomicina, para la esterilización superficial del material de plantas.

Crecimiento del Callo

Los cultivos exhibirán típicamente variabilidad en la morfología del crecimiento, la productividad, los perfiles del producto y otras características. Puesto que las líneas celulares individuales varían en sus preferencias para los constituyentes del medio de crecimiento, pueden usarse muchos medios de crecimiento diferentes para la inducción y la proliferación del callo.

La composición del medio apropiada varía con la especie que se cultiva. Los medios preferidos para las diferentes especies se listan en la Tabla 3. Por ejemplo, aunque pueden usarse otros, los medios nutrientes de crecimiento preferidos para Taxus chinensis son A, D, I, J, K, L, M, O y P. Estos medios contienen preferiblemente los ingredientes listados en la Tabla 2. Los cultivos se llevan a cabo preferiblemente con componentes del medio incorporados a los niveles mostrados en la Tabla 2, aunque el experto apreciará que algunas variaciones en estos niveles no afectarán adversamente el crecimiento celular. Por ejemplo, cuando se usa medio A, se incorporan hormonas o reguladores del crecimiento en el medio en una cantidad entre 1 ppb y 10 ppm, y preferiblemente de 2 ppb a 1 ppm. Cuando se usa el medio D, las hormonas o los reguladores del crecimiento se incorporan en niveles que varían de 1 ppb a 10 ppm, y preferiblemente de 2 ppb a 2 ppm. Las cantidades de otros ingredientes del medio pueden incorporarse en niveles que varían de 1/10 de la concentración a tres veces las concentraciones indicadas en la Tabla 2.

La producción de taxanos en grandes cantidades se facilita cultivando células de Taxus en cultivo en suspensión. Generalmente, el cultivo en suspensión puede iniciarse usando un medio de cultivo que era satisfactorio en el cultivo calloso. Sin embargo, los requisitos para un cultivo en suspensión, y particularmente para la producción altamente eficaz de taxanos, pueden cumplirse mejor mediante la modificación del medio. Se ha encontrado que cuando se cultivan células de Taxus en medio de cultivo modificado y los parámetros de procesamiento se adaptan de acuerdo con el método de la invención, el rendimiento de uno o más taxanos a partir del cultivo se incrementa substancialmente.

Según se usa aquí, el término "medio nutriente" se usa para describir un medio que es adecuado para cultivos callosos y en suspensión de células de plantas. El término "medio nutriente" es general y abarca tanto "medio de crecimiento" como "medio de producción". El término "medio de crecimiento" se usa para describir un medio nutriente que favorece el crecimiento rápido de células cultivadas. El término "medio de producción" se refiere a un medio nutriente que favorece la biosíntesis de taxol, bacatina III y taxanos en células cultivadas. Se entiende que puede producirse crecimiento en un medio de producción y que puede tener lugar producción en un medio de crecimiento; y que tanto el crecimiento como la producción óptimos pueden tener lugar en un solo medio nutriente.

Crecimiento en Suspensión

Los cultivos en suspensión de Taxus son capaces de velocidades de crecimiento rápidas y altas densidades celulares como otros cultivos de células de plantas. Sin embargo, las condiciones óptimas pueden variar de una línea celular a otra y, de acuerdo con esto, deben considerarse métodos que conducen hacia la optimización rápida para cualquier línea celular dada.

Los cultivos de diversas especies de Taxus se cultivan mediante transferencia en medios nutrientes que contienen sales macro- y micro-nutrientes, fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, vitaminas, ácidos orgánicos y reguladores del crecimiento de las plantas naturales y sintéticos. En particular, un medio nutriente para el cultivo en suspensión de células de Taxus contendrá típicamente sales inorgánicas que suministran los macronutrientes calcio, magnesio, sodio, potasio, fosfato, sulfato, cloruro, nitrato y amonio y micronutrientes tales como cobre, hierro, manganeso, molibdeno, zinc, boro, cobalto, yodo y níquel. El medio también contendrá típicamente vitaminas tales como mioinositol, tiamina, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido fólico, piridoxina y opcionalmente biotina, pantotenato, niacina y similares. Estos componentes pueden estar presentes a lo largo de concentraciones de 1/30 a treinta veces las concentraciones listadas en la Tabla 2, y preferiblemente a de 1/20 a veinte veces las concentraciones listadas en la Tabla 2, más preferiblemente a de 1/3 a tres veces las concentraciones listadas en la Tabla 2 y lo más preferiblemente a las concentraciones listadas en la Tabla 2.

El medio nutriente también contendrá una o más fuentes de carbono y típicamente contendrá una fuente de carbono primaria, que se define como una fuente que proporciona más de 50% del carbono total en el medio nutriente. La fuente de carbono primaria es preferiblemente lactosa, galactosa, rafinosa, manosa, celobiosa, arabinosa, xilosa, sorbitol o, preferiblemente, glucosa, fructosa, sacarosa o maltosa. La concentración de la fuente de carbono primaria puede variar de 0,05% (p/v) a 10% (p/v) y preferiblemente de 0,1% (p/v) a 8% (p/v).

El medio nutriente también contendrá una fuente de nitrógeno, que, además de cualquier nitrógeno añadido en forma de sales macronutrientes, será proporcionada preferiblemente al menos en parte por una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, uno o más aminoácidos tales como glutamina, ácido glutámico y ácido aspártico o hidrolizados de proteínas). Estas fuentes de nitrógeno orgánico pueden suministrar nitrógeno a concentraciones que varían de 0,1 mM a 60 mM y preferiblemente de 1 a 30 mM. El medio también puede contener uno o más ácidos orgánicos tales como acetato, piruvato, citrato, oxoglutarato, succinato, fumarato, maleato y similares. Estos componentes pueden incluirse en el medio en concentraciones de 0,1 mM a 30 mM y preferiblemente en concentraciones de 0,5 mM a 20 mM.

El medio también contendrá típicamente uno o más reguladores del crecimiento de las plantas naturales o sintéticos, incluyendo reguladores del crecimiento relacionados con auxinas, tales como picloram, ácido indolacético, ácido 1-naftalenoacético, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 3,7-dicloro-8-quinolincarboxílico, ácido 3,6-dicloro-o-anísico y similares, reguladores del crecimiento relacionados con citoquininas tales como N^{6}-benciladenina, 6-[\gamma,\gamma-dimetilalilamino]purina, cinetina, zeatina, N-fenil-N'-1,2,3-tidiazol-5-ilurea (tidiazurón) y derivados de fenilurea relacionados y similares, giberelinas tales como GA_{3}, GA_{4}, GA_{7} y derivados de GA, ácido abscísico y sus derivados, brasinosteroides y reguladores del crecimiento relacionados con el etileno. Reguladores del crecimiento de las plantas relacionados con auxinas adecuados adicionales se listan posteriormente. Debe apuntarse que el medio nutriente puede contener más de un regulador del crecimiento perteneciente a una sola clase, por ejemplo, más de un solo regulador del crecimiento relacionado con auxinas o más de un regulador relacionado con citoquininas. Los reguladores del crecimiento se incorporarán preferiblemente en el medio a una concentración entre 10^{-10} M y 10^{-3} M, preferiblemente a de 10^{-8} a 3 x 10^{-5} M y más preferiblemente a las concentraciones listadas en la Tabla 2.

A no ser que se indique otra cosa, los medios de crecimiento, según se definen aquí, proporcionan un punto de partida adecuado para la optimización normal de medios de cultivo calloso y medios de producción. Es un asunto habitual para los expertos en la técnica incorporar, modificar y manipular clases particulares de componentes, y componentes de dentro de una clase dada, para alcanzar un comportamiento óptimo; modificaciones de medios particulares se proporcionan en las Tablas y los Ejemplos posteriores.

Los medios de cultivos se exponen a un ambiente gaseoso tal como aire y preferiblemente se baten o se agitan de otro modo para permitir la mezcladura apropiada de los componentes del cultivo. Los cultivos se mantienen a una temperatura entre 23ºC y 27ºC, aunque bajo condiciones y/o circunstancias apropiadas, las temperaturas podrían variar de 0ºC a 33ºC. El pH puede ser de aproximadamente 3 a 7 y preferiblemente estar entre 4 y 6. El cultivo puede hacerse crecer bajo condiciones de luz que varían desde oscuridad total hasta luz total (espectro de banda estrecha y/o ancho) durante diversos períodos de tiempo.

Los tiempos de doblamiento se han medido controlando el incremento de biomasa dependiente del tiempo, así como simplemente controlando el índice de crecimiento durante un subcultivo habitual. Se han alcanzado densidades en peso seco máximas de 15-24 gramos por litro. Las características de crecimiento de diversas suspensiones de especies de Taxus se elaboran en el Ejemplo 4.

Condiciones para la Producción de Taxanos

Si la formación de metabolitos secundarios en un cultivo en suspensión tiene lugar simultáneamente con el crecimiento, el metabolito se denomina asociado con el crecimiento, y una sola formulación de medio puede ser suficiente para alcanzar buen crecimiento y producción de alto nivel. En muchos otros sistemas se ha encontrado que el crecimiento rápido y la formación de productos alta no tienen lugar simultáneamente. En tales casos, las fases de crecimiento y producción están separadas y se desarrolla independientemente un medio para cada fase (revisado en Payne y otros, 1991, Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, Hanser Publishers, Munich). En el caso de la producción y taxanos en Taxus, el crecimiento y la formación de productos pueden separarse, y se han desarrollado medios independientes para cada uno.

En un modo preferido de esta invención, la composición del medio durante la fase de crecimiento celular es diferente de la composición del medio durante la fase de producción de taxanos. Por ejemplo, la identidad y el nivel de las fuentes de carbono, particularmente la fuente de carbono primaria, puede cambiar entre la fase de crecimiento y la fase de producción. Preferiblemente, el medio de producción contendrá azúcar a un nivel superior que el medio de crecimiento. Más preferiblemente, el nivel de azúcar inicial en el medio de producción puede ser 2-20 veces superior en la fase de producción que en la fase de crecimiento. La fuente de carbono primaria es preferiblemente lactosa, galactosa, rafinosa, manosa, celobiosa, arabinosa, xilosa, sorbitol o, preferiblemente, glucosa, fructosa, sacarosa o maltosa. La concentración de la fuente de carbono primaria puede variar de 0,05% (p/v) a 10% (p/v) y preferiblemente de 0,1% (p/v) a 8% (p/v). Fuentes de carbono particularmente preferidas para la producción de taxol o bacatina son maltosa, sacarosa, glucosa y/o fructosa. En modalidades particularmente preferidas, estos azúcares se incorporarán en el medio nutriente inicial a concentraciones de al menos 3,5%.

La identidad y el nivel de suplementos orgánicos, que pueden incluir vitaminas, fuentes de nitrógeno orgánicas tales como aminoácidos, así como la presencia o niveles de los agentes de mejora descritos posteriormente, pueden cambiar o pueden diferir en los medios. La identidad y los niveles de los reguladores del crecimiento de las plantas naturales o sintéticos pueden diferir entre los medios. De forma similar, los niveles y la identidad de sales macronutrientes y micronutrientes también pueden diferir entre los medios de crecimiento y producción. Preferiblemente, el contenido de sal se reduce en el medio de producción con relación al medio de crecimiento, opcionalmente, las sales de nitrato y sulfato se reducen desproporcionadamente y más preferiblemente la extensión de la reducción es una reducción en un factor de 2-20 veces. Sin embargo, se entiende que puede formularse para este cultivo un solo medio de crecimiento/producción.

Los medios de producción desarrollados aquí no solo incrementan la formación de taxanos sino que también dirigen la biosíntesis celular hacia la producción de taxanos particulares, tales como taxol o bacatina III. Además, la producción de subproductos interferentes tales como cefalomanina es mínima en comparación con el tejido de corteza. Los medios de producción desarrollados aquí también promueven la viabilidad y la biosíntesis celular prolongadas y, además, hacen que se secreten al medio extracelular niveles significativos de producto. Estas características son extremadamente importantes en la puesta en práctica de un procedimiento a escala comercial eficaz para la producción de taxanos.

Los métodos para la extracción y la recuperación de taxol y taxanos a partir de las células y el medio siguen técnicas convencionales (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5). La técnica de inmunoensayo (ELISA) seguía en gran parte los procedimientos suministrados por Hawaii Biotechnology en el estuche disponible comercialmente (véase además, Grothaus y otros, 1995, Journal of Natural Products; 58, 1003-1014, incorporado aquí mediante referencia). El anticuerpo puede ser específico para cualquier taxano, tal como taxol o bacatina III, o, menos específicamente, para el esqueleto de taxano. Los métodos de cromatografía líquida de alta resolución se modificaron ligeramente a partir de los procedimientos existentes que se elaboran en el Ejemplo 5. Bajo las condiciones usadas en esta invención, se alcanzó una resolución clara de picos de taxanos, dando como resultado una detección y una cuantificación exactas. Debido a la posibilidad de co-eluir componentes no taxánicos, la pureza espectral de cada pico de taxano putativo se verificó ordinariamente mediante ordenación de diodos antes de la integración de las áreas de los picos. Los tiempos de retención de patrones de taxanos se listan en el Ejemplo 5, y un cromatograma de muestras se incluye en la Figura 4.

Para las plantas superiores, la luz es un potente factor en el metabolismo secundario tanto en plantas intactas como en cultivos celulares. Tanto la intensidad como la longitud de onda de la luz son importantes (Seibert y Kadkade 1980, "Plant Tissue Culture as a Source of Biochemicals" E.J. Staba (ed), CRC Press, Boca Ratón, Florida, pp. 123-141). Por ejemplo, las biosíntesis de flavanoides y antocianina están habitualmente favorecidas por una luz continua de alta intensidad, mientras que los cultivos cultivados en la oscuridad pueden ser preferibles para otros metabolitos. El incremento en el verdor o la capacidad fotosintética de las células cultivadas también puede incrementar la formación de producto o el espectro de productos. Los estudios de los inventores implicaban el uso de fuentes luminosas de banda ancha así como de banda estrecha específica. Según se muestra en el Ejemplo 7.3, la exposición a la luz puede producir la acumulación de taxol incrementada así como la secreción al medio. El efecto estimulante de la luz sobre la producción de taxol sugiere la existencia de mecanismos de control únicos para la biosíntesis de taxanos. La naturaleza del fotorreceptor y las características bioquímicas de la estimulación inducida por luz no están todavía claras. Sin embargo, la incorporación de agentes de mejora, de acuerdo con las enseñanzas de esta invención, hace el papel de la luz menos crítico para un comportamiento óptimo.

Además de nutrientes disueltos no volátiles, los componentes gaseosos, principalmente oxígeno, dióxido de carbono y etileno (una hormona de planta), pueden representar papeles críticos en el crecimiento y la formación del producto. Dos parámetros son importantes. Las concentraciones de gas disuelto que favorecen el crecimiento y la formación de taxol son obviamente importantes ya que dictan las condiciones de operación del reactor. Además, las velocidades de consumo o producción necesitan incorporarse al diseño del reactor, de modo que pueden mantenerse las concentraciones especificadas óptimas.

Además de su importancia en la respiración, el oxígeno también puede afectar drásticamente a la velocidad de biosíntesis de metabolitos secundarios. Una alta constante de saturación para una etapa que requiere oxígeno en una ruta biosintética secundaria puede requerir que las células se sometan a altos niveles de oxígeno en el reactor. Se ha documentado la importancia de la complementación con CO_{2} para mantener altas velocidades de crecimiento. El etileno, una hormona de plantas, representa papeles pleiotrópicos en todos los aspectos del crecimiento y el desarrollo de las plantas, incluyendo el metabolismo secundario (por ejemplo, véase Payne y otros, 1991).

Los inventores han encontrado que ciertos regímenes de concentraciones de gases pueden favorecer el crecimiento y el metabolismo secundario en cultivos celulares. Por ejemplo un intervalo de concentraciones de oxígeno puede ser compatible con la cultivación del cultivo desde 1% de saturación de aire hasta 200% de saturación de aire, y preferiblemente en el intervalo de 10% a 100%, y lo más preferiblemente en el intervalo de 25% a 95%. Un intervalo de concentraciones de dióxido de carbono puede ser compatible con la cultivación del cultivo de 0,03% (v/v en la fase gaseosa que está en equilibrio con el medio de cultivo) a 15% (v/v) y preferiblemente en el intervalo de 0,3% a 8% (v/v). Las concentraciones óptimas de gases disueltos pueden diferir con respecto al metabolismo celular, por ejemplo, las células que sufren crecimiento rápido pueden tener diferentes óptimos que las células que sufren biosíntesis de taxanos, lo que típicamente favorece niveles de oxígeno superiores, y son menos sensibles a niveles de dióxido de carbono superiores. Los óptimos también pueden variar con la cinética del cultivo; por ejemplo, las células en la fase de demora pueden preferir diferentes concentraciones de gases disueltos que las células en fase de crecimiento logarítmica.

Los gases disueltos pueden interactuar con otros componentes del cultivo y con la acción de los agentes de mejora de muchos modos. Por ejemplo, los requerimientos de oxígeno pueden cambiar durante la elicitación o estimulación de la biosíntesis. Incrementos en las velocidades de respiración como una respuesta a lesiones se observan comúnmente cuando los cultivos de células de plantas son activados. Los elicitores o estimuladores pueden mediar su acción a través del etileno, o pueden afectar a la producción de etileno independientemente de promover el metabolismo secundario. En tales casos, puede ser deseable substituir una preparación de elicitor microbiano por etileno, y quizás prevenir la toxicidad asociada con otros componentes microbianos de la preparación de elicitor. Alternativamente, puede ser ventajoso inhibir la acción del etileno, permitiendo de ese modo que el elicitor o estimulante promueva el metabolismo secundario de una manera más exclusiva y de ese modo más eficaz. Según se describe posteriormente, el ión plata, un componente que se sabe que afecta a la acción del etileno, modifica ventajosamente la biosíntesis de taxanos.

Agentes de Mejora

La producción de metabolitos secundarios es un procedimiento complejo, que requiere la acción coordinada de muchas enzimas diferentes para producir y modificar secuencialmente los precursores que finalmente se convierten en los metabolitos secundarios. Al mismo tiempo, la producción de metabolitos secundarios se disminuirá si otras enzimas metabolizan precursores del metabolito deseado, agotando las reservas de precursores necesarias para construir los metabolitos secundarios.

La limitación de la cantidad de precursor disponible, debido a baja producción o desviación subsiguiente, o la limitación en la conversión de un precursor o producto intermedio para un producto intermedio aguas abajo, o la limitación en la actividad de una enzima dada, limitarán la producción de metabolitos secundarios. En cualquier sistema de cultivo particular, la velocidad a la que se produce un metabolito secundario estará controlada por una de estas limitaciones, formando un cuello de botella en la ruta por la que el precursor o los precursores se convierten en el metabolito secundario. Mitigar la limitación que provoca el cuello de botella incrementará la velocidad de producción del metabolito secundario en ese sistema de cultivo hasta el punto en el que otra etapa de la ruta se haga limitativa. La etapa particular que limita la velocidad global de producción variará entre diferentes cultivos, como lo hará la acción que mitiga la limitación.

Los taxanos son metabolitos secundarios que se producen a través de una serie de muchas etapas enzimáticas y los presentes inventores han determinado varias clases de agentes de mejora que mitigan una o más de las etapas limitativas de la velocidad en la biosíntesis de taxanos. La adición de uno de estos agentes de mejora a un cultivo de células productoras de taxanos mejorará la velocidad de producción de taxanos. Por otra parte, los inventores han determinado que el uso de los agentes de mejora analizados aquí tendrá al menos algún efecto de mejora en la mayoría de los cultivos productores de taxanos, sugiriendo que la velocidad de producción global está determinada no por una sola etapa limitativa de la velocidad sino por una interacción compleja entre una multiplicidad de factores limitativos. La mitigación de uno de los factores limitativos mejorará la producción de taxanos, aunque la magnitud de la mejora dependerá en particular de condiciones de cultivo que determinan los efectos limitativos relativos de otras etapas en la biosíntesis de taxanos, una vez que se ha mitigado una limitación particular. Condiciones de cultivo que afectan a la interacción entre diversos factores limitativos incluyen la constitución genética de las células, la composición del medio de cultivo y el ambiente gaseoso, la temperatura, la iluminación y el protocolo del procedimiento, y el agente o los agentes de mejora añadidos a un cultivo particular se seleccionarán particularmente en vista de los factores limitativos de ese cultivo, que pueden determinarse empíricamente comparando los efectos de agentes de mejora individuales como los indicados aquí. Por otra parte, se ha descubierto que se alcanzará una mejora adicional de la producción de taxanos si está presente en el cultivo más de un agente de mejora.

Agentes de mejora representativos dentro de lo contemplado por esta invención se ejemplifican en la Tabla 1. Los agentes de mejora de esta invención se analizarán bajo varias clases generales. Estas clases son: agentes anti-pardeamiento, agentes anti-senescencia, agentes anti-etileno, reguladores del crecimiento de las plantas, tales como reguladores del crecimiento relacionados con auxinas, precursores, inhibidores, elicitores, estimulantes y compuestos relacionados con jasmonato.

Una clase de agentes de mejora contemplada por esta invención son los agentes anti-pardeamiento. Según se usa aquí, el término "agentes anti-pardeamiento" se refiere a componentes que se añaden al medio nutriente para prevenir la formación de pigmentos durante el cultivo celular. Estos pigmentos incluyen compuestos fenólicos y compuestos relacionados que generalmente se observa que tienen un efecto perjudicial sobre el crecimiento celular, la viabilidad y la formación de productos. Un agente anti-pardeamiento típico usado en los medios nutrientes de acuerdo con esta invención es el ácido ascórbico. Los agentes anti-pardeamiento pueden incorporarse típicamente en el medio a un intervalo de concentración de 10 ppb a 1000 ppm.

Otra clase de agentes de mejora son los agentes anti-senescencia. Un agente anti-senescencia es un compuesto de origen biológico o no biológico que protege a las células de la senescencia. Tales agentes podrían actuar, por ejemplo, bloqueando la producción de compuestos que promueven la senescencia, bloqueando la acción de factores que promueven la senescencia, proporcionando actividades de atrapamiento de radicales o antioxidante, protegiendo la integridad de las membranas celulares y los orgánulos o mediante otros mecanismos. Tales agentes incluyen antagonistas de la acción del etileno; poliaminas y sus metabolitos, tales como espermina, espermidina, diaminopropano y similares; agentes anti-pardeamiento, inhibidores de la producción de compuestos fenólicos y atrapadores de radicales, tales como glutationa reducida, galato de propilo y compuestos de sulfhidrilo tales como \beta-mercaptoetanolamina.

Los agentes anti-etileno se definen como substratos que interfieren con la producción de etileno o la acción del etileno. Los agentes anti-etileno que interfieren con el metabolismo del etileno pueden clasificarse además como antagonistas de la biosíntesis de etileno y antagonistas de la acción del etileno. Los antagonistas de la biosíntesis de etileno son compuestos que interfieren con la ruta biosintética hacia el etileno; ejemplos de enzimas a lo largo de esta ruta biosintética que son inhibidas incluyen ACC sintasa, ACC oxidasa y etileno oxidasa. Ejemplos de antagonistas de la biosíntesis de etileno incluyen ácido \alpha-aminoisobutírico, ácido acetilsalicílico, metoxivinilglicina, ácido aminooxiacético y similares.

Ejemplos de antagonistas de la acción del etileno incluyen compuestos que contienen plata, complejos de plata o iones plata, dióxido de carbono, 1-metilciclopropeno, 2,5-norbornadieno, trans-cicloocteno, cis-buteno, diazo-ciclopentadieno y similares. Sales de plata adecuadas incluyen nitrato de plata, tiosulfato de plata, fosfato de plata, benzoato de plata, sulfato de plata, sal argéntica de ácido toluenosulfónico, cloruro de plata, óxido de plata, acetato de plata, pentafluoropropionato de plata, cianato de plata, sal argéntica de ácido láctico, hexafluorofosfato de plata, nitrito de plata y la sal triargéntica de ácido cítrico. Ejemplos ilustrativos de la mejora de la biosíntesis de taxanos mediante una variedad de sales de plata se muestran en el Ejemplo 10.

Los agentes anti-etileno pueden incorporarse en el medio a niveles de 10 ppb a 1000 ppm. Cuando se incorpora plata en el medio, se añadirá en una concentración de menos de 900 \muM, preferiblemente menos de 500 \muM y más preferiblemente menos de 200 \muM. Cuando se incorpora plata en el medio, se añadirá en una concentración de al menos 10 nM, preferiblemente 100 nM, más preferiblemente 1 \muM y típicamente en 10 \muM.

Agentes de mejora contemplados en esta invención incluyen reguladores del crecimiento de las plantas, particularmente reguladores del crecimiento relacionados con auxinas, que incluirán auxinas, compuestos con actividad similar a las auxinas y antagonistas de auxinas. Los reguladores del crecimiento relacionados con auxinas se incorporarán típicamente en el medio a concentraciones de entre 10^{-10} M y 10^{-3} M, preferiblemente entre 10^{-8} y 10^{-5} M. Los ejemplos más preferidos de reguladores del crecimiento relacionados con auxinas incluyen ácido 1-naftalenoacético, ácido 2-naftalenoacético, 1-naftalenoacetamida/naftilacetamida, ácido N-(1-naftil)ftalámico, ácido 1-naftoxiacético, ácido 2-naftoxiacético, ácido beta-naftoxiacético, 1-aftoxiacetamida, ácido 3-clorofenoxiacético, ácido 4-clorofenoxiacético, ácido 4-yodofenoxiacético, indolacetamida, ácido indolacético, acetato de indoílo, indolacetil-leucina, ácido gamma-(3-indol)butírico, ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico, éster metílico de ácido 4-amino-3,5,6-tricloropiconílico, ácido 3,6-dicloro-o-anísico, ácido 3,7-dicloro-8-quinolincarboxílico, ácido fenilacético, ácido 2-yodofenilacético, ácido 3-yodofenilacético, ácido 2-metoxifenilacético, clorprofam (3-clorocarbanilato de isopropilo), ácido 4-cloroindol-3-acético, ácido 5-cloroindol-3-acético, butirato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo, indolacetilfenilalanina, indolacetilglicina, indolacetilalanina, 4-cloroindol, ácido p-clorofenoxiisobutírico, ácido 1-pirenoxilbenzoico, ácido lisofosfatídico, 1-naftil-N-metilcarbamato y ácido etil-5-cloro-1H-indazol-3-ilacetato-3-indolbutanoico. Otros ejemplos preferidos de reguladores del crecimiento relacionados con auxinas incluyen ácido naftaleno-2,6-dicarboxílico, dianhídrido de ácido naftaleno-1,4,5,8-tetracarboxílico, naftaleno-2-sulfonamida, anhídrido 4-amino-3,6-disulfo-1,8-naftálico, ácido 3,5-dimetilfenoxiacético, 1,8-naftalimida, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 2,3-diclorofenoxiacético, ácido 2,3,5-triclorofenoxiacético, ácido 2-metil-4-clorofenoxiacético, ácidos nitrofenoxiacéticos, ácido DL-alfa-(2,4-diclorofenoxi)propiónico, ácido D-alfa-(2,4-diclorofenoxi)propiónico, ácido 4-bromofenoxiacético, ácido 4-fluorofenoxiacético, ácido 2-hidroxifenoxiacético, 5-cloroindol, acetato de 6-cloro-3-indoílo, 5-fluoroindol, ácido 5-cloroindol-2-carboxílico, ácido 3-cloroindol-2-carboxílico, ácido indol-3-pirúvico, butirato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo, butirato de 6-cloro-3-indoílo, ácido quinolin-2-tioglicólico, ácidos aminofenilacéticos, ácido 3-nitrofenilacético, ácido 3-cloro-4-hidroxibenzoico, clorflurenol (ácido 2-cloro-9-hidroxifluoreno-9-carboxílico), acetato de 6-cloro-3-indoílo, hidroclouro de N-(6-aminohexil)-5-cloro-1-naftalenosulfonamida, 2-cloro-3-(2,3-diclorofenil)propionitrilo, ácido o-clorofenoxiacético, ácido 6,7-dimetoxi-1,2-benzioxazol-3-acético, ácido 3-oxo-1,2-benzisotiazolin-2-ilacético, mastoparán, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido 2-(3-clorofenoxi)propanoico y mecoprop (ácido 2-(4-cloro-2-metilfenoxi)propanoico). Otros ejemplos de reguladores del crecimiento relacionados con auxinas adecuados incluyen hidrazida de ácido naftoico, ácido 2,4-dibromofenoxiacético, ácido 3-trifluorometilfenoxiacético, oxiindol, ácido indol-2-carboxílico, ácido indol-3-láctico, ácido beta-(3-indol)propiónico, ácido 2-bromofenilacético, ácido 3-bromofenilacético, ácido 2-clorofenilacético, ácido 3-clorofenilacético, ácido 2-metilfenilacético, ácido 3-metilfenilacético, ácido 3-trifluorometilfenilacético, ácido 3-metiltiofenilacético, ácido fenilpropiónico, ácido 4-cloro-2-metilfeniltioacético, ácido 2-clorobenzoico, ácido 3-clorobenzoico, ácido 2,3-diclorobenzoico, ácido 3,4-diclorobenzoico, ácido 2,3,5-triclorobenzoico, ácido 2,4,6-triclorobenzoico, ácido 2-benzotiazoloxiacético, 2-cloro-3-(2,3-diclorofenil)propionitrilo, 2,4-diamino-s-triazina, anhídrido naftálico, dikegulac (ácido 2,3:4,6-bis-O-(1-metiletiliden)-\alpha-L-xilo-2-hexulofuranosónico), éster clorflurenolmetílico, ácido 2-(p-clorofenoxi)-2-metilpropiónico, ácido 2-cloro-9-hidroxifluoreno-9-carboxílico, ácido 2,4,6-triclorofenoxiacético, ácido 2-(p-clorofenoxi)-2-metilpropiónico, 4-(cloro-o-toliloxi)butirato de etilo, [N-(1,3-dimetil-1H-pirazol-5-il)-2-(3,5,6-tricloro-2-piridinil)oxi]acetamida, ácido 4-cloro-2-oxobenzotiazolin-3-il-acético, ácido 2-(2,4-Diclorofenoxi)propanoico, ácido 2-(2,4,5-triclorofenoxi)propanoico, ácido 4-fluorofenilacético, ácido 3-hidroxifenilacético, ortonil (2-(beta-cloro-beta-cianoetil)-6-clorotolueno), ácido 3,4,5-trimetoxicinámico, 2-(3,4-diclorofenoxi)trietilamina, ácido indol-3-propiónico, ioxinil sódico (4-hidroxi-3,5-diyodobenzonitrilo), ácido 2-benzotiazolacético y ácido 3-(fenil-1,2,4-tiadiazol-5-il)tioacético.

Otras clases de reguladores del crecimiento de las plantas también pueden incorporarse en el medio nutriente como agentes de mejora. Estas incluyen reguladores del crecimiento relacionados con citoquininas tales como N^{6}-benciladenina, 6-[\gamma,\gamma-dimetilalilamino]purina, cinetina, zeatina, N-fenil-N'-1,2,3-tidiazol-5-ilurea (tidiazurón) y derivados de fenilurea relacionados y similares, giberelinas tales como GA_{3}, GA_{4}, GA_{7} y derivados de GA, ácido abscísico y sus derivados, brasinosteroides y reguladores del crecimiento relacionados con el etileno. Tales reguladores del crecimiento
pueden incorporarse en el medio a concentraciones entre 10^{-10} M y 10^{-3} M, preferiblemente entre 10^{-8} M y 10^{-5} M.

Otra clase de agentes de mejora son los precursores o precursores biosintéticos. Según se usa aquí, el término precursores se usa para describir compuestos añadidos al medio nutriente que son metabolizados e incorporados por las células como taxol y taxanos. Precursores adecuados incluyen precursores de compuestos isoprenoides tales como acetato, piruvato y similares; \alpha-fenilalanina, \beta-fenilalanina (ácido 3-amino-3-fenilpropiónico), fenilisoserina, N-benzoilfenilisoserina, ácido benzoico, ácido shikímico, glutamina, ácido cinámico y similares. Derivados de las moléculas mencionadas anteriormente también son adecuados como precursores.

Otra clase de agentes de mejora son los inhibidores. Los inhibidores son compuestos que inhiben la actividad enzimática u otras actividades celulares. Según se usa aquí, el término "inhibidores metabólicos" se usa para describir compuestos añadidos al medio nutritivo que interfieren con las rutas biosintéticas específica. Por ejemplo, puede usarse un inhibidor metabólico para mejorar la biosíntesis de taxol, bacatina III u otros taxanos bloqueando una ruta diferente que compite con un precursor biosintético previo. Agentes de mejora particularmente eficaces de esta clase incluyen inhibidores del metabolismo fenilpropanoide, que son compuestos capaces de inhibir la síntesis o el metabolismo de ácido cinámico o sus derivados. Estos compuestos incluyen preferiblemente ácido p-cumárico, 4-fluoro-DL-tirosina, ácido 4-metoxibenzoico, ácido 3-dimetilaminobenzoico, ácido 4-metoxicinámico, éster etílico de ácido 4-nitrocinámico, 4-nitrocinamaldehído, mercaptoetanol, 4-hidroxicumarina, cinamilfluoreno, ácido 2-ciano-4-hidroxicinámico, ácido cinamilidenmalónico, ácido 4-dimetilaminocinámico, N-cinamilpiperazina, N-trans-cinamoilimidazol, ácido 2-aminoindano-2-fosfónico, bencilhidroxilamina, procaína, monensina, N-(4-hidroxifenil)glicina, ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico, ácido 3-(2-hidroxifenil)propiónico, más preferiblemente D-fenilalanina, N-(2-mercatopropionil)glicina y su complejo de sal de ácido acético, DL-metafluorofenilalanina, p-fluoro-DL-fenilalanina, ditiotreitol, ácido 4-fluorocinámmico, ácido trans-3,4-difluorocinámico, 3,4-difluoro-D-fenilalanina, ácido dietilditiocarbámico, ácido 4-fluoro-(1-amino-2-feniletil)fosfónico, ácido 3,4-metilendioxibenzoico y, lo más preferiblemente, ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico, ácido 3,4-metilendioxicinámico, ácido 3-[3,4-metilendioxifenil]propiónico, ácido 3,4-metilendioxifenilacético, 4-fluoro-L-fenilalanina, ácido 4-hidroxifenilpirúvico, 4-fluoro-DL-tirosina, ácido trans-3,4-dimetoxicinámico, ácido fenilpropiólico, ácido L-2-hidroxi-3-fenilpropiónico, ácido 2-hidroxi-4,6-dimetoxibenzoico, SKF-525A (éster 2-(dietilamino)etílico de ácido \alpha-fenil-\alpha-propilbencenoacético), vinilimidazol, oxalato amónico, ácido sinápico y 1-aminobenzotriazol y análogos relacionados. Cuando se incorporan al medio, los inhibidores se añadirán a una concentración entre 10 ppb y 1000 ppm, preferiblemente a una concentración entre 100 ppb y 100 ppm y más preferiblemente a una concentración de 1 ppm a 50 ppm.

Para mejorar el rendimiento de taxol, bacatina III y otros taxanos relacionados en cultivos celulares, los inventores han emprendido un número de métodos. Uno de los métodos que se ha usado para mejorar la productividad es el uso de los llamados elicitores. Según se usa aquí, el término elicitores se usa para compuestos de origen biológico y no biológico que provocan un incremento en la producción de metabolitos secundarios cuando se aplican a plantas o cultivos de células de plantas (Eilert, 1987, "Cell Culture and Somatic Genetics of Plants", Vol. 4, F. Constabel e I.K. Vasil (eds), Academic Press, Nueva York, pp. 153-196; Ebel, 1984, Bioregulators Chemistry and Uses, 257-271; y Darvill y otros, 1984, Ann. Rev. Plant. Physiol., 35, 243-275). Muchos compuestos diferentes pueden actuar como elicitores, dependiendo de su naturaleza de origen y de su modo de acción con el metabolismo celular. En estos estudios, los inventores han usado dos tipos principales de elicitores: 1) Elicitores bióticos que habitualmente comprenden extractos o filtrados de la pared celular de un grupo seleccionado de hongos, bacterias y levaduras, y también sus fracciones purificadas; 2) Elicitores abióticos que han incluido agentes de estrés químico así como algunos compuestos de origen biológico (véanse los elicitores listados en la Tabla 1). Además, sales y complejos que contienen iones metálicos pesados también pueden considerarse elicitores abióticos eficaces; estos incluyen ejemplos tales como cobalto, níquel, lantano, selenio, vanadio, plomo, cadmio, cromo, aluminio, yodo, bario, bismuto, litio, rubidio, estroncio y oro. Debe apuntarse que ciertos compuestos que median en la activación, por ejemplo los compuestos relacionados con jasmonato descritos posteriormente, también pueden considerarse elicitores.

Christen y otros (1991) dan cuenta del uso de elicitores fúngicos y compuestos seleccionados para la producción de taxol mediante suspensiones de Taxus brevifolia; sin embargo, los incrementos en el nivel de acumulación de taxol debido a los tratamientos con elicitores no se han especificado.

En general, eran eficaces ambos tipos de elicitores. Aunque la extensión en la que se producía la elicitación (acumulación de taxano en cultivos celulares así como su secreción en el medio) difería de un elicitor a otro y de una especie a otra. El incremento de producción más alto se alcanzó con glutamato de quitosano, liquenano, ácido ferúlico y ácido benzoico. El quitosano y el liquenano son polisacáridos complejos derivados de paredes celulares microbianas. El quitosano, cuando se usa solo, es insoluble en el medio, y es tóxico y provoca daño celular permanente. El glutamato de quitosano, por otra parte, es fácilmente soluble en el medio y no afecta a la viabilidad celular. Los ácidos ferúlico y benzoico son productos químicos sintetizados de origen biológico, y generalmente se usan como antioxidantes en sistemas biológicos.

Los elicitores y los agentes de estrés metabólico pueden utilizarse de acuerdo con esta invención para maximizar la producción y la secreción de taxol, bacatina III y taxanos totales en cultivo tisular determinando la especificidad y la concentración del elicitor, el tiempo y la duración, como una función de la edad del cultivo y la composición del medio.

Otra clase de agentes de mejora contemplados en esta invención son los estimulantes. Según se usa aquí, el término estimulante se usa para describir compuestos añadidos al medio nutriente que estimulan o activan rutas biosintéticas específicas, por ejemplo las que conducen a la biosíntesis.

Los compuestos relacionados con jasmonato son una clase de compuestos que median en la reacción de elicitación, estimulando de ese modo la biosíntesis de metabolitos secundarios. Los compuestos relacionados con jasmonato incluyen ácido jasmónico y sus ésteres alquílicos, tales como jasmonato de metilo, jasmonato de etilo, jasmonato de propilo, jasmonato de butilo, jasmonato de pentilo, jasmonato de hexilo; ácido dihidrojasmónico y sus ésteres alquílicos, tales como dihidrojasmonato de metilo, dihidrojasmonato de etilo, dihidrojasmonato de n-propilo, dihidrojasmonato de butilo, dihidrojasmonato de pentilo, dihidrojasmonato de hexilo; jasmonato de epimetilo, jasmonato de fluorometilo, cis-jasmona, isojasmona, tetrahidrojasmona, ácido 12-oxocitodienoico, dihidrojasmona, acetato de jasmonilo, apritona, amilciclopentenona, hexilciclopentenona, hexilciclopentenona y derivados y análogos relacionados. Los compuestos relacionados con jasmonato se incorporan al medio en concentraciones de 10^{-9} M a 10^{-3} M y preferiblemente en concentraciones de 10^{-6} a 5 x 10^{-4} M y más preferiblemente en concentraciones de 10^{-5} M a 2 x 10^{-4} M. Debe apuntarse que puede incorporarse al medio nutriente más de un compuesto relacionado con jasmonato. Será identificado por el experto que la concentración de agentes de mejora, tales como compuestos relacionados con jasmonato, reguladores del crecimiento relacionados con auxinas, precursores y otros nutrientes, cambiará y estos compuestos son metabolizados en el cultivo. A no ser que se indique otra cosa, las concentraciones citadas aquí se refieren a la concentración inicial en el medio nutriente.

Combinar agentes de mejora procedentes de al menos dos de las siguientes clases de agentes de mejora se ha observado que mejora la producción de taxanos por células de Taxus más allá de la mejora máxima observada para uno cualquiera de los agentes cuando se usan solos. Estas clases de agentes de mejora son elicitores, compuestos relacionados con jasmonato, inhibidores de la acción del etileno, inhibidores del metabolismo fenilpropanoico, agentes antisenescencia, precursores y reguladores del crecimiento relacionados con auxinas. Por lo tanto, en un modo preferido, la invención proporciona métodos para mejorar la producción de uno o más taxanos cultivando células de una especie de Taxus en presencia de agentes de mejora seleccionados de al menos dos de estos grupos de agentes.

Métodos preferidos para la producción de taxanos usan el inhibidor prototípico de la acción del etileno, plata, en combinación con al menos otro agente de mejora, y en métodos particularmente preferidos el otro agente es jasmonato de metilo, o un inhibidor del metabolismo fenilpropanoide, tal como ácido 3,4-metilendioxinitrocinámico.

Cuando se usan en combinación entre sí, los compuestos relacionados con jasmonato y los inhibidores de la acción del etileno pueden incorporarse en el medio nutriente en ciertas proporciones entre sí. Por ejemplo, cuando se usan en combinación jasmonato de metilo y tiosulfato de plata, las relaciones molares del jasmonato de metilo al ión plata pueden estar en el intervalo entre 0,0001 y 9,5, preferiblemente en el intervalo entre 0,01 y 8, más preferiblemente en el intervalo entre 0,1 y 7 y lo más preferiblemente en el intervalo entre 1 y 5.

Cuando se usan en combinación entre sí, los reguladores del crecimiento relacionados con auxinas y los inhibidores de la acción del etileno pueden incorporarse en el medio nutriente en ciertas proporciones entre sí. Por ejemplo, cuando se usan en combinación un regulador del crecimiento relacionado con auxinas y tiosulfato de plata, las relaciones molares del regulador del crecimiento relacionado con auxinas al ión plata pueden estar en el intervalo entre 0,011 y 1000, preferiblemente en el intervalo entre 0,015 y 100 y más preferiblemente en el intervalo entre 0,02 y 50 y lo más preferiblemente entre 0,05 y 30.

Generalmente, cuando se cultivan células de Taxus para la producción de taxanos, se añadirán al medio de cultivo uno o más reguladores del crecimiento relacionados con auxinas. La presencia de un regulador o reguladores del crecimiento relacionados con auxinas promoverá el crecimiento celular, pero más significativamente mejorará la producción de taxanos por el cultivo. Puede obtenerse una mejora adicional añadiendo al menos otro agente de mejora simultáneamente con el factor de crecimiento relacionado con auxinas.

En un modo preferido de esta invención, se añaden uno o más agentes de mejora al cultivo en una cantidad suficiente para mejorar la producción de uno o más taxanos en al menos 3 veces, preferiblemente en al menos 5 veces, más preferiblemente en al menos 10 veces y aún más preferiblemente en al menos 7 veces con relación al nivel de producción en ausencia del mejorador o los mejoradores. En otro modo preferido de esta invención, uno o más agentes de mejora se añaden al cultivo en una cantidad suficiente para mejorar la productividad volumétrica de taxol al menos hasta 10 mg/l/día, más preferiblemente hasta al menos 15 mg/l/día y aún más preferiblemente hasta al menos 22 mg/l/día. En otro modo preferido de esta invención, uno o más agentes de mejora se añaden al cultivo en una cantidad suficiente para mejorar la valoración de todo el caldo de taxol hasta al menos 150 mg/l, más preferiblemente hasta al menos 200 mg/l y aún más preferiblemente hasta al menos 350 mg/l. En otro modo preferido de esta invención, uno o más agentes de mejora se añaden al cultivo en una cantidad suficiente para mejorar la productividad volumétrica de bacatina III hasta al menos 15 mg/l/día, más preferiblemente hasta al menos 20 mg/l/día y aún más preferiblemente hasta al menos 25 mg/l/día. En otro modo preferido de esta invención, uno o más agentes de mejora se añaden al cultivo en una cantidad suficiente para mejorar la valoración de todo el caldo de bacatina III hasta al menos 100 mg/l, más preferiblemente hasta al menos 150 mg/l y aún más preferiblemente hasta al menos 250 mg/l. En otro modo preferido de esta invención, uno o más agentes de mejora se añaden al cultivo en una cantidad suficiente para mejorar la productividad volumétrica de taxanos hasta al menos 15 mg/l/día, más preferiblemente hasta al menos 25 mg/l/día y aún más preferiblemente hasta al menos 4 mg/l/día. En otro modo preferido de esta invención, uno o más agentes de mejora se añaden al cultivo en una cantidad suficiente para mejorar la valoración de todo el caldo de taxanos hasta al menos 200 mg/l, más preferiblemente hasta al menos 300 mg/l y aún más preferiblemente hasta al menos 400 mg/l.

Muchos de los compuestos descritos como agentes de mejora anteriormente se han usado en otros sistemas de plantas. La formulación, la administración y los niveles de concentración fisiológicos apropiados en estos sistemas no relacionados con Taxus proporcionarán una guía para que el experto aplique estos agentes de acuerdo con esta invención.

Material Celular

Células adecuadas para el cultivo en el método de esta invención pueden ser de cualquier especie de Taxus. Preferiblemente, las células serán de una línea celular que produce inherentemente taxanos con un rendimiento relativamente alto. Típicamente, tales células tienen la capacidad de producir altos niveles de uno o más taxanos bajo condiciones estándar o exhiben altas productividades volumétricas medias de taxanos bajo condiciones estándar. Las líneas celulares adecuadas pueden identificarse cultivando células de la línea celular bajo condiciones de producción de taxanos estándar y observando el nivel de uno o más taxanos producidos en el cultivo o determinando la productividad volumétrica media para uno o más taxanos en el cultivo mediante los siguientes procedimientos.

Las células para el uso en el procedimiento de prueba de cultivo de producción se hacen crecer en un medio adecuado adaptado para la línea celular particular. Después de la terminación del crecimiento en fase logarítmica, una parte alícuota de células se cultiva para la producción de prueba de taxanos. El cultivo de producción se realiza generalmente en medio líquido, aunque pueden usarse cultivo calloso o medio sólido. En el cultivo de producción, las células se cultivan en el medio N de la Tabla 2, en el medio N de la Tabla 2 excepto por la substitución de sacarosa por maltosa al 7% (p/v) o en un medio nutriente optimizado para el crecimiento y el mantenimiento de la línea celular particular. En el cultivo de producción, la densidad celular debe estar en el intervalo de 1-20 por ciento (p/v) sobre una base en peso fresco. Las células se cultivan durante 10-20 días a 25ºC +/- 2ºC bajo condiciones de oscuridad. Los cultivos líquidos deben agitarse y airearse apropiadamente, por ejemplo en una batidora giratoria a 120-180
rpm.

Los cultivos de producción para evaluar las características de las líneas celulares incluyen agentes de mejora adecuados. Generalmente, se prueban seis cócteles de mejora (combinaciones de hasta cinco agentes de mejora) alternativos para cada línea celular. Las combinaciones se muestran en la Tabla A posteriormente.

Al final del cultivo, la valoración de taxanos individuales en el cultivo puede medirse mediante ensayo de ELISA realizado como se describe aquí, o el perfil de taxanos producidos en el cultivo puede determinarse mediante análisis de HPLC según se describe en el Ejemplo 5. Las líneas celulares preferidas producirán uno o más taxanos por encima de los niveles de taxanos buscados mínimos en uno o más de los cócteles de mejora. Las líneas celulares preferidas superarán los niveles buscados tanto para la valoración como para la productividad para al menos un cóctel de mejora, y más preferiblemente para dos o más cócteles de mejora. La concentración de taxanos buscada mínima al final del cultivo de producción para líneas celulares adecuadas será al menos 100 mg/l de taxanos. Alternativamente, el objetivo de productividad volumétrica media mínima a lo largo del transcurso del cultivo de producción será 10 mg/l/día de taxanos. Líneas celulares más preferidas alcanzarán una valoración de taxanos mínima al final del cultivo de producción de al menos 100 mg/l de taxol o 200 mg/l de bacatina III, o una productividad volumétrica media durante el transcurso del cultivo de producción de 10 mg/l/día de taxol o 15 mg/l/día de bacatina III.

TABLA A Cócteles de Mejora

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ Combinaciones de Agentes de Mejora\cr \+\cr  1. \+ Naa 20  \mu M
+ Mdna 30  \mu M\cr  2. \+ Naa 20  \mu M + Mdna 30  \mu M + Slts 50
 \mu M\cr  3. \+ Naa 20  \mu M + Mdna 30  \mu M + Mjs 89  \mu M\cr 
4. \+ Naa 20  \mu M + Mdna 30  \mu M + Mjs 89  \mu M + Slts 50
 \mu M\cr  5. \+ Naa 20  \mu M + Mdna 30  \mu M + Mjs 89  \mu M +
Slts 50  \mu M + Gln 5  \mu M\cr  6. \+ Naa 20  \mu M + Mjs 89
 \mu M + Slts 50  \mu M\cr  \+ Gln = glutamina\cr  \+ Naa = ácido
1-naftalenoacético\cr  \+ Mdna = ácido
3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico\cr
 \+ Mjs = jasmonato de metilo\cr  \+ Slts = tiosulfato de
plata\cr}

Medios de producción adecuados para las diversas especies se listan en la Tabla 5, aunque pueden usarse otros. Por ejemplo, los Medios B, C y N de la Tabla 2 son medios de producción particularmente adecuados para Taxus chinensis. Los medios contienen preferiblemente los ingredientes listados en la Tabla 2. Estos medios contienen preferiblemente sales inorgánicas principales y secundarias, compuestos orgánicos y hormonas del crecimiento o reguladores del crecimiento, en las cantidades generalmente con los intervalos preferidos que parten de 1/10 a tres veces la concentración de cada ingrediente del medio indicado en la Tabla 2. Cuando se usa Medio B o N, los reguladores del crecimiento se incorporan típicamente al medio en una cantidad entre 0,1 ppm y 20 ppm y preferiblemente entre 1 ppm y 10 ppm. Cuando se usa Medio C o N, los reguladores del crecimiento se incorporan preferiblemente a niveles que varían de 0,1 ppm a 5 ppm.

Será entendido por parte del experto que dentro de lo contemplado en esta invención pueden hacerse modificaciones en los medios descritos aquí, tales como substitución de otras composiciones convencionales (tales como compuestos orgánicos, vitaminas, aminoácidos, precursores, elicitores e inhibidores), adición o supresión de diversos componentes, incluyendo reguladores del crecimiento, o alteración de proporciones, a fin de producir un crecimiento y una producción de taxanos igual o mejor que los observados con los medios de la Tabla 2.

Modos de Operación del Procedimiento

El modo de operación para un procedimiento de cultivo de células de plantas se refiere a la manera en la que los nutrientes, las células y los productos se añaden o se retiran con respecto al tiempo (Payne y otros, 1991). Cuando todos los nutrientes se suministran inicialmente, y el contenido del cultivo que comprende células y productos se recoge al final del período de cultivo, el modo de operación se denomina un "procedimiento discontinuo en una fase". Cuando un procedimiento discontinuo se divide en dos fases secuenciales, una fase de crecimiento y una de producción, intercambiándose el medio entre las dos fases, el modo de operación se denomina un "procedimiento discontinuo en dos fases". Dentro de lo contemplado por esta invención, la transición desde el medio de crecimiento al medio de producción puede producirse mediante un cambio escalonado abrupto, o progresivamente mediante una serie de etapas continuas, o mediante cambio progresivo. En un extremo, el cambio progresivo se efectúa mediante substitución progresiva de medio, o cambiando incrementalmente la composición. En otra alternativa, el cambio progresivo se efectúa alimentando uno o más componentes del medio de producción al cultivo en fase de crecimiento. Este es un ejemplo del procedimiento de alimentación por partidas.

En una operación de "alimentación por partidas", componentes del medio particulares tales como nutrientes y/o uno o más agentes de mejora se suministran periódicamente o continuamente durante el transcurso de un cultivo. Debe apuntarse que ciertos componentes pueden incorporarse al medio nutriente inicialmente en el modo discontinuo, a continuación añadirse en el modo de alimentación por partidas o pueden añadirse al medio nutriente exclusivamente en el modo de alimentación por partidas.

Usando la operación de alimentación por partidas, se ha encontrado que las células pueden mantenerse en un estado productivo durante un período prolongado y, de hecho, que la productividad de las células podía mejorarse. Según se ilustra en los Ejemplos 15 y 17 en las Tablas 16 y 18, añadir ciertos nutrientes y agentes de mejora en un modo de alimentación por partidas daba perfeccionamientos significativos en el comportamiento global para los taxanos generalmente y para taxanos específicos tales como taxol y bacatina III. Además, se ha encontrado que este modo de operación es compatible con una variedad de diferentes líneas celulares bajo una variedad de diferentes condiciones de los medios.

La adición mediante alimentación por partidas de componentes es particularmente ventajosa cuando la concentración del componente particular ha de mantenerse a un nivel bajo en el cultivo, por ejemplo, para evitar los efectos de la inhibición del substrato. De forma similar, la adición mediante alimentación por partidas es ventajosa cuando las células reaccionan negativamente con un componente cuando se añade inicialmente al medio nutriente o si no pueden añadirse cantidades estequiométricamente significativas de un componente debido a limitaciones de solubilidad o toxicidad. Además, la adición mediante alimentación por partidas continua o continuada (periódica) de una solución de alimentación que contiene un componente se prefiere particularmente cuando las células reaccionan negativamente con el componente cuando se añade de una manera más rápida, tal como la adición pulsatoria. Componentes particulares a los que las células responden favorablemente cuando se añaden en un modo de alimentación por partidas incluyen precursores de taxano tales como alfa- y beta-fenilalanina; fuentes de carbono tales como maltosa, fructosa y glucosa; aminoácidos tales como glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico; macronutrientes tales como fosfato, calcio y magnesio; y agentes de mejora tales como reguladores del crecimiento relacionados con auxinas y compuestos relacionados con jasmonato.

Será evidente para el experto que la composición de la alimentación puede variarse para obtener los resultados deseados, tales como extensión de la fase de producción para incrementar el rendimiento de taxanos o extensión de la fase de crecimiento para alcanzar una densidad de biomasa superior. La selección de condiciones adecuadas para alcanzar productividad y comportamiento óptimos está fácilmente dentro de la destreza del experto habitual en vista de las enseñanzas descritas aquí. De forma similar, variaciones de otros parámetros de operación, tales como la cronología y la duración de la adición y la velocidad de la adición de los componentes alimentados por partidas, para alcanzar los resultados deseados están dentro de alcance del experto en vista de las enseñanzas descritas aquí.

El intercambio de medio que se describe aquí se refiere a la retirada de medio gastado del cultivo seguida por la adición de medio reciente al cultivo; las células son retenidas en gran parte en el cultivo durante la operación. En el método de esta invención, la operación de intercambio de medio es un método ventajoso para obtener y mantener altas productividades volumétricas de producción de taxanos, dando como resultado un comportamiento del procedimiento y niveles de producción globales superiores, en comparación con un procedimiento discontinuo. El producto extracelular resultante de tal operación puede conducir a una recuperación y purificación aguas abajo más fáciles que otros modos de procesamiento.

Según se ilustra en el Ejemplo 14 y la Tabla 15, el intercambio de medio es satisfactorio para mantener altas productividades para taxanos generalmente y para taxanos específicos tales como taxol, bacatina III y 10-desacetilbacatina III. Además, este modo de operación daba como resultado el incremento en la productividad volumétrica con relación a la operación discontinua para taxanos generalmente y para taxanos específicos tales como taxol y bacatina III. Por otra parte, este modo de operación es compatible con una variedad de líneas celulares diferentes bajo una variedad de condiciones de medio diferentes. Según se ilustra adicionalmente en el Ejemplo 7.3, la retirada de medio gastado y la reposición de medio reciente cada 3 días contribuía a una mejora significativa de la producción de taxanos y taxol en condiciones de crecimiento, así como a un incremento en las cantidades de producto extracelular.

Los efectos estimulantes del intercambio de medio pueden haberse debido a la retirada de producto in situ, que evitaría la inhibición por retroalimentación y la degradación del producto. Tales efectos positivos de la retirada de producto in situ sobre la producción y la secreción de metabolitos secundarios en cultivos en suspensión han sido documentados por, entre otros, Robins y Rhodes (1986, Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 35-41) y Asada y Shuler (1989, Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 475-481). La retirada periódica de medio gastado incorpora las ventajas anteriores y, adicionalmente, puede servir para desreprimir la biosíntesis secundaria retirando otros componentes inhibidores no taxánicos (tales como compuestos fenólicos) del medio.

La reposición de medio reciente a células que sufren biosíntesis activa también puede mejorar la producción proporcionando nutrientes esenciales que se han agotado. Por ejemplo, Miyasaka y otros (1986, Phytochemistry, 25, 637-640) fueron capaces de estimular células en fase estacionaria de Salvia miltiorhiza para producir los metabolitos diterpénicos criptotansinona y ferruginol simplemente añadiendo sacarosa al medio. Presumiblemente, la biosíntesis ha cesado debido a la limitación de carbono en la fase estacionaria. El protocolo de intercambio de medio periódico usado en el presente trabajo podría haber sido beneficioso como resultado de cualquiera de los factores anteriores. Se entiende que la cantidad de medio intercambiado, la frecuencia del intercambio y la composición del medio que se repone pueden variarse. La capacidad para estimular la biosíntesis y la secreción mediante intercambio de medio tiene implicaciones importantes para el diseño y el funcionamiento de un procedimiento comercial eficaz en el modo continuo, semicontinuo o de alimentación por partidas.

Cuando se recoge una porción substancial, pero no la totalidad, de los contenidos de un cultivo discontinuo, con adición de medio reciente para el crecimiento y la producción de células continuados, el procedimiento se asemeja a una operación de "vaciado y llenado repetidos" y se denomina un "procedimiento semicontinuo".

Cuando se suministra continuamente medio reciente y el medio efluente se retira continuamente, el procedimiento se denomina "continuo". Si las células se retienen dentro del reactor, el procedimiento se denomina un "modo de perfusión". Si las células se retiran continuamente con el medio efluente, el procedimiento continuo se denomina un "quimiostato".

Se entiende que estos diversos modos de operación del procedimiento son compatibles con el sistema de producción de taxanos descrito aquí.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir adicionalmente los materiales y métodos que pueden usarse al llevar a cabo la invención. Los ejemplos pretenden ser ilustrativos y no pretenden limitar la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1 Iniciación del Callo

Se recogieron muestras de material de plantas Taxus de un número de plantas silvestres y cultivadas. Las muestras se procesaron al llegar al laboratorio o se almacenaron a 4ºC hasta que podían usarse.

El material se lavó en primer lugar en solución jabonosa diluida, se enjuagó en agua y la superficie se esterilizó en una solución de CLOROX (hipoclorito al 1%, pH 7) durante 10 minutos. Bajo condiciones estériles, el material se enjuagó a continuación 3 veces con agua estéril. Las agujas se cortaron a continuación en una solución de polivinilpirrolidona (PVP) al 1% con 100 mg/ml de ácido ascórbico. Las agujas se pusieron con el extremo cortado en Medio E (véase la Tabla 2). Se cultivaron de treinta a cuarenta explantes por placa de medio. Las placas que contenían los explantes se incubaron a 25 \pm 1ºC en la oscuridad. Las placas se comprobaron diariamente con respecto a la apariencia de microorganismos contaminantes y, cuando estaban presentes, las agujas no contaminadas se retiraron y se colocaron en una placa reciente de Medio E. Se observó una formación de callo substancial y el callo se separó del explante a los 20 días y se puso sobre los diversos medios de proliferación del callo listados en la Tabla 3. Por ejemplo, callos de Taxus chinensis se transfirieron a Medio D (véase la Tabla 2). Este procedimiento de iniciación será muy eficaz, dando como resultado un bajo grado de contaminación y una alta frecuencia de inducción del callo de más de 90% de los explantes iniciados. El mismo procedimiento se usó satisfactoriamente para iniciar cultivos de Taxus brevifolia, Taxus canadensis,
Taxus cuspidata, Taxus baccata, Taxus globosa, Taxus floridana, Taxus wallichiana, Taxus media y Taxus chinensis.

Ejemplo 2 Proliferación del Callo

Una vez que los callos se retiraban del explante, se cultivaron a 25 \pm 1ºC en la oscuridad. Las partes sanas del callo se transfirieron a medio reciente cada 7 a 10 días, y se encontró que esta frecuencia de transferencia era extremadamente importante para la prevención del pardeamiento y para el mantenimiento prolongado del callo. Los medios de crecimiento y mantenimiento preferidos para callos de diversas especies se resumen en la Tabla 3.

Ejemplo 3 Iniciación de la Suspensión

Se inoculó asépticamente 1 g de peso fresco de material calloso a un matraz Erlenmeyer de 125 ml que contenía 25 ml de medio líquido apropiado para cada especie (véase la Tabla 3). Por ejemplo, se usó Medio D para Taxus chinensis. El matraz se cubrió con una tapa de espuma de silicona (Bellco, NJ) y se puso en un agitador giratorio a 120 rpm a 24 \pm 1ºC en la oscuridad. Se formaron cultivos en suspensión en aproximadamente 3 a 10 días. Inicialmente, el medio se intercambió filtrando por succión el contenido del matraz a través de un embudo Buchner que contenía un filtro Miracloth (Calbiochem) y resuspendiendo toda la biomasa en medio reciente. Durante el crecimiento celular, 1-2 g (peso fresco) de células se transfirieron generalmente a un nuevo matraz de 125 ml que contenía 125 ml de medio reciente y se subcultivaron posteriormente semanalmente.

Ejemplo 4 Crecimiento de Células Suspendidas

Las velocidades de crecimiento y las densidades celulares típicas alcanzadas en cultivos en suspensión de especies representativas se listan en la Tabla 4.

Como un ejemplo detallado, el incremento de biomasa (peso fresco y seco) con el tiempo para línea K-1 de Taxus chinensis se muestra en la Figura 1. La velocidad de crecimiento máxima se midió tomando la pendiente en los puntos de incremento más rápido de biomasa sobre las curvas de crecimiento. Los cultivos celulares de Taxus chinensis crecían con un tiempo de doblamiento máximo de 2,5 días. Esta velocidad de crecimiento es significativamente superior que la presentada previamente para cultivos en suspensión de especies de Taxus. Por ejemplo, Christen y otros (1991) presentaron un incremento de 5 a 10 veces en la biomasa después de 3 a 4 semanas de cultivo, lo que se traduce en un tiempo de doblamiento medio para suspensiones de Taxus brevifolia de 7 a 12 días.

La capacidad para cultivar células a una alta densidad es importante para maximizar la productividad volumétrica de un procedimiento de cultivo celular. Mientras que los cultivos de Taxus brevifolia alcanzaban una densidad celular de menos de 1 g de peso seco por litro (calculado a partir de los datos presentados en Christen y otros (1991)), las suspensiones de Taxus chinensis eran capaces de alcanzar densidades de hasta 8 a 20 g de peso seco por litro después de 18 días de crecimiento. La viabilidad de las células se determinó tiñendo las células con una solución al 0,05% de diacetato de fluoresceína en acetona (Widholm, 1972, Stain Technol., 47, 189-194) y contando el número de células fluorescentes verdes durante la excitación con luz azul en un microscopio de fluorescencia invertido (Olympus IMT-2, Japón). La viabilidad de las células era superior a 90% en toda la fase de crecimiento.

La capacidad para cultivar células bajo condiciones de crecimiento rápido hasta altas densidades celulares mientras que se retiene una alta viabilidad es un requisito previo importante para el funcionamiento económico de un procedimiento de cultivo de células de plantas para producir taxol, bacatina III y taxanos.

Ejemplo 5 Análisis de Taxol, Bacatina III y Otros Taxanos 5.1. Métodos de ELISA

El análisis de ELISA (Hawaii Biotech #TA-01) se usó para la detección de taxol en extractos de cultivos celulares (véase Grothaus y otros, 1995). Este método proporciona una alta sensibilidad (0,1 ng/ml), sin embargo, debido a que se usa un anticuerpo policlonal, se observa reactividad cruzada con otros taxanos. La HPLC preparativa (escala analítica) con recogida de fracciones mostraba una reactividad cruzada con 10-desacetiltaxol, 7-xilosil-10-desacetiltaxol, cefalomanina, 10-desacetil-7-epitaxol, 7-epitaxol, así como otros taxanos no identificados. A pesar de tal reacción cruzada se encontró que este método era extremadamente útil para la detección de la producción de taxanos y permitía rastrear rápidamente grandes números de líneas celulares. Los extractos celulares que mostraban una producción significativa de taxanos se analizaron a continuación con detalle usando los procedimientos de HPLC esbozados posteriormente.

Un análisis de ELISA monoclonal (Hawaii Biotech Nº TA-02) también se usó para la detección de taxol en extractos de cultivos celulares. Este método proporciona alta sensibilidad (0,1 ng/ml) y significativamente menos reactividad cruzada.

5.2. Extracción de Taxol, Bacatina III y Otros Taxanos

La extracción de taxanos de sobrenadantes se realizó mediante varios métodos, dependiendo de las concentraciones presentes. Cuando están presentes cantidades suficientes de taxanos (aproximadamente 1-5 mg/l) en medios líquidos, las muestras se preparan muy rápidamente y eficazmente. Los medios (2 ml) se secaron completamente (a vacío) y se añadió una cantidad medida de metanol (0,5-2,0 ml). Esta mezcla se agitó ultrasónicamente hasta que se lograba la disolución o suspensión completa de la muestra. Los sólidos se retiraron mediante centrifugación antes del análisis por HPLC. Se han obtenido recuperaciones cuantitativas a niveles de 1 mg/l con niveles de detección muy por debajo de 0,1 mg/l.

Cuando la concentración de taxanos en los sobrenadantes de cultivo era baja (menos de 1 mg/l), el medio se extraía tres veces con un volumen igual de una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isopropílico (IPA) (9:1 en volumen). La capa orgánica se redujo hasta sequedad y se reconstituyó en un volumen medido de metanol (5-250 ml). La extracción múltiple recuperaba típicamente 90-95% del taxol, la cefalomanina y la bacatina III en niveles de 0,6 mg/l.

Cuando las concentraciones de taxanos en el sobrenadante superaban \sim5 mg/l, se empleaba una preparación de muestra más rápida. Una parte (volumen) de sobrenadante se mezcló con tres partes (volumen) de metanol que contenía ácido acético al 0,1%. Esta mezcla se sometió a continuación a ultrasonidos durante 30 minutos, se filtró y se analizó mediante HPLC.

Se prepararon muestras de caldo entero (sobrenadante de cultivo que contiene células) usando un método similar al descrito en el párrafo precedente. Una parte (volumen) de caldo entero se mezcló con tres partes (volumen) de metanol que contenía ácido acético al 0,1%. Esta mezcla se sometió a continuación a ultrasonidos durante 30 minutos, se dejó reposar durante 30 minutos adicionales, se filtró y a continuación se analizó mediante HPLC.

Los materiales celulares se extrajeron congelando células recientemente recogidas (-5ºC), seguido por secado a vacío y extracción de Soxhlet durante 50 ciclos. El volumen de metanol se redujo (\sim100 veces) mediante evaporación giratoria y la muestra resultante se analizó mediante HPLC. Se recuperaba generalmente de 70 a 80% de los taxanos con 10-15% de descomposición medible. Se encontró más tarde que el secado exhaustivo de la muestra antes de la extracción Soxhlet daba como resultado una degradación de menos de 5% de taxol.

La extracción de medios sólidos y callo se efectuó idénticamente a la de las células cuando los niveles de taxano eran bajos, sin embargo, siempre se realizaba el reparto en cloruro de metileno/IPA frente a agua del extracto de metanol final. Cuando los niveles de taxano superaban \sim5 mg/l, se empleó el método de extracción del caldo entero para preparar muestras de callo sobre medio solidificado.

5.3. Métodos de Cromatografía Líquida de Alta Resolución

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) analítica se realizó sobre una columna de difenilo cargada con alto contenido de carbono (Supelco, 5 \mum, 4,6 mm x 25 cm) con un sistema de mezcladura de alta presión con gradiente binario LDC Analytical que consistía en bombas CM3500/CM3200, un automuestreador de volumen variable CM4100 y un detector de ordenación de fotodiodos SM5000 interconectado a un ordenador personal. La temperatura de la columna se reguló a 35ºC con un horno para columnas Eldex CH150. El análisis cuantitativo por HPLC de taxanos se efectuó usando un esquema de elución de gradiente binario como sigue:

\vskip1.000000\baselineskip

Tiempo	% de Eluyente A	% de Eluyente B	Flujo

0	75	25	1 ml/min
40	35	65	''
42	25	75	''
47	25	75	''
50	75	25	''

Eluyente A = KH_{2}PO_{4} 0,015 mM llevado hasta pH 3,5 con ácido trifluoroacético
Eluyente B = acetonitrilo

Los métodos cromatográficos usados se asemejan a varios métodos publicados (Witherup y otros, 1989, J. Liq. Chomatog., 12, 2117-2132) con las excepciones de que se ha usado un tampón de fosfato que contenía ácido trifluoroacético y se emplea un gradiente más largo. Estas diferencias mejoran significativamente la resolución de taxol y otros taxanos de la mezcla. Los tiempos de retención relativos observados para taxanos se muestran posteriormente. El taxol se eluye entre 31 y 33 minutos dependiendo de la columna y el hardware usado.

\vskip1.000000\baselineskip

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Compuesto  \+  \hskip4cm  \+  Tiempo de Retención
Relativo \cr \+\+\cr  10-desacetilbacatina III \+
\+ 0,38\cr  bacatina III \+ \+ 0,56\cr 
7-xilosil-10-desacetiltaxol
\+ \+ 0,80\cr  10-desacetiltaxol \+ \+ 0,87\cr 
cefalomanina \+ \+ 0,94\cr 
10-desacetil-7-epitaxol
\+ \+ 0,98\cr  taxol \+ \+ 1,00\cr  7-epitaxol \+ \+
1,12\cr}

Los tiempos de retención del taxol, la cefalomanina y la bacatina III se determinaron usando muestras auténticas obtenidas de the National Cancer Institute. Los tiempos de retención de los otros taxanos listados anteriormente se compararon con patrones analíticos proporcionados por Hauser Chemical (Boulder CO). La identificación de taxanos conocidos se basaba en el tiempo de retención y comparaciones espectrales ultravioleta. Los compuestos que exhibían un espectro UV similar al del taxol y la bacatina III, pero que no se correlacionaban con los tiempos de retención relativos de estos taxanos, se consideraban taxanos. La cuantificación del taxol, la cefalomanina y la bacatina III se basaba en factores de respuesta determinados a partir de materiales auténticos. La cuantificación de la 10-desacetilbacatina III se realizó usando el factor de respuesta determinado para bacatina III. Cuando era apropiado, la cuantificación de los taxanos restantes se basaba en los factores de respuesta medidos para el taxol y la bacatina III. El término taxanos totales representa la suma de los taxanos que exhibían un UV característico similar al taxol y la bacatina III. Taxanos totales identificados en cultivos de Taxus incluyen, entre otros, 10-desacetilbacatina III, 9-dihidrobacatina III, 7-epi-10-desacetilbacatina III, bacatina III, 9-dihidro-13-acetilbacatina III, 7-xilosil-10-desacetilcefalomanina, 7-xilosil-10-desacetiltaxol, 7-epibacatina III, 10-desacetiltaxol, 7-xilosiltaxol, cefalomanina, 7-epi-10-desacetiltaxol, taxol, 2-benzoil-2-desacetil-1-hidroxibacatina I, taxol C, 7-epitaxol y 2-benzoil-2-desacetilbacatina I.

Taxanos que no exhibían la absorbancia UV característica, pero si exhibían características de fragmentación de masa de taxanos durante la espectrometría de masas, también se observaron en cultivos celulares de Taxus. Ejemplos de tales taxanos producidos en cultivos celulares de Taxus son, entre otros, taxuyunanina C y sus análogos y derivados.

Cada uno de los patrones (10 \mul) se inyectó típicamente (inicialmente y a continuación después de 3 ó 4 muestras) y se integraron las áreas para cada uno de los tres componentes a partir del cromatograma de 227 mm. Los factores de respuesta para cada uno de los componentes se obtuvieron mediante análisis lineal de mínimos cuadrados de los datos. Se inyectaron 10 \mul de cada muestra y la cantidad por inyección se calculó basándose en la regresión de datos estándar. Estos resultados se convirtieron en cantidad por litro o porcentaje en peso seco. La Figura 4 ilustra un cromatograma típico de una muestra de sobrenadante.

5.4. Métodos Rápidos de Cromatografía Líquida de Alta Resolución

Además del método anterior, se desarrollaron varios métodos rápidos de análisis por HPLC para permitir mayor producción de muestra. Dos de estos métodos se describen con detalle posteriormente.

Método 1

Se realizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) rápida en una columna Phenomenex Curosil-G (5 \mum, 4,6 mm x 25 cm con dispositivo de seguridad de 4,6 mm x 3 cm) a temperatura ambiente usando el hardware descrito anteriormente. El análisis por HPLC cuantitativo de taxanos se efectuó usando un esquema de elución en gradiente binario como sigue:

Tiempo	% de Eluyente A	% de Eluyente B	Flujo

0	60	40	1,5 ml/min
10	25	75	''
11	25	75	''

\hskip0,8cm Eluyente A = KH_{2}PO_{4} 0,01 mM llevado hasta pH 3,5 con ácido trifluoroacético
\hskip0,8cm Eluyente B = acetonitrilo

Los tiempos de retención relativos observados para los taxanos se muestran posteriormente. El taxol se eluye en aproximadamente 8 minutos dependiendo de la columna y el hardware usados.

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Compuesto  \+  \hskip4cm  \+  Tiempo de Retención
Relativo \cr \+\+\cr  10-desacetilbacatina III \+
\+ 0,42\cr  bacatina III \+ \+ 0,61\cr  taxol \+ \+
1,00\cr}

Se prepararon patrones que contenían taxol, bacatina III y 10-desacetilbacatina III a niveles de 50 mg/l, 10 mg/l y 1 mg/l. Un patrón se inyectó inicialmente y a continuación después de cada novena muestra y las áreas para cada uno de los tres componentes se integraron a partir del cromatograma de 227 nm. Se obtuvieron factores de respuesta para cada uno de los componentes mediante análisis lineal de mínimos cuadrados de los datos. Se inyectaron 10 \mul de cada muestra y la cantidad por litro se calculó a partir del área del pico basándose en la dilución de la muestra y la regresión de los datos de los patrones.

\newpage

Método 2

También se realizó cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) rápida en una columna Phenomenex IB-SIL Phenyl (3 \mum, 4,6 mm x 15 cm con dispositivo de seguridad de 4,6 mm x 3 cm) a temperatura ambiente usando el hardware descrito anteriormente. El análisis por HPLC cuantitativo de los taxanos se efectuó usando un esquema de elución en gradiente binario como sigue:

Tiempo	% de Eluyente A	% de Eluyente B	Flujo

0	65	35	1,0 ml/min
10	30	70	''
12	30	70	''

\hskip0,8cm Eluyente A = KH_{2}PO_{4} 0,015 mM llevado hasta pH 3,5 con ácido trifluoroacético
\hskip0,8cm Eluyente B = acetonitrilo

Los tiempos de retención relativos observados para los taxanos se muestran posteriormente. El taxol se eluye en aproximadamente 9,5 minutos dependiendo de la columna y el hardware usados.

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Compuesto  \+  \hskip4cm  \+  Tiempo de Retención
Relativo \cr \+\+\cr  10-desacetilbacatina III \+
\+ 0,41\cr  bacatina III \+ \+ 0,61\cr  taxol \+ \+
1,00\cr}

La cuantificación se realizó como se describe anteriormente.

También se encontró que modificaciones de los métodos anteriores con respecto al caudal y la extensión del gradiente y el tiempo efectuaban una cromatografía adecuada para análisis de cultivos de células de plantas.

5.5. Confirmación por MS/MS de Taxol

La identidad del taxol en un sobrenadante de cultivo tisular se ha confirmado usando un método de MS/MS (según se muestra en la Figura 6) que acopla la inyección de flujo con la ionización química a presión atmosférica por pulverización iónica. Los detalles de los procedimientos usados para adquirir los datos presentados en la Figura 5 eran como sigue: Espectrómetro de Masas: Triple cuadrupolo Sciex API 3 con una fuente de ionización a presión atmosférica. Se usó nitrógeno como el gas de cortina y se usó argón como el gas de colisión para los espectros de CID. Interfase: Interfase de Pulverización Iónica que produce iones mediante Ionización por Evaporación Iónica (Electropulverización). Se usó aire cero como el gas nebulizador. Bomba LC: Bomba de doble jeringa ABI 140B que funciona a 5 \mul/minuto. Disolventes: acetonitrilo/H_{2}O 50/50 NH_{4}OAc 2 mM + ácido fórmico al 0,1%. Volumen de Inyección: 5 \mul, todos los espectros se tomaron mediante análisis con inyección de flujo. Este método proporcionaba una confirmación inequívoca de la presencia de taxol en muestras de cultivo celular, y también proporcionaba una cuantificación con una excelente concordancia con los resultados de HPLC.

Ejemplo 6 Producción de taxol por diversas especies

El taxol producido por cultivos celulares de diversas especies de Taxus se resume en la Tabla 5. El callo se cultivó durante 20 días en la oscuridad sobre el medio solidificado indicado para cada especie. Las células y el medio se secaron y se extrajeron con metanol juntos, y se ensayaron mediante ELISA o HPLC según se indica.

Ejemplo 7 7.1. Producción en el medio de crecimiento

La producción de taxol y taxanos comenzó en los primeros 2 días de transferencia al crecimiento de la línea celular K-1 de Taxus chinensis en el Medio A de crecimiento. El taxol máximo observado era el día 15, en 8,81 \mug/matraz, lo que corresponde a 0,44 mg/litro de taxol. De esto, 41,6% estaba presente en el medio extracelular. El día 15, la concentración de taxanos totales era 72,87 \mug/matraz, 3,6 mg/litro, de los cuales 58,6% estaba presente en el medio extracelular. La viabilidad de las células era siempre mayor que 90% según se medía mediante tinción de fluorescencia (Ejemplo 4), sugiriendo que la presencia de taxol y taxanos extracelulares se debía a la secreción más que deberse a la lisis de células.

Los niveles de producción de taxol, bacatina III y taxanos relacionados se han caracterizado para numerosas líneas celulares diferentes bajo un número de diferentes condiciones de crecimiento (elaboradas en la Tabla 2 y en otros ejemplos) en las que no se mejora la biosíntesis de taxanos. Estos datos colectivos indican que cuando los cultivos se cultivan bajo condiciones optimizadas para el crecimiento, pero no para la biosíntesis de taxanos, los niveles de producción de taxol son típicamente menores que o iguales a 0,5 mg/l, y siempre menores que o iguales a 2 mg/l; las productividades volumétricas de taxol varían típicamente de 0,03 mg/l/día a 0,07 mg/l/día y siempre son menores que 0,3 mg/l/día. De forma similar, los niveles de producción de bacatina III son típicamente menores que o iguales a 0,5 mg/l y siempre menores que o iguales a 1 mg/l; las productividades volumétricas de bacatina III son típicamente menores que o iguales a 0,03 mg/l/día y siempre menores que 0,15 mg/l/día. De forma similar, las valoraciones de taxanos totales son típicamente menores que 5 mg/l y son siempre menores que o iguales a 20 mg/l; las productividades volumétricas de taxanos totales son típicamente menores que 1 mg/l/día y siempre menores que 3 mg/l/día.

7.2. Intercambio de medio para la mejora de la productividad

Se obtuvieron mejoras significativas en la productividad de taxol y taxanos totales eliminando por succión asépticamente Medio A de crecimiento el día 9, reemplazando por medio reciente y repitiendo el procedimiento el día 12. El experimento se terminó el día 15, y los resultados se muestran en la Figura 2. Los importantes incrementos en la productividad debidos al intercambio de medio se resumen en la Tabla 6. Las cantidades totales de taxol y taxanos producidas eran alrededor de 4,6 veces superiores con intercambio de medio en comparación con controles sin tratamiento. De forma importante, se recuperaban alrededor de 4,9 veces más taxol y alrededor de 5,9 veces más taxanos totales en el medio extracelular en comparación con controles sin tratamiento de intercambio de medio.

La capacidad para mejorar marcadamente las productividades de taxol y taxanos totales y, además, para provocar la acumulación de producto extracelular, es importante para el funcionamiento de un procedimiento continuo y eficaz con reutilización de biomasa y purificación aguas abajo simplificada.

7.3. Efecto de la Luz sobre la producción de taxanos en el medio de crecimiento

Se sabe que la luz representa un papel importante no sólo en la fotosíntesis, sino también en diversos aspectos del metabolismo secundario en cultivos de células de plantas (Seibert y Kadkade, 1980). Mientras que los experimentos descritos en los Ejemplos 4, 7.1 y 7.2 se efectuaron en la oscuridad, la respuesta de cultivos de Taxus chinensis a la luz se describe aquí.

Se inoculó un gramo de peso fresco de células de 7 días de edad de la línea K-1 de Taxus chinensis en 25 ml de Medio A de crecimiento (véase la Tabla 2) en matraces Erlenmeyer de 125 ml y se incubó a 24 \pm 1ºC en un agitador giratorio a 120 rpm. Matraces duplicados se pusieron en la oscuridad y bajo una lámpara Standard GroLux a una distancia de 0,91 metros (3 pies). Las características espectrales de la lámpara se muestran en la Figura 3. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

La exposición de los cultivos a la luz no afectaba a los niveles de taxanos totales o a la extensión de la acumulación extracelular. Sin embargo, los perfiles de taxanos se alteraban significativamente en los dos tratamientos. Por ejemplo, las células cultivadas a la luz producían 2,8 veces más taxol que las células en la oscuridad. La proporción de taxol extracelular también era significativamente superior que en el tratamiento en la oscuridad (76% frente a 56%). El uso de tratamiento con luz, especialmente de calidad espectral específica, podría ser útil en un procedimiento de cultivo celular para la producción de taxol.

Ejemplo 8 Elicitores

El término elicitores se usa para compuestos de origen biológico (o biótico) y no biológico (o abiótico) que provocan un incremento en el metabolismo secundario cuando se añaden a cultivos de células de plantas.

Aunque se ha encontrado útil un número de elicitores, un ejemplo ilustrativo representativo se describe aquí con detalle, a saber, el uso de glutamato de quitosano. Aunque el quitosano se ha probado previamente como un elicitor en algunos sistemas de cultivo de células de planta, las reacciones tóxicas adjuntas, tales como pardeamiento y pérdida de viabilidad, han hecho su uso poco práctico (Beaumont y Knorr, 1987, Biotechnol. Lett. 9, 377-382). En efecto, tales reacciones secundarias tóxicas son una desventaja común de muchos elicitores presentados en la literatura. El uso de quitosanos modificados químicamente, tales como glutamato de quitosano, para inducir específicamente la biosíntesis de taxol y taxanos mientras se evitan efectos secundarios tóxicos es un nuevo método.

Se filtraron por succión asépticamente suspensiones de línea K-1 de Taxus chinensis desarrollada en Medio D durante de 7 a 8 días, usando un embudo Buchner estéril acoplado con un filtro Miracloth (Calbiochem). Se transfirieron asépticamente 2 g de peso fresco de células a 25 ml de Medio C (véase la Tabla 2) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Se preparó recientemente una solución de glutamato de quitosano al 0,05% y se esterilizó por filtración a través de un filtro de cartucho de 0,22 micras. Se añadieron 825 \mul de esta solución al matraz al comienzo del experimento, correspondiendo a un nivel de 165 mg de elicitor por gramo de peso seco de células. Los matraces se incubaron a 24 \pm 1ºC en un agitador giratorio a 100 rpm en la oscuridad. Los matraces se muestrearon destructivamente el día 15, y se registraron observaciones sobre el crecimiento, el color de las células y el medio y la viabilidad de las células. Las muestras se analizaron con respecto a los taxanos según se describe en el Ejemplo 5. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 8.

El tratamiento con elicitores daba como resultado un ligero aumento en la producción de taxanos totales por célula (0,53% frente a 0,42% de peso seco de taxanos) sobre los controles no tratados. La naturaleza atóxica del elicitor es evidente a partir de las altas viabilidades (75-80%) observadas en ambos tratamientos. De hecho, se ha observado reproduciblemente un peso seco incrementado en el tratamiento con elicitor en comparación con los controles (14,2 g/l frente a 10,1 g/l de peso seco). Las densidades celulares superiores daban como resultado una valoración 1,8 veces mayor de taxanos totales en el tratamiento con elicitor, es decir, 75,8 mg/l frente a 42,4 mg/l para el control.

El tratamiento con elicitor daba como resultado una biosíntesis de taxol incrementada, tanto en una base por célula (0,098% frente a 0,054% de peso seco de taxol, un incremento de 1,8 veces) como en una comparación de valoraciones (13,9 mg/l frente a 5,4 mg/l, un incremento de 2,6 veces). La extensión de la secreción era superior para el tratamiento con elicitor en comparación con el control (85% frente a 72% de producto extracelular).

El tratamiento con elicitor descrito aquí da como resultado una producción de taxol incrementada, un perfil de producto más favorable, una secreción de producto mejorada y una retención de la alta viabilidad celular. Estas características de producción representan una mejora significativa para un procedimiento de cultivo celular para la producción de taxol.

Ejemplo 9 Desarrollo de medios de producción

En un esfuerzo para incrementar las productividades de taxol sobre los niveles descritos en el Ejemplo 6, se manipularon los niveles de nutrientes para formular "medios de producción" especiales. Se filtraron por succión asépticamente suspensiones de 7 a 8 días de línea K-1 de Taxus chinensis que había crecido en Medio D, usando un embudo Buchner estéril acoplado con un filtro Miracloth (tela de poliéster de rayón con aglutinante acrílico) (Calbiochem). Se transfirieron asépticamente 500 mg de peso fresco de células a 5 ml de Medios B y C de producción (véase la Tabla 2). Los recipientes se incubaron durante períodos de tiempo variables de 28, 25 y 42 días a 24 \pm 1ºC en un agitador giratorio a 110 rpm en la oscuridad. Los tratamientos se muestrearon destructivamente, y se registraron observaciones sobre el crecimiento, el color de las células y el medio, y la viabilidad celular. Las muestras se analizaron con respecto a los taxanos según se describe en el Ejemplo 5. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 8.

9.1 Resultados de un Cultivo de 18 días

Los cultivos de células de Taxus chinensis respondían a las composiciones de medio alteradas produciendo niveles significativos de taxanos y taxol. Estos datos se resumen en la Tabla 9, y un cromatograma de la muestra se observa en la Figura 4. En el Medio B, se produjeron 99,8 mg/litro de taxanos totales, con 24,1 mg/litro de taxol. En el Medio C, se produjeron 110 mg/litro de taxanos totales, con 21,3 mg/litro de taxol. Sobre una base en peso seco, las células producían 0,18% en peso seco de taxol sobre Medio B y 0,065% en peso seco de taxol sobre Medio C.

9.2. Cultivo Prolongado

La producción de taxol y taxanos después del cultivo prolongado de células (línea K-1) de Taxus chinensis durante 25 y 42 días se estudió en Medio C, cuyos resultados se resumen en la Figura 5. Pueden resumirse las siguientes observaciones significativas:

(i) Los cultivos en suspensión de Taxus son capaces de producir niveles significativos de taxol y otros taxanos. La acumulación más alta se producía en 42 días, con 0,32% en peso seco de taxol y 0,62% en peso seco de taxanos totales; correspondientes a valoraciones de 153 mg/l de taxol y 295 mg/l de taxanos totales basadas en el volumen de medio final. El análisis de esta muestra mediante espectrometría de masas en tándem confirmaba la presencia de taxol como se muestra en la Figura 6. La cuantificación mediante MS/MS mostraba una excelente concordancia con la HPLC.

(ii) La velocidad de biosíntesis de taxol entre los días 25 y 42 estaba en alrededor de 7,6 mg de taxol por litro al día suponiendo una producción lineal en el período de 17 días. Esta velocidad es significativamente superior que la velocidad de producción en los primeros 25 días. La velocidad de biosíntesis de taxanos totales entre los días 25 y 42 era 12,3 mg por litro por día. Las productividades volumétricas medias para taxol, bacatina III y taxanos totales eran 3,6, 0,5 y 7,0 mg/l/día, respectivamente.

(iii) Las formulaciones de los medios de producción pueden inducir incrementos de hasta 45 veces en el contenido de taxol específico en comparación con condiciones de crecimiento rápido tales como las descritas en el Ejemplo 7.

(iv) El espectro del producto puede manipularse a fin de dirigir la biosíntesis hacia el taxol obtenido como producto final deseado, mientras que se minimiza la producción de taxanos indeseables. Por ejemplo, el día 25, el taxol constituía 28% de los taxanos totales y el día 42 el taxol constituía el 52% de los taxanos totales en contraste con el medio de crecimiento (véase el Ejemplo 7.1), en el que el taxol constituía sólo 12,2% de los taxanos totales. Esta capacidad para manipular los perfiles de productos tendrá repercusiones importantes para la purificación aguas abajo y para cuestiones reguladoras relacionadas con la pureza del producto. Por ejemplo, la capacidad para suprimir la producción del subproducto de taxano cefalomanina podría simplificar mucho la purificación aguas abajo en comparación con la purificación de taxol procedente de tejido de corteza.

(v) Se han inducido cultivos de células de Taxus para secretar cantidades significativas de taxol (87% el día 42) y otros taxanos. Que la presencia de taxol y taxanos extracelulares se debe a la secreción más que deberse a la lisis celular se corrobora mediante varias observaciones independientes: (a) la biosíntesis continuada se producía entre los días 25 y 42, sugiriendo que las células eran viables y activas. Observaciones independientes han mostrado que se ha observado >70% de viabilidad después de 18 días en el medio de producción, (b) se secretaban diferentes porcentajes de diferentes taxanos. Si las células hubieran sufrido lisis, podría haberse esperado que el porcentaje en el medio fuera similar para los diferentes taxanos.

(vi) Merece particularmente la pena apreciar la capacidad de esta línea celular de Taxus para desarrollar y producir taxol a altas velocidades en un ambiente extracelular tan rico en producto.

(vii) La línea celular de Taxus con la que se obtuvieron estos resultados también es capaz de un crecimiento rápido hasta altas densidades celulares, y expresaba las productividades presentadas después de 20 generaciones bajo condiciones de crecimiento rápido, confirmando su estabilidad y potencial comercial.

Los niveles de taxol y taxanos producidos por líneas celulares de Taxus chinensis bajo las condiciones descritas aquí son superiores a los resultados previamente presentados en un factor de 35 a 150 veces. Por ejemplo, Christen y otros (1991) presentaron la producción de 1 a 3 mg/litro de taxol mediante cultivos en suspensión de Taxus brevifolia después de 2 a 4 semanas de cultivo. Wickeramesinhe y Arteca (1991) presentaron la producción de taxol en 0,009% en peso seco en cultivos celulares de Taxus media.

En resumen, los presentes datos muestran que con una indicación y selección cuidadosa de cultivos de Taxus chinensis, y con condiciones del medio de crecimiento especialmente formuladas, puede inducirse que las células crezcan rápidamente hasta altas densidades celulares. Cuando estas células se transfieren a condiciones del medio de producción, las células son capaces de biosintetizar y secretar niveles significativos de taxol y otros taxanos durante períodos prolongados mientras que se mantienen altas viabilidades. La incorporación de un intercambio periódico de medio, luz y elicitores con el medio de producción da como resultado mejoras de la productividad sinérgicas adicionales. Estas propiedades son requisitos previos críticos para un procedimiento comercial eficaz para la producción de taxol y taxanos que use tecnología de cultivo tisular.

Ejemplo 10 10.1. Mejora de la Producción de Taxanos Usando Plata

Se encontró que la plata, en forma de compuestos que contienen plata, complejos de plata o iones plata, es un agente de mejora útil de la biosíntesis de taxol, bacatina III y taxanos en cultivos celulares de especies de Taxus. También se ha encontrado que la combinación de plata y otros agentes de mejora es útil para obtener y mantener altas velocidades de producción de taxanos.

Células de siete días de edad de suspensión KS1A de Taxus chinensis cultivada en Medio L (Tabla 2) se filtraron por succión asépticamente usando un embudo de Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Se inocularon de aproximadamente 0,75 a 1 gramo de peso fresco de células en de 4 a 5 ml de medio de cultivo de la composición dada indicada en la Tabla 10, para dar una densidad celular en peso fresco en el intervalo de 15% a 20% (p/v). Los recipientes se incubaron a 25 \pm 1ºC a 120 rpm en un agitador giratorio (2,54 cm (1 pulgada) de desplazamiento) en la oscuridad. La evaporación se corrigió mediante la adición de agua destilada estéril. Se tomaron muestras de caldo entero (es decir, taxanos tanto extracelulares como intracelulares) a intervalos periódicos y se procesaron y analizaron mediante HPLC de acuerdo con los métodos esbozados en el Ejemplo 5.

Los datos resumidos en la Tabla 10 indican que la producción de taxol, bacatina III y otros taxanos puede mejorarse satisfactoriamente mediante una variedad de compuestos que contienen plata. Esta mejora se debe principalmente a la presencia de plata en el medio, según se demuestra en la Tabla 10, que muestra una mejora para una variedad de diferentes compuestos que contienen plata y diferentes iones conjugados. Estos niveles de producción son significativamente superiores que los observados en cultivos no mejorados (para los cuales los niveles de producción se elaboran en el Ejemplo 7).

10.2. Mejora de la Producción de Taxanos Usando Tiosulfato de Plata

Basándose en consideraciones de toxicidad y facilidad de preparación y almacenamiento, se usó tiosulfato de plata en experimentos subsiguientes. El método usado para la preparación de tiosulfato de plata era como sigue: se disolvieron 1,98 gramos de tiosulfato sódico (pentahidrato) en 80 ml de agua. Se añadieron 20 ml de una solución 0,1 M de nitrato de plata mientras se agitaba vigorosamente, dando como resultado 100 ml de una solución de reserva 20 mM de tiosulfato de plata. Podía usarse tiosulfato potásico en lugar de tiosulfato sódico con resultados igualmente eficaces. Las soluciones de reserva se esterilizaron por filtración usando filtros de cartucho de 0,22 \mum en medios de cultivo celular al comienzo de un experimento dado. También son adecuados métodos alternativos para preparar soluciones de tiosulfato de plata similares. Los métodos de cultivo celular eran similares a los descritos para los experimentos descritos en la Tabla 10.

La Tabla 11 resume datos obtenidos usando plata como un agente de mejora para un número de diferentes cultivos celulares de Taxus chinensis. Estos datos muestran que la plata efectúa una mejora fundamental de la biosíntesis de taxanos generalmente. El perfil de productos específico observado en cualquier caso dado refleja las características de la línea celular y el medio de cultivo. Un ion/complejo de plata puede ser particularmente eficaz para mejorar la producción de taxanos cuando se usa junto con otros factores en el medio que favorece la síntesis, tales como reguladores del crecimiento, una fuente de carbono, sales, micronutrientes y similares.

Ejemplo 11 Mejora de la Producción de Taxanos Usando Jasmonato de Metilo y Compuestos Relacionados con Jasmonato

Se encontró que el éster metílico del ácido jasmónico (jasmonato de metilo), así como el ácido jasmónico y los compuestos relacionados, eran útiles como agentes de mejora de la biosíntesis de taxanos en cultivos celulares de especies de Taxus. También se ha encontrado que la combinación de jasmonato de metilo y otros agentes de mejora es útil para obtener y mantener altas velocidades de producción de taxanos.

Células de siete días de edad de suspensiones de Taxus chinensis cultivadas en Medio M (Tabla 2) se filtraron por succión asépticamente usando un embudo de Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Las células se inocularon en el medio de cultivo de la composición dada indicada en la Tabla 12, a una densidad celular en peso fresco en el intervalo de 15% a 20% (p/v). Los cultivos se inocularon a 25 \pm 1ºC a 120 ó 180 rpm (dependiendo del tamaño del recipiente) en un agitador giratorio (desplazamiento 2,54 cm (1 pulgada)) en la oscuridad. La evaporación se corrigió añadiendo agua destilada estéril. Muestras de caldo entero (es decir, taxanos tanto extracelulares como intracelulares) se tomaron a intervalos periódicos y se procesaron y analizaron mediante HPLC de acuerdo con los métodos esbozados en el Ejemplo 5.

La Tabla 12 resume datos obtenidos usando ácido jasmónico y su éster metílico como agentes de mejora para varias líneas celulares de Taxus chinensis representativas. Estos datos muestran que el ácido jasmónico y su éster metílico efectúan una mejora fundamental de la biosíntesis de taxanos generalmente. El perfil de productos específico observado en cualquier caso dado refleja características de la línea celular y el medio de cultivo. Estos niveles de producción obtenidos en presencia de estos agentes de mejora son significativamente superiores que los observados en cultivos no mejorados (para los cuales los niveles de producción se elaboran en el Ejemplo 7).

El ácido jasmónico, su éster metílico y los compuestos relacionados son agentes de mejora eficaces de la biosíntesis de taxanos cuando se usan junto con otros factores en el medio que favorece la síntesis, tales como otros agentes de mejora, reguladores del crecimiento, una fuente de carbono, sales, micronutrientes y similares.

Ejemplo 12 Mejora de la producción de taxanos usando ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico

Se encontró que el análogo de ácido cinámico ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico (MDNA) y los compuestos relacionados son agentes de mejora útiles de la biosíntesis de taxanos en cultivos celulares de especies de Taxus. También se ha encontrado que la combinación de MDNA y otros agentes de mejora es útil para obtener y mantener altas velocidades de producción de taxanos.

Células de siete días de edad de cultivo en suspensión de Taxus chinensis SS122-42 cultivadas en Medio M (Tabla 2) se filtraron por succión asépticamente usando un embudo de Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Las células se inocularon en condiciones de medio de cultivo a una densidad en peso fresco de 15% a 20% (p/v). Los recipientes se incubaron a 24 \pm 1ºC a 180 rpm en un agitador giratorio (desplazamiento 2,54 cm (1 pulgada)) en la oscuridad. Los cultivos tratados se muestrearon y analizaron usando los métodos descritos en el Ejemplo 5 en diversos puntos temporales. La evaporación se corrigió añadiendo agua destilada estéril a intervalos periódicos. Muestras de caldo entero (es decir, taxanos tanto extracelulares como intracelulares) se tomaron a intervalos periódicos y se procesaron y analizaron mediante HPLC de acuerdo con los métodos esbozados en el Ejemplo 5.

La Tabla 13 resume datos obtenidos usando ácido 3,4-metilendioxinitrocinámico como un agente de mejora para la biosíntesis de taxanos en cultivos celulares de Taxus chinensis. Estos datos muestran que el MDNA efectúa una mejora fundamental de la biosíntesis de taxanos generalmente. El cultivo en Medio II, es decir en presencia de MDNA y plata, mejora adicionalmente la producción de taxanos. El perfil de productos específico observado en cualquier caso dado refleja las características de la línea celular y el medio de cultivo. Estos niveles de producción son significativamente superiores que los observados en cultivos no mejorados (para los cuales los niveles de producción se elaboran en el Ejemplo 7).

Ejemplo 13 Mejora de la Biosíntesis de Taxanos Usando una Combinación de Agentes de Mejora

Diversos agentes de mejora, usados en combinación, daban aumentos significativos y sinérgicos en la producción de taxanos.

Células de siete días de edad de cultivos en suspensión de Taxus chinensis cultivadas en Medio P (SS64-412), Medio O (SS64-561), Medio I (SS124-77, SS85-26), Medio M (SS122-29) (la composición de estos medios se lista en la Tabla 2) se filtraron por succión asépticamente usando un embudo de Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Las células se inocularon en medio de cultivo (indicado en la Tabla 14) a una densidad en peso fresco de 20% (p/v). Los cultivos se incubaron a 24 \pm 1ºC a 180 rpm en un agitador giratorio (desplazamiento 2,54 cm (1 pulgada)) en la oscuridad. La evaporación se corrigió añadiendo agua destilada estéril a intervalos periódicos. Muestras de caldo entero (es decir, taxanos tanto extracelulares como intracelulares) se tomaron a intervalos periódicos y se procesaron y analizaron mediante HPLC de acuerdo con los métodos esbozados en el Ejemplo
5.

La Tabla 14 resume datos obtenidos usando diversas combinaciones de agentes de mejora para la biosíntesis de taxol, bacatina III y taxanos en cultivos celulares de Taxus chinensis. Los datos demuestran la mejora adicional substancial de la producción de taxanos mediante combinaciones de agentes de mejora sobre los observados para agentes individuales, y sobre niveles de producción en condiciones no mejoradas (para las cuales los niveles de producción se elaboran en el Ejemplo 7).

Ejemplo 14 Mejora de la Producción de Taxanos Mediante Intercambio de Medio

Este ejemplo demuestra que puede mantenerse alta productividad en el cultivo reponiendo componentes del medio y retirando medio gastado.

Las líneas celulares se cultivaron inicialmente en Medio O (Paella), Medio I (SS29-3A5) y Medio I (SS45-146). Las composiciones detalladas de estos medios de cultivo se describen en la Tabla 2. Células de siete días de edad de estas líneas celulares se filtraron por succión asépticamente usando un embudo Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Se inocularon aproximadamente 1,5 gramos de peso fresco de células en 4,25 ml de los medios de cultivos respectivos indicados en la Tabla 15. Los recipientes se incubaron a 24 \pm 1ºC a 120 rpm en un agitador giratorio (desplazamiento 2,54 cm (1 pulgada)) en la oscuridad. La evaporación se corrigió mediante la adición de agua destilada estéril a intervalos periódicos. Para los tratamientos de intercambio del medio, el medio de producción gastado se eliminó por succión usando una pipeta estéril después de 10 a 11 días de cultivo discontinuo, dejando las células en el recipiente. El sobrenadante gastado se analizó con respecto a los taxanos extracelulares usando los métodos descritos en el Ejemplo 5. Medio de cultivo reciente de la misma composición que el primer cultivo discontinuo se añadió al recipiente que contenía células productivas. Las células se cultivaron bajo las mismas condiciones ambientales descritas anteriormente. El ciclo de intercambio de medio se repitió después de 10 a 11 días adicionales de cultivo. Los taxanos extracelulares totales para la producción discontinua se comparan con los de la producción con intercambio de medio en la Tabla 15. Los valores de concentración con intercambio de medio indican la cantidad total de taxano producido en el medio extracelular dividida por el volumen del cultivo en suspensión de células (es decir, 5,75 ml).

La Tabla 15 indica que las células pueden mantenerse en un estado productivo durante un período prolongado y, de hecho, que la productividad de las células puede mejorarse mediante intercambio de medio repetido. La mejora mediante intercambio de medio repetido es factible usando un intervalo de diferentes condiciones de mejora y con una variedad de cultivos celulares.

Los datos demuestran una mejora adicional substancial de producción de taxanos sobre los niveles de producción en condiciones no mejoradas (para las cuales los niveles de producción se elaboran en el Ejemplo 7).

Ejemplo 15 Mejoras de la Producción de Taxanos Mediante Operación de Alimentación por Partidas

Células de siete días de edad de líneas celulares cultivadas en Medio I (CR-128, SS36-245), Medio L (SS36-359) (las composiciones de estos medios se describen en la Tabla 2) se filtraron por succión asépticamente usando un embudo Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Se inoculó aproximadamente 1 gramo de peso fresco de células en 4 ml de medio de cultivo de la composición dada indicada en la Tabla 16a. Los recipientes se incubaron a 24 \pm 1ºC a 120 rpm en un agitador giratorio (desplazamiento 2,54 cm (1 pulgada)) en la oscuridad. La evaporación se corrigió mediante la adición de agua destilada estéril a intervalos periódicos. Para la operación de alimentación por partidas, soluciones de alimentación estériles de composiciones predeterminadas se alimentaron continuamente a los recipientes de cultivo a velocidades de alimentación predeterminadas, por ejemplo 10 ml de solución de alimentación por litro de cultivo al día. Los detalles de la operación de alimentación por partida se describen en la Tabla 16.b, incluyendo las composiciones de las soluciones de alimentación y los protocolos de alimentación. Los cultivos tratados se muestrearon y se analizaron usando los métodos descritos en el Ejemplo 5.

La Tabla 16.a. indica que las células pueden mantenerse en un estado productivo durante un período prolongado y, de hecho, que la productividad de las células puede mejorarse mediante la operación de alimentación por partidas, dando como resultado la acumulación de altos niveles de bacatina III, taxol y otros taxanos. Las cantidades relativas de taxanos particulares reflejan la interacción del protocolo de alimentación y la composición de la alimentación con la línea celular y las condiciones del cultivo. Esta Tabla también indica que alimentar fenilalanina da como resultado una producción mejorada de taxol con relación a otros taxanos.

Los datos demuestran una mejora adicional substancial de la producción de taxanos sobre los niveles de producción en condiciones no mejoradas (para las cuales los niveles de producción se elaboran en el Ejemplo 7).

Ejemplo 16 Mejora de la Biosíntesis de Taxanos Usando una Combinación de Agentes de Mejora

Diversos agentes de mejora, usados en combinación, daban mejoras significativas y sinérgicas en la producción de taxol, bacatina III y taxanos.

Células de siete días de edad de cultivos en suspensión de Taxus chinensis (SS122-41, cr427, SS122-30, cr857, cr452) cultivadas en Medio M (la composición del medio se lista en la Tabla 2) se filtraron por succión asépticamente usando un embudo Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Las células se inocularon en medio de cultivo (indicado en la Tabla 17) a una densidad en peso fresco de 20% (p/v) a no ser que se describa otra cosa en la Tabla 17. Los cultivos se incubaron a 24 \pm 1ºC a 180 rpm en un agitador giratorio (desplazamiento 2,54 cm (1 pulgada)) en la oscuridad. La evaporación se corrigió añadiendo agua destilada estéril según fuera necesario. Muestras de caldo entero (es decir, taxanos tanto extracelulares como intracelulares) se tomaron a intervalos periódicos y se procesaron y analizaron mediante HPLC de acuerdo con los métodos esbozados en el Ejemplo 5.

La Tabla 17 resume datos obtenidos usando diversas combinaciones de agentes de mejora para la biosíntesis de taxol y taxanos en cultivos celulares de Taxus chinensis. Los datos demuestran una mejora adicional substancial de la producción de taxanos mediante combinaciones de agentes de mejora sobre los observados para agentes individuales y sobre las condiciones no mejoradas (cuyos detalles se proporcionan en el Ejemplo 7).

Ejemplo 17 Mejora de la Producción de Taxanos Mediante Operación de Alimentación por Partidas

Células de siete días de edad de líneas celulares cultivadas en Medio M (SS122-41) (las composiciones de estos medios se describen en la Tabla 2) se filtraron por succión asépticamente usando un embudo Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem). Se inoculó aproximadamente 1 gramo de peso fresco de células en 4 ml de medio de cultivo de la composición dada indicada en la Tabla 18.a. Los recipientes se incubaron a 24 \pm 2ºC a 120 rpm en un agitador giratorio (desplazamiento 2,54 cm (1 pulgada)) en la oscuridad. La evaporación se corrigió mediante la adición de agua destilada estéril. Para la operación de alimentación por etapas, soluciones de alimentación estériles de composiciones predeterminadas se alimentaron continuamente a los recipientes de cultivo. Detalles de la operación de alimentación por partidas, incluyendo las composiciones de las soluciones de alimentación y los protocolos de alimentación, se describen en la Tabla 18.b. Los cultivos tratados se muestrearon y analizaron usando los métodos descritos en el Ejemplo 5.

La Tabla 18.a. indica que las células pueden mantenerse en un estado productivo durante un período prolongado y, de hecho, que la productividad volumétrica de las células puede mejorarse mediante la operación de alimentación por partidas, dando como resultado la acumulación de altos niveles de bacatina III, taxol y otros taxanos. Las cantidades relativas de taxanos particulares reflejan la interacción del protocolo de alimentación y la composición de la alimentación con la línea celular y las condiciones del cultivo.

Con propósitos de claridad de comprensión, la invención precedente se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo junto con modalidades específicas, aunque otros aspectos, ventajas y modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica de la que trata la invención. La descripción y los ejemplos precedentes pretenden ilustrar, pero no limitar, el alcance de la invención. Modificaciones de los modos descritos anteriormente para llevar a cabo la invención que son evidentes para los expertos en la técnica pretenden estar dentro del alcance de la invención, que solo está limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica de la que trata esta invención.

TABLA 1.a Lista de Elicitores Usados en la Elicitación de Cultivos Celulares de especies de Taxus

I. Elicitores Bióticos (microorganismos)

Botrytis cinerea	Phytophtora megasperma
Pinellas stripticum	Oligosporus sp.
Pythium mamillatum	Pythium sylvaticaum
Verticillium dahliae	Verticillium sp.
Penicillium minioluteum	Phytophtora lateralis
Cytospora cincta	Cytospora leucostoma
Alternaria bassicicola	Alternaria solani
Alternaria cucumerina	Botrytis squamosa
Cochiobolus heterostrophus	Colletotrichum trifolii
Colletotricum orbiculare	Colletotrichum graminicola
Colletotrichum gloeosporoioides	Cylindrocaldium floridanum
Fusarium crookwellense
Fusarium heterosporium
Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Fusarium oxysporum f. sp. pisi
Gibberella zeae
Gaeumannomyces graminis var. tritici
Geotrichum sp.
Leptosphaeria korroae
Nectria haematococca MPVI
Mycosphaerella pinodes
Ophiostoma ulmi
Phoma lingam
Phoma pinodella
Phytophthora infestans
Pythium aristosporum
Pythium graminicola
Pythium ultimum
Rhizoctonia solani
Sclerotinina sp.
S. nodorum D-45
Trametes versicolor
Ustilago maydis
Venturia inaqualis

II. Elicitores Bióticos (Fracciones o productos microbianos)

Quitosano	Celulisina
Liquenano	Multifect X
Glucomanano	Multifect CL
Pleurano	Resinasa
Glucano	Pulpxyme
Carboximetilglucano	SP431
Hidroximetilglucano	Pectinol
Sulfoetilglucano	Rapidasa
Manano	Klerzyme
Xilano	Quitinasa
Manobiosa
Manotriosa
Manopentosa
Manotetraosa

TABLA 1.a (continuación)

III. Elicitores Abióticos (Agentes de Estrés Químico así como algunos productos bioquímicos presentes en la naturaleza)

Ácido araquidónico	Ácido elaídico
AMP cíclico	Dibutiril-AMP cíclico
Jasomonato de metilo	Cis-Jasmona
Miconazol	Ácido ferúlico
AMO-1618	Triton X-100
Ácido benzoico y derivados	Ácido salicílico y derivados
Galato de propilo	Sesamol
Cloruro de clorocolina	3,4-diclorofenoxitrietil (amina)
Ácido cloroetilfosfónico	Ácido dietilditiocarbámico
Ácido nordihidroguayarético
Ditiotreitol	Metabisulfito sódico
Metabisulfito potásico	d-amino-DL-fenilalanina
Sulfato de vanadilo	Uniconazol
Paclobutrazol	Espermina
Espermidina	Putrescina
Cadaverina
Sulfato de protamina
SKF-7997
MER 29
Ancimidol
Triadimefón
Fosfón D
Tiourea
Sulfato de dextrano
Hidroquinona
Glutamato de quitosano
Fenpropemorf
Procloraz
Naptifina
EDU
HTA
MPTA
Glutationa
EGTA
Giberelinas
Ácido abscísico
1,3-Difenilurea
Diazolidinilurea
Floroglucinol
Alginato sódico
Carragenano

\newpage

TABLA 1.b Lista de Precursores, Inhibidores y Estimulantes o Activadores Usados en la Regulación de la Biosíntesis de Taxol y Taxanos en cultivos celulares de especies de T

Precursores	Inhibidores	Estimulantes

Fenilalanina	Cloruro de clorocolina	AMP cíclico
Lisina	Uniconazol	Dibutiril-AMP cíclico
Tirosina	Paclobutrazol	Jasmonato de metilo
Triptófano	SKF-7997	Cis-Jasmona
Metionina	MER 29	Ácido cloroetilfosfónico
Tiramina	Ancimidol	Espermina
Ácido acético y sus sales	Triadimefón	Espermidina
Ácido mevalónico	Fosfón D	Putrescina
Acetato de farnesilo	Fenpropemorf	Cadaverina
Acetato de geranilo	Procloraz	MPTA
Acetato de geranilgeraniol	Naptifina	DCPTA
Triptamina	Miconazol	DIPTA
Mentol	Nitrato de plata	ACC
\alpha-Pineno	Norbornadieno	HTA
Ácido trans-cinámico	AMO 1618	Brasinosteroides
Cambreno A	Alar	BHA
Verticileno	Ácido 4-amino-5-hexinoico	BHT
Verticilol	Feniletanolamina	OTA
Alcanfor	Fenetilamina
Quercetina	Glifosfato
Ácido levulínico	Dihidrocicloeucalenol
Ácido abiético	Sulfóxido de metionina
Borneol	\beta-Hidroxifenetilamina
	5-Metil-DL-triptófano
	\alpha-Fluorofenilalanina
	Hidrocloruro de 5-2-
	aminoetil-L-cisteína

\newpage

TABLA 1.c Elicitores

Xilanasa	Butacloro
Quitooligosacáridos	Isotiocianato de butilo
Aducto de Espermina-bis(óxido nítrico)	Clorambeno
Bis-N,N'-diacetilquitibiosaisopropilamina	Carbamato de etilo
Aducto de óxido nítrico	2-Hidroxietilhidrazina
Aducto de dietilamina-bis (óxido nítrico)	Ácido hidroxiglutárico disódico
N,N'-diacetil-\beta-quitobiósido de bencilo	Triptofol
Ácido siríngico	Tiourea
Benzotiadiazol	Tioacetamida
Bipiridilo	2,4,6-Triclorfenol
Gosipol y derivados	Metocloruro de piridin-2-aldoxima
Ácido 2-cloro-4-metilisonicotínico	Monohidrato de oxalato potásico
Indometacina	Hidrobromuro de poli-L-lisina
N,N',N'-Triacetilquitotriosa	Nerol
N,N'-diacetilquitobiosa	Ácido N-(l-naftil)-ftalámico
Oxalato de diamonio	Oxalato
Nigerano	Hidroclorudo de octapomina
p-Hidroxiacetofenona	Oxizamida
Ácido péctico	2-Metilpirazina
Lisozima	Ácido Metoxiacético
Óxido nítrico	N-Etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-
Glutationa (reducida)	dihidroquinolina
1,2-Diaminopropano	Acetato de lantano
1,3-Diaminopropano	Ácido linolénico
\beta-mercaptoetilamina	Lipasa
Hidroxilamina	Yodoacetamida
Desoxiglucosa	2-hidroxietilhidrazina
Ácido 2-clorbenzoico	Dinocap
2-Metil-1,2-DL(3-piridil)-1-propano	1,3-Difenilurea
5-Bromouracilo	Peróxido de hidrógeno
7-Nitrondazol	Hidroperóxido de urea
8-Hidroxiquinolina	Ácido sebácico
Ácido acetoamidocinámico	Peróxido de benzoílo
2-Aminoantraquinona	N-metilmaleimida
Ácido N-acetil-L-glutámico	Peróxido de cumeno
Agmatina	N-Acetil-D-Glucosamina
3-Acetilpiridina	Octil-\beta-D-Glucopiranósido
Lactato de butirilbutirilo	Fluorofosfato de diisopropilo
7-Bromo-5-cloro-8-hidroxiquinolina	Isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
Bencilbenzoato	Hidroxietil-\beta-1,3-glucano
Bromoxinil	Dextrano
	Amarillo de Lucifer
Siringaldehído
Citinasa
Bacitracina
Cianuro cálcico
Glucanos
Ácido Glutárico
Morfolina
Octametilciclotetrasiloxano
Hidrocloruro de trigonelina

TABLA 1.c (continuación)

Ácido antranílico
Metanosulfonato de colistina
Colchicina
2,4-Diclorofenol
L-Fenilalanina-2-naftilamida
Ácido hidroxiglutárico y sus sales
Ácido DL-2-hidroxi-3-metilbutírico
Monohidrato de 1-10-fenantrolina
3-(4-Hidroxifenil)propionato de N-sulfosuccinimidilo
Trans-1,6-difenilhexatrieno
Ácido araquidónico
Hidrogenoperóxido de urea
Peróxido de hidrógeno
Bestatina
Hidroxianisol butilado
Hidroxitolueno butilado
Goma de gelano
Celulasa
Ácido pimélico
Fosfocloridato de diisopropilo
Nitrapirina
Hidroperóixdo de t-butilo
DL-Fosfinotricinamonio
Siringato de metilo
Trifluralina
Tridecanona
Mimosina
Narigenina
Dimetilaminopiridina
1-Bencilimidazol
DL-o-clorofenilalanina
Cloruro de cetilpiridinio
Hidroquinona
Siringomicina

\newpage

TABLA 1.d. Precursores

Dimetilfenilalanina	1,6-Difosfato de D-fructosa
Cloruro de geranilo	Ácido \beta-hidroxipirúvico
Geranilgeraniol	Ácido 4-hidroxifenilpirúvico
trans-Ácido cinámico	Acetato de metilo
Ácido pirúvico	Laurato de metilo
Ácido fenilpirúvico	Ácido oxaloacético
Ácido ortosuccinilbenzoico	Pinenos
Ácido 2,3-dihidrobenzoico	Acetato de geranilo
Ácido o-hidroxifenilpirúvico	Nerol
Acetato potásico	Felandreno
Ácido glutámico	Cloruro de benzoílo
Ácido aspártico	Ácido R(-)Citramálico
DL-\beta-fenilserina	Asparagina
Ácido hipúrico	Ácido 2,3-diclorobenzoico
Ácido p-hidroxicinámico	Isoleucina
Acetato de bencilo	Leucina
Ácido fenilacético	Ácido fosfoglicérico
Ácido 3-benzoilpropiónico	Serina
Ácido cítrico	Ácido 2-hidroxicinámico
Benzoato cálcico	Ácido 3-hidroxicinámico
Arginina	Ácido 4-hidroxicinámico
N-Benzoil-DL-fenilalanina	Borneol
Ácido 3,4-dihidroxicinámico	Sal potásico de fosfoglicerato
Ácido fosfoenolpirúvico	3-Fosfato de gliceraldehído
Fenilisoserina	Fosfato de dihidroxiacetona
4-Hidrocumarina	Glicina
Glutamina	Acetato de etilo
Ornitina	Cinamato de metilo
Metionina	Acetato potásico
Ácido shikímico	Ácido libre de fosfato de DL-
Ácido Oxoglutámico	gliceraldehído
Ácido DL-3-amino-3-fenilpropiónico	Benzoato cálcico
\alpha-Fenilalanina	Ácido oxoglutámico
\beta-Fenilalanina	Ácido fosfoenolpirúvico
N-Benzoilfenilisoserina	Mentol
Geraniol	Cambreno A
Linalol	Verticilol
Geranil-linalol	Verticeleno
Isovalerato de isobornilo	Ácido abiético
Acetato de cinamilo	Ácido succínico
Propionato de cinamilo	Ácido fumárico
Cloruro de cinamilo	Sal potásico de acetoacetato

TABLA 1.e Inhibidores

Rizobitoxina	Ácido trans-3,4-difluorocinámico
\alpha-Canalina	Mercaptoetanol
Ácido \alpha-aminoisobutírico	4-Hidroxicumarina
Ácido cis-propenilfosfónico	Cinamilfluoreno
Flurprimidol	Ácido 2-ciano-4-hidroxicinámico
Clorometilciclopropano	Ácido cinamilidenmalónico
Diazociclopentadieno	Ácido 4-dimetilaminocinámico
Succinato amónico	N-Cinamilpiperazina
\gamma-Glutamilmetilamida	N-trans-cinamoilimidazol
Ácido 2,3-dimercaptosuccínico	Cinamilideneacetofenona
p-Fosfato de nitrofenilo	Ácido 3,4-metilendioxicinámico
Pervanadato	Ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico
Ortovanadato	Ácido 3-(3,4-
Tiolactona de N-acetil-DL-homocisteína	metilendioxifenil)propiónico
Sales de ácido 2,3-difosfoglicérico	Ácido 3,4-metilendioxifenilacético
p-Benzoato de hidroximercurilo	Ácido 3,4-trans-dimetoxicinámico
Cloruro de metilmercurio	Ácido 4-metoxicinámico
Metilciclopropano	Ácido 2-metoxicinámico
Carboxilato de metilciclopropano	Éster etílico de ácido 4-nitrocinámico
Ciclooctodina	Ácido metoxicinámico
Metoxivinilglicina	4-Nitrocinamaldehído
Ibuprofeno	Ácido 3-nitrocinámico
Ácido piperonílico	Ácido 2-nitrocinámico
Ácido fenilpropiónico	Ácido 3,4-dimetoxi-6-nitrocinámico
Ácido L-2-hidroxi-3-fenilpropiónico	Oxalato amónico
Ácido aminooxiacético	Ácido sinápico
D-Fenilalanina	Ácido 2-hidroxi-4,6-dimetoxibenzoico
Ácido fenilpirúvico	Ácido 3-dimetilaminobenzoico
L-Tirosina	Ácido 3,4-dimetoxibenzoico
Ácido 4-fluoro-(1-amino-2-	Ácido 4-metoxibenzoico
feniletil)fosfónico	N(G)-Nitro-D-arginina
Ácido 4-hidroxifenilpirúvico	N(G)-Nitro-L-Arginina
m-Fluoro-DL-fenilalanina	Ácido malónico
p-Fluoro-DL-fenilalanina	Hidrazida de ácido maleico
m-Fluoro-DL-tirosina	Ácido okadaico
3,4-Difluoro-D-fenilalanina	1,4-ciclohexanodiona
1-Aminobenzotriazol	Fluorofosfato de diisopropilo
Ácido 4-fluorocinámico	Ácido oxámico
SKF-525A	Derivados de ácido oxámico
Sal sódica de ácido dietilditiocarbámico	Sulfanilamida
Ditiotreitol	N-Acetil-S-farnesil-L-cisteína
Ácido p-cumárico	Sal sódica de ácido caetomélico A
Vinilimidazol
Ácido \alpha-hidroxifarnesilfosfónico	Hidrazida de ácido isonicotínico
N6-Monometil-L-arginina	2,3-dimercaptopropanol
7-Nitroondazol	Ácido salicilhidroxámico
Norflurazona	Ácido 3-amino-4-
Ciclooctodien-\alpha-fluorofenilalanina	hidroxibencenosulfónico
Ácido dietilditiocarbámico	Hidroxiurea
SKF-7997 [fosfato-tricloruro de tris-(2-	Ácido 6,7-dimetoxi-1,2-benzisoxazol-3-
dietilaminoetilo)]	acético

TABLA 1.e (continuación)

Triadimefón	Ácido 3-oxo-1,2-benzisotiazolin-2-
Ácido 2,3,4-trimetoxicinámico	ilacético
Ácido 2,4-dimetoxicinámico	Ácido 2,3,5-triyodobenzoico
Ácido 3-hidroxifenilacético	Ácido 2-(p-clorofenoxi)-2-
4-Aminotriazol	metilpropiónico
Ácido 4-Fluorocinámico	Ácido N-(1-naftil)ftalámico
Ácido 4-cloro-2-metilfenoxiacético	Ácido 1-pirenoxibenzoico
1,3-Dicloropropano	Ácido 2-cloro-9-hidroxifluoren-9-
N-Etilmaleimida	carboxílico
Semicarbazida	Cloruro de clorcolina
4-Clororesorcinol	Carboxilato de 2'-isopropil-4'-(cloruro de
1,2-Dicloropropano	trimetilamonio)-5-metilfenilpiperidona
Yodoacetamida	Sesamol
Fenilhidrazina	Ancimidol
Tiosulfato de plata	Daminozida
Cloruro de plata	Lovastatina
Tiosemicarbazida	Simvastina
N-(fosfonometil)-glicina	Ácido cafeico
Ácido p-clorofenoxiisobutírico	Ácido ferúlico
Triton x-100	Ácido 2,5-Dihidroxicinámico
Triparanol	Ácido 2,5-dihidrometoxicinámico
Cloruro de clorfonio	4-Hexilresorcinol
Mepiquat	Cloruro de cetilpiridinio
Sal cálcica de prohexadiona	Estourosporina
Cloromequat	Dimetiltiourea
Tetcyclasis	Ácido fenilpropiónico
2-Aza-2,3-dihidroescualeno	Oxalto amónico
Dinoconazol	1-Aminobenzotriazol
Tridemorf	1-Vinilimidazol
2,3-Iminoescualeno	Mercaptoetanol
Glifosina	Ácido 3,5-diyodo-4-hidroxibenzoico
Carbamato de isopropil-N-fenilo	5-Metil-7-cloro-4-etoxicarbanilmetoxi-
Orizalina	2,1,3-benzotiadiazol
Cafeína	Bromoxinil
D-Arginina	3,4,5-Triclorofenol
\alpha-Metilornitina	N-Metilmaleimida
Conavanina	4-Fluoro-DL-tirosina
Ácido abscísico	3-Nitrocinamato de etilo
3-Amino-1,2,4-triazol
Ácido nitrocinámico	Conavanina
Ácido 3,4-dimetoxifenilacético	Putrescina metilacetilénica
N-cinamilpiperazina	Ácido metilpirúvico
Hidroxilamina	Ácido \alpha-hidroxi-2-
2,4-Dinitrofenilhidrazina	piridinmetanosulfónico
Bromuro de tetrametilamonio	Ácido acetohidroxámico
Clotrimazol	Carbamato de isopropil-N-fenilo
Valinonicina	Yoduro de D1-fenileno
Procaína	Ácido 2-aminoindano-2-fosfónico
Monensina	Arsenato potásico
Uniconazol	Ácido \alpha-aminooxi-\beta-fenilpropiónico
Paclobutrazol	Bencilhidroxilamina
4-Aminotriazol	Butóxido de piperonilo
Isotiocianato de bencilo

TABLA 1.e (continuación)

Selenometionina
1-Acetil-2-tiourea
3,4-Deshidro-DL-prolina
2-Etilnaftaleno
Ácido 3-nitrobenzoico
Sales de plata tales como cloruro de plata,
nitrato de plata, etc.
Hidrosulfito sódico
7-Nitronadozol
Etionina
Azacitididina
Etoxicarbonilpirimidina
Miconazol
Ácido 2,3:4,6-di-o-isopropiliden-2-ceto-
L-gulónico
N-(4-Hidroxifenil)glicina
Ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico
Ácido 3-(2-hidroxifenil)propiónico
4-Ciclohexanodiona
Hidrocloruro de N-(6-aminohexil)-5-
cloro-1-naftalenosulfonamida
Endotal
Fosfano
Cianamida
\alpha-(1-Metiletil)-\alpha-(4-trifluorometoxi)-
fenil-5-pirimidinmetanol
Ácido 2-Aminoisobutírico
D-Arginina
n-Butilamina
Ácido p-cloromercuribencenosulfónico
Metilglioxal-bis(guanilhidrazona)
\alpha-Metilornitina

\newpage

TABLA 1.f. Estimulantes

Pirofosfato potásico	Ácido p-aminohipúrico
Pirofosfato sódico	Cinamato de bencilo
Uracilo	Ácido jasmónico
Melatonina	Jasmonato de metilo
Hidrocloruro de hidroxilamina	Dihidroisojasmona
Tionicotinamida	Isojasmona
S-adenosil-L-metionina	cis-Jasmona
Trifosfato de inosina	Tetrahidrojasmona
Ácido indol-3-láctico	Lactona de cis-jasmona
Ácido indol-3-pirúvico	Dihidrojasmona
Ácido indol-2-carboxílico	Jasminolactona
Indol-3-aldehído	Jasmonalactona
N-indolil-acetil-valina	Ácido 12-oxofitodienoico
Fosfato de piridoxal	Jasmonol
Dihidrojasmonato de metilo	\gamma-Metildecalactona
Bipiridilo	Tiglato de citronelilo
4-Acetoamidofenol	Acetato de jasmonilo
Imidazol	Mastoparano
Octil-\beta-D-glucopiranósido	Ácido lisofosfatídico
3-aminopiridina	Cipermetrina
Ácido gaunílico	Cantaridina
Ácido citidílico	Ácido acetilsalicílico
Isopropil-\beta-d-tiogalactopiranósido	Ácido salicílico y derivados
Ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico	Ácido 2,6-dicloroisonicotínico
Ácido 3-(2-hidroxifenil)propiónico	Óxido nítrico
Ácido indol-3-pirúvico	Ácido traumático
Ácido tiobenzoico	Ácido cítrico
Dimetilaminofenilalanina	Ácido citidílico
Ácido p-hidroxifenilpirúvico	Ácido málico o sal de ácido málico
Ácido 2,3-dihidroxibenzoico	Malato potásico
Benzoato de etilo	Sales de ácido cítrico y derivados
Ácido 3,4-dihidroxicinámico	Mononucléotido de flavina-adenina
Ácido 4-hidroxicinámico	Monocleótido de flavina
N-acetil-L-fenilalanina	Dibutiril-AMP cíclico
Ácido 3-benzoilpropiónico	Espermina
Ácido p-hidroxicinámico	Espermidina
5',5'-Ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico)	Putrescina
Ácido \beta-hidroxipirúvico	Cadaverina
Ácido 4-hidroxipirúvico	S-Adenosilmetionina
Cinamato de metilo	Fosfato de piridoxal
Salicilato de metilo	6-Aminonicotinamida
Benzoato de 2-naftilo	4-Dimetilaminopiridina
Salicilato de fenilo	N-(2-hidroxietil)succinimida
Ácido tiosalicílico	Ácido 2-oxoglutárico
Propaclor
Tiamina
Propionato de vinilo
Hidrocloruro de trietilamina
Ácido 3,5-diisopropilsalicílico
Sulfato de adenina
p-Amino-L-fenilalanina

TABLA 1.f (continuación)

Salicilato de bencilo
1,2-Benzisoxazol
Ácido 2,4-carbonildibenzoico
L-Citrulina
4-Fosfato de D-eritrosa
1,6-Difosfato de fructosa
Trifosfato de inosina
Dihidrocloruro de N-metilputrescina
Hidrocloruro de \beta-feniletilamina
Lisina
Imidazol
Ácido guanílico
Melatonina
Ácido aminociclopropanocarboxílico
Pirofosfato de isopentilo
N-Acetil-L-glutamina
Isoglutamina
Treonina
Pirofosfato potásico
Pirofosfato sódico
Ácido L-2-aminoadípico
Hidrocloruro de N-metil-N-propargilbencilamina
Hemisulfato de aminoguanidina
Ácido L-(+)-2-amino-7-fosfonoheptanoico
Sulfamato amónico
Aducto de espermina-bis(óxido nítrico)
Aducto de dietilamina-bis(óxido nítrico)
Galactosa
Valina
Vitamina B-12
Ácido ascórbico y derivados
Coronatina
Fenobarbital
24-epi-Brasinólido
Dihidrojasmonato de n-propilo
Jasmonato de propilo
Jasmonato de epimetilo

TABLA 2 Componentes de medios usados para cultivar cultivos de Taxus

1

2

: * Indica que los componentes deben esterilizarse por filtración en el medio

TABLA 3 Condiciones preferidas para la proliferación del callo para diversas especies de Taxus. Los ingredientes en los medios basales se listan en la Tabla 2

Especies	Medio Basal	Reguladores del Crecimiento*
	(Tabla 2)	Auxina	Citoquinina
		Tipo	Conc. (M)	Tipo	Conc. (M)
T. brevifolia	F	P	5 x 10^{-6}	2iP	10^{-7}
	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. canadensis	H	P	5 x 10^{-6}	K	10^{-7}
	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. chinensis	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
	A	N	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. globosa	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. floridana	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. baccata	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. cuspidata	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. media	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}
T. wallichiana	D	P	5 x 10^{-6}	BA	10^{-8}

* Abreviaturas: Picloram (P), Ácido naftalenoacético (N), Benciladenina (BA), Dimetilaminopurina (2iP),
Kinetina (K)

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Características de crecimiento típicas para cultivos en suspensión de especies de Taxus

Especies	Tiempo de Doblamiento	Tiempo de Doblamiento	Densidad en	Densidad en
	de Peso Seco	de Peso Fresco	Peso Seco	Peso Fresco

T. brevifolia g/l	2,0 días	3,5 días	20	400
T. baccata	2,0	6,0	15	220
T. chinensis	2,5	4,5	20	285
T. canadensis	nd*	8,5	13	260

* no determinado

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Producción de taxol en diversas especies de Taxus

Especies	Contenido de Taxol	Medio	Análisis
	(% en peso seco)	(Véanse las Tablas 2 y 3)

T. brevifolia	0,006	F	ELISA
T. chinensis	0,004	H	ELISA
T. baccata	0,0014	D	HPLC
T. globosa	0,00003	G	ELISA
T. cuspidata	0,0025	G	HPLC
T. floridana	0,001	G	ELISA
T. media	0,02	F	ELISA
T. canadensis	0,18	B	HPLC

TABLA 6 Mejoras en la productividad debidas al tratamiento de intercambio de medio. Los números se expresan como una mejora de X veces sobre niveles alcanzados en un intervalo por partidas de 15 días. La línea K-1 celular de Taxus chinensis se cultivó en Medio A en la oscuridad

	Niveles totales*	Niveles extracelulares

Taxol	4,6	4,89
Taxanos totales	4,55	5,94

* Niveles totales en células y medio combinados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 Efecto del tratamiento con luz con Standard GroLux sobre el contenido de taxol y taxanos en cultivos de 10 días de línea K-1 de Taxus chinensis cultivada en Medio A. Las cantidades mostradas se expresan como \mug extraídos de 20 ml de suspensión. El crecimiento celular era idéntico en ambos tratamientos (164 mg de peso seco por matraz)

	Luz	Oscuridad

Taxol total: células y medio:	8,8 \mug	3,13 \mug
Taxol extracelular:	76,40%	56,20%
Taxanos totales: células y medio:	61,55 \mug	62,17 \mug
Taxanos extracelulares:	89%	84%

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Claims

1. Un método para producir taxanos con altos rendimientos en un cultivo celular de una especie de Taxus que comprende: cultivar en cultivo en suspensión, en uno o más medios nutrientes bajo condiciones de crecimiento y formación de producto, células de una especie de Taxus derivada de cultivos callosos o en suspensión, y recuperar uno o más taxanos de dichas células o dicho medio de dicho cultivo celular, o ambos, en donde el uno o más medios nutrientes contienen un inhibidor del metabolismo fenilpropanoide.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el inhibidor del metabolismo fenilpropanoide se selecciona de ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico, ácido 3,4-metilendioxicinámico, ácido 3-[3,4-metilendioxifenil]propiónico, ácido 3,4-metilendioxifenilacético, 4-fluoro-L-fenilalanina, ácido 4-hidroxifenilpirúvico, 4-fluoro-DL-tirosina, ácido trans-3,4-dimetoxicinámico, ácido fenilpropiólico, ácido L-2-hidroxi-3-fenilpropiónico, ácido 2-hidroxi-4,6-dimetoxibenzoico, éster 2-(dietilamino)etílico de ácido \alpha-fenil-\alpha-propilbencenoacético, vinilimidazol, oxalato amónico, ácido sinápico y 1-aminobenzotriazol.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que al menos uno de los uno o más medios nutrientes comprende un agente de mejora seleccionado de:

a) un inhibidor de la acción del etileno;

b) un compuesto relacionado con jasmonato; y

c) un regulador del crecimiento relacionado con auxinas.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el uno o más medios nutrientes contienen un compuesto que contiene plata o un complejo de plata o un ión plata.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos uno de los uno o más medios nutrientes contienen ácido jasmónico o un éste alquílico del mismo.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el grupo alquilo esterificado al ácido jasmónico tiene de uno a seis átomos de carbono.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el uno o más medios nutrientes contienen además un compuesto que contiene plata, un complejo de plata o ión plata.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el regulador del crecimiento relacionado con auxinas es ácido 1-naftalenoacético, ácido 2-naftalenoacético, 1-naftalenoacetamida/naftilacetamida, ácido N-(1-naftil)ftalámico, ácido 1-naftoxiacético, ácido 2-naftoxiacético, ácido beta-naftoxiacético, 1-naftoxiacetamida, ácido 3-clorofenoxiacético, ácido 4-clorofenoxiacético, ácido 4-yodofenoxiacético, indolacetamida, ácido indolacético, acetato de indoílo, indolacetil-leucina, ácido gamma-(3-indol)butírico, ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico, éster metílico de ácido 4-amino-3,5,6-tricloropiconílico, ácido 3,6-dicloro-o-anísico, ácido 3,7-dicloro-8-quinolincarboxílico, ácido fenilacético, ácido 2-yodofenilacético, ácido 3-yodofenilacético, ácido 2-metoxifenilacético, clorprofam, ácido 4-cloroindol-3-acético, ácido 5-cloroindol-3-acético, ácido 3-clorindol-3-acético, butirato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo, indolacetilfenilalanina, indolacetilglicina, indolacetilalanina, 4-cloroindol, ácido p-clorofenoxiisobutírico, ácido 1-pirenoxilbenzoico, ácido lisofosfatídico, N-metilcarbamato de 1-naftilo y ácido etil-5-cloro-1H-indazol-3-ilacetato-3-indolbutanoico.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el uno o más medios nutrientes también incluyen un precursor de taxano.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el precursor de taxano es \alpha-fenilalanina, \beta-fenilalanina o una mezcla de las mismas.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el uno o más medios nutrientes también contienen glutamina.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el uno o más medios nutrientes también contienen ácido glutámico, ácido aspártico o una mezcla de los mismos.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el uno o más medios nutrientes incluyen maltosa como una fuente de carbono.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el uno o más medios nutrientes incluyen sacarosa como una fuente de carbono.

\newpage

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el uno o más medios nutrientes incluyen glucosa, fructosa o una mezcla de las mismas como una fuente de carbono.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que maltosa, sacarosa, glucosa, fructosa o una mezcla de las mismas es la fuente de carbono primaria.

17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el medio nutriente es el mismo para el crecimiento del cultivo celular y para la producción de taxol y taxanos.

18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la producción de dichos uno o más taxanos se induce cambiando la composición del medio nutriente.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende además, intercambiar medio nutriente al menos una vez durante la producción de taxanos.

20. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende además intercambiar medio nutriente al menos una vez durante la etapa de cultivo.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que comprende además la retirada de taxano del cultivo durante la producción de taxanos.

22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que células de dicha especie de Taxus se cultiva mediante un procedimiento de alimentación por partidas.

23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que tiene un período de formación de producto en el que la productividad volumétrica de taxanos es al menos 15 mg/l/día de media durante el período de formación de producto.

24. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el taxol se recupera de dichas células o dicho medio de dicho cultivo celular o ambos.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la productividad volumétrica del taxol es al menos 10 mg/l/día computada durante el período de producción de taxol.

26. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que se recupera bacatina III de dichas células o dicho medio de dicho cultivo celular o ambos.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la productividad volumétrica de bacatina III es al menos 15 mg/l/día computada durante el período de producción de taxanos.

28. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que la especie de Taxus es T. brevifolia, T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. baccata, T globosa, T. floridana, T. wallichiana o T. media.

29. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que las células de una especie de Taxus producen taxol por encima del fondo mediante ELISA en cultivo calloso o cultivo en suspensión en medio que no contiene agentes de mejora.

30. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que las células de una especie de Taxus producen taxanos en cultivo en suspensión con una productividad volumétrica media de 10 mg/l/día en un medio que contiene tiosulfato de plata, jasmonato de metilo y ácido 1-naftalenoacético.