MXPA98009847A - Produccion mejorada de taxanos por cultivos de células de especies de taxus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos por los cuales taxol, bacatina III y otros compuestos similares al taxol, o taxanos, se pueden producir con rendimiento muy alto a partir de todas las especies conocidas de Taxus, por ejemplo, brevifolia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, walichiana, media y chinensis;se ha descubierto que modificaciones particulares de las condiciones de cultivo (es decir, composición de los medios y modos de operación) mejoran el rendimiento de varios taxanos a partir de cultivos de células de todas las especies de Taxus;agentes mejoradores particularmente preferidos incluyen ion o complejo de plata,ácido jasmónico (especialmente eléster metílico), reguladores del crecimiento relacionados con auxina e inhibidores de la vía fenilpropanoide, tales comoácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico;estos agentes mejoradores se pueden usar solos o en combinación con algún otro u otras condiciones que mejoran el rendimiento;aún cuando el rendimiento de taxanos a partir de cultivos de células vegetales de T. chinensis mejora particularmente mediante el uso de una o más de estas condiciones, se ha encontrado que el rendimiento de taxanos para todas las especies de Taxus se beneficia por el uso de estas condiciones.

Description

PRODUCCIÓN MEJORADA DE TAXANOS POR CULTIVOS DE CÉLULAS DE ESPECIES DE TAXUS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A.- CAMPO DE LA INVENCIÓN Este invención está dirigida a métodos para la producción y recuperación incrementadas de taxol, bacatina III y otros taxanos mediante cultivos de células de las especies Taxus.

B.- LA TÉCNICA RELACIONADA EL DESAFIO DEL SUMINISTRO DE TAXANO El taxol es un alcaloide diterpenoide aislado originalmente de la corteza del tejo del pacífico Taxus brevi folia (Wani y coautores, 1971, J". Am . Chem . Soc . 93, 2325-2327) . El interés en el taxol comenzó cuando el National Cáncer Institute (NCI) , en un programa de selección a gran escala, encontró que los extractos crudos de corteza exhibían actividades antitumorales. Desde entonces los ensayos clínicos han conformado que el taxol es extremadamente efectivo contra cánceres refractarios de los ovarios y contra cánceres de mama y otros . Se ha declarado que el taxol es un avance en la quimioterapia debido a su mecanismo fundamentalmente diferente de citotoxicidad, es decir, porque inhibe la despolimerización de microtúbulos (véase Rowinsky y coautores, 1990, <J. Natl , Cáncer Inst. , 82, 1247-1259). Una variable desalentadora en la ecuación del taxol ha sido el suministro. El taxol derivado de corteza ha sido descontinuado como la fuente primaria del fármaco comercial; se ha logrado la producción a gran escala por medio de una semisíntesis, es decir, la unión química de una cadena lateral al precursor derivado de la planta, 10-desacetilbacatina III. La síntesis total, si bien se logra mediante laboratorios académicos, muestra poca promesa como una ruta comercial viable para el taxol. Por lo tanto, hay necesidad urgente de desarrollar fuentes de costo efectivo, ambientalmente benignas y consistentes para satisfacer la demanda de taxol que continúa creciendo. Además del taxol, hay urgente necesidad de desarrollar procesos para la producción comercial de moléculas de taxano relacionadas . Los derivados de taxol , tales como Taxotere ya han sido introducidos en el mercado mundial . Además, se ha enfocado a una actividad de investigación tremenda sobre el descubrimiento y desarrollo de nuevos derivados de taxano, con actividad ventajosa. Esos avances probablemente crearán una necesidad creciente de cantidades grandes de moléculas de "esqueleto" inicial apropiada, a partir de la cual puedan sintetizarse efectivamente determinados derivados seleccionados . Un ejemplo de dicha molécula es el precursor É mencionado antes, 10-desacetilbacatina III, que se usa como punto de partida para el taxol semisintético. Otra molécula 5 inicial conveniente para la producción semisintética de taxol y otros derivados es el bacatina III. El bacatina III normalmente no se acumula como un taxano importante in planta, y por consiguiente, no hay una fuente natural, a gran escala, para esa molécula. Sin embargo, es un punto de partida muy conveniente para la semisíntesis, debido a su cercanía química con el taxol; por ejemplo, los pasos que son necesarios para la acetilación 10 del 10-desacetilbacatina III son obviados si el bacatina III es el punto de partida en lugar del 10- desacetilbacatina III. 15 La invención está relacionada con el desarrollo de procedimientos con base en cultivos de células vegetales, para la producción comercial de taxol, bacatina III y otros taxanos.

LOS CULTIVOS DE TEJIDO COMO FUENTES DE SUSTANCIAS QU MICAS 20 DERIVADAS DE PLANTAS La capacidad de las células vegetales para dividirse, crecer y producir metabolitos secundarios bajo una variedad de diferentes regímenes culturales, ha sido demostrada ampliamente por numerosos grupos. En la actualidad se están produciendo dos compuestos, shikonina (un tinte rojo y antiinflamatorio) y la ginsengosida (un tónico en la medicina oriental) mediante procedimientos de cultivo de tejidos en el Japón. Otros muchos procedimientos están cercanos a la comercialización, según se informa, incluyendo la vainillina, la berberina y el ácido rosmarínico (véase Payne y coautores, 1991 "Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems", Hanser Publishers, Munich, Alemania) . Las ventajas de un proceso para el cultivo de células vegetales, en cuanto al taxol, el bacatina III y los taxanos, son muchas: (i) Un procedimiento de cultivo de células asegura un suministro ilimitado, continuo y uniforme de producto, y no está sujeto a plagas, desastres ni fluctuaciones de estaciones; (ii) los cultivos de células pueden ser efectuados en grandes biorreactores, y pueden ser inducidos a producir en exceso el compuesto que interesa, manipulando las condiciones ambientales; (iii) los cultivos de células producen un espectromasa simple de compuestos, en comparación con la corteza o las agujas, simplificando considerablemente la separación y la purificación; (iv) un proceso de cultivo de células puede adaptarse rápidamente a cambios rápidos en la demanda, mejor que los procesos de base agrícola; (v) además de suministrar el taxol, el bacatina III u otros precursores, un proceso de cultivo de células también podría producir compuestos de taxano que exhibieran perfiles de bioactividad ventajosos, o que pudieran convertirse a otros derivados bioactivos. Puesto que el cultivo de células vegetales a gran escala, aséptico, es inherentemente costoso, un proceso de cultivo de células se vuelve comercialmente relevante únicamente cuando esos costos son contrarrestados por una elevada productividad. Toda especie vegetal y cualquier metabolito buscado es diferente, y son necesarios enfoques diferentes para cada sistema particular. Esta invención se enfoca en enfoques creativos y de expertos para obtener cultivos de células de plantas sumamente productivos, para la producción de taxol, bacatina III y taxanos.

LOS PROBLEMAS CON LOS CULTIVOS DE TEJIDO DE PLANTAS MADERERAS Y CONIFERAS Una investigación histórica de la literatura sugiere que si bien las plantas herbáceas han sido manipuladas de manera relativamente fácil en cultivos, los cultivos productores de plantas madereras y de coniferas han sido logrados sólo con dificultades. El desarrollo del metabolito secundario que produce los cultivos de gimnospermas y de coniferas generalmente han sido bajos. Por ejemplo, Berlin y Witte (1988, Phytoche i s try , 27, 127-132) encontraron que los cultivos de Thuja occidentalis aumentaron su biomasa únicamente en alrededor de 30% en 18 días. Van Uden y coautores (1990, Plant Cell Reports, 9, 257-260) informaron de un aumento de biomasa de 20 a 50% en 21 días para suspensiones de Calli tris drummondii . Westgate y coautores (1991, Appl . Microbiol . Biotechnol . , 34, 798-803) informaron de un tiempo de duplicación de alrededor de 10 días para suspensiones de la gimnosperma Cephalotaxus harringtonia . Como se resume por Bornman (1983, Physiol . Plant . , 57, 5-16) se ha dirigido una cantidad tremenda de esfuerzos hacia el desarrollo del medio para las suspensiones de picea (Picea abies) . Este trabajo colectivo demuestra que las suspensiones de gimnosperma en realidad son capaces de desarrollarse rápidamente, pero que no se puede aplicar generalidades, y que las formulaciones de medios para diferentes líneas de células deben ser puestas al óptimo independientemente. Una investigación de la productividad secundaria de metabolitos entre los cultivos de gimnospermas también señala la dificultad de inducir una biosíntesis rápida en comparación con las especies herbáceas. Por ejemplo, los cultivos de Cephalotaxus harringtonia produjeron alcaloides de terpeno a un nivel de únicamente 1% a 3% del encontrado en la planta antecesora (Delfel y Rothfus, 1977, Phytoche istry, 16, 1595-1598) . Aún después de una producción inicial satisfactoria, Heinstein (1985, Journal of Natural Products, 48, 1-9) únicamente fue capaz de aproximarse a los niveles producidos en la planta original (aproximadamente 0.04% en peso seco de alcaloides totales) . Van Uden y coautores (1990) fueron capaces de inducir cultivos en suspensión de la conifera Calli tris drummondii para producir podofilotoxina, pero únicamente a niveles de la décima parte de lo que se produce por las agujas. La capacidad de Thuja occidentalis para producir niveles importantes de monoterpenos (10 a 20 mg/litro) y del diterpenoide deshidroferruginol (2 a 8 mg/litro) se ha demostrado convincentemente por Berlin y coautores (1988) . Sin embargo, esos resultados fueron obtenidos un crecimiento lento (30% de aumento de biomasa en 18 días) y baja densidad de células (5 a 7 gramos en peso seco por litro) de cultivo.

EL CULTIVO DE CELULAS PARA LA PRODUCCIÓN DE TAXANO Las dificultades para obtener el crecimiento rápido y la elevada productividad encontrados en las suspensiones de gimnospermas, se ha reflejado en general por los informes hasta ahora sobre la producción de taxano en los cultivos de células de Taxus . Jaziri y coautores (1991, J. Pharm Belg. 46, 93-99) iniciaron recientemente cultivos de callos de Taxus baccata, pero fueron incapaces de detectar ningún taxol usando su análisis inmunosorbente. ickremensinhe y Arteca (1991, Plant Physiol. 96 (suplemento) p.97) informaron la presencia de 0.009% en peso seco de taxol en cultivos de callos de Taxus media (cv. hicksii) pero no se indicó los detalles sobre los tiempos de duplicación, las densidades de células ni la escala de tiempo durante el cual se produjo el taxol informado. La patente estadounidense No. 5,019,504 (Christen y coinventores, 1991) describe la producción y recuperación de taxano y de compuestos parecidos al taxano, por medio de cultivos de células de Taxus brevi folia . Estos investigadores informaron la producción de taxol a un nivel de 1 a 3 mg/litro en un marco de tiempo de dos a cuatro semanas. También informaron un incremento en la masa células de "5 a 10 veces en 3 a 4 semanas" lo que corresponde a tiempos de duplicación de alrededor de 7 a 12 días. Son necesarios incrementos importantes en los títulos del taxano y en la productividad volumétrica, antes de que se pueda suministrar un proceso económicamente viable para el cultivo de células vegetales, para la producción de taxano, a fin de satisfacer la demanda anual proyectada de muchos cientos de kilogramos por año.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los objetivos de esta invención incluyen la formulación de condiciones ambientales especiales para el desarrollo rápido de crianza, densidades elevadas de células y viabilidades elevadas de células. (Las características .de crecimiento informadas en este estudio sobrepasan los ato resultados previos en un factor importante) . Es un objetivo de esta invención producir taxanos a « 5 velocidades elevadas mediante selección cuidadosa de las líneas de células, selección cuidadosa y manipulación de las condiciones del medio, incorporación de agentes de incremento y selección cuidadosa de los modos de operar el procedimiento. Los objetivos de esta invención incluyen la capacidad de manipular el perfil de los taxanos producidos alterando ^P formulaciones de medios y condiciones ambientales . En particular, es un objetivo propiciar que las células produzcan taxol o bacatina III como producto de taxano predominante y/o suprimir la producción del subproducto cefalomanina, proporcionando de esa manera una solución biológica elegante a un problema costoso e importante de separación y purificación corriente abajo. Esos y otros objetivos son satisfechos por fe una o más modalidades de esta invención. Los inventores han descubierto que el taxol, el 20 bacatina III y otros compuestos parecidos al taxol, o los taxanos, pueden ser producidos en un rendimiento muy alto a partir de las especies Taxus conocidas, por ejemplo, brevi folia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, wallichiana, media y chinensis . Además, por métodos de esta 25 invención, es posible obtener taxol, bacatina III y otros taxanos en un marco de tiempo mucho más breve que el informado previamente. En particular, los inventores encontraron que la especie Taxus chinensis es capas de crecer rápidamente y de producir niveles extremadamente de taxol, bacatina III y 5 taxanos en un periodo de tiempo breve. Con la especie Taxus chinensis, los inventores han sido capaces de manipular células para producir taxol, bacatina III y taxanos en cantidades bastante en exceso de la obtenidas a partir de cultivos de tejidos de otras especies Taxus . 10 Se ha descubierto modificaciones particulares de las condiciones de cultivo (es decir, la composición del medio y los medios de operación) , para incrementar el rendimiento de diversos taxanos a partir del cultivo de células de todas las especies de Taxus . Los agentes de incremento particularmente preferidos incluye el ion plata o el complejo de plata, el ácido jasmónico (especialmente el éster metílico) , los reguladores de crecimiento relacionados con auxina y los K inhibidores de la trayectoria del fenilpropanoide, tal como el ácido 3 , 4-metilendioxi-6-nitrocinámico. Estos agentes incrementadores pueden ser usados solos o en combinaciones entre sí o con otras condiciones incrementadoras de crecimiento. Si bien el rendimiento de taxanos a partir del cultivo de células vegetales de T. chinensis es incrementado en particular mediante el uso de una o más de estas condiciones, el rendimiento de los taxanos para todas las especies Taxus se ha encontrado que se beneficia del uso de esas condiciones . En una modalidad, esta invención provee un método para producir taxanos en elevados rendimientos en cultivo de células de una especie Taxus, que comprende cultivar células de una especie Taxus en un cultivo de suspensión en uno o más medios nutrientes bajo condiciones de crecimiento y de formación de producto, y recuperar uno o más taxanos a partir de dichas células o dicho medio del cultivo de células o de ambos; y las células se derivan del callo o de cultivos de suspensión y los medios nutrientes que contienen un inhibidor del metabolismo de fenilpropanoide. Los inhibidores adecuados del metabolismo del fenilpropanoide incluyen el ácido 3,4-metilendioxi-6-nitrocinámico, el ácido 3,4-metilendioxicínámico, el ácido 3 , 4-metilendioxifenilpropiónico, el ácido 3, 4-metilendioxifenilacético, el ácido 3,4-metilendioxibenzoico, el ácido 3 , 4-trans-dimetoxicinámico, el ácido 4-hidroxicinámico, el ácido fenilpropiólico, la fluorofenilalanina, el 1-aminobenzotriazol, el ácido 2-hidroxi-4, 6-dimetoxibenzoico, SKF 525A, oxalato de amonio, vinilimidazol, ácido dietilditiocarbámico y ácido sinápico. En una modalidad preferida, al menos uno de uno o más medios nutrientes usados en el método de esta invención comprende también otro agente de incremento que puede ser un inhibidor de la acción de etileno; ácido jasmónico o un éster de ácido jasmónico o un regulador de crecimiento relacionado con la auxina. En las modalidades particularmente preferidas, el otro agente de incremento es un inhibidor de la acción del etileno que es un compuesto que contiene plata, o un complejo de plata o un ion plata. En otra modalidad preferida particularmente, el otro agente de incremento es el ácido jasmónico o un éster alquílico del mismo, y más preferible, el grupo alquilo esterificado al ácido jasmónico tiene de 1 a 6 átomos de carbono. En una modalidad todavía más preferida, el agente de incremento es el ácido jasmónico o un éster alquílico del mismo; y el medio también contiene un compuesto que contiene plata, un complejo de plata o ion plata. En otra modalidad particularmente preferida adicional, el otro agente de incremento es un regulador del crecimiento relacionado con la auxina, tal como ácido indolacético, piclorama, ácido Ó-naftalenacético, ácido indolbutírico, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 3 , 7-dicloro-8-quinolincarboxílico o ácido 3, 6-dicloro-o-anísico. En otra modalidad, esta invención provee un método para producir taxanos en un rendimiento elevado en cultivo de células de especies Taxus, cultivando células de una especie Taxus en cultivo en suspensión, en uno o más medios nutrientes bajo condiciones de crecimiento y de formación de producto, y recuperar uno o más taxanos de dichas células o dicho medio de cultivo de células o ambos; derivándose las células del tallo o de los cultivos en suspensión y el medio nutriente contiene plata a una concentración de 900 µmoles o menos en la forma de un compuesto que contiene plata, o un complejo de plata o ion plata, junto con al menos un agente de incremento que puede ser ácido jasmónico o un éster de ácido jasmónico, un regulador de crecimiento relacionado con la auxina. En una modalidad preferida, el agente de incremento es ácido jasmónico o un éster de ácido jasmónico; la razón molar de plata a agente de incremento es menor que 9.5. En otra modalidad preferida, el agente de incremento es un regulador de crecimiento relacionado con la auxina, y la razón molar de plata a agente de incremento es por lo menos 0.011. En cualquiera de las modalidades anteriores, el uno o más medios nutrientes también pueden incluir un precursor de taxano, que puede ser CC-fenilalanina, ß-fenilalanina o una mezcla de ellas. En cualquiera de las modalidades anteriores, el uno o más medios nutrientes también pueden incluir glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico o una mezcla de esos aminoácidos, o uno o más medios nutrientes usados en el cultivo de células pueden incluir maltosa, sacarosa, glucosa y/o fructosa como fuente de carbono, de preferencia como la fuente primaria de carbono. En una modalidad, el medio nutriente es el mismo para el crecimiento de cultivo de células y para la producción de taxol y de taxano. En una modalidad alternativa, la producción de uno o más taxanos se induce en el cultivo cambiando la composición del medio nutriente. En una modalidad preferida, el medio en el cultivo es cambiado" típicamente y típicamente el cambio de medio logra el retiro periódico de los taxanos del cultivo. De preferencia, se cultiva las células de la especie Taxus por medio de un procedimiento de carga de alimento. Típicamente, se recupera el taxol o bacatina III y/u otros taxanos de las células o del medio de cultivo de las células o de ambos. En general, el cultivo de la especie Taxus de acuerdo con esta invención provee una productividad volumétrica promedio de taxanos que es por lo menos 15 mg/litro/día en promedio, durante el periodo de producción de taxano. La productividad volumétrica promedio del taxol típicamente es por lo menos 10 mg/litro/día, computados para el periodo de producción del taxol. La productividad volumétrica promedio de bacatina III típicamente es al menos 15 mg/litro/día, computada durante el periodo de producción de taxano . De preferencia, las células cultivadas de acuerdo con el método de esta invención son células de las especies Taxus y las especies pueden ser T. brevifolia, T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. baccata, T. globosa, T. floridana, T. wallichiana o T. media . De preferencia, las células de una especie Taxus usada en el método de esta invención son células que producen taxol encima del fondo mediante ELISA en cultivo de callo o en cultivo en suspensión, en un medio que no contiene agentes de incremento. Más preferible es que las células de una especie de Taxus usadas en el método de esta invención sean células que produzcan taxanos en cultivo en suspensión, a una productividad volumétrica promedio de 10 mg/litro en un medio que contiene tiosulfato de plata, jasmonato de metilo y auxina.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1.- El incremento de biomasa en una línea K-l en cultivo en suspensión de Taxus chinensis, durante un ciclo de crecimiento intermitente típico en medio A. Las barras de error representan la desviación de norma medida a partir de matraces duplicados. Figura 2. - El efecto del cambio de medio los días 9 y 12 sobre la productividad de taxol (A) y de taxano total (B) en un experimento de 15 días. Los números en cada casilla representan el intervalo de tiempo (días) durante el cual se produjo el producto. La porción oscurecida de las casillas intracelulares representa el taxol o los taxanos totales que estaban presentes en el inoculo de células al inicio del experimento. Todos los tratamientos fueron efectuados por duplicado. La línea K-l de células en suspensión de Taxus chinensis fue usada como medio A, según se elabora en el cuadro 2.

Figura 3. - Las características espectrales de una lámpara Gro-Lux Standard (GTE Sylvania, Danvers, MA, . EUA) usada en el ejemplo 7.3. Figura 4.- La producción de taxano en la suspensión de células K-l de Taxus chinensis . Se muestra la porción del cromatograma desde el minuto 10 al minuto 40. Las exploraciones con la formación de diodos de los picos de taxanos seleccionados muestran un espectro característico de absorción UV de taxano, con un pico a 227 nanómetros. Figura 5.- La producción de taxol y de taxano después de cultivo prolongado en el medio C mediante la línea K-l de células de Taxus chinensis . El panel superior tabula los datos para los taxanos conocidos y desconocidos, mientras que el panel inferior muestra la producción incrementada de taxol y de taxano durante el periodo de tiempo de 25 a 42 días. Figura 6.- La confirmación por MS/MS del taxol en el sobrenadante del cultivo de células. El panel A muestra el espectro de masa APCI con rocío iónico, de taxol auténtico y el panel B muestra el espectro iónico hijo del pico predecesor (m/z 871 = taxol+NH4+) . El panel C representa el espectro APCI de rocío iónico a partir del extracto de células crudo y muestra m/z 854 y 871, característico del taxol. El panel D muestra el espectro hijo correspondiente de m/z 871 y provee evidencia inequívoca de la presencia de taxol en el sobrenadante de cultivo de células.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las plantas han provisto desde hace mucho fuentes importantes de sustancias farmacéuticas y sustancias químicas de especialidad. Esos productos típicamente han sido obtenidos por medio de extracción de materiales de las plantas cosechadas o por síntesis químicas. El taxol y los taxanos se han vuelto una de las clases más importantes de agentes anticáncer en emerger recientemente de la selección de productos naturales. Tal como se usa en la presente, los términos compuestos parecidos a taxol o taxanos son usados de manera intercambiable para describir un compuesto diterpenoide con un anillo de taxano. Los taxanos por sí mismos pueden poseer actividad antineoplástica o pueden ser modificados para producir compuestos bioactivos. El término taxanos totales se refiere a todos los taxanos que exhiben una absorbencia de UV característica, como está descrita en el ejemplo 5 que viene más adelante. Tal como se usa en la presente, el término "callo" se usa para describir una masa de células de plantas cultivadas, que está estructuralmente no diferenciada, y que se cultiva sobre un medio solidificado. Tal como se usa en la presente, el término "cultivo en suspensión" se usa para describir células estructuralmente no diferenciadas que están dispersadas en un medio nutriente líquido. Se debe entender que los cultivos en suspensión comprenden células en diversas etapas de agregación. Una escala de tamaños de agregado se encuentra en las suspensiones descritas en esta invención, variando los tamaños desde décimas de miera de diámetro (células individuales o unas cuantas células agregadas) hasta agregados con muchos milímetros de diámetro que consisten de muchos miles de células. El material de planta o material vegetal usado en esta invención puede ser obtenido de cualquier especie conocida de Taxus, por ejemplo, brevif olia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, wallichiana (también denominada yunnanensis) , media, f stigiata y chinensis (incluyendo las especies sinónimas, tales como sumatrama, celebica y speciosa y las subespecie chinensis variedad mairei) . En particular, los inventores han identificado la especie Taxus chinensis como capaz de producir cantidades importantes de taxol, bacatina III y taxanos, a productividades volumétricas elevadas. Se ha descubierto por los inventores que el contenido de taxano específico varía con la especia de planta, y dentro de la especie de planta con la fuente de tejido y los árboles específicos. Seleccionar una fuente de alto rendimiento y el cultivo para la producción de taxano, es un primer paso importante hacia la provisión de cantidades suficientes de taxanos para uso terapéutico.

MARCAS PARA LA RELEVANCIA COMERCIAL Se puede utilizar un número de marcas para calibrar la atractividad comercial y la viabilidad de un proceso dado que se basa en el cultivo de células de planta, para la producción de taxano. Las marcas deben caracterizarse y basarse en los parámetros funcionales claves del procedimiento, incluyendo los costos de fermentación, la facilidad para la recuperación corriente abajo y la capacidad de producción. Las marcas que serán descritas aquí son tanto de titulación como de productividad volumétrica. La titulación del caldo se define como la concentración del producto en el caldo entero, y usualmente se expresa como miligramos de producto por litro de caldo (mg/litro) . Por definición, el título de caldo entero no distingue entre las porciones intracelulares y extracelulares del producto. El título de caldo se usa típicamente para caracterizar el funcionamiento de un proceso intermitente o de alimentación intermitente. Un título mayor de caldo implica mayor capacidad de producción para un volumen de reactor dado y, concomitantemente, menores costos de producción unitaria. De manera similar, un producto con elevado título usualmente tiene mayor recuperación en el rendimiento alto, conduciendo así a otras mejoras en los costos de producción unitaria. La productividad volumétrica se define como la cantidad de producto producido por volumen de reacción unitario por unidad de tiempo, y se expresa comúnmente en unidades de (to miligramos por litro por día. Para los propósitos de la producción de taxano, se define la escala de tiempo como el , 5 marco de tiempo durante el cual tiene lugar la producción a la escala de producción que precede inmediatamente la cosecha y la recuperación. La productividad volumétrica complementa el título como marca para los procesos intermitentes y de alimentación intermitente, y es particularmente útil para 10 caracterizar procedimientos en los que se retira el producto durante la producción, por ejemplo, mediante el cambio periódico de medio u otro método de separación. Una productividad volumétrica elevada implica mayor capacidad de producción para un volumen de reactor dado para un periodo de 15 tiempo dado y, concomitantemente, menores costos de producción por unidad y mayor desempeño general del procedimiento. En ciertos casos de productividad volumétrica se utiliza calibrar la capacidad intrínseca de un procedimiento biológico, por ejemplo, en las etapas primeras de desarrollo 20 del procedimiento, es útil medir la productividad durante la parte más productiva del ciclo de producción, es decir, durante un intervalo de tiempo corto, cuando los regímenes de biosíntesis están a su máximo. Esto se conoce típicamente como la productividad volumétrica instantánea máxima. Sin embargo, 25 al calibrar el funcionamiento de un procedimiento, la marca más apropiada es una productividad volumétrica promedio, en la cual se mide la productividad durante toda la fase productora. Claramente, a fin de obtener la productividad volumétrica promedio máxima, se debe mantener la productividad instantánea máxima durante la mayor parte de la fase productora. A menos que se califique de otra manera, el término productividad volumétrica se refiere a la productividad volumétrica promedio, determinada para toda la fase de producción. Típicamente, se inicia la fase de producción mediante cambios en la composición del medio nutriente, ya sea reemplazando el medio de crecimiento por medio de producción o añadiendo agentes de incremento que induzcan un incremento importante en la producción de taxano.

INICIO DE LAS LINEAS DE CELULAS DE TAXUS Se puede recoger el material vegetal de Taxus de toda ßfe América del Norte, así como de otros continentes. Se inicia el cultivo seleccionando el tejido apropiado de Taxus para crecimiento. El tejido de cualquier parte de la planta, incluyendo la corteza, el cambio, las agujas, los tallos, las semillas, los conos y las raíces, pueden ser seleccionados para inducir el callo. Sin embargo, para rendimiento máximo de taxol, se prefiere las agujas y las regiones meristémicas de las partes de plantas. Lo que más se prefiere son las agujas recién desarrolladas (por ejemplo, de 1 a 3 meses de edad), que generalmente pueden ser identificadas por un color verde más claro. El término "recién desarrolladas" se debe tomar en su sentido amplio para significar la producción de agujas de . 5 planta dentro de la estación de crecimiento del año. Para prevenir la contaminación del cultivo se debe esterilizar superficialmente el tejido antes de introducirlo en el medio de cultivo. Cualquier técnica de esterilización convencional, tal como CLOROX (una marca propiedad de Clorox Company para blanqueador), será un tratamiento efectivo.

• Además, los agentes antimicrobianos, tales como cefoxitina, benlate, cloxacilina, ampicilina, sulfato de gentamicina y fosfomicina pueden ser usados para la esterilización superficial del material vegetal . 15 EL CRECIMIENTO DEL CALLO Los cultivos típicamente exhibirán variabilidad en la • morfología de crecimiento, la productividad, los perfiles de producto y otras características. Dado que las líneas de células individuales varían en sus preferencias para los constituyentes medios de desarrollo, se puede utilizar muchos medios de crecimiento diferentes para la inducción y proliferación del callo. 25 La composición media apropiada varía con la especie que se esté cultivando. Los medios preferidos para las diferentes especies están mencionados en el cuadro 3. Por ejemplo, aunque puede utilizarse otros, los medios nutrientes de crecimiento preferidos para Taxus chinensis son A, D, I, J, K, L, M, O, P. Estos medios contienen de preferencia los ingredientes mencionados en el cuadro 2. Preferentemente se lleva a cabo el cultivo con componentes de medio incorporados a los niveles mostrados en el cuadro 2 , aunque quien tenga experiencia en la técnica reconocerá que cierta variación en esos niveles no afectará adversamente el crecimiento de las células. Por ejemplo, cuando se usa el medio A, se incorporó hormonas de crecimiento o reguladores en el medio, en una cantidad entre 1 ppb a 10 ppm y, de preferencia, a 2 ppb hasta 1 ppm. Cuando se usó el medio D, se incorporó las hormonas de crecimiento o reguladores a niveles que varía de 1 ppb a 10 ppm y, de preferencia a 2 ppb a 2 ppm. Se puede incorporar las cantidades de los demás ingredientes del medio a niveles que van desde un décimo de la concentración hasta tres veces las concentraciones indicadas en el cuadro 2. La producción de taxanos en grandes cantidades se facilita cultivando las células de Taxus en el cultivo en suspensión. En general, el cultivo en suspensión puede ser iniciado utilizando un medio de cultivo que fue satisfactorio en el cultivo de callo. Sin embargo, los requisitos para el cultivo de suspensión y particularmente para la producción altamente eficiente de taxanos, puede ser satisfecha mejor mediante modificación del medio. Se ha encontrado que cuando se cultiva células de Taxus en un medio de cultivo modificado y en parámetros • de procesamiento adecuados a la medida de acuerdo con métodos de esta invención, el rendimiento de uno o más taxanos del cultivo se incrementa sustancialmente. Tal como se usa en la presente, el término "medio nutriente" se usa para describir un medio que es adecuado para el cultivo de callo de células de planta y cultivos en suspensión. El término "medio nutriente" es general y abarca tanto el "medio de crecimiento" como el "medio de producción" . El término "medio de crecimiento" se usa para describir un medio nutriente que favorece el crecimiento rápido de células cultivadas. El término "medio de producción" se refiere a un medio nutriente que favorece la biosíntesis de taxol, bacatina III y taxano en células cultivadas. Se entiende que puede ocurrir el crecimiento en un medio de producción y que la producción puede tener lugar en un medio de crecimiento; y que puede efectuarse tanto crecimiento como producción óptimos en un solo medio nutriente.

EL CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN Los cultivos en suspensión de Taxus son capaces de crecer a velocidades rápidas y a densidades elevadas de células, al igual que otros cultivos de células vegetales. Sin embargo, las condiciones óptimas pueden variar de una línea de células a otra, y en consecuencia, se debe considerar métodos que conduzcan a alcanzar el punto óptimo de manera rápida para cualquier línea de células dada. Los cultivos de diversas especies de Taxus son cultivados mediante transferencia a medios nutrientes que contienen sales macro y micronutrientes, fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, vitaminas, ácidos orgánicos y reguladores naturales y sintéticos del crecimiento de plantas. En particular, el medio nutriente para el cultivo en suspensión de células de Taxus típicamente contendrá sales inorgánicas que suministren los macronutrientes calcio, magnesio, sodio, potasio, fosfato, sulfato, cloruro, nitrato y amonio, y los micronutrientes como cobre, hierro, manganeso, molibdeno, zinc, boro, cobalto, yodo y níquel. El medio contendrá también típicamente vitaminas tales como mioinositol, tiamina, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido fólico, piridoxina y, opcionalmente, biotina, pantotenato, niacína y similares. Esos componentes pueden estar presentes a escalas de concentración de 1/30 a 30 veces las concentraciones que aparecen en el cuadro 2 y, de preferencia, a 1/20 hasta 20 veces las concentraciones que aparecen en el cuadro 2 , más preferible a 1/3 hasta 3 veces las concentraciones que aparecen en el cuadro 2 y, muy preferible, a las concentraciones que estén mencionadas en el cuadro 2. El medio nutriente también contendrá una o más fuentes de carbono y típicamente contendrá una fuente de carbono primaria, que se define como una fuente que provee más del 50% del carbono total en el medio nutriente. La fuente de carbono primaria de preferencia es lactosa, galactosa, rafinosa, mañosa, celobiosa, arabinosa, xilosa, sorbitol o de preferencia, glucosa, fructosa, sacarosa o maltosa. La concentración de la fuente de carbono primaria puede variar de 0.05% (en peso/volumen) a 10% (en peso/volumen) y, de preferencia, de 0.1% (en peso/volumen) a 8% (en peso/volumen). El medio nutriente también contendrá una fuente de nitrógeno que, además de cualquier nitrógeno añadido en la forma de sales macronutrientes, estará provista de preferencia al menos en parte por una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, uno o más aminoácidos, tales como glutamina, ácido gutámico o ácido aspártico o hidrolizados de proteína) . Estas fuentes orgánicas de nitrógeno pueden suministrar el nitrógeno a concentraciones que van desde 0.1 mmoles hasta 60 mmoles y, de preferencia, de 1 a 30 mmoles. El medio también puede contener uno o más ácidos orgánicos, tales como acetato, piruvato, citrato, oxoglutarato, succinato, fumarato, malato y similares . Esos componentes pueden estar incluidos en el medio a concentraciones de 0.1 mmoles a 30 mmoles y, de preferencia, a concentraciones de 0.5 mmoles a 20 mmoles.

El medio contendrá también típicamente uno o más reguladores del crecimiento de plantas, naturales o sintéticos, incluyendo los reguladores de crecimiento relacionados con la auxina, tales como picloram, ácido indolacético, ácido 1-naftalenacético, ácido indolbutírico, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 3 , 7-dicloro-8 -quinolincarboxílico, ácido 3, 6-dicloro-o-anísico y similares; reguladores de crecimiento relacionados con citocinina, tales como N -benciladenina, 6- [gamma, gamma-dimetilalilamino] purina, einetina, zeatina, N-fenil-N1 -1, 2 , 3-tidiazol-5-ilurea (tidiazuron) y derivados relacionados con fenilurea y similares; giberrelinas, tales como GA3, GA4, GA7 y derivados de GA, ácido abscísico y sus derivados, brasinoesteroides y reguladores de crecimiento relacionados con etileno. Otros reguladores del crecimiento de plantas relacionados con auxina, adecuados, adicionales, están mencionados más adelante. Se debe notar que el medio nutriente puede contener uno o más reguladores del crecimiento que pertenezcan a una sola clase, por ejemplo, más de un regulador individual relacionado con la auxina o más de un regulador relacionado con la citocinina. Los reguladores de crecimiento de preferencia quedan incorporados en el medio a una concentración entre 10~10 moles a § ~^ moles, de preferencia de 10"° a 3 x 10~5 moles y, más preferible, a las concentraciones que aparecen en el cuadro 2. A menos que se indique de otra manera, los medios de crecimiento como los definidos aquí proveen un punto de partida adecuado para llevar al punto óptimo la rutina de medios de cultivo de callo y medios de producción. Es cuestión rutinaria para los expertos en la materia incorporar, modificar y manipular clases particulares de componentes y los componentes dentro de una clase dada, para obtener un funcionamiento óptimo; las modificaciones particulares a los medios están provistas en los cuadros y en los ejemplos que vienen más adelante . Los cultivos líquidos están expuestos a ambientes gaseosos, tales como aire y, de preferencia, son sacudidos o agitados de otra manera para permitir el mezclado adecuado de los componentes de cultivo. Se mantiene los cultivos a una temperatura entre 23°C y 27°C aunque bajo las condiciones y/o las circunstancias apropiadas, las temperaturas podrían variar desde 0°C hasta 33 °C. El pH puede ser aproximadamente de 3 a 7 y, de preferencia, entre 4 y 6. Se puede desarrollar el cultivo bajo condiciones de luz que varían desde total oscuridad hasta luz total (espectro de banda angosta y/o banda ancha) durante diversos períodos de tiempo. Se ha medido los tiempos de duplicación vigilando el incremento de la biomasa independiente del tiempo, así como por simple vigilancia del índice de crecimiento durante el subcultivo rutinario. Se ha obtenido densidades máximas en peso seco de 15 a 24 g por litro. Las características de crecimiento de diversas suspensiones de especie Taxus están elaboradas en el ejemplo 4.

LAS CONDICIONES DE PRODUCCIÓN DE TAXANO Si tiene lugar formación secundaria de metabolito en un cultivo de suspensión, concurrentemente con el crecimiento, se denomina el metabolito asociado con el crecimiento, y puede ser suficiente una sola formulación de medio para obtener buen crecimiento y elevado nivel de producción. En muchos otros sistemas, se ha encontrado que no tienen lugar concurrentemente el crecimiento rápido y la formación elevada de producto. En dichos casos, se separan las fases de crecimiento y de producción y se desarrolla un medio para cada fase, independientemente (resumido en Payne y coautores, 1991, Plant Cello and Tissue Culture in Liquid Systems, Hanser Publishers, Munich, Alemania) . En el caso de la producción de taxano en Taxus, se puede separar el crecimiento y la formación de producto y se ha desarrollado medios independientes para cada uno . En un modo preferido de esta invención, la composición del medio durante la fase de crecimiento de la célula es diferente de la composición del medio durante la fase de producción de taxano. Por ejemplo, la identidad y el nivel de las fuentes de carbono, particularmente la fuente de carbono primaria, pueden cambiar entre la fase de crecimiento y la fase de producción. Preferiblemente el medio de producción contendrá azúcar a un nivel mayor que el medio de crecimiento. Se prefiere más que el nivel de azúcar inicial en el medio de producción pueda ser de dos a 20 veces mayor en la fase de producción que en la fase de crecimiento. De preferencia la fuente de carbono primaria es lactosa, galactosa, rafinosa, mañosa, celobiosa, arabinosa, xilosa, sorbitol o, de preferencia, glucosa, fructosa, sacarosa o maltosa. La concentración de la fuente de carbono primaria puede variar de 0.05% (en peso/volumen) a 10% (en peso/volumen) y de preferencia de 0.1% (en peso/volumen) a 8% (en peso/volumen) . Las fuentes de carbono particularmente preferidas para la producción de taxol o bacatina son maltosa, sacarosa, glucosa y/o fructosa. En modalidades particularmente preferidas, se puede incorporar estos azúcares en un medio nutriente inicial a concentraciones de al menos 3.5%. La identidad y el nivel de complementos orgánicos, que pueden incluir vitaminas, fuentes de nitrógeno orgánicas como aminoácidos, así como la presencia o los niveles de incremento descritos más adelante, pueden cambiar o pueden diferir en el medio. La identidad de los niveles de reguladores del crecimiento de la planta, naturales o sintéticos, pueden diferir entre los medios. De manera similar, los niveles y la identidad del macronutriente y las sales de macronutriente pueden diferir también entre los medios de crecimiento y de producción. De preferencia se reduce el contenido de sal en el medio de producción con respecto al medio de crecimiento, opcionalmente se reduce las sales nitrato y sulfato de manera desproporcionada y, ' más preferible, el grado de reducción es una reducción en un factor de 2 a 20 veces. Sin embargo, se debe entender que se puede formular un solo medio de crecimiento/producción para este cultivo. Los medios de producción desarrollados aquí no solamente aumentan la formación de taxano, sino que además dirigen la biosíntesis celular hacia la producción de taxanos particulares, tales como taxol o bacatina III. Además, la producción de subproductos que interfieren, tales como cefalomanina, es mínima en comparación con el tejido de corteza. El medio de producción desarrollado aquí también promueve una viabilidad de células y una biosíntesis prolongadas y, además, provoca que sean secretados niveles importantes de producto hacia el medio extracelular. Esas características son extremadamente importantes en la operación de un proceso eficiente a escala comercial para la producción de taxano. Los métodos para la extracción y la recuperación de taxol y taxanos a partir de células y el medio, siguen técnicas convencionales (véase, por ejemplo, el ejemplo 5) . La técnica de inmunoanálisis (ELISA) siguió en gran medida los protocolos suministrados por Hawaii Biotechnology en el equipo obtenible comercialmente (véase también Grothaus y coautores, 1995, Journal of Natural Products, 58, 1003-1014, incorporada aquí mediante esta referencia) . El anticuerpo puede ser específico para cualquier taxano, tales como taxol o bacatina III, o menos específicamente, para el esqueleto de taxano. Los métodos de cromatografía en líquido de alto rendimiento fueron modificados ligeramente con respecto a los protocolos existentes, según se elabora en el ejemplo 5. Bajo las condiciones usadas en esta invención, se obtuvo una resolución clara de los picos de taxano, lo que dio como resultado la detección precisa y la cuantificación precisa. Debido a la posibilidad de coeluir componentes que no sean de taxano, se comprobó rutinariamente la pureza espectral de los picos de taxano mediante la disposición del diodo antes de integración de las áreas de pico. Los tiempos de retención de las normas de taxano están relacionados en el ejemplo 5 y un cromatograma de muestra está incluido en la figura 4. Para plantas mayores, la luz es un factor potente en un metabolismo secundario, tanto en plantas intactas como en cultivo de células. Tanto la intensidad como la longitud de onda de la luz son importantes (Seibert y Kadkade 1980, "Plant Tissue Culture as a Source of Biochemicals" , E.J. Staba (editor), CRC Press, Boca Ratón, Florida, EUA, pp. 123-141). Por ejemplo, la biosíntesis de flavanoides y de antocianina usualmente son favorecidas con luz continua de alta intensidad, mientras que se prefiere cultivos efectuados en la oscuridad para otros metabolitos. El aumento en la capacidad de formación de verde o capacidad fotosintética en las células cultivadas, también aumenta la formación del producto o el espectro del producto. Los estudios de los inventores implicaron el uso de una banda amplia así como de fuentes luminosas de banda angosta específicas. Como se muestra en el ejemplo 7.3, la exposición a la luz puede efectuar acumulación incrementada de taxol así como secreción al medio. El efecto estimulador de la luz sobre la producción de taxol sugiere la existencia de mecanismos de control únicos para la biosíntesis de los taxanos. La naturaleza del fotorreceptor y las características bioquímicas de la simulación inducida con luz todavía no están claras. Sin embargo, la incorporación de agentes de incremento de acuerdo con las enseñanzas de esta invención hace que el papel de la luz sea menos crítico para el funcionamiento óptimo. Además de los nutrientes no volátiles disueltos, los componentes gaseosos, primariamente oxígeno, dióxido de carbono y etileno (una hormona de las plantas) juegan papeles críticos en el desarrollo y la formación del producto. Son importantes dos parámetros. Las concentraciones de gas disuelto que favorecen el crecimiento y la formación de taxol son obviamente importantes puesto que dictan las condiciones de operación del reactor. Además, los regímenes de consumo o de producción que es necesario incorporar en el diseño del reactor, de manera que se puedan mantener concentraciones óptimas como las especificadas . 5 Además de su importancia en la respiración, el oxígeno también puede afectar dramáticamente el régimen o la velocidad del metabolito secundario. Una constante de alta saturación para un paso que requiere oxígeno en una trayectoria biosintética secundaria, puede requerir que se someta las 0 células a niveles elevados de oxígeno en el reactor. La importancia de la suplementación de CO2 al mantener las velocidades elevadas de crecimiento, ha sido documentada. El etileno, una hormona de planta, juega papeles pleyotrópicos en todos los aspectos del crecimiento y desarrollo de la planta, 5 incluyendo el metabolismo secundario (por ejemplo, véase Payne y coautores, 1991) . Los inventores han descubierto que ciertos regímenes de la concentración de gas pueden favorecer el crecimiento y el cultivo secundario en los cultivos de células. Por ejemplo, 0 puede ser compatible una escala de concentraciones de oxígeno con el cultivo, de 1% de saturación de aire hasta 200% de saturación de aire y, de preferencia, en la escala de 10% a 100%, muy preferible, en la escala de 25% a 95%. Una escala de concentraciones de dióxido de carbono puede ser compatible con 5 el cultivo, de 0.03% (en volumen/volumen en la fase gaseosa, es decir en equilibrio con el medio de cultivo) hasta 15% (en volumen/volumen) y, de preferencia, en la escala de 0.3% a 8% (en volumen/volumen) . Las concentraciones óptimas de los gases disueltos pueden diferir con respecto al metabolismo de las células, por ejemplo, las células que sufren un crecimiento rápido pueden tener diferentes óptimos con respecto a las células que sufren biosíntesis de taxano, lo que típicamente favorece niveles de oxígeno mayores, y son menos sensibles a niveles mayores de bióxido de carbono. Los óptimos también pueden variar con la cinética del cultivo; por ejemplo, las células en una fase de reposo pueden preferir diferentes concentraciones de gas disuelto que las células en fase de crecimiento logarítmico. Los gases disueltos pueden interactuar con los demás componentes del cultivo y con la acción de los agentes de incremento, de diversas maneras. Por ejemplo, los requisitos de oxígeno pueden cambiar cuando se desata o se estimula la biosíntesis. Los aumentos en los regímenes de respiración, como una respuesta ligada, son observados comúnmente cuando se inician los cultivos de las células de planta. Los iniciadores o estimuladores pueden variar su acción con el etileno o pueden afectar la producción de etileno, independientemente de promover el metabolismo secundario. En dichos casos puede ser conveniente sustituir una preparación de iniciador microbiano con etileno y quizás prevenir la toxicidad asociada con otros componentes microbianos en la preparación iniciadora. Alternativamente, puede ser ventajoso inhibir la acción del etileno permitiendo de esa manera que el iniciador o estimulante promuevan el metabolismo secundario de una manera más exclusiva, y de tal modo, más efectiva. Como se describe más adelante, el ion plata, un componente conocido que afecta la acción del etileno, modifica ventajosamente la biosíntesis de taxano .

LOS AGENTES DE INCREMENTO La producción de metabolitos secundarios es un proceso complejo, que requiere la acción coordinada de muchas enzimas diferentes para producir y modificar secuencialmente los precursores que son convertidos finalmente a los metabolitos secundarios. Al mismo tiempo, la producción de metabolito secundario disminuirá si otras enzimas metabolizan precursores del metabolito deseado, drenando los rebalses de precursor necesarios para formar los metabolitos secundarios. La limitación de la cantidad de precursor disponible, debida a la producción baja o a la diversión subsecuente, o la limitación en la conversión de un precursor o intermediario a un intermediario corriente abajo, o la limitación en la actividad de una enzima dada, limitarán la producción de metabolitos secundarios. En cualquier sistema de cultivo particular, el régimen al que se produce un metabolito secundario será controlado por una de estas limitaciones, formando un cuello de botella en la trayectoria mediante la cual se convierte el precursor o los precursores al metabolito secundario. Aliviar la limitación que provoca el cuello de botella aumentará la velocidad de producción del metabolito secundario en ese sistema de cultivo hasta el punto en que otro paso en la trayectoria se vuelve limitante. El paso particular que limita la velocidad general de producción variará entre diferentes cultivos, al igual que la acción que alivia la limitación. Los taxanos son metabolitos secundarios que son producidos mediante una serie de muchos pasos enzimáticos, y los inventores de la presente han determinado varias clases de agentes de incremento que alivian uno o más de esos pasos limitadores de velocidad en la biosíntesis del taxano. La adición de uno de esos agentes de incremento a un cultivo de células productoras de taxano aumentará la velocidad de producción del taxano. Adicionalmente, los inventores han determinado que el uso de agentes de incremento discutidos aquí tendrá al menos cierto efecto incrementador en la mayoría de los cultivos productores de taxano, lo que sugiere que determine la velocidad global de producción no mediante un solo paso que limita la velocidad, sino mediante una interacción compleja entre una multiplicidad de factores. El alivio de cualquiera de estos factores limitadores incrementará la producción del taxano, aunque la magnitud del incremento dependerá de las condiciones particulares de cultivo, que determinan el efecto limitador relativo de otros pasos en la 5 biosíntesis del taxano; una vez que se ha aliviado la limitación particular. Las condiciones de cultivo que afectan la interacción entre los diversos factores limitantes incluyen la genética que constituye las células, la composición del medio de .cultivo y el ambiente gaseoso, la temperatura, la iluminación y el protocolo del procedimiento, así como el W agente o los agentes de incremento añadidos a un cultivo particular, que usualmente serán seleccionados en vista de los factores limitantes en ese cultivo, que se pueden determinar empíricamente mediante comparación de los efectos de agentes de incremento individuales, como los aquí señalados. Además, se ha descubierto que el incremento adicional en la producción de taxano se logrará si está presente en el cultivo más de un agente de incremento. • Los agentes de incremento representativos dentro de lo contemplado por esta invención están ejemplificados en el cuadro 1. Los agentes de incremento de esta invención serán discutidos bajo diversas clases generales. Esas clases son: los agentes contra tostado, los agentes anti-senescencia, los agentes anti-etileno, los reguladores de crecimiento de planta, tales como los reguladores de crecimiento relacionados con la auxina, los precursores, inhibidores, iniciadores, estimulantes y compuestos relacionados con el jasmonato. Una clase de agentes de incremento contemplados por esta invención son los agentes anti-tostado. Tal como se usa 5 en la presente, el término "agentes anti-tostado" se refiere a los componentes que son añadidos al medio nutriente para permitir la formación de pigmentos durante el cultivo de la célula. Esos pigmentos incluyen los compuestos fenólicos y otros relacionados que son observados generalmente con un efecto dañino sobre el crecimiento de las células, su • viabilidad y la formación de producto. Un agente anti-tostado típico, utilizado en los medios nutrientes de acuerdo con esta invención, es el ácido ascórbico. Se puede incorporar típicamente los agentes anti-tostado en el medio a una escala de concentración de 10 ppb a 1000 ppm. Otra clase de agentes de incremento la constituyen los agentes anti-senescencia. Un agente anti-senescencia es un tt» compuesto de origen biológico o no biológico que protege a las células contra el envejecimiento. Dichas agentes podrían actuar, por ejemplo, bloqueando la producción de compuestos que promueven la senescencia, bloqueando la acción de factores promotores de senescencia, promoviendo la depuración de radical o las actividades antioxidantes, protegiendo la integridad de las membranas celulares o de los organelos o mediante otros mecanismos. Dichos agentes incluyen los antagonistas de la acción de etileno; las poliaminas y sus metabolitos, tales como espermina, espermidina, diaminopropano y similares; los agentes anti-tostado, inhibidores de la producción de fenólicos y los depuradores de radical, tales como glutationa, galato de propilo y compuestos de sulfhidrilo, tales como ß-mercaptoetanolamina . Los agentes anti-etileno como se definen son sustancias que interfieren con la producción de etileno o la acción de etileno. Los agentes anti-etileno que interfieren con el metabolismo del etileno pueden ser clasificados adicionalmente como antagonistas de biosíntesis de etileno y antagonistas de la acción de etileno. Los antagonistas de la biosíntesis de etileno son compuestos que interfieren con la trayectoria de la biosíntesis del etileno; ejemplos de enzimas a lo largo de esa trayectoria biosintética que son inhibidas incluyen la ACC-sintasa, la ACC-oxidasa y otras etileno-oxidasas . Los ejemplos de antagonistas de la biosíntesis de etileno incluyen el ácido OG-aminoisobutírico, el ácido acetilsalicílico, la metoxivinilglicina, el ácido aminooxiacético y similares. Los ejemplos de antagonistas de la acción del etileno incluyen los compuestos que contienen plata, los complejos de plata o los iones plata; el dióxido de carbono, 1-metilciclopropeno, 2, 5-norbornadieno, trans-cicloocteno, cis-buteno, diazo-ciclopentadieno y similares. Las sales de plata adecuadas incluyen nitrato de plata, tiosulfato de plata, fosfato de plata, benzoato de plata, sulfato de plata, sal de plata de ácido toluensulfónico, cloruro de plata, óxido de plata, acetato de plata, pentafluoropropionato de plata, 5 cianato de plata, sal de plata del ácido láctico, hexafluorofosfato de plata, nitrilo de plata y la sal de triplata del ácido cítrico. Los ejemplos ilustrativos del incremento de la síntesis de taxano mediante una variedad de sales de plata están mostrados en el ejemplo 10. Los agentes 10 anti-etileno pueden ser incorporados en el medio a niveles de 10 ppb a 1000 ppm. Cuando se incorpora la plata en el medio, se añadirá a una concentración de menos de 900 µM, de preferencia menos de 500 µM y, más preferible, menos de 200 µM. Cuando se incorpora la plata en el medio, se añadirá a una 15 concentración de cuando menos 10 nM, de preferencia 100 nM, más preferible 1 µM y típicamente a 10 µM. Los agentes de incremento contemplados en esta ^fe invención incluyen los reguladores del crecimiento de planta, particularmente los reguladores de crecimiento relacionados con 20 la auxina, que incluirán auxinas, compuestos con actividad parecida a la auxina y antagonistas de auxina. Los reguladores de crecimiento relacionados con la auxina típicamente serán incorporados en el medio a concentraciones de entre 10"10 M y 10~3 M, de preferencia 10~8 y 10~5 M. Los ejemplos muy preferidos de reguladores de crecimiento relacionados con la auxina incluyen: ácido 1-naftalenacético, ácido 2-naftalenacético, 1-naftalenacetamida/naftilacetamina, ácido N- (1-naftil) ftalámico, ácido 1-naftoxiacético, ácido 2-naftoxiacético, ácido beta-naftoxiacético, 1-naftoxiacetamida, ácido 3 -clorofenoxiacético, ácido 4 -clorofenoxiacético, ácido 3-yodofenoxiacético, indolacetamida, ácido indolacético, acetato de indol, indolacetil leucina, ácido gamma- (3-indol) butírico, ácido 4-amino-3 , 5, 6-tricloropicolínico, éster metílico del ácido 4-amino-3 , 5, 6-tricloropicolínico, ácido 3,6-dicloro-o-anísico, ácido 3 , 7-dicloro-8-quinolincarboxílico, ácido fenilacético, ácido 2-yodofenilacético, ácido 3-yodofenilacético, ácido 2-metoxifenilacético, Chlorpropham, ácido 4-cloroindol-3-acético, ácido 5-cloroindol-3-acético, butirato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo, indolacetilfenilalanina, indolacetilglicina, indolacetilalanina, 4-cloroindol, ácido p-clorofenoxiisobutírico, ácido 1-pirenoxilbenzoico, ácido lisofosfatídico, N-metilcarbamato de 1-naftilo y ácido etil-5-cloro-lH-indazol-3-ilacetato-3-indolbutanoico. Otros ejemplos preferidos de reguladores de crecimiento relacionados con auxina incluyen: ácido naftalen-2, 6-dicarboxílico, dianhidrido de ácido naftalen-1, 4, 5, 8-tetracarboxílico, naftalen-2-sulfonamida, anhídrido 4-amino-3, 6-disulfo-l, 8-naftílico, ácido 3, 5-dimetilfenoxiacético, 1, 8-naftalimida, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 2, 3 -diclorofenoxiacético, ácido 2, 3 , 5-triclorofenoxiacético, ácido 2-metil-4- clorofenoxiacético, ácido nitrofenoxiacéticos, ácido DL-alfa- (2, 4-diclorofenoxi) propionico, ácido D-alfa- (2,4- diclorofenoxi) propiónico, ácido 4-bromofenoxiacético, ácido 4- fluorofenoxiacético, ácido 2-hidroxifenoxiacético, 5- 5 cloroindol, acetato de 6-cloro-3-indoílo, 5-fluoroindol, ácido 5-cloroindol-2-carboxílico, ácido 3 -cloroindol-2 -carboxílico, ácido indol-3 -pirúvico, butirato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo, butirato de 6-cloro-3-indoílo, ácido quinolin-2-trioglicólico, ácidos aminofenilacéticos, ácido 3 -nitrofenilacético, ácido 3- 10 cloro-4-hidroxibenzoico, clorflurenol, acetato de 6-cloro-3- • indoílo, clorhidrato de N- (6-aminohexil) -5-cloro-l- naftalensulfonamida, 2-cloro-3- (2, 3 -diclorofenil) propionitrilo, ácido o-clorofenoxiacético, ácido 6, 7-dimetoxi-1, 2- bencisoxazol-3 -acético, ácido 3-oxo-l, 2-benci-isotiazolin-2- 15 ilacético, Mastoparan, ácido 2 , 3 , 5-triyodobenzoico, ácido 2- (3- clorofenoxi) propanoico y Mecoprop. Otros ejemplos de reguladores de crecimientos relacionados con auxina adecuados incluyen: hidrazida de ácido naftoico, ácido 2,4- • dibromofenoxiacético, ácido 3 -trifluorometilfenoxiacético, oxiindol, ácido indol-2 -carboxílico, ácido indol-3-láctico, ácido beta- (3-indol) propiónico, ácido 2 -bromofenilacético, ácido 3 -bromofenilacético, ácido 2-clorofenilacético, ácido 3- clorofenilacético, ácido 2-metilfenilacético, ácido 3- metilfenilacético, ácido 3 -trifluorometilfenilacético, ácido 3- 25 metiltiofenilacético, ácido fenilpropiónico, ácido 4-cloro-2- metilfeniltioacético, ácido 2-clorobenzoico, ácido 3-clorobenzoico, ácido 2 , 3-diclorobenzoico, ácido 3,4-diclorobenzoico, ácido 2, 3, 5-triclorobenzoico, ácido 2,4,6-triclorobenzoico, ácido 2-benzotiazoloxiacético, 2-cloro-3- (2, 3 -diclorofenil) propionitrilo, 2 , 4-diamino-s-triazina, anhídrido naftálico, Dikegulac, éster clorflurecolmetílico, ácido 2- (p-clorofenoxi) -2-metilpropiónico, ácido 2-cloro-9-hidroxifluoren-9-carboxílico, ácido 2,4,6-triclorofenoxiacético, ácido 2- (p-clorofenoxi) -2-metilpropiónico, 4- (cloro-o-toliloxi) butirato de etilo, [N- (l,3-dimetil-lH-pirazol-5-il) -2- (3,5, 6-tricloro-2-piridinil) oxi] acetamida, ácido 4-cloro-2-oxobenzotiazolin-3 -il-acético, ácido 2- (2 , 4 -diclorofenoxi) propanoico, ácido 2- (2,4,5-triclorofenoxi) propanoico, ácido 4-fluorofenilacético, ácido 3-hidroxifenilacético, Orthonil, ácido 3 , 4 , 5-trimetoxicinámico, 2- (3 , 4-diclorofenoxi) trietilamina, ácido indol-3 -propiónico, yoxinil sódico, ácido 2-benzotiazolacético y ácido (3-fenil-1,2, 4-tiadiazol-5-il) tioacético. Otras clases de reguladores de crecimiento de plantas también pueden ser incorporados en el medio nutriente como agentes de incremento. Estos incluyen los reguladores de crecimiento relacionados con citocinina, tales como N -benciladenina, 6- [gamma, gamma-dimetilamino] purina, cinetina, zeatina, N-fenil-N' -1, 2 , 3-tidiazol-5-ilurea (thidiazuron) y derivados de fenilurea relacionados, y similares; giberrelinas, tales como GA3 , GA4, GA7 y derivados de GA, ácido abscísico y sus derivados, brasinoesteroides y reguladores de crecimiento relacionados con el crecimiento. Dichos reguladores de crecimiento pueden ser incorporados en el medio a concentraciones entre 10 M y 10 M, de preferencia entre 10"8 M y 10"5 M. Otra clase de agentes de incremento son los precursores o precursores biosintéticos. Como se usa en la presente, el término precursores describe los compuestos añadidos al medio nutriente que son metabolizados e incorporados en las células a taxol y taxanos . Los precursores adecuados incluyen precursores de compuestos isoprenoides, tales como acetato, piruvato y similares: Ó-fenilalanina, ß-fenilalanina (ácido 3-amino-3-fenilpropiónico) , fenilisoserina, N-benzoilfenilisoserina, ácido benzoico, ácido shiquímico, glutamina, ácido cinámico y similares. Los derivados de las moléculas mencionadas arriba, también son adecuados como precursores . Otra clase de agentes de incremento son los inhibidores. Los inhibidores son compuestos que inhiben las actividades enzimática u otras celulares. Tal como se usa aquí, el término "inhibidores metabólicos" describe compuestos añadidos al medio nutriente que interfieren con trayectorias biosintéticas específicas. Por ejemplo, se puede usar un inhibidor metabólico para incrementar la biosíntesis de taxol, de bacatina II, u otro taxano bloqueando una trayectoria diferente que compita por un precursor biosintético temprano. Los agentes de incremento particularmente efectivos de esta clase incluyen los inhibidores del metabolismo de fenilpropanoides, que son compuestos capaces de inhibir la síntesis del metabolismo de ácido cinámico o sus derivados. Esos compuestos incluyen preferiblemente, ácido p-cumárico, 4-fluoro-DL-tirosina, ácido 4-metoxibenzoico, ácido 3-dimetilaminobenzoico, ácido 4-metoxicinámico, éster etílico del ácido 4-nitrocinámico, 4-nitrocinamaldehído, mercaptoetanol, 4-hidroxicumarina, Cinnamylfluorene, ácido 2-ciano-4-hidroxicinámico, ácido dinamilidenmalónico, ácido 4-dimetilaminocinámico, N-cinamilpiperazina, N-trans-cinamoilimidazol, ácido 2-aminoindan-2-fosfónico, bencilhidroxilamina, procaína, Monensin, N- (4-hidroxifenil) glicina, ácido 3- (4-hidroxifenil) propiónico, ácido 3- (2-hidroxifenil) propiónico, más preferible, D-fenilalanina, N- (2 -mercaptopropionil) glicina y sus complejos de sal de ácido acético, DL-metafluorofenilalanina, p-fluoro-DL-fenilalanina, Dithiothreitol, ácido 4-fluorocinámico, ácido trans-3,4-difluorocinámico, 3 , 4-difluoro-D-fenilalanina, ácido dietilditiocarbámico, ácido 4-fluoro (l-amino-2-feniletil) fosfónico, ácido 3 , 4-metilendioxibenzoico, y más preferible, ácido 3 , 4-metilendioxi-6-nitrocinámico, ácido 3,4-metilendioxicinámico, ácido 3- [3,4- metilendioxifenil] propiónico, ácido 3,4-metilendioxifenilacético, 4-fluoro-L-fenilalanina, ácido 4-hidroxifenilpirúvico, 4-fluoro-DL-tiroxina, ácido tras-3,4-dimetoxicinámico, ácido fenilpropiólico, ácido L-2-hidroxi-3-fenilpropiónico, ácido 2-hidroxi-4 , 6-dimetoxibenzoico, SKF-525A (éster 2- (dietilamino) etílico de ácido Ó-fenil-Ó-propilbencenacético) , vinilimidazol, oxalato de amonio, ácido sinápico y 1-aminobenzotriazol, y análogos relacionados. Cuando se incorporan en el medio, los inhibidores serán añadidos a una concentración entre 10 ppb y 1000 ppm, de preferencia, a una concentración entre 100 ppb y 100 ppm y más preferible, a una concentración de 1 ppm a 50 ppm. A fin de mejorar el rendimiento de taxol, bacatina III y otros taxanos relacionados en cultivos de células, los inventores han efectuado numerosas aproximaciones . Una de las aproximaciones que ha sido usada para incrementar la productividad es el uso de los llamados iniciadores. Tal como se usa en la presente, el término iniciadores indica compuestos de origen biológico o no biológico que provoquen un incremento en la producción de metabolito secundario cuando son aplicados a plantas o cultivos de células de planta (Eilert 1987, "Cell Culture and Somatic Genetics of Plants", tomo 4, F. Constabel e I.K. Vasil (editores), Academic Press, New York, EUA, pp. 153-196; Ebel, 1984 Bioregulators : Chemistry and Uses 257-271; y Darvill y coautores, 1984, Ann. Rev. Plant . Physiol . , 35, 243- 275) . Muchos compuestos diferentes pueden actuar como iniciadores, dependiendo de su naturaleza de origen y de su modo de acción con el metabolismo de la célula. En estos estudios, los inventores han empleado dos clases principales de iniciadores: (1) los iniciadores bióticos que usualmente comprenden extractos de pared de célula o filtrados de pared de célula de un grupo seleccionado de hongos, bacterias y levaduras, y también sus fracciones purificadas; (2) iniciadores abióticos que tienen incluidos agentes de esfuerzo químico así como algunos compuestos de origen biológico (véase los iniciadores mencionados en el cuadro 1) . Adicionalmente, las sales de complejos que contienen iones de metal pesado también pueden ser considerados como iniciadores abióticos efectivos,- estos incluyen ejemplos tales como cobalto, níquel, lantano, selenio, vanadio, plomo, cadmio, cromo, aluminio, yodo, bario, bismuto, litio, rubidio, estroncio y oro. Se debe notar que ciertos compuestos que median la iniciación, por ejemplo, los compuestos relacionados con jasmonato descritos más adelante, también se pueden considerar como iniciadores. Christen y coautores (1991) informan del uso de iniciadores fúngales y compuestos seleccionados para la producción de taxol mediante suspensiones de Taxus brevi folia; sin embargo, los incrementos en el nivel de la acumulación de taxol debidos a los tratamientos de iniciador, no han sido especificados .

En general, ambas clases de iniciadores fueron efectivas, si bien el grado en el que ocurrió la iniciación (acumulación de taxano en cultivos de células, así como su secreción en el medio) ocurrieron de manera diferente de un iniciador a otro y de una especie a otra. El máximo aumento en la producción fue logrado con glutamato de quitosano, liquenan, ácido ferúlico y ácido benzoico. El quitosán y el liquenan con polisacáridos complejos derivados de paredes de células microbianas. El quitosán, cuando es usado solo es insoluble en el medio y es tóxico y provoca daños permanentes a las células.

El glutamato de quitosán, por otra parte, es fácilmente soluble en el medio y no afecta la viabilidad de las células. Los ácidos ferúlico y benzoico son sustancias químicas sintetizadas, de origen biológico, y en general son usados como antioxidantes en sistemas biológicos. Los iniciadores y los agentes de esfuerzo metabólico pueden ser utilizados de acuerdo con esta invención para elevar al máximo la producción de taxol, la bacatina III y de taxano total, y la secreción en el cultivo de tejido mediante la determinación de especificidad del iniciador y la concentración, el tiempo y la duración, como una función de la edad del cultivo y de la composición del medio. Otra clase de agentes de incremento, contemplados por esta invención, son los estimulantes. Como se usa en la presente, el término estimulante es usado para describir compuestos añadidos al medio nutriente, que estimulan o activan las trayectorias biosintéticas específicas, por ejemplo, las que conducen a la biosíntesis. Los compuestos relacionados con jasmonato son una clase de compuestos que median la reacción de inicio, estimulando de esa manera la biosíntesis de metabolito secundario. Los compuestos relacionados con jasmonato incluyen el ácido jasmónico y sus esteres de alquilo, tales como jasmonato de metilo, jasmonato de etilo, jasmonato de propilo, jasmonato de butilo, jasmonato de pentilo, jasmonato de hexilo; ácido hidrojasmónico y sus esteres de alquilo, tales como dihidrojasmonato de metilo, dihidroj asmonato de etilo, dihidroj asmonato de hexilo; jasmonato de epimetilo, jasmonato de fluorometilo, cis-jasmona, isojasmona, tetrahidrojasmona, ácido 12-oxofitodienoico, dihidroj asmona, acetato de jasmonil, apritona, amilciclopentanona, hexilciclopentenona, hexilciclopentanona, y sus derivados y análogos relacionados. Los compuestos relacionados con el jasmonato son incorporados en el medio a concentraciones de 10 ~9 M a 10 ~3 M y, de preferencia a concentraciones de 10 — 6 a 5 x 10 4. M y, ma ^s preferible, a concentraciones de 10~5 M a 2 x 10 M. Se debe notar que se puede incorporar en el medio nutriente más de un compuesto relacionado con jasmonato. Se reconocerá por los expertos en la materia que la concentraciones de agentes de incremento, tales como los compuestos relacionados con jasmonato, los reguladores de crecimiento relacionados con auxina, los precursores y otros nutrientes, cambiarán conforme son metabolizados esos compuestos en el cultivo. A menos que se indique de otra manera, las concentraciones mencionadas aquí se refieren a la concentración inicial en el medio nutriente. Combinar agentes de incremento de al menos dos de las siguientes clases de agentes de incremento, ha demostrado que aumenta la producción de taxano por células de Taxus más allá del incremento observado para cualquiera de los agentes cuando son utilizados solos. Esas clases de agentes de incremento son los iniciadores, los compuestos relacionados con jasmonato, los inhibidores de la acción de etileno, los inhibidores de metabolismo de fenilpropanoides, los agentes anti-senescencia, los precursores, y los reguladores de crecimiento relacionados con auxina. Por consiguiente, en un modo preferido, esta invención provee métodos para aumentar la producción de uno o más taxanos cultivando célula de una especie Taxus en presencia de agentes de incremento seleccionados de al menos dos de esos grupos de agentes . Los métodos preferidos para la producción de taxano utilizan el inhibidor prototípico de acción de etileno, plata, en combinación con al menos otro agente de incremento y, en los métodos particularmente preferidos, el otro agente es jasmonato de metilo o un inhibidor del metabolismo de fenilpropanoide, como ácido 3, 4-metilendioxinitrocinámico.

Cuando se los usa en combinación entre sí, los compuestos relacionados con jasmonato y los inhibidores de la acción de etileno pueden ser incorporados en el medio nutriente en determinadas proporciones entre sí. Por ejemplo, cuando se usa jasmonato de metilo y tiosulfato de plata en combinación, las razones molares de jasmonato de metilo a ion plata pueden estar en la escala entre 0.0001 y 9.5, de preferencia en la escala entre 0.001 y 8, más preferible en la escala entre 0.1 y 7 y, muy preferible, en la escala entre 1 y 5. Cuando se los usa en combinaciones entre sí, los reguladores del crecimiento relacionados con auxina y los inhibidores de la acción de etileno pueden ser incorporados en el medio nutriente en determinadas proporciones entre sí. Por ejemplo, cuando se usa un regulador del crecimiento relacionado con auxina y tiosulfato de plata, en combinación, las razones molares del regulador del crecimiento relacionado con auxina-plata pueden estar en la escala entre 0.011 y 1000, de preferencia en la escala entre 0.015 y 100 y, más preferible, en la escala entre 0.02 y 50, y lo que más se prefiere entre 0.05 y 30. En general, cuando se cultiva células de Taxus para la producción de taxanos, se añadirá al medio de cultivo uno o más reguladores del crecimiento relacionados con auxina. La presencia de uno o más reguladores de crecimiento relacionados con auxina promoverá el crecimiento de las células pero, más significativamente, incrementará la producción de taxanos por el cultivo. Se puede obtener incrementos adicionales añadiendo al menos otro agente de incremento contemporáneamente con el factor de crecimiento relacionado con auxina. En un modo preferido de esta invención, se añade uno o más agentes de incremento al cultivo en una cantidad suficiente para incrementar la producción de uno o más taxanos por lo menos en 3 veces, de preferencia al menos 5 veces, más preferible, al menos 10 veces y, todavía más preferible, al menos 30 veces con respecto al nivel de producción en ausencia del incrementador o los incrementadores. En otro modo preferido de esta invención, se añade uno o más agentes de incremento al cultivo en una cantidad suficiente para aumentar la productividad volumétrica del taxol al menos a 10 mg/litro/día, más preferible al menos 15 mg/litro/día y, todavía más preferible, al menos 22 mg/litro/día. En otro modo preferido de esta invención, se añade uno o más agentes de incremento al cultivo en una cantidad suficiente para aumentar el título de caldo entero de taxol a al menos 150 mg/litro, más preferible al menos 200 mg/litro y, todavía mejor, al menos 350 mg/litro. En otro modo preferido de esta invención, se añade uno o más agentes de incremento al cultivo en una cantidad suficiente para aumentar la productividad volumétrica de bacatina III a al menos 15 mg/litro/día, más preferible al menos 20 mg/litro/día y, todavía más preferible, al menos 25 mg/litro/día. En otro modo preferido de esta invención, se añade uno o más agentes de incremento al cultivo en una cantidad suficiente para l<jto incrementar el título en el caldo entero de bacatina III a al menos 100 mg/litro, más preferible al menos 150 mg/litro y, - 5 todavía más preferible, al menos 250 mg/litro. En otro modo preferido de esta invención, se añade uno o más agentes de incremento al cultivo en una cantidad suficiente para aumentar la productividad volumétrica de los taxanos a al menos 15 mg/litro/día, más preferible, al menos 25 mg/litro/día y, todavía más preferible, al menos 40 mg/litro/día. En otro modo ^.w preferido de esta invención, se añade uno o más agentes de incremento al cultivo en una cantidad suficiente para aumentar el título en el caldo entero de taxanos a al menos 200 mg/litro, más preferible, al menos a 300 mg/litro y, todavía más preferible, al menos a 400 mg/litro. Muchos de los compuestos descritos como agentes de incremento anteriormente han sido usados en otros sistemas de ét plantas. La formulación, administración y niveles de concentración fisiológica apropiados en esos sistemas que no 20 son de Taxus, proveerán una guía para los expertos en la materia a fin de aplicar esos agentes de acuerdo con esta invención.

EL MATERIAL CELULAR Las células adecuadas para cultivo en el método de esta invención pueden ser de diversas especies de Taxus . De preferencia las células serán de una serie de células que pruduzcan inherentemente taxanos en un rendimiento relativamente alto. Típicamente, dichas células tienen la capacidad de producir niveles de uno o más taxanos bajo condiciones normales o exhibir productividades elevadas volumétricas, en promedio, de taxanos bajo condiciones normales. Las líneas de células adecuadas pueden ser identificadas cultivando células de la línea de células bajo condiciones normales para la producción de taxano y observando el nivel de uno o más taxanos producidos en el cultivo, o determinando la productividad volumétrica promedio de uno o más taxanos mediante uno de los siguientes procedimientos en el cultivo. Las células para uso en el procedimiento de prueba en el cultivo de producción son desarrolladas en un medio adecuado adaptado para la línea de células particular. Después que se completa la trayectoria de la fase logarítmica, se cultiva una alícuota de las células para la producción de la muestra de taxanos. Generalmente se lleva a cabo el cultivo de producción en un medio líquido, si bien se puede utilizar el cultivo de callo sobre un medio sólido. En el cultivo de producción se cultiva las células en el medio N del cuadro 2, en el medio N del cuadro 2 excepto por el reemplazo de sacarosa por 7% (en peso/volumen) de maltosa, o en medio nutriente optimizado para el desarrollo y mantenimiento de la línea de células en 5 particular. En el cultivo de producción, la densidad de células debe estar en la escala de 15 a 20 por ciento (en peso/volumen) sobre la base de peso fresco. Se cultiva las células durante 10 a 20 días a 25°C ± 2°C, bajo condiciones de oscuridad. Se debe agitar y airear los cultivos líquidos, por ejemplo, en un sacudidor rotatorio a 120-180 rpm. Los cultivos de producción para evaluar las características de la línea de células incluirán agentes de incremento adecuados. En general, se prueba para cada línea de células seis combinaciones de incremento alternativas (combinaciones de hasta 5 agentes de incremento) . Las combinaciones están mostradas en el cuadro A que viene más adelante . flfc. Al final del cultivo, se puede medir el título de los taxanos individuales presentes en el cultivo mediante análisis ELISA efectuado como se describe aquí, o se puede determinar el perfil de los taxanos producidos- en el cultivo mediante análisis de HPLC, como se describe en el ejemplo 5. Las líneas de células preferidas producirán uno o más taxanos por encima de los niveles de taxano buscados, mínimos, en una o más de las combinaciones de incremento. Las líneas de células preferidas sobrepasarán los niveles buscados tanto por lo que respecta al título como por lo que respecta a la productividad, para al menos una combinación de incremento y, más preferible, dos o más combinaciones de incremento. El título de taxano buscado, mínimo, al final del cultivo de producción para las líneas de células adecuadas, será por lo menos 100 mg/litro de taxanos. Alternativamente, el blanco buscado de productividad volumétrica promedio, mínimo, durante el curso del cultivo de producción, será de 10 mg/litro/día de taxanos. Las líneas de células más preferidas obtendrán títulos de taxano mínimos al final del cultivo de producción de al menos 100 mg/litro de taxol o 200 mg/litro de bacatina III, o una productividad volumétrica promedio, durante el curdo del cultivo de producción, de 10 mg/litro/día de taxol o 15 mg/litro/día de bacatina III.

CUADRO A COMBINACIONES DE INCREMENTO COMBINACIONES DE AGENTES DE INCREMENTO 1, 20 µM NAA + 30 µM MDNA 2, 20 µM NAA + 30 µM MDNA + 50 µM SLTS 3. 20 µM NAA + 30 µM MDNA + 89 µM MJS 4. 20 µM NAA + 30 µM MDNA + 89 µM MJS + 50 µM SLTS 5, 20 µM NAA + 30 µM MDNA + 89 µM MJS + 50 µM SLTS + 5 mM Gln 6. 20 µM NAA + 89 µM MJS + 50 µM SLTS Gln = glutamina NAA = ácido 1-naftalenacético MDNA = ácido 3 , 4-metilendioxi-6-nitrocinámico MJS = jasmonato de metilo SLTS = tiosulfato de plata Los medios de producción adecuados para las diversas especies están mencionados en el cuadro 5, aunque pueden ser usados otros. Por ejemplo, los medios B, C y N del cuadro 2 son medios de producción particularmente adecuados para Taxus chinensis . Los medios contienen preferiblemente los ingredientes mencionados en el cuadro 2. Esos medios contienen preferiblemente sales inorgánicas mayores y menores, ingredientes orgánicos y hormonas de crecimiento o reguladores del crecimiento, en cantidades generalmente dentro de las escalas preferidas que se inician con la décima parte hasta tres veces la concentración de cada ingrediente de medio indicado en el cuadro 2. Cuando se usa B o N como medio, los reguladores de crecimiento típicamente son incorporados en el medio en una cantidad entre 0.1 ppm y 20 ppm, y de preferencia entre 1 ppm y 10 ppm. Cuando se usa el medio C o N, se incorpora los reguladores de crecimiento de preferencia a los niveles que van desde 0.1 ppm hasta 5 ppm. Quienes tengan experiencia ordinaria en la técnica entenderán que, dentro de lo contemplado por esta invención, pueden hacerse modificaciones en los medios aquí descritos, por ejemplo, sustituyendo con otras composiciones convencionales (tales como elementos orgánicos, vitaminas, aminoácidos, precursores, activadores e inhibidores) , la adición u omisión de diversos componentes, incluyendo los reguladores de crecimiento o la alteración de proporciones, a fin de producir un crecimiento y una producción de taxano iguales a o mejores que los observados con los medios del cuadro 2.

MODOS DE OPERACIÓN DEL PROCEDIMIENTO El modo de operar un procedimiento para el cultivo de células de plantas se refiere a la manera en que los nutrientes, las células y los productos son añadidos o eliminados con respecto al tiempo (Payne y coautores, 1991) . Cuando son suministrados inicialmente todos los nutrientes, y los contenidos de cultivo que comprenden las células y el producto son cosechados al final del periodo de cultivo, se denomina el modo de operación "procedimiento intermitente de una sola etapa" . Cuando un procedimiento intermitente es dividido en dos fases secuenciales, una fase de crecimiento y una fase de producción, cambiándose el medio entre las dos fases, de denomina el modo de operación "procedimiento intermitente de dos etapas". Dentro de lo que está contemplado en esta invención, la transición del medio de crecimiento al medio de producción puede ocurrir mediante un cambio por pasos abruptos, o progresivamente mediante una serie de pasos continuos, o mediante un cambio progresivo. En un extremo, el cambio progresivo se logra mediante el reemplazo progresivo del medio o cambiando incrementalmente la composición. En otra alternativa, el cambio progresivo se logra alimentando uno o más componentes al medio de producción al cultivo de la fase de crecimiento. Este es un ejemplo del proceso de alimentación intermitente . En una operación "de alimentación intermitente", los componentes particulares del medio, tales como los nutrientes y/o uno o más agentes de incremento son suministrados ya sea continua o periódicamente durante el curso de un cultivo. Se debe notar que ciertos componentes deben ser incorporados en el medio nutriente inicialmente en el modo intermitente, luego añadidos en el modo de alimentación intermitente, o se los puede añadir al medio nutriente exclusivamente en el modo de alimentación intermitente. Utilizando la operación con alimentación intermitente, se ha encontrado que se pueden mantener las células en un estado de producción durante un periodo prolongado y, de hecho, que la productividad de las células podría incrementarse. Tal como se ilustra en los ejemplos 15 y 17, y en los cuadros 16 y 18, la adición de ciertos nutrientes y agentes de incremento de la manera de una alimentación intermitente, dio mejoras importantes en el funcionamiento general para los taxanos, en general, y para taxanos específicos, tales como taxol y bacatina III. Adicionalmente, se ha encontrado que este modo de operación es compatible con una variedad de líneas de células diferentes, bajo una variedad de diferentes condiciones de medios. La adición por alimentación intermitente de los componentes es particularmente ventajosa cuando se debe mantener la concentración de un componente particular a un nivel bajo en el cultivo, por ejemplo, para contrarrestar los efectos de la inhibición del substrato. Similarmente, la adición por alimentación intermitente es ventajosa cuando las células reaccionan negativamente a un componente, cuando es añadido inicialmente al medio nutriente o bien si no se puede añadir cantidades estequiométricamente significativas de un componente debido a limitaciones de solubilidad o de toxicidad. Además, la adición continua o continuada (periódica) de alimentación intermitente de una solución de alimentación que contiene un componente, se prefiere en particular cuando las células reaccionan negativamente al componente cuando es añadido de una manera más rápida, como una adición pulsante. Los componentes particulares a los que responden favorablemente las células cuando son añadidos en un modo de alimentación intermitente incluyen precursores de taxano tales como alfa y beta-fenilalanina, fuentes de carbono tales como maltosa, fructosa y glucosa,- aminoácidos tales como glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico; macronutrientes, tales como fosfato, calcio y magnesio; y agentes de incremento tales como reguladores del crecimiento relacionados con auxina y compuestos relacionados con jasmonato. Será evidente para los expertos en la materia que la composición de la alimentación puede variarse para obtener los resultados deseados, tales como la extensión de la fase de producción para incrementar el rendimiento de taxano o la extensión de la fase de crecimiento para obtener una densidad mayor de biomasa. La selección de las condiciones adecuadas para obtener la productividad óptima y el funcionamiento óptimo está fácilmente dentro de la experiencia ordinaria de los expertos en la materia, en vista de las enseñanzas aquí descritas. Las variaciones similares de los demás parámetros de operación tales como el control del tiempo y la duración de la adición, así como el régimen de adición de los componentes de alimentación intermitente, para obtener los resultados deseados, están dentro de los alcances de la experiencia de los técnicos en la materia, en vista de las enseñanzas aquí descritas. El cambio de medio, como se describe aquí, se refiere a la eliminación del medio agotado del cultivo, seguido por la adición de medio fresco al cultivo; las células son retenidas en gran parte en el cultivo durante la operación. En el método de esta invención, la operación de cambio de medio es un método ventajoso para obtener y mantener productividades volumétricas elevadas de producción de taxano, lo que da por resultado un funcionamiento superior del procedimiento y niveles generales de producción superiores, en comparación con los procedimientos intermitentes . El producto extracelular que es el resultado de dicha operación puede conducir por sí mismo a la recuperación más fácil corriente abajo y a la purificación más fácil, que mediante otros modos de procedimiento. Como se ilustra en el ejemplo 14 y en el cuadro 15, el cambio de medio es satisfactorio para mantener elevadas productividades de taxanos en general y para taxanos específicos, tales como taxol, bacatina III y 10-desacetilbacatina III. Además, este modo de operación dio por resultado un aumento en la productividad volumétrica con respecto a la operación intermitente para los taxanos en general y para los taxanos específicos tales como taxol y bacatina III. Adicionalmente, este modo de operación es compatible con una variedad de diferentes líneas de células bajo una variedad de diferentes condiciones de medios. Como se ilustra adicionalmente en el ejemplo 7.3, la eliminación de medio agotado y la reposición con medio fresco cada 3 días, contribuyó a un incremento importante en la producción de taxano y de taxol, a las condiciones de crecimiento, así como un incremento en las cantidades de producto extracelular.

Los efectos estimuladores del cambio de medio pueden haberse debido a la eliminación del producto in situ, lo que prevendría efectivamente la inhibición de la realimentación y la degradación del producto. Dichos efectos positivos de eliminación de producto in situ sobre la producción de metabolito secundaria y la secreción en cultivos de suspensión, había sido documentada, entre otros, por Robins y Rhodes (1986, Appl . Microbiol . Biotechnol . , 24, 35-41) y por Asada y Shuler (1989, Appl . Microbiol . Biotechnol . 30, 475-481). La eliminación periódica del medio agotado incorpora las ventajas anteriores y, adicionalmente, puede servir para volver a deprimir la biosíntesis secundaria el eliminar otros componentes inhibidores, que no son de taxano (tales como los compuestos fenólicos) del medio. La reposición con medio fresco de las células que están sufriendo biosíntesis activa también puede incrementar la producción al proveer nutrientes esenciales que habían sido agotados. Por ejemplo, Miyasaka y coautores (1986, Phytochemistry, 25, 637-640) fueron capaces de estimular células en fase estacionaria de Salvia mil tiorhiza para producir los metabolitos de diterpeno, criptotanshinona y ferruginol, simplemente añadiendo sacarosa al medio. Presumiblemente había cesado la biosíntesis debido a la alimentación de carbono en la fase estacionaria. El protocolo de cambio de medio periódico usado en el presente trabajo podría ser benéfico como resultado de cualquiera de los factores anteriores. Se entiende que la cantidad de medio cambiado, la frecuencia del cambio y la composición del medio que se está reponiendo pueden variar. La capacidad para estimular la biosíntesis y la secreción mediante el cambio de medio tiene implicaciones importantes para el diseño y la operación de un proceso comercial eficiente en el modo continuo, semicontinuo o de alimentación intermitente. Cuando se cosecha una porción sustancial, pero no la totalidad de los contenidos de un cultivo intermitente, con adición de medio fresco para continuar el crecimiento de células y la producción, el proceso de parece a una operación de "extracción y reposición repetidas" y se denomina un ] "proceso semicontinuo" . Cuando se suministra continuamente medio fresco y el medio efluente es retirado continuamente, se denomina el procedimiento "continuo" . Si las células son retenidas dentro del reactor, el procedimiento se denomina un "modo de perfusión" . Si las células son eliminadas continuamente con el medio efluente, se denomina el procedimiento continuo un "quimiostato" . Se entiende que estos diversos modos de operación del procedimiento son compatibles con el sistema de producción del taxano aquí descritos .

LOS EJEMPLOS Están provistos los siguientes ejemplos para describir los materiales y los métodos que pueden ser usados para poner en práctica la invención. Los ejemplos están destinados a ser ilustrativos y no a limitar la invención de ninguna manera .

EJEMPLO 1 INICIACIÓN DE CALLO Se recogió muestras de material vegetal de Taxus de varias plantas silvestres y cultivadas. Se procesó las muestras cuando llegaron al laboratorio o se las almacenó a 4°C hasta que pudieron ser usadas . Se lavó primeramente el material en solución diluida de jabón, se enjuagó en agua y se esterilizó la superficie en una solución de CLOROX (1% de hipoclorito, pH 7) durante 10 minutos. Luego se enjuagó el material bajo condiciones estériles, tres veces con agua estéril. Se cortó entonces agujas en una solución al 1% de polivinilpirrolidona (PVP) con 100 mg/litro de ácido ascórbico. Se colocó las agujas con el extremo cortado en el medio E (véase el cuadro 2) . Se cultivó 30 a 40 explantes por placa de medio. Se incubó las placas que contenían los explantes a 25±1°C en la oscuridad. Se vigiló diariamente las placas para ver la aparición de microorganismos contaminantes, y cuando estuvieron presentes, se eliminó las agujas no contaminadas y se las colocó en una placa fresca de medio E. Se observó la formación de callo sustancial y se separó el callo del explante a los 20 días y se los colocó sobre diversos medios de proliferación de callo mencionados en el cuadro 3. Por ejemplo, se transfirió tallos de Taxus chinensis al medio D (véase el cuadro 2) . Este procedimiento de inicio fue muy eficiente dando por resultado bajo régimen de contaminación y elevada frecuencia de inducción de callo en más del 90% de los explantes iniciados. El mismo procedimiento fue usado satisfactoriamente para iniciar cultivos de Taxus brevif olia, Taxus canadensis, Taxus cuspidata, Taxus baccata, Taxus globosa, Taxus floridana, Taxus wallichiana, Taxus media y Taxus chinensis.

EJEMPLO 2 PROLIFERACIÓN DEL CALLO Una vez que se quitaron los callos del explante, fueron cultivados a 25±1°C en la oscuridad. Se transfirió las partes sanas del callo a medio fresco cada 7 a 10 días, y esta frecuencia de transferencia se encontró que era extremadamente importante para prevenir el tostado y para el mantenimiento prolongado del callo. Los medios preferidos de crecimiento y de mantenimiento para los callos de diversas especies están resumidos en el cuadro 3.

EJEMPLO 3 INICIO DE LA SUSPENSIÓN Se inoculó de manera aséptica 1 g de peso fresco de material de callo en un matraz de Erlenmeyer de 125 ml, que contenía 25 ml de medio líquido apropiado para cada especie (véase el cuadro 3) . Por ejemplo, el medio D fue usado para Taxus chinensis . Se cubrió el matraz con una tapa de espuma de silicón (Bélico, New Jersey, EUA) y se lo colocó en un sacudidor giratorio a 120 rpm a 24±1°C, en la oscuridad. Se formó cultivos en suspensión aproximadamente en 3 a 10 días. Inicialmente se cambió el medio mediante filtrado por succión de los contenidos del matraz a través de un embudo Buchner «que contenía un filtro de miracloth (Calbiochem) y se volvió a suspender toda la biomasa en medio fresco. Cuando se desarrolló las células, se transfirió generalmente 1 a 2 g (peso fresco) de células a un nuevo matraz de 125 ml que contenía 25 ml de medio fresco y posteriormente se subcultivó semanalmente .

EJEMPLO 4 DESARROLLO DE LAS CELULAS SUSPENDIDAS Los regímenes típicos de desarrollo y las densidades 5 de células obtenidas en cultivos en suspensión, de una especie representativa, están mencionados en el cuadro 4. Como un ejemplo detallado, el incremento en la biomasa (peso fresco y peso seco) con el tiempo para línea K-l de Taxus chinensis está mostrado en la figura 1. Se midió el régimen de desarrollo máximo tomando la pendiente en los puntos • de incremento más rápido de la biomasa en las curvas de desarrollo. Los cultivos de células de Taxus chinensis crecieron a un tiempo de duplicación máximo de 2.5 días. Este régimen de crecimiento es significativamente mayor que el informado previamente para los cultivos en suspensión de las especies Taxus . Por ejemplo, Christen y coautores (1991) informaron de un incremento de 5 a 10 veces en la biomasa después de 3 a 4 semanas de cultivo, lo que se traduce a un • tiempo de duplicación promedio para las suspensiones de Taxus brevifolia de 7 a 12 días. La capacidad de cultivar células a una densidad elevada es importante para elevar al máximo la productividad volumétrica de un proceso de cultivo de células. Si bien los cultivos de Taxus brevifolia alcanzaron una densidad de células de menos de 1 gramo de peso seco por litro (calculado a partir de datos presentados en Christen y coautores (1991)), las suspensiones de Taxus chinensis fueron capaces de alcanzar densidades de 8 hasta 20 gramos de peso seco por litro después de 18 días de desarrollo. La viabilidad de las células se determinó manchando células con una solución al 0.05% de diacetato de fluoresceína en acetona ( idholm, 1972, Stain Technol . , 47, 189-194), y contando el número de células que fluorescen en verde por excitación con luz azul, en un microscopio de fluorescencia invertida (Olympus IMT-2, Japón). La viabilidad de las células fue mayor que 90% durante toda la fase de crecimiento. La capacidad de cultivar células bajo condiciones de desarrollo rápido hasta densidades de células elevadas, al mismo tiempo que se mantiene una elevada viabilidad, es un pre-requisito importante de la operación económica de un proceso de cultivo de células de plantas para producir taxol, bacatina III y taxanos .

EJEMPLO 5 ANÁLISIS DE TAXOL, BACATINA III Y OTROS TAXANOS .1. Métodos ELISA Se usó el análisis ELISA (Hawaii Biotech No. Ta-01) para la detección de taxol en los extractos de cultivo de células (véase Grothaus y coautores, 1995) . Este método provee elevada sensibilidad (0.1 nanogramo/mililitro) , sin embargo, sabido a que se usa un anticuerpo policlonal, se observa j p reactividad cruzada con otros taxanos. La HPLC preparatoria (escala analítica) con recolección de fracción mostró reactividad cruzada con 10-desacetiltaxol, 7-xilosil-10- desacetiltaxol, cefalomanina, 10-desacetil-7-epitaxol, 7- epitaxol, así como otros taxanos no identificados. A pesar de dicha reactividad cruzada, se encontró que este método era extremadamente útil para la detección de la producción de taxano y permitió que se discriminara rápidamente un gran número de líneas de células. Los extractos de células que muestran producción importante de taxanos fueron analizados entonces detalladamente utilizando procedimientos de HPLC como los que se indican a continuación. 15 Un análisis monoclonal ELISA (Hawaii Biotech No. TA- 02) fue usado también para la detección de taxol en extractos de cultivos de células. Este método provee elevada ?F sensibilidad (0.1 ng/ml) y significativamente menos reactividad cruzada . 20 5.2. Extracción de taxol, bacatina III y otros taxanos Se llevó a cabo la extracción de taxanos a partir de sobrenadantes a partir de varios métodos que dependen de las concentraciones presentes. Cuando están presentes suficientes cantidades de taxanos (aproximadamente 1-5 mg/litro) , se preparó muestras muy rápidamente y de manera muy eficiente. Se secó completamente (al vacío) 2 ml de medio y se midió la cantidad de 0.5-2.0 ml de metanol que se añadió. Se agitó ultrasónicamente esta mezcla hasta la disolución o dispersión completa de la muestra. Se separó los sólidos por centrifugación antes del análisis por HPLC. Se han obtenido recuperaciones cuantitativas a niveles de 1 mg/litro con niveles de detección bastante por debajo de 0.1 mg/litro. Cuando la concentración de taxanos en los sobrenadantes de cultivo fue muy baja (menos de 1 mg/litro) , se extrajo tres veces el medio con un volumen igual de una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isopropílico (IPA) (9:1 en volumen) . Se redujo esta capa orgánica hasta sequedad y se volvió a constituir en un volumen medido de metanol (50-250 ml) . La extracción múltiple recuperó típicamente del 90 al 95% del taxol, cefalomanina y bacatina III a niveles de 0.6 mg/litro. Cuando las concentraciones de taxano en el sobrenadante sobrepasaron los 5 mg/litro aproximadamente, se empleó una preparación de muestra más rápida. Se mezcló una parte (en volumen) de sobrenadante con tres partes (en volumen) de metanol que contenía 0.1% de ácido acético. Luego se trató sónicamente esta mezcla durante 30 minutos, se filtró y se analizó mediante HPLC. Se preparó muestras de calco entero (sobrenadante de cultivo que contenía células) , utilizando un método similar al descrito en el párrafo precedente. Se mezcló una parte (en volumen) de caldo entero con tres partes (en volumen) de metanol que contenía 0.1% de ácido acético. Luego se trató sónicamente esta mezcla durante 30 minutos, luego se permitió que reposara durante otros 30 minutos, se filtró y finalmente se analizó mediante HPLC. Se extrajo los materiales de célula congelando células cosechadas recientemente (-5°C) , y luego secando al vacío y extrayendo en soxhlet con metanol durante 50 ciclos. Se redujo el volumen de metanol (aproximadamente 100 veces) mediante evaporación rotatoria y se analizó la muestra resultante mediante HPLC. Generalmente se recuperó de 70 a 80% de los taxanos con descomposición mensurable de 10 a 15%. Se encontró posteriormente que el secado exhaustivo de la muestra antes de la extracción en soxhlet daba por resultado menos de 5% de degradación del taxol. La extracción de los medios sólidos y el callo se logró de manera idéntica a la de las células cuando los niveles de taxano fueron bajos; sin embargo, siempre se llevó a cabo la división de cloruro de metileno/IPA frente a agua del extracto metanólico final. Cuando los niveles de taxano sobrepasaron alrededor de 5 mg/litro, se empleó el método de extracción de caldo entero para preparar muestras de callo en el medio solidificado. .3. Métodos de cromatografía en líquido de alto rendimiento Se llevó a cabo cromatografía en líquido de alto rendimiento, analítica (HPLC) en una columna de difenilo cargada con elevado contenido de carbono (Supelco, 5 mmoles, 4.6 mm x 25 cm) con un sistema mezclador de alta presión, con gradiente binario analítico LDC, que consistía de bombas CM3500/CM3200, un automuestreador de volumen variable CM4100 y un detector con formación de fotodiodos SM5000, que formaba interfase con una computadora personal . Se reguló la temperatura de la columna a 35°C con un horno de columna Eldex CH150. Se efectuó el análisis HPLC cuantitativo de los taxanos utilizando un esquema de elución con gradiente binario de la siguiente manera: Tiempo % de eluvente A % de ei1uyente B Flu o 0 75 25 1 ml/min 40 35 65 11 42 25 75 II 47 25 75 II 50 75 25 II Eluyente A = 0.015 mmoles de KH2PO4, llevado a pH 3.5 con ácido trifluoroacético . Eluyente B = acetonitrilo. Los métodos cromatográficos usados se parecen a varios métodos publicados ( itherup y coautores, 1989, J. Liq.

Chromatog. , 12, 2117-2132) excepto que se ha utilizado un regulador fosfato que contenía ácido trifluoroacético y se emplea un gradiente más prolongado. Estas diferencias mejoran significativamente la resolución del taxol y otros taxanos de la mezcla. Los tiempos de retención relativos observados para los taxanos están mostrados a continuación. El taxol eluye entre 31 y 33 minutos, dependiendo de la columna y del aparato usado . Compuesto Tiempo de retención relativo 10-desacetilbacatina III 0.38 Bacatina III 0.56 7-xilosil-10-desacetiltaxol 0.80 10-desacetiltaxol 0.87 cefalomanina 0.94 10-desacetil-7-epitaxol 0.98 Taxol 1.00 7-epitaxol 1.12 Los tiempos de retención del taxol, la cefalomanina y la bacatina III fueron determinados utilizando muestras auténticas obtenidas del National Cáncer Institute. Los tiempos de retención de otros taxanos mencionados arriba fueron comparados con normas analíticas provistas por Hauser Chemical (Boulder, Colorado, EUA) . La identificación de taxanos conocidos se basó en el tiempo de retención y en comparaciones espectrales ultravioletas. Los compuestos que exhibieron un espectro UV similar al del taxol y de la bacatina III, pero que no se correlacionaron con los tiempos de retención relativos de esos taxanos, fueron considerados taxanos. La cuantificación del taxol, la cefalomanina y la bacatina III fue basada en factores de respuesta determinados a partir de materiales auténticos. Se llevó a cabo la cuantificación de 10- desacetilbacatina III utilizando el factor de respuesta determinado para la bacatina III. Cuando fue apropiado, se basó la cuantificación de los taxanos restantes en factores de respuesta medidos para taxol y para bacatina III. El término • taxanos totales representa la suma de taxanos totales que exhibieron una UV característica similar a la del taxol y la bacatina III. Los taxanos totales identificados en los cultivos de Taxus incluyen, entre otros: 10-desacetilbacatina III, 9-dihidrobacatina III, 7-epi-10-desacetilbacatina III, bacatina III, 9-dihidro-13-acetilbacatina III, 7-xilosil-10- desacetilcefalomanina, 7-xilosil-10-desacetiltaxol, 7- epibacatina III, 10-desacetiltaxol , 7-xilosiltaxol , • cefalomanina, 7-epi-10-desacetiltaxol, taxol, 2-benzoil-2- 20 desacetil-1-hidroxibacatina I, taxol C, 7-epitaxol y 2-benzoil- 2 -desacetilbacatina I. Los taxanos que no exhibieron la absorbencia de UV característica, pero que sí exhibieron características de fragmentación de masa de taxano, por espectrometría de masa, también fueron observados en los cultivos de células de Taxus .

Los ejemplos de dichos taxanos producidos en cultivos de células de Taxus, son Taxuyunanina C y sus análogos y • derivados . Cada una de las normas (10 microlitros) fue inyectada típicamente (inicialmente después de 3 a 4 muestras) y se integró las áreas para cada uno de tres componentes a partir del cromatograma de 227 nm. Se obtuvo factores de respuesta para cada uno de los componentes mediante el análisis lineal menos cuadrado de los datos. Se inyectó 10 µl de cada muestra y se calculó la cantidad por inyección con base en la regresión de datos comunes y corrientes. Se convirtió esos resultados a cantidad por litro o a porcentaje en peso seco. La figura 4 ilustra un cromatograma típico de una muestra de sobrenadante. 5.4. Métodos rápidos de cromatografía de líquido de alto rendimiento Además del método anterior, se desarrolló varios métodos rápidos de análisis HPLC para permitir la mayor • producción de muestras. Dos de esos métodos están descritos 20 detalladamente a continuación. Método (1) . Se llevó a cabo cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC) rápida sobre una columna Phenomenex Curosil-G (5 µM, 4.6 mm x 25 cm con 4.6 mm x 3 cm de guarda) a la temperatura ambiente, utilizando los instrumentos descritos arriba. Se llevó a cabo el análisis cuantitativo por HPLC de los taxanos utilizando un esquema de elución con gradiente binario de la siguiente manera: Tiempo % de eluyente A % de eluyente B Flu o 0 60 40 1.5 ml/min 10 25 75 " 11 25 75 " Eluyente A = 0.01 mmol de KH2PO4, llevado a pH 3.5 con ácido trifluoroacético . Eluyente B = acetonitrilo. Los tiempos de retención relativos observados para los taxanos están mostrados a continuación. El taxol eluye aproximadamente a los 8 minutos, dependiendo de la columna y de los instrumentos usados . Compuesto Tiempo de retención relativo 10 -desacetilbacatina III 0.42 Bacatina III 0.61 Taxol 1.00 Se preparó normas que contenían taxol, bacatina III y -desacetilbacatina III a niveles de 50 mg/litro, 10 mg/litro y 1 mg/litro. Se inyectó una norma inicialmente y luego después de cada novena muestra; y se integró las áreas para cada uno de los tres componentes a partir del cromatograma de 227 nm. Se obtuvieron los factores de respuesta para cada uno de los componentes mediante análisis lineal menos cuadrado de los datos. Se inyectó 10 µl de cada muestra y se calculó la cantidad por litro a partir del área de pico con base en la dilución de la muestra y la regresión de datos de norma. Método (2) . Se llevó a cabo también cromatografía rápida en líquido de alto rendimiento (HPLC) en una columna Phenomenex IB-SIL fenil (3 micromoles, 4.6 mm x 15 cm con guarda de 4.6 mm x 3 cm) a la temperatura ambiente, utilizando el aparato descrito arriba. Se efectuó el análisis cuantitativo por HPLC de los taxanos utilizando un esquema de elución con gradiente binario de la siguiente manera: 0 Tiempo % de eluyente A % de eluvente B Flujo 0 65 35 1.0 ml/min 10 30 70 " 12 30 70 " Eluyente A = 0.015 mmol de KH2PO4, llevado a pH 3.5 con ácido 5 trifluoroacético. Eluyente B = acetonitrilo. Los tiempos de retención relativos observados para ¿ los taxanos están mostrados a continuación. El taxol eluye aproximadamente a 9.5 minutos, dependiendo de la columna y del 0 aparato usado. Compuesto Tiempo de retención relativo 10-desacetilbacatina III 0.41 Bacatina III 0.61 Taxol 1.00 Se llevó a cabo la cuantificación como se describió con anterioridad. Las modificaciones de los métodos anteriores, con respecto al régimen de flujo y a la extensión del gradiente y el tiempo también fueron efectuados para llevar a cabo cromatografía adecuada para el análisis de cultivo de células de plantas. .4. Confirmación MS/MS de taxol La identidad del taxol en el sobrenadante del cultivo de células se ha confirmado utilizando un método MS/MS (como se muestra en la figura 6) con pares de inyección de flujo con ionización química a presión atmosférica por rocío iónico. Los detalles de los procedimientos usados para adquirir los datos presentados en la figura 6 fueron como sigue: espectrómetro de masa: Sciex API 3, triple cuadruplo con una fuente de ionización a presión atmosférica. Se utilizó nitrógeno como gas de cortina y se usó argón como gas de colisión para los espectros DIC. Interfase: Inferíase de aspersión iónica que produce iones mediante ionización por evaporación de ion (?lectroaspersión) . Se utilizó aire cero como gas nebulizador. Bomba LC: ABl 14OB, bomba de doble jeringa que opera a 5 µl/minuto. Solventes: 50/50 de acetonitrilo/H2?, 2 mmoles de NH4OAC + 0.1% de ácido fórmico. Volumen de inyección: 5 µl, todos los espectros tomados bajo análisis por inyección de flujo. Este método proporcionó confirmación inequívoca de la presencia de taxol en las muestras de cultivo de células, y también proporcionó cuantificación con excelente coincidencia con los resultados de HPLC.

EJEMPLO 6 PRODUCCIÓN DE TAXOL MEDIANTE DIVERSAS ESPECIES Se resume el taxol producido mediante cultivos de células de diversas especies de Taxus en el cuadro 5. Se cultivó los callos durante 20 días en la oscuridad, en el medio solidificado indicado para cada especie. Las células y el medio fueron secados y extraídos con metanol juntos, y se los analizó ya sea por ELISA o por HPLC, según se indica.

EJEMPLO 7 7.1 PRODUCCIÓN EN EL MEDIO DE CRECIMIENTO La producción de taxol de taxanos comenzó durante los dos primeros días de transferencia en la línea K-l de células de Taxus chinensis, al medio A. El taxol máximo observado fue el día 15, a 8.81 µg/matraz, lo que corresponde a 0.44 mg/litro de taxol. De esto estuvo presente el 46.1% en el medio extracelular. El día 15, la concentración total de taxano fue de 72.87 µg/matraz o 3.6 mg/litro, de los cuales estuvo presente 58.6% en el medio extracelular. La viabilidad de las células siempre fue mayor de 90% cuando se midió mediante manchado de fluorescencia (ejemplo 4) , lo que sugiere que la presencia de taxol y taxanos extracelulares se debió a la secreción más bien que a la lisis de las células. Los niveles de producción de taxol, bacatina III y taxanos relacionados se ha caracterizado para numerosas líneas diferentes de células, bajo numerosas condiciones diferentes de desarrollo (elaborados en el cuadro 2 y en otros ejemplos) , en donde no se incrementó la biosíntesis del taxano. Estos datos colectivos indicaron que, cuando se cultiva cultivos bajo condiciones optimizadas para el desarrollo, pero no para la biosíntesis de taxano, los niveles de producción de taxol típicamente son menores que o iguales a 0.5 mg/litro, y siempre menores gue o iguales a 2 mg/litro; las productividades volumétricas de taxol típicamente varían de 0.03 mg/litro/día a 0.07 mg/litro/día, y siempre son menores que 0.3 mg/litro/día. De manera similar, los niveles de producción de bacatina III típicamente son menores o iguales a 0.5 mg/litro y siempre son menores que o iguales a 1 mg/litro; las productividades volumétricas de bacatina III típicamente son menores que o iguales a 0.03 mg/litro/día, y siempre son menores que 0.15 mg/litro/día. De manera similar, los títulos de taxano total típicamente son menores que 5 mg/litro y siempre son menores o iguales a 20 mg/litro; las productividades volumétricas de taxano típicamente son menores que 1 mg/litro/día y siempre son menores que 3 mg/litro/día. 7.3 EL CAMBIO DE MEDIO PARA INCREMENTO DE PRODUCTIVIDAD Se obtuvo mejoras importantes para la productividad de taxol y de taxano total succionando asépticamente el medio A de crecimiento el día 9 y reemplazándolo por medio fresco y repitiendo el procedimiento el día 12. Se dio por terminado el experimento el día 15 y se muestran los resultados en la figura 2. Los incrementos importantes en la productividad debidos al cambio de medio están resumidos en el cuadro 6. Las cantidades totales de taxol y de taxanos producidas fueron aproximadamente de 4.6 veces mayores con cambio de medio, en comparación con los controles sin tratamiento. De manera importante, se recuperó aproximadamente 4.9 veces más taxol y aproximadamente 5.9 veces más taxanos totales en el medio extracelular en comparación con los controles sin tratamiento con cambio de medio . Es importante la capacidad de incrementar notablemente las productividades de taxol y de taxano total y, además, de provocar la acumulación de producto extracelular, para la operación de un procedimiento continuo y eficiente con reuso de la biomasa y purificación corriente abajo simplificada. 7.3 EL EFECTO DE LA LUZ SOBRE LA PRODUCCIÓN DE TAXANO EN EL MEDIO DE CRECIMIENTO Se sabe que la luz juega un papel importante no solamente en la fotosíntesis sino en diversos aspectos del metabolismo secundario en los cultivos de células de plantas (Seibert y Kadkade 1980) . Si bien se llevó a cabo los experimentos descritos en los ejemplos 4, 7.1 y 7.2 en la oscuridad, se describe aquí la respuesta a la luz de los cultivos de Taxus chinensis . Se inoculó 1 gramo de peso fresco de células de 7 días de edad de la línea K-l de Taxus chinensis en 25 ml de medio A de crecimiento (cuadro 2) en matraces Erlenmeyer de 125 ml, y se los incubó a 24+1°C en un sacudidor giratorio a 120 rpm. Se colocó matraces duplicados en la oscuridad y bajo una lámpara GroLux Standard a una distancia de 91 cm. Se muestra en la figura 3 las características espectrales de la lámpara. Los resultados están mostrados en el cuadro 7. La exposición de cultivos a la luz no afectó los niveles totales de taxano ni el grado de acumulación extracelular. Sin embargo, se alteró significativamente los perfiles de taxano en los dos tratamientos. Por ejemplo, las células cultivadas a la luz produjeron 2.8 veces más taxol que las células en la oscuridad. La proporción de taxol extracelular también fue significativamente mayor que en el tratamiento en la oscuridad (76% contra 56%) . El uso del tratamiento con luz, especialmente de la calidad espectral específica, podría ser útil en el proceso de cultivar células para la producción de taxol .

EJEMPLO 8 LOS INICIADORES Se utiliza el término iniciador para compuestos de origen biológico (o biótico) y no biológicos (o abiótico) que provoquen un incremento en el metabolismo secundario, cuando son añadidos a cultivos de células de plantas. Si bien se ha encontrado que son útiles numerosos iniciadores, se describe un ejemplo ilustrativo representativo aquí detalladamente, o sea, el uso de glutamato de quitosán. Aunque el quitosán ha sido ensayado previamente como iniciador en algunos sistemas de cultivo de células de planta, las reacciones tóxicas acompañantes, tales como el tostado y la pérdida de viabilidad han hecho impráctico su uso (Beaumont y Knorr 1987, Biotechnol . Lett .9 , 377-382) . En realidad, dichas reacciones laterales tóxicas son un inconveniente común de muchos iniciadores informados en la literatura. El uso de quitosanos modificados químicamente, tales como glutamato de quitosán, para inducir específicamente la biosíntesis de taxol y de taxano, al mismo tiempo que se contrarrestan los efectos laterales tóxicos, es una aproximación novedosa.

Las suspensiones de línea K-l de Taxus chinensis desarrolladas en el medio D durante 7 a 8 días fueron filtradas por succión asépticamente utilizando un embudo Buchner estéril, equipado con un filtro miracloth (Calbiochem) . Se transfirió asépticamente 2 gramos de células peso fresco a 25 ml de medio C (véase el cuadro 2) en un matraz de Erlenmeyer de 125 ml . Se preparó una solución de glutamato de quitosán al 0.05%, fresca, y se esterilizó en filtro a través de un filtro de cartucho de 0.22 mieras. Se añadió 825 µl de esta solución al matraz al comenzar el experimento, lo que corresponde a un nivel de 165 mg de iniciador por gramo de células, en peso seco. Se incubó los matraces a 24+1 °C en un sacudidor giratorio a 110 rpm, en la oscuridad. Se muestreó de manera destructiva los matraces el día 15 y se registró las observaciones sobre desarrollo, color de las células y del medio y viabilidad de células. Se sometió a análisis las muestras para taxanos tal como se describió en el ejemplo 5. Los resultados de este experimento están mostrados en el cuadro 8. El tratamiento con iniciador dio como resultado una mejora modesta en la producción de taxano total por célula (0.53% contra 0.42% de peso seco de taxanos), sobre controles no tratados. La naturaleza no tóxica del iniciador es evidente a partir de las elevadas viabilidades (75-80%) observadas en ambos tratamientos. De hecho, un peso seco incrementado en el tratamiento de iniciador, en comparación con los controles, ha sido observado de manera reproducible (14.2 g/litro contra 10.1 g/litro de peso seco) . Las mayores densidades de célula dieron por resultado un título 1.8 veces mayor de taxanos totales en el tratamiento con iniciador, es decir, 75.8 mg/litro contra 42.4 mg/litro para el control. El tratamiento con iniciador dio por resultado una biosíntesis incrementada de taxol tanto en una base por células (0.098% contra 0.054% de peso seco de taxol, un incremento de 1.8 veces) como en una comparación de título (13.9 mg/litro contra 5.4 mg/litro, un incremento de 2.6 veces) . El grado de secreción fue mayor para el tratamiento con iniciador, en comparación con el control (85% contra 72% de producto extracelular) . El tratamiento con iniciador descrito aquí da por resultado una producción incrementada de taxol, un perfil de producto más favorable, secreción de producto incrementada y retención de elevada viabilidad de la célula. Estas características de producción representan una mejora importante para un proceso de cultivo de células, para la producción de taxol .

EJEMPLO 9 ^DESARROLLO DEL MEDIO DE PRODUCCIÓN En un esfuerzo por incrementar las productividades de taxol sobre los niveles descritos en el ejemplo 6, se manipuló los niveles de nutrientes para formular un "medio de producción" especial. Se filtró asépticamente por succión suspensiones de 7 a 8 días de edad de la línea K-l de Taxus chinensis, desarrollada en el medio D, utilizando un embudo de Buchner estéril con un filtro MIRACLOTH (tela de rayón-poliéster con aglutinador acrílico) (Calbiochem) . Se transfirió asépticamente 500 mg de peso fresco de células a 5 ml del medio de producción B y C (véase el cuadro 2) . Se incubó los recipientes durante periodos de tiempo diversos de 18, 25 y 42 días a 24+l°C, en un sacudidor giratorio a 110 rpm, en la oscuridad. Se muestreó de manera destructiva los tratamientos y se registró las observaciones sobre desarrollo, color de las células y el medio y viabilidad de las células. Se analizó las muestras para taxanos como se describió en el ejemplo 5. Los resultados de este experimento están mostrados en el cuadro 8. 9.1 RESULTADOS DEL CULTIVO DURANTE 18 DÍAS Los cultivos de células de Taxus chinensis respondieron a las composiciones de medio alterado produciendo niveles significativos de taxanos y de taxol. Esos datos están resumidos en el cuadro 9 y el cromatograma de muestra está mostrado en la figura 4. En el medio B se produjo 99.8 mg/litro de taxanos totales con 24.1 mg/litro de taxol. En el medio C se produjo 110 mg/litro de taxanos totales como 21.3 mg/litro de taxol. Sobre una base de peso seco, las células produjeron 0.18% en peso seco de taxol en el medio de B y 0.065% de peso seco de taxol en el medio C. 9.2. CULTIVO PROLONGADO Se estudió la producción de taxol y de taxano después de cultivo prolongado de células (línea K.l) de Taxus chinensis durante 25 y 42 días, en el medio C; y sus resultados están resumidos en el cuadro 5. Se pueden resumir las siguientes observaciones importantes: (i) Los cultivos en suspensión de Taxus son capaces de producir niveles importantes de taxol y de otros taxanos. La máxima acumulación ocurrió a los 42 días, con 0.32% en peso seco de taxol y 0.62% en peso seco de taxanos totales; lo que corresponde a títulos de 153 mg/litro de taxol y 295 mg/litro de taxanos totales con base en el volumen final del medio. El análisis de esta muestra mediante espectrometría de masa en tándem confirmó la presencia de taxol como se muestra en la figura 6. La cuantificación mediante MS/MS mostró una coincidencia excelente con HPLC. (ii) La velocidad de biosíntesis de taxol entre los días 25 y 42 fue aproximadamente 9.6 mg de taxol por litro por día, suponiendo una producción lineal en el periodo de 17 días. Esta velocidad es significativamente mayor que la de producción en los primeros 25 días. La velocidad de biosíntesis de taxanos totales entre los días 25 y 42 fue de 12.3 mg por litro por día. Las productividades volumétricas promedio de taxol, bacatina III y taxanos totales fueron 3.6, 0.5 y 7.0 mg/litro/día, respectivamente. (iii) Se puede inducir las formulaciones de medio de producción hasta incrementos de 45 veces en el contenido específico de taxol, en comparación con las condiciones de crecimiento rápido (en las que no se incrementa la biosíntesis de taxano) tal como las descritas en el ejemplo 7. 10 (iv) Se puede manipular el espectro de producto de Í manera que se lleve la biosíntesis hacia exclusivamente el taxol como producto final deseado, al mismo tiempo que se reduce al mínimo la producción de taxanos indeseables. Por ejemplo, el día 25, el taxol constituyó el 28% de los taxanos totales y el día 42 el taxol constituyó el 52% de los taxanos totales, en contraste con el medio de crecimiento (véase el ejemplo 7.1), cuando el taxol constituyó únicamente el 12.2% de los taxanos totales. Esta capacidad para manipular los • perfiles de producto tendrá repercusiones importantes para la purificación corriente abajo y para los aspectos reguladores relacionados con la pureza del producto. Por ejemplo, la capacidad para suprimir la producción del subproducto taxano, la cefalomanina podría simplificar grandemente la purificación corriente abajo en comparación con la purificación de taxol a partir del tejido de corteza. (v) Los cultivos de células de Taxus han sido inducidos al secretar cantidades importantes de taxol (87% el día 42) y otros taxanos. Que la presencia de taxol extracelular y de taxanos se debe a secreción en lugar de a lisis de células, se corrobora por varias observaciones independientes: (a) La biosíntesis continua ocurrió entre los días 25 y 42, lo que sugiere que las células eras viables y estaban activas. Las observaciones independientes han demostrado que más del 70% de viabilidad se había observado después de 18 días de medio de producción. (b) Se secretó diferentes porcentajes de diferentes taxanos. Si las células habían sufrido lisis, el porcentaje en el medio habría de esperarse que fuera similar para los diferentes taxanos. (vi) La capacidad de la línea de células de Taxus para iniciar y producir taxol a regímenes elevados en un ambiente extracelular tan rico en producto, es particularmente notable. (vii) La línea de células de Taxus con la que se obtuvo estos resultados también es capaz de desarrollo rápido a densidades elevadas de células, y expresó las productividades informadas después de 20 generaciones bajo condiciones de crecimiento rápido, lo que atestiguan su estabilidad y su potencial comercial . Los niveles de taxol y de taxanos producidos por líneas de células de Taxus chinensis, bajo las condiciones descritas aquí, son mayores que los resultados informados anteriormente en un factor de 35 a 150 veces. Por ejemplo, Christen y coautores (1991) informaron la producción de 1 a 3 mg/litro de taxol por cultivos de Taxus brevifolia, después de 2 a 4 semanas de cultivo. ickeramesinhe y Arteca (1991) informaron la producción de taxol a 0.009% en peso seco de cultivo de células de Taxus media . En resumen, los datos de la presente muestran que con inicio cuidadosa y selección de cultivos de Taxus chinensis y con condiciones de medio de desarrollo especialmente formuladas, se puede inducir a las células a que crezcan rápidamente hasta elevadas densidades de células. Cuando esas células son transferidas a condiciones de medios de producción, las células son capaces de biosintetizar y secretar niveles importantes de taxol y otros taxanos durante periodos prolongados, al mismo tiempo que mantienen elevadas viabilidades. La incorporación de cambio de medio periódico, luz e iniciadores, con el medio de producción, da por resultado incrementos sinergísticos adicionales en la productividad. Esas propiedades son pre-requisitos críticos para un proceso comercial eficiente para la producción de taxol y de taxano, utilizando la tecnología de cultivo de tejidos.

EJEMPLO 10 .1. INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXANO UTILIZANDO PLATA. Se encontró que la plata, tanto en la forma de 5 compuestos que contienen plata, como de complejos de plata o de iones plata, era un agente de incremento útil de la biosíntesis de taxol, bacatina III y taxano en cultivos de células de especies Taxus . La combinación de agentes de incremento de plata y otros, se ha encontrado que es útil para obtener y mantener regímenes elevados de producción de taxano. F Se filtró por succión asépticamente células de 7 días de edad de KS1A en suspensión, de Taxus chinensis, cultivadas en el medio L (cuadro 2) utilizando un embudo de Buchner equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem) . Se inoculó aproximadamente 0.75 a 1 gramo de peso fresco de células en 4 a ml de medio de cultivo de la composición dada indicado en el cuadro 10, para producir una densidad de células, en peso ato fresco, en la escala de 15% a 20% (en peso/volumen) . Se incubó los recipientes a 25±1°C a 120 RPM en un sacudidor giratorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se corrigió la evaporación mediante la adición de agua destilada estéril. Se tomó a intervalos periódicos muestras de caldo entero (es decir, taxanos tanto extracelulares como intracelulares) y se procesó y analizó mediante HPLC de acuerdo con los métodos señalados en el ejemplo 5.

Se resume en el cuadro 10 los datos que indican que la producción de taxol, bacatina III y otros taxanos, se puede incrementar satisfactoriamente mediante una variedad de compuestos que contienen plata. Este incremento se debe primariamente a la presencia de plata en el medio, como se demuestra en el cuadro 10, que muestra el incremento para una variedad de diferentes compuestos que contienen plata y diferentes iones contrarios. Estos niveles de producción son significativamente más altos que los observados en cultivos no incrementados (los niveles de producción para ellos están dados en el ejemplo 7) . .2. EL INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXANO UTILIZANDO TIOSULFATO DE PLATA Con base en las consideraciones de toxicidad y facilidad de preparación y almacenamiento, se utilizó tiosulfato de plata en los experimentos subsecuentes. El método usado para la preparación de tiosulfato de plata es como sigue: se disolvió 1.98 gramos de tiosulfato de sodio (pentahidrato) en 80 ml de agua. Se añadió 20 ml de una solución 0.1 M de nitrato de plata mientras se sacudía vigorosamente, lo que dio por resultado 100 ml de una solución 20 mM maestra de tiosulfato de plata. Se pudo usar tiosulfato de potasio en lugar de tiosulfato de sodio con resultados igualmente eficaces. Las soluciones de almacén fueron esterilizada en filtro utilizando filtros de cartucho de 0.22 µM en el medio de cultivo de células al inicio de un experimento dado. También son adecuados métodos alternativos para preparar soluciones de tiosulfato de plata similares. Los protocolos de cultivos de células fueron similares para los descritos en los experimentos señalados en el cuadro 10. El cuadro 11 resume datos obtenidos utilizando plata como agente de incremento para un número de diferentes cultivos de células de Taxus chinensis . Estos datos muestran que la plata efectúa un incremento fundamental en la biosíntesis del taxano en general. El perfil del producto específico observado en cualquier caso dado refleja características de la línea de células y del medio de cultivo. El complejo de ion plata puede ser particularmente efectivo en el incremento de la producción de taxano cuando se usa conjuntamente con otros factores en el medio que favorezcan la biosíntesis, tales como los reguladores del crecimiento, la fuente de carbono, las sales, los micronutrientes y similares.

EJEMPLO 11 INCREMENTO DE PRODUCCIÓN DE TAXANO UTILIZANDO JASMONATO DE METILO Y COMPUESTOS RELACIONADOS CON EL JASMONATO Se encontró que el éster metílico de ácido jasmónico (jasmonato de metilo) así como el ácido jasmónico y los compuestos relacionados eran útiles como agentes de incremento para la biosíntesis de taxano en cultivos de células de la especie Taxus . La combinación de jasmonato de metilo y otros agentes de incremento también se encontró que era útil para obtener y mantener regímenes elevados de producción de taxano. Se filtró por succión asépticamente células de 7 días de edad de suspensiones de Taxus chinensis cultivadas en medio M (cuadro 2) utilizando un embudo Buchner estéril, equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem) . Se inoculó las células en el medio de cultivo de la composición dada indicado en el cuadro 12, a una densidad de peso fresco de células en la escala de 15% a 20% (en peso/volumen) . Se incubó los cultivos a 24+l°C a 120 o 180 RPM (dependiendo del tamaño del recipiente) en un sacudidor giratorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se corrigió la evaporación añadiendo agua destilada estéril. Se tomó muestras de caldo entero (es decir, taxanos tanto extracelulares como intracelulares) a intervalos periódicos y se los procesó y analizó mediante HPLC de acuerdo con los métodos señalados en el ejemplo 5. El cuadro 12 resume los datos obtenidos mediante el uso de ácido jasmónico y su éster metílico como agentes de incremento para diversas líneas de células de Taxus chinensis, representativas. Esos datos muestran que el ácido jasmónico y su éster metílico efectúan un incremento fundamental en la biosíntesis de taxanos en general. El perfil de producto específico observado, en todo caso, refleja las características de la línea de células y del medio de cultivo. Esos niveles de producción obtenidos en la presencia de estos agentes de incremento son significativamente mayores que los observados en cultivos no incrementados (los niveles de producción para los cuales están dados en el ejemplo 7) . El ácido jasmónico, su éster metílico y los compuestos relacionados son agentes de incremento efectivos en la biosíntesis de taxano, cuando se los usa junto con otros factores en el medio que favorece la biosíntesis, tal como otros agentes de incremento, reguladores de crecimiento, fuente de carbono, sales, micronutrientes y similares.

EJEMPLO 12 INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE TAXANO UTILIZANDO ACIDO 3,4- METILENDIOXI-6 -NITROCINAMICO Se encontró que el análogo de ácido cinámico, ácido 3 , 4-metilendioxi-6-nitrocinámico (MDNA) y los compuestos relacionados eran agentes de incremento útiles en la biosíntesis de taxano, en cultivos de células de las especies Taxus . La combinación de MDNA y otros agentes de incremento se encontró también que era útil para obtener y mantener regímenes elevados de producción de taxano. Se filtró por succión asépticamente células de 7 días de edad del cultivo SS122-42 en suspensión de Taxus chinensis cultivado en medio M (cuadro 2), utilizando un embudo Buchner estéril, equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem) . Se inoculó las células en el medio de cultivo bajo condiciones a una densidad de peso fresco de 15% a 20% (en peso/volumen) . Se incubó los recipientes a 24±1°C, a 180 RPM en un sacudidor giratorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se tomó muestras y se analizó los cultivos tratados utilizando los métodos descritos en el ejemplo 5 en diversos puntos de tiempo. Se corrigió la evaporación añadiendo agua destilada estéril a intervalos periódicos. Se tomó muestras de caldo entero (es decir, taxanos extracelulares e intracelulares) a intervalos periódicos y se los procesó y analizó mediante HPLC de acuerdo con los métodos indicados en el ejemplo 5. El cuadro 13 resume los datos obtenidos utilizando ácido 3 , 4-metilendioxinitrocinámico como agente de incremento para la biosíntesis de taxano en cultivos de células de Taxus chinensis . Esos datos muestran que MDNA efectúa un incremento fundamental en la biosíntesis de taxanos en general. El cultivo en el medio II, es decir, en presencia de MDNA y plata, aumenta adicionalmente la producción de los taxanos. El perfil específico de producto observado en cualquier caso dado refleja las características de la línea de células y del medio de cultivo. Esos niveles de producción son significativamente mayores que los observados en los cultivos no incrementados (los niveles de producción para ellos están dados en el ejemplo 7) .

EJEMPLO 13 INCREMENTO DE LA BIOSINTESIS DE TAXANO UTILIZANDO UNA COMBINACIÓN DE AGENTES DE INCREMENTO Diversos agentes de incremento, usado en combinación, dieron mejoras significativas y sinergísticas en la producción de taxano. Se filtró asépticamente por succión células de 7 días de edad de cultivos en suspensión de Taxus chinensis, cultivados en el medio P (SS64-412) , el medio O (SS64-561, SS64-571) , el medio I (SS124-77, SS85-26) , el medio M (SS122-29) (la composición de estos medios está mencionada en el cuadro 2); utilizando un embudo de Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem) . Se inoculó las células en el medio de cultivo (indicado en el cuadro 14) a una densidad de peso fresco de 20% (en peso/volumen) . Se incubó los cultivos a 24+l°C a 180 RPM en un sacudidor rotatorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se corrigió la evaporación añadiendo agua destilada estéril a intervalos periódicos. Se recogió muestras de caldo entero (es decir, taxanos extracelulares e intracelulares) a intervalos periódicos, y se los procesó y analizó mediante HPLC de acuerdo con los métodos señalados en el ejemplo 5. El cuadro 14 resume los datos obtenidos mediante diversas combinaciones de agentes de incremento para la biosíntesis de taxol, bacatina III y taxano en cultivos de células de Taxus chinensis . Los datos demuestran incrementos adicionales sustanciales en la producción de taxano mediante la combinación de agentes de incremento, con respecto a lo que se observa con agentes individuales y sobre los niveles de producción en condiciones no incrementadas (los niveles de producción para estos están dados en el ejemplo 7) .

EJEMPLO 14 INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXANO MEDIANTE CAMBIO DE MEDIO Este ejemplo demuestra la elevada productividad de cultivo que se puede mantener reponiendo los componentes del medio y eliminando el medio agotado. flk Se cultivó inicialmente líneas de células en medio O (Paella) , medio I (SS29-3A5) y medio I (SS45-146) . Las composiciones detalladas de estos medios de cultivo están descritas en el cuadro 2. Se filtró asépticamente por succión células de 7 días de edad de esas línea de células utilizando un embudo de Buchner estéril equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem) . Se inoculó aproximadamente 1.5 gramos de peso fresco de células en 4.25 ml de medio de cultivo respectivo, como se indica en el cuadro 15. Se incubó los recipientes a 24+l°C a 120 RPM en un sacudidor giratorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se corrigió la evaporación añadiendo agua destilada estéril a intervalos periódicos. Para los tratamientos con cambio de medio, se eliminó por succión el medio de producción agotado utilizando una pipeta estéril después de 10 a 11 días de cultivo intermitente, dejando las células en el recipiente. Se analizó el sobrenadante agotado para los taxanos extracelulares, utilizando los métodos descritos en el ejemplo 5. Se añadió medio de cultivo fresco de la misma composición que el primer cultivo intermitente al recipiente que contenía las células productoras. Se cultivó las células mediante las mismas condiciones ambientales descritas arriba. Se repitió el ciclo de cambio de medio después de otros 10 a 11 días de cultivo. Se compara los taxanos extracelulares totales para la producción intermitente con la de la producción de cambio de medio en el cuadro 15. Los valores de concentración del cambio de medio denotan la cantidad total de taxano producida en el medio extracelular, dividida entre el volumen del cultivo de suspensión de células (es decir, 5.75 ml) . El cuadro 15 indica que las células pueden ser mantenidas en estado productivo durante un periodo prolongado y, de hecho, que la productividad de las células se puede incrementar mediante el cambio de medio repetido. El incremento mediante el cambio de medio repetido es factible utilizando una gama de diferentes condiciones de incremento y con una variedad de cultivos de células. Los datos demuestran incremento adicional sustancial de la producción de taxano con respecto a niveles de producción en las condiciones no incrementadas (los niveles de producción para estas están dados en el ejemplo 7) .

EJEMPLO 15 INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE TAXANO MEDIANTE LA OPERACIÓN DE ALIMENTACIÓN INTERMITENTE Se filtró asépticamente por succión células de 7 días de edad de líneas de células cultivadas en el medio I (CR-128, SS36-245) , en el medio L (SS36-359) (las composiciones de estos medio está descritas en el cuadro 2) , utilizando un embudo de Buchner estéril, equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem) . Se inoculó aproximadamente 1 gramo de peso fresco de células en 4 ml de medio de cultivo con la composición dada indicada en el cuadro 16.a. Se incubó los recipientes a 24+l°C a 120 RPM, en un sacudidor giratorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se corrigió la evaporación mediante la adición de agua destilada estéril a intervalos periódicos. Para la operación de alimentación intermitente, se alimentó continuamente soluciones de alimentación estériles de composiciones predeterminadas en los recipientes de cultivo a regímenes predeterminados de alimentación, por ejemplo, 10 ml de solución de alimentación por litro de cultivo por día. Los detalles de la operación de 5 alimentación intermitente están descritos en el cuadro 16. b, incluyendo las composiciones de las soluciones de alimentación y los protocolos de alimentación. Se muestreó los cultivos tratados y se los analizó utilizando los métodos descritos en el ejemplo 5. 10 El cuadro 16.a indica que las células pueden ser mantenidas en un estado productivo durante un periodo prolongado y, de hecho, que la productividad de las células se puede incrementar mediante la operación de alimentación intermitente, lo que da por resultado la acumulación de niveles altos de bacatina III, taxol y otros taxanos. Las cantidades relativas de los taxanos particulares reflejan la interacción del protocolo de alimentación y de la composición de tt, alimentación, con la línea de células y las condiciones de cultivo. Este cuadro indica también los resultados de alimentar fenilalanina en la producción incrementada de taxol con respecto a otros taxanos . Los datos demuestran incremento adicional sustancial de la producción de taxano con respecto a los niveles de producción en condiciones no incrementadas (los niveles de producción para los cuales están dados en el ejemplo 7) .

EJEMPLO 16 INCREMENTO EN LA BIOSINTESIS DE TAXANO UTILIZANDO UNA COMBINACIÓN DE AGENTES DE INCREMENTO Diversos agentes de incremento, usados en combinación, dan mejoras importantes y sinergísticas en la producción de taxol, bacatina III y taxano. Se filtró asépticamente por succión células de 7 días de edad de cultivos en suspensión de Taxus chinensis (SS122-41, cr427, SS122-30, cr857, cr452) cultivadas en medio M (la composición del medio está mencionada en el cuadro 2), utilizando un embudo de Buchner estéril, equipado con un filtro MIRACLOTH (Calbiochem) . Se inoculó las células en el medio de cultivo (indicado en el cuadro 17) a una densidad de peso fresco de 20% (en peso/volumen) a menos que se describa de otra manera en el cuadro 17. Se incubó los cultivos a 24±1°C a 180 RPM, en un sacudidor giratorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se corrigió la evaporación mediante la adición de agua destilada estéril según fue necesario. Se tomó muestras de caldo entero (es decir, taxanos extracelulares e intracelulares) a intervalos periódicos y se los procesó y analizó mediante HPLC, de acuerdo con los métodos señalados en el ejemplo 5. El cuadro 17 resume los datos obtenidos usando diversas combinaciones de agentes de incremento para la biosíntesis de taxol y de taxano en cultivos de células de Taxus chinensis . Los datos demuestran incremento adicional sustancial en la producción de taxano mediante las combinaciones de agentes de incremento sobre lo que se ve para agentes individuales y condiciones no incrementadas (cuyos detalles están provistos en el ejemplo 7) .

EJEMPLO 17 INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXANO MEDIANTE LA OPERACIÓN DE 10 ALIMENTACIÓN INTERMITENTE Se filtró asépticamente por succión células de 7 días de edad de líneas de células cultivadas en medio M (SS122-41) (las composiciones de esos medios están descritas en el cuadro 2), utilizando un embudo estéril de Buchner, equipado con un filtro Miracloth (Calbiochem) . Se inoculó aproximadamente 1 gramo de peso fresco de células en 4 ml de medio de cultivo de tt la composición dada indicada en el cuadro 18.a. Se incubó los recipientes a 24+2 °C, a 120 RPM, en un sacudidor giratorio (carrera de 2.54 cm) en la oscuridad. Se corrigió la evaporación mediante la adición de agua destilada estéril. Para la operación de alimentación intermitente, se alimentó continuamente soluciones de alimentación estériles de composiciones predeterminadas, en los recipientes de cultivo.

Los detalles de la operación de alimentación intermitente, incluyendo las composiciones de las soluciones de alimentación y los protocolos de alimentación, están descritos en el cuadro 18.b. Se muestreó los cultivos tratados y se los analizó utilizando los métodos descritos en el ejemplo 5. El cuadro 18.a. indica que se puede mantener las células en un estado productivo durante un periodo prolongado y, de hecho, se puede incrementar la productividad volumétrica de las células mediante la operación de alimentación intermitente, lo que da por resultado la acumulación de niveles elevados de bacatina III, taxol y otros taxanos. Las cantidades relativas de taxanos en particular reflejan la interacción del protocolo de alimentación y la composición de alimentación, con las condiciones de líneas y de células de cultivo . Los datos demuestran incremento adicional sustancial en la producción de taxano con respecto a los niveles de producción en condiciones no incrementadas (cuyos niveles de producción están mencionados en el ejemplo 7) . Para propósitos de claridad de comprensión, se ha descrito la invención precedente con cierto detalle, a manera de ilustración y ejemplo, conjuntamente con modalidades específicas, aunque serán evidente para los expertos en la técnica a la que pertenece la invención otros aspectos, ventajas y modificaciones. La descripción precedente y los ejemplos están destinados a ilustrar, pero no a limitar el alcance de la invención. Las modificaciones de los modos anteriormente descritos de poner en práctica la invención, que son aparentes para las personas expertas en la materia, están destinadas a quedar dentro del alcance de la invención, que únicamente está limitada por las reivindicaciones que vienen al final. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicadoras del nivel de experiencia de quienes tengan experiencia en la materia a la que se refiere esta invención. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente quedan incorporadas aquí como referencia en la misma medida de que si cada publicación o solicitud de patente individual hubiese sido indicada específica e individualmente para ser incorporada mediante la referencia.

CUADRO l.a LISTA DE INICIADORES USADOS EN EL INICIO DE LOS CULTIVOS DE CELULAS DE TAXUS SPP. I. INICIADORES BIOTICOS (MICROORGANISMOS) Botrytis cinérea Phytophthora megasperma Pinellas stripticum Oligosporus sp. Pythium mamillatum Pythium sylvaticum Verticillium dahliae Verticillium sp . Penicillium minioluteum Phytophthora lateralis Cytospora cincta Cytospora leucostoma Al ternaria brassicicola Al ternaria solani fl Alternaría cucumerina Botrytis squamosa Cochliobolus heterostrophus Colletotrichum trif olí i 5 Colletotrichum orbiculare Colletotrichum graminicola Colletotrichum gloeosporioides Cylindrocladium floridanum Fusarium crookwellense Fusarium heterosporium Fusarium oxysporum f . sp. conglutinans 10 Fusarium oxysporum f. sp . lycopersici Fusarium oxysporum f. sp . pisi Gibberella zeae Gaeumannomyces graminis var. tri tici Geo tri chum sp . 15 Leptosphaeria korrae Nectria haematococca MPVI Mycosphaerella pinodes Ophiostoma ulmi Phoma lingam 20 Phoma pinodella Phytophthora inf stans Pythium aristosporum Pythium graminicola Pythium ul timum 25 Rhizoctonia solani Sclerotinia sp. S. nodorum D-45 Trame tes versicolor Ustilago maydi s Venturia inaequalis II. INICIADORES BIOTICOS (FRACCIONES MICROBIANAS O PRODUCTOS MICROBIANOS) Quitosán Celulisin Liquenán Multifect XL Glucomanán Multifect CL Pleurán Resinasa Glucán Pulpxima Carboximetilglucán SP341 Hidroximetilglucán Pectinol Sulfoetilglucán Rapidase Manan Klerzyme Xilán Chitinase Manobiosa Manotriosa Manopentaosa Manótetraosa III. INICIADORES ABIOTICOS (AGENTES DE ESFUERZO QUÍMICO ASI COMO ALGUNAS SUSTANCIAS BIOQUÍMICAS QUE OCURREN EN LA NATURALEZA) Acido araquidónico Acido elaidico AMP cíclico AMP dibutiril cíclico Jasmonato de metilo Cis-jasmonato Miconazol Acido ferúlico AMO-1618 Tritón X-100 Acido benzoico y derivados Acido salicílico y derivados Galato de propilo Sesamol Cloruro de clorocolina 3 , 4-diclorofenoxitrietil Acido cloroetilfosfórico (amina) Acido nordihidroguayarético Acido dietilditiocarbámico Ditiotreitol Metabisulfito de sodio Metabisulfito de potasio b-amino-DL-fenilalanina Sulfato de vanadilo Uniconazol Paclobutrazol Espermina Espermidina Putrescina Cadavarina Sulfato de protamina SKF-7997 MER 29 Ancimidol Triadimefón Fosfon D Tiourea Sulfato de dextrano Hidroquinona Glutamato de quitosán Fenpropemorph Prochloraz Naptifine EDU HTA MPTA Glutationa EGTA Gibberellins Acido abscísico 1 , 3 -difenilurea Diazolidinilurea Phloroglucinol Alginato de sodio Carragenán CUADRO l.b. LISTA DE PRECURSORES, INHIBIDORES Y ESTIMULANTES DE ACTIVADORES USADOS EN LA REGULACIÓN DE BIOSINTESIS DE TAXOL Y DE TAXANOS EN CULTIVOS DE CELULAS DE T. spp.

Precursores Inhibidores Estimulantes Fenilalanina Cloruro de clorocolina AMP cíclico Lisina Iniconazol AMP dibutil -Tirosina Paclobutrazol cíclico Triptofano SKF-7997 Jasmonato de Metionina MER 29 metilo Tiramina Ancymidol Cis-jasmonato Acido acético y Triadimefon Acido cloro- sus sales Phosphon D etilfosfónico Acido mevalónico Fenpropemorph Espermina Acetato de farnesilo Prochloraz Espermidina Acetato de geranilo Naptifine Putrescina Acetato de geranil - Miconazol Cadavarina geraniol Nitrato de plata MPTA Triptamina Norbornadieno DCPTA Mentol AMO 1618 ACC a-pireno Alar HTA Acido trans-cinámico Acido 4-amino-5-hexi- Brasinoeste-Cambrene A noico roides Verticillene Feniletanolamina BHA Verticillol Fenetilamina BHT Alcanfor Glifosato OTA Quercetin Dihidrocicloeucalenol Acido levulínico Sulfóxido de metionina Acido abiético ß-hidroxifenetilamina Borneol 5-metil-DL-triptofano a-fluorofenilalanina clorhidrato de 5-2- aminoetil-L-cisteína CUADRO l.c. INICIADORES Xilanasa Butaclore Quitooligosacáridos Isotiocinato de butilo Aducto de óxido bis-nítrico de Clorambén espermina Carbamato de etilo Bis-N,N' -diacetilquitobiosa- 2 -hidroxietilhidrazina isopropilamina Sal de disodio de ácido Aducto de óxido nítrico hidroxiglutarico Aducto de bis (óxido nítrico) Triptofol dietilamina Tiourea Acido siríngico Tioacetamida Benzotiadiazol 2,4, 6-triclorfenol Bipiridilo metocloruro de piridin-2- Gosipol y derivados aldoxima Acido 2-clor-4-metilisonicotínico Monohidrato de oxalato de Indometacina potasio N,N' ,N' -triacetilquitotriosa Bromhidrato de poli-L-lisina N,N' -diacitilquitobiosa Nerol Oxalato de diamonio Acido N- (1-naftil) ftalámico Nigeran Oxalato p-hidroxiacetofenona Clorhidrato de octapomina Acido péctico Orizamida Lisozima 2 -metilpirazina Oxido nítrico Acido metoxiacético Alutationa (reducida) N-etoxicarbonil-2-etoxi-l, 2- 1, 2-diaminopropano dihidroquinolina 1,3 -diaminopropano Acitato de lantano ß-mercaptoetilamina Acido linolénico Hidroxilamina Lipasa Desoxiglucosa Yodoacetamida Acido 2-clorobenzoico 2 -hidroxietilhidrazina 2-metil-l,2-DL (3-piridil)- Dinocap 1-propano 1 , 3 -difenilurea 5-bromouracilo Peróxido de hidrógeno 7-nitrondazol Hidroperóxido de urea 8 -hidroxiquinolina Acido sebácico Acido acedoamidocinámico Peróxido de benzoílo 2 -aminoantraquinona N-metilmaleimida Acido N-acetil-L-glutámico Peróxido de eumeno jto Agmantin N-acetil-D-glucosamina 3 -acetilpiridina Octil -ß-D-glucopiranosida 5 Lactato de Butirilbutirilo Fluorofosfato de diiso¬ 7-bromo-5-cloro-8-hidroxi- propilo quinolina Isopropil -ß-D-tiogalacto- Benzoato de bencilo piranosida Bromoxinilo Hidroxietil-ß-1 , 3 -glucano 10 Siringaldehído Dextrano WF Quitanasa Amarillo Lucifer Bacitracín Cianuro de calcio Glucans 15 Acido glutárico Morfolina Octametilciclotetrasiloxano tt Clorhidrato de trifonelina Acido antranílico 20 Sulfonato de colistinmetano Colquicina 2 , 4-diclorofenol L-fenilalanina-2-naftilamida Acido hidroxiglutáriso y sus sales 25 Acido DL-2-hidroxi-3-metilbutírico Monohidrato de 1-10-fenantrolina Propionato de N-sulfosuccimidil-3- (4-hidroxifenilo) Trans-1, 6-difenilhexatrieno 5 Acido araquidónico Peróxido de hidrógeno de urea Peróxido de hidrógeno Bestatina Hidroxianisol butilado 10 Hidroxitolueno butilado Í Goma de ge11ano Celulasa Acido pimélico Fosfocloridato de diisopropilo 15 Nitrapirina Hidroperóxido de ter-butilo DL-fosfinotricinamonio Siringato de metilo • Triflutalina 20 Tridecanona Mimosina Arigenina Dimetilaminopiridina 1-bencilimidazol 25 DL-o-clorofenilalanina Cloruro de cetilpiridinio Hidroquinona Siringomicina CUADRO l.d. PRECURSORES Dimetilfenilalaniña 1, 6-difosfato de D-fructosa Cloruro de geranilo Acido ß-hidroxipirúvico 10 Geranilgeraniol Acido 4 -hidroxifenilpirúvico • Acido trans -cinámico Acetato de metilo Acido pirúvico Laurato de metilo Acido fenilpirúvico Acido oxaloacético Acido ortosuccinilbenzoico Pinenos 15 Acido 2 , 3-dihidrobenzoico Acetato de geranilo Acido 0 -hidroxifenilpirúvico Nerol Acetato de potasio Felandreno Acido glutámico Cloruro de benzoílo • Acido aspártico Acido R (-) citramálico 20 DL-ß-fenilserina Aspargina Acido hipúrico Acido 2 , 3-diclorobenzoico Acido p-hidroxicinámico Isoleucina Acetato de bencilo Leucina Acido fenilacético Acido fosfoglicérico 25 Acido 3-benzoilpropiónico Serina Acido cítrico Acido 2-hidroxicinámico Benzoato de calcio Acido 3-hidroxicinámico Arginina Acido 4-hidroxicinámico N-benzoil-DL-fenilalanina Borneol Acido 3, 4-dihidroxicinámico Sal fosfoglicerato de Acido fosfenolopirúvico potasio Fenilisoserina 3 -fosfato de gliceraldehído 4-hidrocumarina Fosfato de dihidroxiacetona Glutamina Glicina Ornitina Acetato de etilo Metionina Cinamato de metilo Acido Shiquímico Acetato de potasio Acido oxoglutámico Acido libre de fosfato de Acido DL-3-amino-3 -fenil DL-gliceraldehído propiónico Benzoato de calcio a-fenilalanina Acido oxoglutámico ß-fenilalanina Acido fosfenolpirúvico N-benzoilfenilisoserina Mentol Geraniol Cambrene A Linalool Verticilol Geranil-1inalool Verticellene Isovalerato de isobornilo Acido abiético Acetato de cinamilo Acido succínico Propionato de cinamilo Acido fumárico Cloruro de cinamilo Sal de acetoacetato de potasio CUADRO l.e. INHIBIDORES Rizobitoxina Acido trans-3 , 4-difluorocinámico a-Canalina Mercaptoetanol Acido a-aminoisobutírico 4-hidroxicumarina Acido cis-fpropenilfosfónico Cinamulfluoreno 10 Flurprimidol Acido 2-ciano-4-hidroxicinámico X^ß Clorometilciclopropano Acido cinamilidenmalónico Diazociclopentadieno Acido 4-dimetilaminocinámico Succinato de diamonio N-dinamilpiperazina g-glutamilmetilamida N-trans-cinamoilimidazol 15 Acido 2, 3-dimercapto- Cinamilidenacetofenona succínico Acido 3 , 4-metilendioxi-6-nitro- Fosfato de p-nitrofenilo cinámico gf- Pervanadato Acido 3- (3 , 4-metilendioxifenil) - Ortovanadato propiónico 20 N-acetil-DL-homocisteína Acido 3 , 4-metilendioxifeniltiolactona acético Sales de ácido 2, 3 -difosfo- Acido 3 , 4-trans-dimetoxicinámico clivérico Acido 4-metoxicinámico Benzoato de p-hidroxi- Acido 2-metoxicinámico 25 mercurilo Ester etílico del ácido 4-nitro- Cloruro de metilmercurio cinámico Metilciclopropano Acido metoxicinámico Careboxilato de metilciclo4-nitrocinamaldehído propano Acido 3-nitrocinámico Ciclooctodina Acido 2-nitrocinámico Metoxivinilglicina Acido 3 , 4 -dimetoxi-6-nitro- Ibuprofen cinámico Acido piperonílico Oxalato de amonio Acido fenilpropiólico Acido sinápico Acido L-2-hidroxi-3-fenil-- Acido 2 -hidroxi -4, 6-dimetoxi - propiónico benzoico Acido amino-oxiacético Acido 3-dimetilaminobenzoico D-fenilalanina Acido 3 , 4-dimetoxibenzoico Acido fenilpirúvico Acido 4-metoxibenzoico L-tirosina N(G) -nitro-D-arginina Acido 4-fluoro- (l-amino-2- N(G) -nitro-L-arginina feniletil) fosfónico Acido malónico Acido 4 -hidroxifenilpirúvico Hidrozida del ácido maleico m-fluoro-DL-fenilalanina Acido ocadaico p-fluoro-DL-fenilalanina 1, 4-ciclohexanodiona m-fluoro-DL-tirosina Fluorofosfato de diisopropilo 3 , 4-difluoro-D-fenilalanina Acido oxámico 1-aminobenzotriazol Derivados de ácido oxámico Acido 4-fluorocinámico Sulfanilamida SKF-525A N-acetil-S-farnesil-L-cisteína Sal de sodio del ácido Sal de sodio del ácido A- dietilditiocarbámico quetomélico Ditiotreitol Hidrazida del ácido isonicotínico Acido p-cumárico 2 , 3 -dimercaptopropanol Vinilimidazol Acido salicilhiudroxiamico Acido a-hidroxifarnesil- Acido 3-amino-4-hidroxibencen- fosfónico sulfónico N6-monometil -L-arginina Hidroxiurea 7-nitro-ondazol Acido 6, 7 -dimetoxi- 1, 2-benci*-Norflurazón isoxazol-3 -acético Ciclooctodieno-Ó-fluoro- Acido 3-oxo-l, 2-benciisotiazolin- fenilalanina 2-ilacético Acido dietilditiocarbámico Acido 2 , 3 , 5-triyodobenzoico SKF 7997 [tricloruro de fos- Acido 2- (p-clorofenoxi) -2-metil- fato de tris- (2-dietil- propiónico aminoetilo) ] Acido N- (1 -naftil ) ftalámico Triadimefon Acido 1-pirenoxilbenzoico Acido 2 , 3 , 4-trimetoxicinámico Acido 2 -cloro-9-hidroxifluoreno-Acido 2 , 4-dimetoxicinámico 9-carboxílico Acido 3 -hidroxifenilacético Cloruro de clorocolina 4 -aminotriazol Fenilpeperidon carboxilato de Acido 4-fluorocinámico 2 ' -isopropil-4 '- (cloruro de triAcido 4-cloro-2-metilfenoxi- metilamonio) -5-metilo acético Sesamol 1, 3-dicloropropano Ancimidol N-etilmaleimida Daminozida Semicarbizida Lovastatin 4-clororesorcinol Simvastatin 1 , 2 -dicloropropano Acido cafeico Yodoacetárnica Acido ferúlico Fenilhidrazina Acido 2 , 5-dihidroxicinámico Tiosulfato de plata Acido 2 , 5-hidroximetoxicinámico Cloruro de plata 4 -hexilresorcinol Tiosemicarbazida Cloruro de cetilpiridinio N- (fosponometil) glicina Estorosporina Acido p-clorofenoxiiso- Dimetiltiourea butírico Acido fenilpropiólico Tritón X-100 Oxalaato de amonio Triparanol 1-aminobenzotriazol cloruro de clorfonio 1-vinilimidazol Mepiquat Mercaptoetanol Sal de calcio de prohexadiona Acido 3 , 5 -diyodo-4 -hidroxi- Chloromequat benzoico Tetcyclasis 5-metil-7-cloro-4-etoxi- 2 -aza-2 , 3 -dihidroescualeno carbanilmetoxi-2 , 1, 3 -benzo Dinoconazol tiaciazol Tridemorph Bromoxinil 2,3-iminoescualeno 3,4, 5-tríclorofenol Glifosina N-metilmaleimida Carbamato de isoprofil-N-fenilo 4-fluoro-DL-tirosina Orizalin 3-nitrocinamato de etilo Cafeína Conavanin D-arginina Putrescina metilacetilénica C£metilornitina Acido metilpirúvico 5 Conavanina Acido C^hidroxi-2-piridino- Acido abscísico metansulfónico 3 -amino-1, 2 , 4-triazol Acido acetohidroxámico Acido 4-nitrocinámico Carbamato de isopropil-N- Acido 3 , 4-dimetoxifenilacético fenilo 10 N-cinamilpiperazina DI-fenilen-yodonio ff Hidroxilamina Acido 2-aminoindan-2- 2 , 4-dinitrofenilhidrazina fosfónico Bromuro de tetrametilamonio Arseniato de potasio Clotrimazol Acido Cf-aminooxi-ß-fenil- 15 Valinonicina propiónico Procaína Bencilhidroxilamina Monensina Butóxido de piperonilo tt Uniconazol Paclobutrazol 20 4-aminotriazol isotíocianato de bencilo Selenometionina l-acetil-2 -tiourea 3 , 4-deshidro-DL-prolina 25 2-etilnaftaleno Acido 3-nitrobenzoico Sales de plata tales como cloruro de plata, nitrato de plata, etc.

Hidrosulfito de sodio 7-nitronadozol Etionina Azacitídidina EtoxicarboniIpirimidina Miconazol Acido 2, 3,4, 6-di-o-isopro- piliden-2-ceto-L- gulónico N- (4-hidroxifenil) glicina Acido 3- (4-hidroxifenil) propiónico Acido 3- (2 -hidroxifenil) propiónico 4-ciclohexanodiona Clorhidrato de N- (6-amino- hexil) -5-cloro-l-naftalensulfonamida Endotal Fosfán Cianamida CC (1-metiletil) -Ó- (4-tri- fluorometoxi) fenil-5- pirimidinometanol Acido 2-aminoisobutírico D-arginina n-butilamina Acido p-cloromercuriobencen- sulfónico Metilglioxal bis(guanil- hidrazona Ot-metilornitina CUADRO l.f. ESTIMULANTES Pirofosfato de potasio Acido p-aminohipúrico Pirofosfato de sodio Cinamato de bencilo Uracilo Acido jasmónico Melatonina Jasmonato de metilo Clorhidrato de hidroxilamina Dihidroisojasmona Tionicotinamida Isojasmona S-adenosil-L-metionina Cis-jasmona Trifosfato de inosina Tetrahidrojasmona Acido indol-3-láctico Lactona de cis-jasmona Acido indol-3 -pirúvico Dihidroj asmona Acido indol -3 -carboxílico Jasminolactona Indol -3 -aldehido Jasmolactona N- indolilacetilvalina Acido 12-oxofitodienoico Fosfato de piridoxal Jasmonol Dihidroj asmonato de metilo g-metildecalactona Bipiridilo Tiglato de citronelilo 4 -acetamidofenol Acetato de jasmonilo Imidazol Mastoparano Octil -ß-D-glucopiranosida Acido lisofosfatídico 3 -aminopiridina Cipermetrina Acido guanílico Cantatidina Acido citidílico Acido acetilsalicílico Isopropil -ß-d-tiogalacto- Acido salicílico y derivados piranosida Acido 2 , 6-dicloroisonicotínico Acido 3- (4 -hidroxifenil) - Oxido nítrico propiónico Acido traumático Acido 3- (2-hidroxifenil) - Acido cítrico propiónico Acido citidílico Acido indol -3 -pirúvico Acido málico o sal de ácido Acido tiobenzoico málico Dimetilaminofenilalanina Malato de potasio Acido p-hidroxifenilpirúvico Sales y derivados de ácido Acido 2 , 3-dihidroxibenzoico cítrico Benzoato de etilo Mononucleótido de flavinadenina Acido 3 , 4-dihidroxicinámico Monocleótido de flavina Acido 4-hidroxicinámico AMP cíclico de dibutirilo N-acetil -L-fenilalanina Espermina Acido 3-benzoilpropiónico Espermidina Acido p-hidroxicinámico Putrescina Acido 5 ',5 ' -ditiobis (2- Cadavarina nitrobenzoico) S-adenosilmetionina Acido ß-hidroxipirúvico Fosfato de piridoxal Acido 4-hidroxifenilpirúvico 6-aminonicotinamida Cinamato de metilo 4 -dimetilaminopiridina Salicilato de metilo N- (2 -hidroxietil) succinimida Benzoato de 2 -naftilo Acido 2-oxoglutárico Salicilato de fenilo Acido tiosalicílico Propaclor Tiamina Propionato de vinilo Clorhidrato de trietilamina Acido 3 , 5-diisopropil- salicílico Sulfato de adenina p-amino-L-fenilalanina Salicilato de bencilo 1 , 2 -bencisoxazol Acido 2 , 4-carbonildibenzoico L-citrulina 4-fosfato de D-etitrosa 1, 6-difosfato de fructosa Trifosfato de inosina Diclorhidrato de N-metil- putrescina Clorhidrato de ß-feniletilamina Lisina Imicazol Acido guanílico Melatonina Acido aminocicloprpano- carboxílico Pirofosfato de isopentilo N-acetil -L-glutamina Isoglutamina Treonina Pirofosfato de potasio Pirofosfato de sodio Acido L-2-aminoadípico Clorhidrato de N-metil-N- propagilbenci1amina Hemisulfato de aminoguanidina Acido L- (+) -2-amino-7-fosfono- heptanoico Sulfamato de amonio Aducto de bis -óxido nítrico- espermina Aducto de bis-óxido nítrico- dietilamina Galactosa Valina Vitamina B-12 Acido ascórbico y derivados Coronatina Fenobarbital Pregnenolona 24 -epi -brasinolida Dihidroj asmonato de n-propilo Jamonato de propilo Jasmonato de epimetilo CUADRO 2 COMPOSICIÓN DE MEDIO USADOS PARA EL CULTIVO DE CULTIVOS DE ESPECIES TJÍXUS Medio A B C D E Ingrediente químico mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l Nitrato de amonio Sulfato de amonio 134.0 33.5 134.0 67.0 Acido bórico 3.0 1.5 0.75 3.0 1.5 Cloruro de calcio 113.24 28.31 113.24 65.62 (anhidro) Cloruro de calcio 2"H2? 20.0 50.0 Nitrato de calcio 4"H2? 208.4 Cloruro de cobalto 6"H2? 0.025 0.006 0.025 0.0125 Cloruro cúprico H2O Sulfato cúprico 5"H2? 0.025 0.01 0.006 0.025 0.0125 Na2 EDTA 2"H20 37.3 9.32 37.3 18.65 Sulfato férrico 2.5 Sulfato ferroso 7"H20 27.85 6.95 27.85 13.9 Sulfato de magnesio 122.09 366.2 30.5 122.09 61.04 (anhidro) Sulfato de manganeso H2O 10.0 23.788 22.5 10.0 5.0 Trióxido de molibdeno 0.001 Acido molíbdico (sal de 0.25 0.062 0.25 0.125 sodio) 2"H2? Cloruro de potasio 65.0 Yoduro de potasio 0.75 0.75 0.175 0.75 0.375 Nitrato de potasio 2500.0 80.0 625.0 . 2500.0 1250.0 Fosfato de potasio 10.0 (monobásico) Sulfato de potasio Fosfato de sodio (mono130.5 16.5 32.62 130.5 65.25 básico anhidro) Sulfato de sodio 200.0 Sulfato de zinc 7"H2? 2.0 3.0 0.5 2.0 1.0 Mio-inositol 100.0 100.0 125.0 100.0 50.0 Acido nicotínico 1.0 0.75 1.0 0.5 Piridoxina HCl 1.0 0.25 1.0 0.5 Tiamina HCl 10.0 *5.0 3.5 10.0 5.0 *Glutamina 292.8 146.4 292.8 292.8 *Triptofano *Fenilalanina 30.0 *Lisina 20.0 *Metionina *Acetato de sodio 10.0 10.0 Sacarosa 10000 50000 400000 10000 10000 N6-benciladenina 0.002 2.0 2.0 0.002 0.002 Acido a-naftalen- 0.931 10.0 acético *Acido ascórbico 50.0 100.0 50.0 100.0 100.0 Picloram 1.2 2.4 Hidrolisato de caseína 500.0 6- (g,g-dimetilalil- amino) purina Cinetina Tidiazuron Maltosa *Acido glutámico *Acido aspártico *Glicina *Serina *Acido fólico pH del medio 5.6 5.8 5.8 5.6 5.6 * indica que el componente debe ser esterili zado en filtro hacia el medio CUADRO 2 COMPOSICIÓN DE MEDIO USADOS PARA EL CULTIVO DE CULTIVOS DE ESPECIES TAXUS ( continuación) • 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.06 0.25 0.25 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.19 0.75 0.75 2500.0 2500.0 2500.0 2500.0 2500.0 2500.0 625.00 2500.0 2500.0 170.0 170.0 990.0 990.0 130.5 130.5 130.5 130.5 130.5 130.5 32.63 130.5 130.5 8.6 8.6 .0 2.0 2.0 .0 0.50 00.0 00.0 00.0 00.0 100.0 00.0 25.0 00.0 H .0 1.0 .0 0.25 .0 ? , 0 1.0 .0 1.25 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0 0.0 2.50 0.0 0.0 756. 92.8 92. 92.8 92. 92. 10000.0 20000.0 10000.0 10000.0 10000.0 10000.0 10000.0 50000.0 10000.0 10000.0 0.002 0.002 0.02 0.02 0.002 0.02 1.862 0.931 0.931 1.862 1.862 0.931 1.862 loo. o 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100 , 0 100.0 100.0 100.0 1.2 1.2 2.4 1000.0 0.02 0.02 0.022 10000.0 H ? 1850. .0 1850.0 1850.0 1850.0 1710.0 5.0 5.0 1.0 .6 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6 3.8 5.6 5.6 CUADRO 3 CONDICIONES PREFERIDAS PARA LA PROLIFERACIÓN DEL CALLO, PARA DIVERSAS ESPECIES DE TAXUS. LOS INGREDIENTES DEL MEDIO BASAL ESTÁN MENCIONADOS EN EL CUADRO 2 Especies Medio Reguladores de desarrollo* Basal Auxina Citocinina (Cuadro 2) Tipo Conc (M) Tipo Conc (M) T. brevifolia F P 5 X 10"6 2ÍP 10"7 D P 5 X 10"6 BA 10"8 T. canadensis H P 5 X 10~6 K 10~7 D P 5 X 10"6 BA 10~8 T. chinensis D P 5 X 10~6 BA 10"8 A N 5 X 10"6 BA 10"8 T. globosa D P 5 X 10"6 BA 10-8 T. floridana D P 5 X 10~6 BA 10"8 T. baccata D P 5 X 10~6 BA 10"8 T. cuspidata D P 5 X 10"6 BA 10"8 T. medi a D P 5 X 10"6 BA 10~8 T. wallichiana D P 5 X 10"6 BA 10"8 * Abreviaturas: Picloramo (P) , ácido naftalenacético (N) , benciladenina (BA) , dimetilalilaminopurina (2iP) , cinetina (K) .

CUADRO 4 CARACTERÍSTICAS TÍPICAS DE DESARROLLO DE LOS CULTIVOS EN SUSPENSIÓN DE TAXUS SP.

Especie Tiempo para Tiempo para Densidad Peso Densidad duplicar el duplicar el peso fresco peso seco peso fresco seco T. brevifolia 2.0 días 3.5 días 20 g/i 400 g/1 T. baccata 2.0 6.0 15 220 T. chinensis 2.5 4.5 20 285 T. canadensis nd* 8 . 5 13 260 • todavía no determinado CUADRO 5 15 PRODUCCIÓN DE TAXOL EN DIVERSAS ESPECIES DE TAXUS Especie Contenido de Medio Análisis Taxol (% de (véase cuadro peso seco) 2 y 3) T. brevifolia 0.006 F ELISA • T. canadensis 0.004 H ELISA T. baccata 0.0014 D HPLC T. globosa 0.0003 G ELISA T. cuspidata 0.0025 G HPLC 25 T. floridana 0.001 G ELISA T. media 0.02 F ELISA T. chinensis 0.18 B HPLC CUADRO 6 MEJORAS EN LA PRODUCTIVIDAD DEBIDAS AL TRATAMIENTO DE CAMBIO DE MEDIO. LOS NÚMEROS ESTÁN EXPRESADOS COMO VECES QUE SE MEJORA CON RESPECTO A LOS NIVELES OBTENIDOS EN UN INTERVALO INTERMITENTE DE 15 DÍAS. LA LINEA DE CELULAS K-l DE TAXUS CHINENSIS FUE CULTIVADA EN EL MEDIO A EN LA OSCURIDAD Niveles totales* Niveles extracelulares Taxol 4.6 4.89 Taxanos totales 4.55 5.94 * Niveles totales en células y medio combinados CUADRO 7 15 EFECTO DEL TRATAMIENTO CON LUZ GROLUX STANDARD SOBRE EL CONTENIDO DE TAXOL Y DE TAXANO EN CULTIVOS DE 10 DÍAS DE EDAD DE LINEA K-l DE TAXUS C INENSIS CULTIVADA EN EL MEDIO A. LAS ttt CANTIDADES MOSTRADAS ESTÁN EXPRESADAS COMO MILIGRAMOS EXTRAÍDOS DE 20 ML DE SUSPENSIÓN. EL DESARROLLO DE CELULAS FUE IDÉNTICOS 20 EN AMBOS TRATAMIENTOS (164 MG DE PESO SECO POR MATRAZ) Luz Oscuridad Taxol total : células y medio 8.8 µg 3.13 µg Taxol extracelular 76.40% 56.20% 25 Taxanos totales : células y medio 61.55 µg 62.17 µg Taxanos extracelulares 89% 84% CUADRO 8 • COMPARACIÓN DE SUSPENSIONES TRATADAS CON GLUTAMATO DE QUITOSAN A SUSPENSIONES NO INICIADAS DE LINEA K-l DE TAXUS CHINENSIS DESPUÉS DE 15 DÍAS DE CULTIVO EN MEDIO C. LOS NIVELES DE TAXANO INFORMADOS SON DE CELULAS Y MEDIO COMBINADOS. EL % EXTRA SE REFIERE AL PORCENTAJE EXTRACELULAR CONTROL Densidad de células 10.1 g/1 Viabilidad de células 70.80% de viables INICIADOR Densidad de células 14.2 g/1 15 Viabilidad de células 75-80% de viables Taxanos % peso mg/l % extra % peso mg/l % extra seco seco Taxol 0.054 5.4 7.2 0.098 13.9 85.0 • Bacatina III 0.057 5.8 69.9 0.055 7.8 76.6 7-xilosil-lO 0.040 4.0 63.0 0.048 6.9 77.0 desacetiltaxc.1 Cefalomanina 10-desacetil- bacatina III 25 10-desacetil- 7-epitaxol 0.054 5.4 74.2 0.076 10.8 85.7 7-epitaxol 0.009 0.9 74.6 0.009 1.3 86.2 Taxanos des0.203 20.5 19 . 1 0.240 34.1 90.2 conocidos Taxanos 0.421 42.4 0.533 75.8 totales CUADRO 9 MANIPULACIÓN DE MEDIO NUTRIENTE PARA BIOSINTESIS INCREMENTADA DE TAXANO Y DE TAXOL EN LINEA K-l DE SUSPENSIÓN DE TAXUS C INENSIS . SE INOCULO 500 MG DE PESO FRESCO DE CELULAS POR 5 ML DE MEDIO Y SE INCUBO EN LA OSCURIDAD DURANTE 18 DÍAS. LOS TAXANOS TOTALES PRODUCIDOS (EN CELULAS Y MEDIO COMBINADOS) ESTÁN INFORMADOS. LOS INGREDIENTES EN LOS MEDIOS B Y C ESTÁN MENCIONADOS EN EL CUADRO 2 Medio B Medio C Nivel de taxano (mg/l) (mg/l) Bacatina III 4.3 3.9 7-xilosil- 10 -desacetiltaxol 8.3 12.9 Cefalomanina 1.1 vestigios 10 -desacetil-7 -epitaxol 4.6 5.4 taxol 24.1 21.3 7-epitaxol 1.3 2.8 -Otros taxanos no identificados* 56.1 63.7 Taxanos totales 99.8 mg/l 110 mg/l CUADRO 10 INCREMENTO EN LA BIOSINTESIS DE TAXANO EN LA LINEA DE CELULAS KS1A DE TAXUS CHINENSIS, MEDIANTE PLATA Compuesto de plata Dosis mg/ 1 de producto extracelular** (mmoles) Bacatina III Taxol Taxanos totales Medio de cultivo 16 5 21 únicamente * Tiosulfato de plata 50 71 15 86 Fosfato de plata 100 48 7 55 Benzoato de plata 20 40 7 47 Sulfato de plata 20 61 7 68 Sal de plata de 20 39 6 45 ácido toluensulfóni co Cloruro de plata 10 22 18 40 Oxido de plata 50 43 18 61 Acetato de plata 10 52 10 62 Nitrato de plata 20 63 6 69 * El medio de cultivo fue el medio N del cuadro 2, con la adición de los siguientes reguladores de crecimiento: 10 mmoles de ácido a-naftalenacético y 1 mmol de tidiazurón ** todas las muestras fueron tomadas después de 14 días de incubación.

CUADRO 11 INCREMENTO EN LA BIOSINTESIS DE TAXOL Y DE TAXANO MEDIANTE PLATA EN DIVERSAS LINEAS DE TAXUS CHINENSIS . LOS TÍTULOS REPRESENTAN LOS NIVELES MEDIDOS EN EL CALDO ENTERO, ES DECIR, EN LAS CELULAS Y EN EL MEDIO EXTRACELULAR Cultivo Concen- Medio Duración Bacatina Taxol Otros Taxanos de tración de (días) III Taxatotales células de plata cult ivo mg/l mg/l nos mg/l mg/l SS6A-1224 0 Ib 30 10 48 23 81 SS6A-1224 50 mM I 30 172 86 126 384 SS122-13 0 IIC 14 2 21 10 33 SS122-13 50 M II 14 12 103 60 173 S122-42 0 II 14 3 80 26 109 S122-42 50 mM II 14 4 146 38 188 a Añadido como tiosulfato de plata b El medio de cultivo es el medio N del cuadro 2, con adición de regulador de desarrollo ácido a-naftalenacético a una concentración de 10 mmoles. c El medio de cultivo es el medio N del cuadro 2, con adición del regulador de desarrollo ácido a-naftalenacético a una concentración de 10 mmoles y tiadiazurón a una concentración de 1 mmol .

CUADRO 12 INCREMENTO EN LA BIOSINTESIS DE TAXOL Y DE TAXANO MEDIANTE ACIDO JASMONICO Y SU ESTER METÍLICO. SE MIDIÓ LOS TÍTULOS DE TAXANO EN EL CALDO ENTERO DESPUÉS DE 14 DÍAS DE CULTIVO. EL MEDIO DE CULTIVO FUE EL MEDIO N DEL CUADRO 2 CON LA PRESENCIA ADICIONAL DEL REGULADOR DE DESARROLLO, ACIDO A-NAFTALENACETICO, A UNA CONCENTRACIÓN DE 10 MMOLES Cultivo de ConcentraBacatina Taxol Otros Taxanos células ción de III taxanos totales j asmonato mg/l mg/l mg/l mg/l SS122 -42 0 3 80 26 109 SS122 -42 200 mM JMA 4 120 87 211 SS122 -42 89 mM MJS 3 121 109 233 S122- 13 0 2 21 10 33 S122- 13 89 mM MJS 9 73 63 124 a JMA denota el ácido libre y MJS denota el jasmonato de metilo CUADRO 13 INCREMENTO EN LA BIOSINTESIS DE TAXOL Y DE TAXANO MEDIANTE ACIDO 3,4-METILENDIOXINITROCINAMICO (MDNA). SE MIDIÓ LOS NIVELES DE TAXANO EN EL CALDO ENTERO DESPUÉS DE 14 DÍAS DE CULTIVO. LA LINEA USADA FUE SS122-42 DE TAXUS CHINENSIS Concentración Medio de Bacatina Taxol Otros Taxanos de MDNA cultivo III, mg/l mg/l taxanos totales mg/l mg/l 0 I 3 80 26 109 50 mM I 5 163 45 213 50 mM II 34 311 89 434 a El medio de cultivo I se refiere al medio N del cuadro 2, con la presencia adicional del regulador de desarrollo, ácido a-naftalenacético a una concentración de 10 mmoles. El medio de cultivo II es idéntico al medio de cultivo I, con la presencia adicional de 50 mmoles de tiosulfato de plata.

CUADRO 14 INCREMENTO DE TAXOL Y TAXANOS EN CULTIVOS DE CELULAS DE TAXUS CHINENSIS UTILIZANDO DIVERSAS COMBINACIONES DE AGENTES DE INCREMENTO. SE EXPRESA TODAS LAS CONCENTRACIONES DE TAXANO COMO TÍTULOS DE CALDO ENTERO (ES DECIR, CONCENTRACIÓN EN CELULAS Y MEDIO COMBINADOS) , Y SE OBTUVO LOS VALORES DESPUÉS DE 11 DÍAS DE INCUBACIÓN Cultivo de Medio de Bacatina Taxol Otros Taxanos células cultivoa III, mg/l mg/l taxanos totales mg/l mg/l • SS64-412 I 42 464 101 606 SS64-561 II 590 182 388 1160 SS64-571 III 596 158 261 1015 15 SS124-77 IV 72 39 576 687 SS122-29 V 18 306 152 476 SS85-26 VI 586 100 416 . 1102 a El medio de cultivo para todas las combinaciones fue el • medio N del cuadro 2. El medio de cultivo I contenía, además del medio N, 10 mmoles de ácido a-naftalenacético (NAA) , 3 mmoles de tiadiazurón (TDZ) , 50 mmoles de ácido 3,4- metilendioxi-6-nitrocinámico (MDNA), 89 mmoles de jasmonato de metilo (MJS) y 50 mmoles de tiosulfato de plata (SLTS) . El medio de cultivo II contenía, además del medio N, 10 mmoles de NAA, 1 mmol de TDZ, 50 mmoles de MDNA, 89 mmoles de MJS, 10 mmoles de SLTS y otros 98.5 mg/litro de fosfato de sodio (monobásico) . El medio de cultivo III contenía, además del medio N, 10 mmoles de ácido indolbutírico, 3 µmoles de TDZ, 30 mmoles de ácido 3 , 4-metilendioxi-6-cinámico, 89 mmoles de MJS y 50 mmoles de SLTS. El medio de cultivo IV contenía, además del medio N, 10 mmoles de NAA, 89 mmoles de MJS, 100 mmoles de SLTS y 5 mmoles de glutamina. El medio de cultivo V contenía, además del medio N, 10 mmoles de NAA, 89 mmoles de MJS y 50 mmoles de SLTS. El medio de cultivo VI contenía, además del medio N, 10 mmoles de NAA, 1 mmol de TDZ, 50 mmoles de MDNA, 18 mmoles de MJS, 50 mmoles de SLTS y 5 mmoles de glutamina.

CUADRO 15 INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXANO MEDIANTE CAMBIO DE MEDIO Línea de Medio de Tipo de Duración Producto0 células cultivo3- operación (días) Paella I Intermitente 11 Taxol Paella I Cambio de medio 20 Taxol SS29-3A5 II Intermitente 14 Bacatina III SS29-3A5 II Cambio de medio 28 Bacatina III SS29--3A5 II Intermitente 22 10-desacetil- bacatina III SS29--3A5 II Cambio de medio 28 10-desacetil- bacatina III SS45--146 III Intermitente 11 Taxanos totales SS45--146 III Cambio de medio 28 Taxanos totales CUADRO 15 INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXANO MEDIANTE CAMBIO DE MEDIO (Continuación) Producto0 Nivel de Productividad Producción volumétrica promedioe (mg/l) (mg/litro/día) Taxol 185 13 Taxol 165 17 Bacatina III 260 18 Bacatina III 580 21 -desacetil- 300 14 bacatina III -desacetil- 400 14 bacatina III Taxanos 700 64 totales Taxanos 2500 89 totales a El medio de cultivo para estas condiciones de cultivo fue el medio N del cuadro 2. El medio de cultivo I incluía, además del medio N, 10 mmoles de ácido a-naftalenacético (NAA) , 1 mmol. de tiadiazurón (TDZ), 50 mmoles de ácido 3,4-metilendioxinitrocinámico (MDNA) , 18 mmoles de jasmonato de metilo (MJS) y 10 mmoles de tiosulfato de plata (SLTS) . El medio de cultivo II incluía, además del medio N, 10 mmoles de NAA, 1 mmol de TDZ, 50 mmoles de MDNA, 89 mmoles de MJS, 10 mmoles de SLTS y 5 mmoles de ácido glutámico (sal de monopotasio) . El medio de cultivo III incluía, además del medio N, 10 mmoles de NAA, 2.5 mmoles de zeatina, 30 mmoles de MDNA, 89 mmoles de MJS y 50 mmoles de SLTS. b Se obtuvo incremento repetido mediante cambio de medio, tal como se describió en el ejemplo 14. c Se menciona el producto predominante producido por una línea de células dada, bajo el medio de cultivo especificado; también se produjo, en cada caso, taxanos diferentes al producto predominante, excepto para la línea de células SS45- 146, para la que se menciona la producción de taxano total, d Los niveles de producción para cultivo intermitente se refieren a las concentraciones extracelulares, es decir, la cantidad de taxano medida en el medio extracelular, dividida entre el volumen del medio extracelular. Para incremento repetido mediante cambio de medio, el nivel de producción se refiere a la cantidad total de taxano medida en el medio extracelular después de cada cambio de medio, dividida entre el volumen de la suspensión. e La productividad volumétrica promedio es un indicador de la capacidad biosintética, y se define como el producto total dividido entre el volumen de suspensión y dividido adicionalmente por la duración de la incubación.

CUADRO 16.a. INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE TAXOL Y TAXANO MEDIANTE LA OPERACIÓN DE ALIMENTACIÓN INTERMITENTE Línea de Medio de Tipo de Componentes Duración células cultivoa operación de alimenta de culti ción intervo total mitente (días) CR-128 A Intermitente - - - 24 A Alimentación inter- Fl 24 tente A Alimentación interF2 24 mitente SS36-245 B Intermitente _ _ _ 31 B Alimentación interF3 31 mitente B Alimentación interF4 31 mitente SS36-359 C Intermitente - - - 21 C Alimentación interF5 21 mitente CUADRO 16.a. INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE TAXOL Y TAXANO MEDIANTE LA OPERACIÓN DE ALIMENTACIÓN INTERMITENTE (continuación) Línea de Bacatina Taxol Otros Taxanos Células I I I Taxanos totales (mg/l ) * (mg/l ) (mg/l ) (mg/l ) CR- 128 152 134 203 489 257 200 295 752 254 316 427 997 SS36-245 170 80 190 440 50 212 198 460 56 412 > 348 816 SS36-359 220 155 163 538 ' 439 182 304 925 a El medio de cultivo para todas las líneas de células fue el medio N (cuadro 2) . Además, el medio de cultivo I contenía 10 µmoles de ácido Ó-naftalenacético (NAA) , 30 µmoles de ácido 3 , 4-metilendioxi-6-nitrocinámico (MDNA), 18 µmoles de jasmonato de metilo (MJS) y 50 µmoles de tiosulfato de plata (SLTS) . El medio de cultivo II contenía, además del medio N, 10 µmoles de NAA, 50 µmoles de MDNA, 50 µmoles de SLTS y 1 µmol de tidiazurón (TDZ) . El medio de cultivo III contenía, además del medio N, 10 µmoles de NAA, 1 µmol de TDZ, 50 µmoles de MDNA, 50 µmoles de SLTS, 89 µmoles de MJS. * Todos los valores de taxano se refieren a títulos de caldo entero (mg de taxanos en células + mg de taxanos en medio extracelular) /volumen total de cultivo (litros) .

CUADRO 16.b. DETALLES DE LA OPERACIÓN DE ALIMENTACIÓN INTERMITENTE DESCRITA EN EL CUADRO 16.a.

Solución Composición Régimen Inicio Duración de alide ali- de ali. de alimen mentación mentación mentación tación (ml/l/día) (día) (días) Fl 25% (en peso/volumen) de 10 17 fructosa, 25 mmoles de glutamina, 50 µmoles de NAA, 250 µmoles de SLTS, 89 µmoles de MJS, 1.48 mmoles de cloruro de calcio, 0.63 mmoles de sulfato de magnesio, 0.68 mmoles de fos. fato de sodio (monobásico) F2 Fl, 75 mmoles de CÉfenil- 10 17 alanina, 25 mmoles de ß- fenilalanina. F3 25% (en peso/volumen) de 10 25 fructosa, 150 mmoles de CC- fenilalanina, 25 mmoles de ß-fenilalanina. F4 50% (en peso/volumen) de 5 22 glucosa, 5.92 mmoles de cloruro de calcio, 2.52 mmoles de sulfato de magnesio, 2.72 mmoles de fosfato de sodio (monobásico) , 500 µmoles de SLTS, 10 µmoles de TDZ, 100 µmoles de NAA, 150 mmoles de CC-fenilalanina, 50 mmoles de ß-fenilalanina . F5 contenía 50% (en peso/volu 5 12 men de glucosa, 100 µmoles de NAA, 10 µmoles de TDZ, 500 µmoles de SLTS, 89 µmoles de MJS, 0.68 mmoles de fosfato de sodio (monobásico) , 50 mmoles de Gf-fenilalanina.

CUADRO 17 INCREMENTO DE TAXOL Y DE TAXANOS EN LOS CULTIVOS DE CELULAS DE TAXUS CHINENSIS , UTILIZANDO DIVERSAS COMBINACIONES DE AGENTES DE INCREMENTO. TODAS LAS CONCENTRACIONES DE TAXANOS ESTÁN EXPRESADAS COMO TÍTULOS DEL CALDO ENTERO (ES DECIR, LA CONCENTRACIÓN EN CELULAS Y EN EL MEDIO COMBINADAS) Cultivo Medio Duración Bacatina Taxol Otros Taxanos de de (días) (mg/l) (mg/l) Taxanos totales células culti o9- (mg/l) (mg/l) SS122-41 I 20 106 374 158 638 SS122-41 Ib 20 7 507 148 662 SS122-30 II 14 27 279 226 532 cr427 III 14 13 302 125 440 cr452 IV 14 11 190 95 296 cr452 V 14 4 172 67 243 cr857 I 24 116 531 258 905 cr914 VI 14 260 436 312 1008 a El medio de cultivo para todas las combinaciones fue el medio N (cuadro 2) en el que se reemplazó la fuente primaria de carbono por otras fuentes como se describe en esta leyenda. El medio de cultivo I contenía 100 gramos/litro de maltosa en lugar de sacarosa y además contenía 20 mmoles de ácido 1- naftalenacético (NAA), 40 mmoles de ácido 3,4- (to metilendioxinitrocinámico (MDNA) , 45 mmoles de jasmonato de metilo (MJS) , 100 mmoles de tiosulfato de plata (SLTS) y 5 5 mmoles de glutamina. El medio de cultivo II contenía 50 gramos/litro de maltosa en lugar de sacarosa y, además, contenía 10 mmoles de NAA, 40 mmoles de MDNA, 100 mmoles de MJS y 75 mmoles de SLTS. El medio de cultivo III contenía 50 gramos/litro de maltosa en lugar de sacarosa y, además, 10 contenía 20 mmoles de NAA, 40 mmoles de MDNA, 45 mmoles de MJS, 9 100 mmoles de SLTS y 5 mmoles de glutamina. El medio de cultivo IV contenía 50 gramos/litro de lactosa en lugar de sacarosa y, además, contenía 20 mmoles de NAA, 40 mmoles de MDNA, 45 mmoles de MJS, 100 mmoles de SLTS y 5 mmoles de 15 glutamina. El medio de cultivo V contenía 40 gramos/litro de galactosa en lugar de sacarosa y, además, contenía 20 mmoles de NAA, 40 mmoles de MDNA, 45 mmoles de MJS, 100 mmoles de SLTS y .jttk 5 mmoles de glutamina. El medio de cultivo VI contenía 70 gramos/litro de maltosa en lugar de sacarosa y, además, 20 contenía 20 mmoles de NAA, 40 mmoles de MDNA, 45 mmoles de MJS, 100 mmoles de SLTS y 5 mmoles de glutamina, b La densidad de peso fresco fue de 26% (en peso/volumen) .

CUADRO 18.a. INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXOL Y DE TAXANO MEDIANTE LA OPERACIÓN DE ALIMENTACIÓN INTERMITENTE Cultivo Medio Tipo de Componen Bacatina de de operación tes de III células cultivo° alimenta (mg/l) ción ínter mitente SS122-41a A Intermitente - - 120 A Alimentación inter- Fl 32 mitente A Alimentación inter- F2 27 mitente S122-41b B Intermitente - - 7 B Alimentación inter- F3 66 mitente.

CUADRO 18.a. INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE TAXOL Y DE TAXANO MEDIANTE LA OPERACIÓN DE ALIMENTACIÓN INTERMITENTE (Continuación) Cultivo Taxol Otros Taxanos de (mg/l) Taxanos totales células (mg/l) (mg/l) SS122-41a 225 123 468 476 171 679 501 180 708 S122-41b 507 148 662 902 251 1219 a La densidad de inoculación fue de 20% (en peso/volumen) b La densidad de inoculación fue de 26% (en peso/volumen) c El medio de cultivo para todas las líneas de células fue el medio N (cuadro 2) . La fuente primaria de carbono fue sacarosa a menos que se sustituya como se describe aquí. Además, el medio de cultivo A contenía 20 µmoles de ácido ?£-naftalenacético (NAA), 40 µmoles de ácido 3,4-metilendioxinitrocinámico (MDNA) , 45 µmoles de jasmonato de metilo (MJS) y 100 µmoles de tiosulfato de plata (SLTS) y 5 mmoles de glutamina. El medio de cultivo B contenía 100 mg/litro de maltosa en lugar de sacarosa y, además, contenía 20 µmoles de NAA, 40 µmoles de MDNA, 45 µmoles de MJS, 100 µmoles de SLTS y 5 mmoles de glutamina. d Hágase referencia al cuadro 18. b. e Todos los valores de taxano se refieren a título de caldo entero (mg de taxanos en células + mg de taxanos en medio extracelular) /volumen total del cultivo (litros) .

CUADRO 18.b. DETALLES DE LA OPERACIÓN DE ALIMENTACIÓN INTERMITENTE DESCRITA EN EL CUADRO 18.a.

Solución de Composición Régimen Inicio de Duración alimentación de ali- alimenta- de ali- mentación ción mentación (ml/l/día) (día) intermitente (días) Fl 50% (en peso/volumen) 8 10 11 -21 de fructosa, 50 mmoles de glutamina F2 50% (en peso/volumen) 10 11-21 -21 de maltosa, 50 mmoles de glutamina.

F3 50% (en peso/volumen) 8 10 10-20 -20 de maltosa, 200 µmoles de NAA, 450 µmoles de MJS, 50 mmoles de glutamina.

Claims (13)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Un método para producir taxanos con altos rendimientos en cultivos de células de una especie de Taxus, caracterizado porque comprende: cultivar en cultivo de suspensión, en uno o más medios nutrientes, bajo condiciones de crecimiento y de formación de producto, las células de una 10 especia de Taxus derivada del callo o de cultivos en WW suspensión, y recuperar uno o más taxanos de dichas células o dicho medio de cultivo de células, o de ambos,- en donde el uno o más medios nutrientes comprenden un agente de incremento seleccionado de: (a) un inhibidor de la acción de etileno; (b) 15 un compuesto relacionado con jasmonato; y (c) un regulador de crecimiento relacionado con auxina. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, tt caracterizado además porque al menos uno del uno o más medios nutrientes contiene un inhibidor del metabolismo de 20 fenilpropanoides. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el inhibidor del metabolismo de fenilpropanoides está seleccionado del ácido 3 , 4 -metilendioxi- 6-nitrocinámico, el ácido 3 , 4-metilendioxicinámico, el ácido 3- 25 [3 , 4-metilendioxifenil] propiónico, el ácido 3,4- metilendioxifenilacético, 4-fluoro-L-fenilalanina, el ácido 4-hidroxifenilpirúvico, 4-fluoro-DL-tirosina, ácido trans-3,4-dimetoxicinámico, ácido fenilpropiólico, ácido L-2-hidroxi-3-fenilpropiónico, ácido 2-hidroxi-4, 6-dimetoxibenzoico, SKF-525A, vinilimidazol, oxalato de amonio, ácido sinápico y 1-aminobenzotriazol . 4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes contiene un compuesto que contiene plata o un complejo de plata o un ion plata. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque al menos uno del uno o más medios nutrientes contiene ácido jasmónico o un éster alquílico del mismo. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el grupo alquilo esterificado al ácido jasmónico tiene de uno a seis átomos de., carbono. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes contienen adicionalmente un compuesto que contiene plata, un complejo de plata o ion plata. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el regulador del crecimiento relacionado con auxina es ácido 1-naftalenacético, ácido 2-naftalenacético, 1-naftalenacetamida/naftilacetamina, ácido N- (1-naftil) ftalámico, ácido 1-naftoxiacético, ácido 2-naftoxiacético, ácido beta-naftoxiacético, 1-naftoxiacetamida, ácido 3 -clorofenoxiacético, ácido 4 -clorofenoxiacético, ácido 3 -yodofenoxiacético, indolacetamida, ácido indolacético, acetato de indol, indolacetil leucina, ácido gamma- (3-indol) butírico, ácido 4-amino-3 , 5, 6-tricloropicolínico, éster metílico del ácido 4-amino-3 , 5, 6-tricloropicolínico, ácido 3,6-dicloro-o-anísico, ácido 3 , 7-dicloro-8-quinolincarboxílico, ácido fenilacético, ácido 2 -yodofenilacético, ácido 3-yodofenilacético, ácido 2 -metoxifenilacético, Chlorpropham, ácido 4-cloroindol-3-acético, ácido 5-cloroindol-3-acético, ácido 3-cloroindol-3-acético, butirato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo, butirato de 6-cloro-3-indoílo, indolacetilfenilalanina, indolacetilglicina, indolacetilalanina, 4-cloroindol, ácido p-clorofenoxiisobutírico, ácido 1-pirenoxilbenzoico, ácido lisofosfatídico, N-metilcarbamato de 1-naftilo y ácido etil-5-cloro-lH-indazol-3-il-acetato-3-indolbutanoico. 9.- Un método para producir taxanos en rendimientos elevados, en cultivo de células de una especie de Taxus, caracterizado porque comprende: cultivar un cultivo en suspensión, en uno o más medios nutrientes, bajo condiciones de crecimiento y de formación de producto, células de una especie de Taxus derivadas de callo o de cultivos en suspensión, y recuperar uno o más taxanos de dichas células o del medio de dicho cultivo de células o de ambos; en donde el uno o más medios nutrientes contienen plata a una concentración de 900 µmoles o menos en la forma de un compuesto que contiene plata, o un complejo de plata o un ion plata; y por lo menos uno del uno o más medios nutrientes comprende un agente de incremento seleccionado de: (a) ácido jasmónico o un éster de ácido jasmónico; y (b) un regulador del crecimiento relacionado con auxina . 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el agente de incremento es ácido jasmónico o un éster de ácido jasmónico; y la razón molar de plata a agente de incremento es menor que 9.5. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el agente de incremento es un regulador del crecimiento relacionado con auxina y la razón molar de agente de incremento a plata es al menos 0.011. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes también incluyen un precursor de taxano. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el precursor de taxano es C-fenilalanina, ß-fenilalanina o una mezcla de las mismas. 1.4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes también contienen glutamina. 15 * - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes contienen también ácido glutámico, ácido aspártico o una mezcla de ellos. 16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes incluyen maltosa como fuente de carbono. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes incluyen sacarosa como fuente de carbono. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque el uno o más medios nutrientes incluyen glucosa, fructosa o una mezcla de ellas, como fuente de carbono. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la maltosa, sacarosa, glucosa, fructosa o mezclas de ellas, es la fuente primaria de carbono. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque el medio nutriente es el mismo para el crecimiento del cultivo de células que para la producción de taxol y de taxano. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque la producción del uno o más taxanos es inducida por el cambio de composición del medio nutriente. 22 - - El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque comprende cambiar el medio nutriente al menos una vez durante la producción de taxano. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 9, caracterizado además porque comprende adicionalmente cambiar el medio nutriente por lo menos una vez durante el paso de cultivo.