JPH1042888A - タキソールの培養生産方法 - Google Patents
タキソールの培養生産方法Info
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- JPH1042888A JPH1042888A JP8217896A JP21789696A JPH1042888A JP H1042888 A JPH1042888 A JP H1042888A JP 8217896 A JP8217896 A JP 8217896A JP 21789696 A JP21789696 A JP 21789696A JP H1042888 A JPH1042888 A JP H1042888A
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- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】タキソール含有植物体から誘導されるカル
ス又は細胞の培養によるタキソールの生産方法におい
て、キトヘプタオースを用いることを特徴とするタキソ
ールの培養生産方法。 【効果】本発明の方法によれば、大量生産が困難であっ
たタキソールを、特に細胞懸濁培養により、従来の方法
より高収率で得ることができる。
ス又は細胞の培養によるタキソールの生産方法におい
て、キトヘプタオースを用いることを特徴とするタキソ
ールの培養生産方法。 【効果】本発明の方法によれば、大量生産が困難であっ
たタキソールを、特に細胞懸濁培養により、従来の方法
より高収率で得ることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タキソール含有植
物体から誘導されるカルス又は細胞の培養によるタキソ
ールの培養生産法に関する。
物体から誘導されるカルス又は細胞の培養によるタキソ
ールの培養生産法に関する。
【０００２】
【従来の技術】タキソールは、イチイ科イチイ属樹木の
樹皮や葉に含まれるタキサン型ジテルペンアルカロイド
で、次に示す構造の化合物である。
樹皮や葉に含まれるタキサン型ジテルペンアルカロイド
で、次に示す構造の化合物である。
【０００３】
【化１】
【０００４】タキソールは、重症の卵巣ガン患者や肺ガ
ン患者に対して優れた効果を示す（出光技報第３５巻第
３号第９４頁（１９９２））ことから、医薬としての利
用が進められている。従来、タキソールはイチイや太平
洋イチイ、西洋イチイの樹皮や葉から溶媒抽出すること
により得られてきた。しかし、これらの植物は成長が遅
く、また微量のタキソールしか単離できないため、供給
量を確保するのは困難であった。そのため、タキソール
を大量生産するために、例えば合成法や培養法が試みら
れている。
ン患者に対して優れた効果を示す（出光技報第３５巻第
３号第９４頁（１９９２））ことから、医薬としての利
用が進められている。従来、タキソールはイチイや太平
洋イチイ、西洋イチイの樹皮や葉から溶媒抽出すること
により得られてきた。しかし、これらの植物は成長が遅
く、また微量のタキソールしか単離できないため、供給
量を確保するのは困難であった。そのため、タキソール
を大量生産するために、例えば合成法や培養法が試みら
れている。
【０００５】合成法についていえば、ごく最近、タキソ
ールの全合成が達成された（K.C.Nicolaou et al., Nat
ure,367, 630,1994 及び Robert A. Holton et al., J.
Am.Chem.Soc., 116,1597,1994 ）。しかしながら、上記
の合成法では反応のステップが多いため、工業的レベル
での生産には問題がある。
ールの全合成が達成された（K.C.Nicolaou et al., Nat
ure,367, 630,1994 及び Robert A. Holton et al., J.
Am.Chem.Soc., 116,1597,1994 ）。しかしながら、上記
の合成法では反応のステップが多いため、工業的レベル
での生産には問題がある。
【０００６】また、培養法については、２，４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸及びカイネチンを用いて培養すること
により、対照の２倍程度の効果が得られ（Arthur G. Fe
tt-Neto et al., Bio/Technology, 10(12), 1572, 199
2）、エリシターとしてキトサングルタメート及び光を
用いて培養することにより対照と比較して４倍の生産性
向上効果が得られている（ＷＯ ９３１７１２１号公
報）。また、太平洋イチイの種子の胚乳を用いてカルス
を誘導し、液体培養でカルスを１３．６倍に増殖させ、
タキソールの乾燥細胞に対する収率は０．０５％という
記載がある（特開平６−２９６４９３号公報）。また、
１％程度のカルス低濃度の培養液で連続培養し、細胞の
外にタキソールは排出する（タキソール収率０．３％ V
S 乾燥細胞）という報告(J. of Chemical Engineering
of Japan, 28, 488 (1995)) もある。さらに、Taxus me
dia の種子からカルスを誘導し、エリシターとしてジャ
スモン酸メチルを用いて液体培養を行い（行宗等：日本
農芸化学会誌、69、臨時増刊号、266 (1995)) 無添加の
場合に比べてタキソールの生産量が約３倍に増加したと
いう報告がある。
ロフェノキシ酢酸及びカイネチンを用いて培養すること
により、対照の２倍程度の効果が得られ（Arthur G. Fe
tt-Neto et al., Bio/Technology, 10(12), 1572, 199
2）、エリシターとしてキトサングルタメート及び光を
用いて培養することにより対照と比較して４倍の生産性
向上効果が得られている（ＷＯ ９３１７１２１号公
報）。また、太平洋イチイの種子の胚乳を用いてカルス
を誘導し、液体培養でカルスを１３．６倍に増殖させ、
タキソールの乾燥細胞に対する収率は０．０５％という
記載がある（特開平６−２９６４９３号公報）。また、
１％程度のカルス低濃度の培養液で連続培養し、細胞の
外にタキソールは排出する（タキソール収率０．３％ V
S 乾燥細胞）という報告(J. of Chemical Engineering
of Japan, 28, 488 (1995)) もある。さらに、Taxus me
dia の種子からカルスを誘導し、エリシターとしてジャ
スモン酸メチルを用いて液体培養を行い（行宗等：日本
農芸化学会誌、69、臨時増刊号、266 (1995)) 無添加の
場合に比べてタキソールの生産量が約３倍に増加したと
いう報告がある。
【０００７】また、本発明者らはキャラボクのカルスに
エリシターとしてキトオリゴ糖１〜９量体を作用させて
ＭＳ寒天培地で培養したところ、エリシター無添加のも
のに比べて２８倍のタキソールの生産を認めた（特開平
８−７０８８０号公報）。しかしながら、これまでに報
告された方法では、希薄なカルス濃度であるため経済的
でなかったり、また細胞外にタキソールを排出する連続
培養法ではカルス量に比し、あまりに多量の培地を必要
とするため、経済的でなかったり、あるいは国内で入手
しがたい植物のカルスを使用する等、実際的でない。ま
た、寒天培地でタキソールをよく生産しても、液体培地
での生産性が低いため工業的でない等の欠点を有してい
る。
エリシターとしてキトオリゴ糖１〜９量体を作用させて
ＭＳ寒天培地で培養したところ、エリシター無添加のも
のに比べて２８倍のタキソールの生産を認めた（特開平
８−７０８８０号公報）。しかしながら、これまでに報
告された方法では、希薄なカルス濃度であるため経済的
でなかったり、また細胞外にタキソールを排出する連続
培養法ではカルス量に比し、あまりに多量の培地を必要
とするため、経済的でなかったり、あるいは国内で入手
しがたい植物のカルスを使用する等、実際的でない。ま
た、寒天培地でタキソールをよく生産しても、液体培地
での生産性が低いため工業的でない等の欠点を有してい
る。
【０００８】さらに、培養法によるタキソールの工業生
産には、まだ多くの問題が残されている。カルスの褐変
死の問題、またイチイ科樹木は木本植物であるためカル
スの増殖が遅いこと、さらに寒天培地では一般にエリシ
ターの効果が高く現れ、実際に工業的に行う液体培地で
は効果が低く現れ、タキソールの生産量が少ないという
ことが挙げられる。また細胞の寿命は、６ヶ月程度まで
と言われ、常に新鮮な植物体をある程度の量補給しなけ
ればならないという問題もある。
産には、まだ多くの問題が残されている。カルスの褐変
死の問題、またイチイ科樹木は木本植物であるためカル
スの増殖が遅いこと、さらに寒天培地では一般にエリシ
ターの効果が高く現れ、実際に工業的に行う液体培地で
は効果が低く現れ、タキソールの生産量が少ないという
ことが挙げられる。また細胞の寿命は、６ヶ月程度まで
と言われ、常に新鮮な植物体をある程度の量補給しなけ
ればならないという問題もある。
【０００９】エリシターは一般に同じ科に属する植物で
も、種類が異なるとその効果の程度は一様ではない。あ
る特定成分が微量しか含まれない植物のカルスの方が、
高含量植物のカルスよりも１種の一定量のエリシターに
よって、はるかに高収率で特定成分を生産するといった
ことも見られる。また、同じ種類のイチイでもタキソー
ル及び類縁体の含量や割合に関して木によってかなりの
個体差が見られる。その個体差は遺伝によるもののみな
らず、環境の影響もあるといわれるなど、複雑な面をも
っている。これらの問題を解決して培養法による一層の
生産性の向上が望まれる。
も、種類が異なるとその効果の程度は一様ではない。あ
る特定成分が微量しか含まれない植物のカルスの方が、
高含量植物のカルスよりも１種の一定量のエリシターに
よって、はるかに高収率で特定成分を生産するといった
ことも見られる。また、同じ種類のイチイでもタキソー
ル及び類縁体の含量や割合に関して木によってかなりの
個体差が見られる。その個体差は遺伝によるもののみな
らず、環境の影響もあるといわれるなど、複雑な面をも
っている。これらの問題を解決して培養法による一層の
生産性の向上が望まれる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タキ
ソールを含有する植物体から誘導されるカルス又は細胞
の培養によって、従来の方法より格段に優れたタキソー
ルの培養生産方法を提供することにある。
ソールを含有する植物体から誘導されるカルス又は細胞
の培養によって、従来の方法より格段に優れたタキソー
ルの培養生産方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行ったところ、日本産イチイの
１種であるキャラボクのカルスの組織培養、特に液体培
養（細胞懸濁培養）において、キトオリゴ糖の７量体、
すなわち、キトヘプタオースがタキソール生産のエリシ
ターとして、特に優れた能力を有することを見出し、本
発明を完成させた。
を解決すべく鋭意研究を行ったところ、日本産イチイの
１種であるキャラボクのカルスの組織培養、特に液体培
養（細胞懸濁培養）において、キトオリゴ糖の７量体、
すなわち、キトヘプタオースがタキソール生産のエリシ
ターとして、特に優れた能力を有することを見出し、本
発明を完成させた。
【００１２】即ち、本発明の要旨は、（１） タキソー
ル含有植物体から誘導されるカルス又は細胞の培養によ
るタキソールの生産方法において、キトヘプタオースを
用いることを特徴とするタキソールの培養生産方法、
（２） タキソール含有植物体がキャラボク、キミノオ
ンコ又はイチイ科植物であることを特徴とする前記
（１）記載の培養生産法、（３） 該培養が細胞懸濁培
養であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の
培養生産方法、並びに（４） 該細胞懸濁培養がＦ４Ｇ
４培地中で行われることを特徴とする前記（３）記載の
培養生産方法、に関する。
ル含有植物体から誘導されるカルス又は細胞の培養によ
るタキソールの生産方法において、キトヘプタオースを
用いることを特徴とするタキソールの培養生産方法、
（２） タキソール含有植物体がキャラボク、キミノオ
ンコ又はイチイ科植物であることを特徴とする前記
（１）記載の培養生産法、（３） 該培養が細胞懸濁培
養であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の
培養生産方法、並びに（４） 該細胞懸濁培養がＦ４Ｇ
４培地中で行われることを特徴とする前記（３）記載の
培養生産方法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の培養生産方法とは、タキ
ソールを含有する植物体から誘導したカルス又はその細
胞を培養し、得られたカルス又は細胞からタキソールを
抽出することによりタキソールを得る方法である。な
お、本発明における新鮮カルスとは、新鮮葉、茎、種子
の胚乳から新たに培養発生させたカルスのことをいう。
ソールを含有する植物体から誘導したカルス又はその細
胞を培養し、得られたカルス又は細胞からタキソールを
抽出することによりタキソールを得る方法である。な
お、本発明における新鮮カルスとは、新鮮葉、茎、種子
の胚乳から新たに培養発生させたカルスのことをいう。
【００１４】本発明において植物体からカルスを誘導す
る方法は特に限定されるものではなく、一般的な方法で
よい。具体的には、培地としてはムラシゲ−スクーグ
（Murashige-Skoog ）培地（以下、ＭＳ培地と略記す
る）、ガンボルグのＢ５培地（Gamborg,O.L. and Watte
r,L.R.,Plant Tissue Culture Methods,National Resea
rch of Canada,Saskatoon, 1975 ）、シェンク−ヒルデ
ブラント（Schenk-Hildebrandt) 培地（ＳＨ培地と略記
する）、Ｆ４Ｇ４培地等が挙げられる。これらの培地の
組成を表１及び表２に示す。
る方法は特に限定されるものではなく、一般的な方法で
よい。具体的には、培地としてはムラシゲ−スクーグ
（Murashige-Skoog ）培地（以下、ＭＳ培地と略記す
る）、ガンボルグのＢ５培地（Gamborg,O.L. and Watte
r,L.R.,Plant Tissue Culture Methods,National Resea
rch of Canada,Saskatoon, 1975 ）、シェンク−ヒルデ
ブラント（Schenk-Hildebrandt) 培地（ＳＨ培地と略記
する）、Ｆ４Ｇ４培地等が挙げられる。これらの培地の
組成を表１及び表２に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】また、この培地に添加する、カルスの誘導
に用いる植物成長調節物質としては２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸、カイネチンが挙げられる。培地中の植物
成長調節物質の濃度は、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸及びカイネチンを併用した場合、それぞれ０．５〜２
０．０ｍｇ／Ｌ、０．００５〜１．０ｍｇ／Ｌの範囲が
好ましく、１．０〜１０．０ｍｇ／Ｌ、０．０１〜０．
１ｍｇ／Ｌの範囲が特に好ましい。誘導の際の温度は室
温でよい。上述の培地を用いて、１か月程度毎に継代す
ることによりカルスを増殖させることができる。寒天培
地による継代培養ではＭＳ培地、Ｂ５培地が適してい
る。
に用いる植物成長調節物質としては２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸、カイネチンが挙げられる。培地中の植物
成長調節物質の濃度は、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸及びカイネチンを併用した場合、それぞれ０．５〜２
０．０ｍｇ／Ｌ、０．００５〜１．０ｍｇ／Ｌの範囲が
好ましく、１．０〜１０．０ｍｇ／Ｌ、０．０１〜０．
１ｍｇ／Ｌの範囲が特に好ましい。誘導の際の温度は室
温でよい。上述の培地を用いて、１か月程度毎に継代す
ることによりカルスを増殖させることができる。寒天培
地による継代培養ではＭＳ培地、Ｂ５培地が適してい
る。
【００１８】本発明に用いる植物体は、タキソールを含
有するものであれば特に限定されるものではない。具体
的には、キャラボク、キミノオンコ、又はイチイ科植物
が挙げられる。イチイ科植物としては、日本イチイ（ta
xus cuspidata)、太平洋イチイ（taxus breviforia) 、
ヨーロッパイチイ（taxus baccata)、カナダイチイ（ta
xus canadensis) 等が挙げられる。また、タキソール含
有植物体として、その他にもタクスス・メディア（taxu
s media ）、 タクスス・スマトラーナ（taxussumatrana
）等がある。
有するものであれば特に限定されるものではない。具体
的には、キャラボク、キミノオンコ、又はイチイ科植物
が挙げられる。イチイ科植物としては、日本イチイ（ta
xus cuspidata)、太平洋イチイ（taxus breviforia) 、
ヨーロッパイチイ（taxus baccata)、カナダイチイ（ta
xus canadensis) 等が挙げられる。また、タキソール含
有植物体として、その他にもタクスス・メディア（taxu
s media ）、 タクスス・スマトラーナ（taxussumatrana
）等がある。
【００１９】上記のようにして得られるカルスに、エリ
シター又は植物ホルモンをさらに添加して培養すること
により、より多量のタキソールを得ることができる。ま
た、エリシター又は植物ホルモンは、カルスに直接添加
してもよく、培地に添加してもよい。
シター又は植物ホルモンをさらに添加して培養すること
により、より多量のタキソールを得ることができる。ま
た、エリシター又は植物ホルモンは、カルスに直接添加
してもよく、培地に添加してもよい。
【００２０】ここでいうエリシターとは、従来微量にし
か得られなかった化合物を量産させる性質を持つ物質で
ある。本発明においては、キトオリゴ糖、中でもキトヘ
プタオースをエリシターとして使用することに特徴があ
る。キトヘプタオースとは、７個のグルコサミンがβ１
−４結合してなるオリゴマーのことである。
か得られなかった化合物を量産させる性質を持つ物質で
ある。本発明においては、キトオリゴ糖、中でもキトヘ
プタオースをエリシターとして使用することに特徴があ
る。キトヘプタオースとは、７個のグルコサミンがβ１
−４結合してなるオリゴマーのことである。
【００２１】このキトヘプタオースの調製方法は特に限
定されるものではなく、例えば、キトサン酢酸塩溶液を
キトサナーゼを用いて水解（参照：坂井和雄、南条文
雄、碓氷泰市：”キチン、キトサンオリゴ糖の生産と利
用”澱粉化学、３７、７９（１９９０））した後、得ら
れる生成物（キトオリゴ糖の１量体〜９量体の混合物）
をＨＰＬＣ等を用いて分画し、キトヘプタオースのみを
含む画分を採取することにより調製することができる。
定されるものではなく、例えば、キトサン酢酸塩溶液を
キトサナーゼを用いて水解（参照：坂井和雄、南条文
雄、碓氷泰市：”キチン、キトサンオリゴ糖の生産と利
用”澱粉化学、３７、７９（１９９０））した後、得ら
れる生成物（キトオリゴ糖の１量体〜９量体の混合物）
をＨＰＬＣ等を用いて分画し、キトヘプタオースのみを
含む画分を採取することにより調製することができる。
【００２２】キトヘプタオースのカルス又は培地への添
加量は、新鮮カルス１ｇ当たり０．２５〜２０ｍｇであ
り、０．５〜５ｍｇが好ましく、１〜２ｍｇが特に好ま
しい。
加量は、新鮮カルス１ｇ当たり０．２５〜２０ｍｇであ
り、０．５〜５ｍｇが好ましく、１〜２ｍｇが特に好ま
しい。
【００２３】本発明の方法である細胞懸濁培養によりタ
キソールを生産する場合には、まず細かな細胞を調製す
るため前培養（液体培養）を行い、ついでこれを接種し
て本培養を行うことが便宜である。カルスが柔らかく、
カルスを直接本培養しても容易に細胞懸濁液が得られる
場合は、前培養は必ずしも必要ではない。例えば、上記
のようにして得られたカルスを液体培地、例えばＦ４Ｇ
４培地に入れ、暗所にて約１２０ｒｐｍで穏やかに攪拌
しながら２５℃で約１週間培養した後、得られた細胞懸
濁液を約１ｍｍのナイロンメッシュで濾過して塊を除
き、ついで濾液をブフナーロートを通して細胞と培地に
分ける。こうして細かな細胞を得る。ついで、この微細
な細胞を一定量とり、液体培地、例えばＦ４Ｇ４培地に
入れ、暗所、２５℃にて約１２０ｒｐｍで振盪培養、す
なわち本培養を行う。
キソールを生産する場合には、まず細かな細胞を調製す
るため前培養（液体培養）を行い、ついでこれを接種し
て本培養を行うことが便宜である。カルスが柔らかく、
カルスを直接本培養しても容易に細胞懸濁液が得られる
場合は、前培養は必ずしも必要ではない。例えば、上記
のようにして得られたカルスを液体培地、例えばＦ４Ｇ
４培地に入れ、暗所にて約１２０ｒｐｍで穏やかに攪拌
しながら２５℃で約１週間培養した後、得られた細胞懸
濁液を約１ｍｍのナイロンメッシュで濾過して塊を除
き、ついで濾液をブフナーロートを通して細胞と培地に
分ける。こうして細かな細胞を得る。ついで、この微細
な細胞を一定量とり、液体培地、例えばＦ４Ｇ４培地に
入れ、暗所、２５℃にて約１２０ｒｐｍで振盪培養、す
なわち本培養を行う。
【００２４】タキソールを生産するための本発明の生産
方法においては、上述の培地、好ましくはＦ４Ｇ４培地
を用い、本培養の５日〜７日目にキトヘプタオース水溶
液を添加しさらに培養を続ける。本培養は細胞量の最も
増加した点で終了する。通常、１５〜３０日間程度であ
る。エリシターとして添加するキトヘプタオースの量
は、培地１リットルに対して０．２〜２０μＭ、好まし
くは２〜１０μＭである。この範囲で、培養した細胞中
のタキソールの量は最も増加する。
方法においては、上述の培地、好ましくはＦ４Ｇ４培地
を用い、本培養の５日〜７日目にキトヘプタオース水溶
液を添加しさらに培養を続ける。本培養は細胞量の最も
増加した点で終了する。通常、１５〜３０日間程度であ
る。エリシターとして添加するキトヘプタオースの量
は、培地１リットルに対して０．２〜２０μＭ、好まし
くは２〜１０μＭである。この範囲で、培養した細胞中
のタキソールの量は最も増加する。
【００２５】培養終了後、増殖した細胞よりタキソール
を抽出し、その量を定量する。増殖した細胞に含まれる
タキソールは、例えば、次のようにして得ることができ
る。培養終了後の細胞を凍結乾燥し、メタノール：水
（１：１、ｖ／ｖ）を溶媒として室温で抽出を行う。抽
出液を減圧濃縮し、得られた抽出物をジクロロメタン：
水（１：１、ｖ／ｖ）を用いてさらに抽出操作を行い、
ジクロロメタン可溶部を得る。得られたジクロロメタン
可溶部を常法によりクロマトグラフィーに付すことによ
り、タキソールの純品を得ることができる。
を抽出し、その量を定量する。増殖した細胞に含まれる
タキソールは、例えば、次のようにして得ることができ
る。培養終了後の細胞を凍結乾燥し、メタノール：水
（１：１、ｖ／ｖ）を溶媒として室温で抽出を行う。抽
出液を減圧濃縮し、得られた抽出物をジクロロメタン：
水（１：１、ｖ／ｖ）を用いてさらに抽出操作を行い、
ジクロロメタン可溶部を得る。得られたジクロロメタン
可溶部を常法によりクロマトグラフィーに付すことによ
り、タキソールの純品を得ることができる。
【００２６】本発明の細胞懸濁培養法によりキトヘプタ
オース（３．５７μＭ／Ｌ）をエリシターとしてタキソ
ールを生産すると、キトヘプタオースを添加しない場合
に比べて５．６倍のタキソールを生産した（実施例
２）。液体培養において現在までに最も有効とされてき
たジャスモン酸メチルの場合は、ジャスモン酸メチルを
１００μＭ／Ｌ添加すると、無添加の場合の２倍量のタ
キソールを生産した（比較例１）ので、本発明に用いら
れるキトヘプタオースは、ジャスモン酸メチルの１／２
８の濃度でジャスモン酸メチルの場合の２．８倍の量の
タキソールを生成させることから、現在最も有効なエリ
シターといえる。
オース（３．５７μＭ／Ｌ）をエリシターとしてタキソ
ールを生産すると、キトヘプタオースを添加しない場合
に比べて５．６倍のタキソールを生産した（実施例
２）。液体培養において現在までに最も有効とされてき
たジャスモン酸メチルの場合は、ジャスモン酸メチルを
１００μＭ／Ｌ添加すると、無添加の場合の２倍量のタ
キソールを生産した（比較例１）ので、本発明に用いら
れるキトヘプタオースは、ジャスモン酸メチルの１／２
８の濃度でジャスモン酸メチルの場合の２．８倍の量の
タキソールを生成させることから、現在最も有効なエリ
シターといえる。
【００２７】
【実施例】以下、製造例、実施例、対照例及び比較例に
より本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら
の実施例等によりなんら限定されるものではない。
より本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら
の実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００２８】製造例１ キャラボクの茎又は葉の切片を常法により無菌化し、
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（４．０ｍｇ／Ｌ培
地）、カイネチン（０．５ｍｇ／Ｌ培地）、カザミノ酸
（１．０ｇ／Ｌ培地）、および褐変防止剤としてポリビ
ニルピロリドン（１．５ｇ／Ｌ培地）を添加したＢ５培
地（以下、増殖用培地と略記する）に植えつけ、２５
℃、暗所でカルスを誘導した。得られたカルスは増殖用
培地上で１ヶ月毎に継代して暗所で増殖させた。
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（４．０ｍｇ／Ｌ培
地）、カイネチン（０．５ｍｇ／Ｌ培地）、カザミノ酸
（１．０ｇ／Ｌ培地）、および褐変防止剤としてポリビ
ニルピロリドン（１．５ｇ／Ｌ培地）を添加したＢ５培
地（以下、増殖用培地と略記する）に植えつけ、２５
℃、暗所でカルスを誘導した。得られたカルスは増殖用
培地上で１ヶ月毎に継代して暗所で増殖させた。
【００２９】実施例１（カルスの寒天培養に対するキト
ヘプタオースの効果） 製造例１で得られたカルス３０ｇを増殖用培地（２０ｍ
Ｌ×１０シャーレ）に植え継ぎ、途中で継代操作するこ
となくカルスの培養を１５日間行った。植え継ぎ時に、
エリシターとしてキトヘプタオース水溶液（５ｍｇ／ｍ
Ｌ／１ｇ新鮮カルス）を、製造例１で得られた細胞１ｇ
あたり１ｍＬ、シリンジを用いて細胞に直接添加した。
対照用にエリシターを添加しないものを用意した。
ヘプタオースの効果） 製造例１で得られたカルス３０ｇを増殖用培地（２０ｍ
Ｌ×１０シャーレ）に植え継ぎ、途中で継代操作するこ
となくカルスの培養を１５日間行った。植え継ぎ時に、
エリシターとしてキトヘプタオース水溶液（５ｍｇ／ｍ
Ｌ／１ｇ新鮮カルス）を、製造例１で得られた細胞１ｇ
あたり１ｍＬ、シリンジを用いて細胞に直接添加した。
対照用にエリシターを添加しないものを用意した。
【００３０】ここで用いるキトヘプタオースは、市販品
の試薬キトヘプタオース（和光純薬社製）、または常法
（Yuji Kikkawa, Tosinori Kawada, Ikuko Furukawa an
d Tomoyasu Sakuno, J.FAC.AGRIC.TOTTORI UNIV., 26,9
(1990)）に従って得たものをイオン交換樹脂 Dowex 50W
-X8 Ｈ* form (100-200 mesh) で分画後中和して得たキ
トヘプタオースを用いる。
の試薬キトヘプタオース（和光純薬社製）、または常法
（Yuji Kikkawa, Tosinori Kawada, Ikuko Furukawa an
d Tomoyasu Sakuno, J.FAC.AGRIC.TOTTORI UNIV., 26,9
(1990)）に従って得たものをイオン交換樹脂 Dowex 50W
-X8 Ｈ* form (100-200 mesh) で分画後中和して得たキ
トヘプタオースを用いる。
【００３１】タキソールの定量法を以下に示す。培養終
了後の細胞を凍結乾燥し、メタノール：水（１：１、ｖ
／ｖ）を溶媒として室温で４２時間抽出操作を行った。
抽出液を減圧濃縮し、得られた抽出物をジクロロメタ
ン：水（１：１、ｖ／ｖ）を用いてさらに抽出操作を行
い、ジクロロメタン可溶部を得た。得られたジクロロメ
タン可溶部の一部をＨＰＬＣにより分析した。あらかじ
め求めておいたタキソールの検量線より生成したタキソ
ールの量を算出した。
了後の細胞を凍結乾燥し、メタノール：水（１：１、ｖ
／ｖ）を溶媒として室温で４２時間抽出操作を行った。
抽出液を減圧濃縮し、得られた抽出物をジクロロメタ
ン：水（１：１、ｖ／ｖ）を用いてさらに抽出操作を行
い、ジクロロメタン可溶部を得た。得られたジクロロメ
タン可溶部の一部をＨＰＬＣにより分析した。あらかじ
め求めておいたタキソールの検量線より生成したタキソ
ールの量を算出した。
【００３２】ＨＰＬＣの分析条件は次のとおりである。 カラム：SUPELCOSILTM-LC-F, UV227nm, 流速１．５ｍＬ
／ｍｉｎ、圧力１９０ｋｇ／ｃｍ2 、 溶離液：アセトニトリル：ＴＨＦ：水＝１７：２８：５
５
／ｍｉｎ、圧力１９０ｋｇ／ｃｍ2 、 溶離液：アセトニトリル：ＴＨＦ：水＝１７：２８：５
５
【００３３】分析の結果、キトヘプタオースを添加した
場合のタキソール生産量は乾燥細胞当たり０．７２％
（乾燥細胞重量３．０ｇに対し２１．６ｍｇ）であっ
た。これはエリシター無添加の場合（以下の対照例１）
の８倍の産生量である。
場合のタキソール生産量は乾燥細胞当たり０．７２％
（乾燥細胞重量３．０ｇに対し２１．６ｍｇ）であっ
た。これはエリシター無添加の場合（以下の対照例１）
の８倍の産生量である。
【００３４】さらに、ジクロロメタン可溶部を精製し、
タキソールの結晶を得た。即ち、得られたジクロロメタ
ン可溶部を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液ＣＨＣｌ
3 ：ＭｅＯＨ＝９：１）にかけた。次いで、クロロホル
ム／メタノールの勾配溶剤系を用いてシリカゲルカラム
からタキソールを含むフラクションを得た。このフラク
ションを分取ＴＬＣ（クロロホルム：水＝１０：１(v/
v))にかけ、無色結晶のタキソールを得た。
タキソールの結晶を得た。即ち、得られたジクロロメタ
ン可溶部を濃縮し、シリカゲルカラム（溶離液ＣＨＣｌ
3 ：ＭｅＯＨ＝９：１）にかけた。次いで、クロロホル
ム／メタノールの勾配溶剤系を用いてシリカゲルカラム
からタキソールを含むフラクションを得た。このフラク
ションを分取ＴＬＣ（クロロホルム：水＝１０：１(v/
v))にかけ、無色結晶のタキソールを得た。
【００３５】上記の方法で得られた無色結晶の物性値は
以下のとおりである。 融点：２１３〜２１５℃ ＵＶλmax ｎｍ（ｌｏｇε）：２２７（４．４７） ２７３（３．２３） ＦＤ−Ｍｓ ｍ／ｚ：８５４（Ｍ+ ＋Ｈ） ８５３（Ｍ+ ） ５６８ ２１０（１００％） １０５ ４３ ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ） ν（ｃｍ-1）：３３００−３５００、１７３０、１７１０、１６５０ 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ） δ（ｐｐｍ）：１．１４（ｓ，３Ｈ） １．２２（ｓ，３Ｈ） １．６７（ｓ，３Ｈ） ２．２０（ｓ，３Ｈ） １．８０（ｓ，３Ｈ） ２．３６（ｓ，３Ｈ） ３．８０（ｄ，Ｈ） ４．２４（ｓ，２Ｈ） ４．９２（ｄ，Ｈ） ５．６８（ｄ，Ｈ） ６．２０（ｔ，Ｈ） ６．２８（ｓ，Ｈ）
以下のとおりである。 融点：２１３〜２１５℃ ＵＶλmax ｎｍ（ｌｏｇε）：２２７（４．４７） ２７３（３．２３） ＦＤ−Ｍｓ ｍ／ｚ：８５４（Ｍ+ ＋Ｈ） ８５３（Ｍ+ ） ５６８ ２１０（１００％） １０５ ４３ ＩＲ（Ｎｕｊｏｌ） ν（ｃｍ-1）：３３００−３５００、１７３０、１７１０、１６５０ 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ） δ（ｐｐｍ）：１．１４（ｓ，３Ｈ） １．２２（ｓ，３Ｈ） １．６７（ｓ，３Ｈ） ２．２０（ｓ，３Ｈ） １．８０（ｓ，３Ｈ） ２．３６（ｓ，３Ｈ） ３．８０（ｄ，Ｈ） ４．２４（ｓ，２Ｈ） ４．９２（ｄ，Ｈ） ５．６８（ｄ，Ｈ） ６．２０（ｔ，Ｈ） ６．２８（ｓ，Ｈ）
【００３６】対照例１ キトヘプタオース水溶液の代わりに１ｍＬ／１ｇ新鮮カ
ルスの水を添加した以外は、実施例と同様の操作を行っ
た。この細胞を１５日間培養し、細胞に含まれるタキソ
ール量を定量すると、乾燥細胞当たり０．０９０％であ
った。
ルスの水を添加した以外は、実施例と同様の操作を行っ
た。この細胞を１５日間培養し、細胞に含まれるタキソ
ール量を定量すると、乾燥細胞当たり０．０９０％であ
った。
【００３７】比較例１ 製造例１で得られたカルス３０ｇを増殖用培地（２０ｍ
Ｌ×１０シャーレ）に植え継ぎ、途中で継代操作するこ
となくカルスの培養を１５日間行った。植え継ぎ時に、
エリシターとしてキトヘプタオース水溶液（５ｍｇ／ｍ
Ｌ／１ｇ新鮮カルス）を、製造例１で得られた細胞１ｇ
あたり１ｍＬ、シリンジを用いて細胞に直接添加した。
対照用にエリシターを添加しないものを用意した。
Ｌ×１０シャーレ）に植え継ぎ、途中で継代操作するこ
となくカルスの培養を１５日間行った。植え継ぎ時に、
エリシターとしてキトヘプタオース水溶液（５ｍｇ／ｍ
Ｌ／１ｇ新鮮カルス）を、製造例１で得られた細胞１ｇ
あたり１ｍＬ、シリンジを用いて細胞に直接添加した。
対照用にエリシターを添加しないものを用意した。
【００３８】ここで用いるエリシターは、キトサンの酵
素加水分解物、市販品の試薬グルコサミン、キトビオー
ス、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオ
ース、キトヘキサオース、キトヘプタオース（和光純薬
社製）を用いた。細胞に含まれるタキソール量を実施例
１と同様に定量した。その結果、対照のカルスのタキソ
ール含量を１とした場合、加水分解物、グルコサミン、
キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キ
トペンタオース、キトヘキサオース又はキトヘプタオー
スをそれぞれ添加したカルスのタキソール含量は、それ
ぞれ５．２倍、１．３倍、１．５倍、２．３倍、１．９
倍、４．８倍、３．９倍及び８．２倍であった。
素加水分解物、市販品の試薬グルコサミン、キトビオー
ス、キトトリオース、キトテトラオース、キトペンタオ
ース、キトヘキサオース、キトヘプタオース（和光純薬
社製）を用いた。細胞に含まれるタキソール量を実施例
１と同様に定量した。その結果、対照のカルスのタキソ
ール含量を１とした場合、加水分解物、グルコサミン、
キトビオース、キトトリオース、キトテトラオース、キ
トペンタオース、キトヘキサオース又はキトヘプタオー
スをそれぞれ添加したカルスのタキソール含量は、それ
ぞれ５．２倍、１．３倍、１．５倍、２．３倍、１．９
倍、４．８倍、３．９倍及び８．２倍であった。
【００３９】実施例２（細胞懸濁培養に対するキトヘプ
タオースの効果） ＜前培養＞製造例１で得られた新鮮カルス１０ｇを増殖
用培地で１ヶ月間継代培養を行い、約５０ｇの増殖した
細胞を得た。この状態では硬い細胞塊が多く、液体培養
に適さないので、前培養を行い、細かい細胞塊を得た。
すなわち細胞を１０倍量の液体培地（Ｆ４Ｇ４培地）と
共に暗所で２５℃、１２０ｒｐｍで振盪し、１週間前培
養した。前培養を行った細胞懸濁液を約１ｍｍのナイロ
ンメッシュで濾過して塊を除き、濾液をブフナーロート
を通して細胞と培地に分けた。
タオースの効果） ＜前培養＞製造例１で得られた新鮮カルス１０ｇを増殖
用培地で１ヶ月間継代培養を行い、約５０ｇの増殖した
細胞を得た。この状態では硬い細胞塊が多く、液体培養
に適さないので、前培養を行い、細かい細胞塊を得た。
すなわち細胞を１０倍量の液体培地（Ｆ４Ｇ４培地）と
共に暗所で２５℃、１２０ｒｐｍで振盪し、１週間前培
養した。前培養を行った細胞懸濁液を約１ｍｍのナイロ
ンメッシュで濾過して塊を除き、濾液をブフナーロート
を通して細胞と培地に分けた。
【００４０】＜本培養＞前培養で得られた細胞のうち１
０ｇをとり、Ｆ４Ｇ４液体培地１００ｍＬ入りの５００
ｍＬ三角フラスコに入れ、暗所２５℃において、１２０
ｒｐｍで振盪培養を３０日間行った。キトヘプタオース
水溶液１０ｍＬ（５ｍｇ／Ｌ、３．５７μＭ）を本培養
６日目に添加して培養を続行した。培養後、細胞の量は
１．３倍に増殖していた。タキソールの抽出操作は実施
例１と同様に行った。分析の結果、培養細胞のタキソー
ル含量は０．３０％（３．０ｍｇ／ｇ乾燥細胞) であ
り、総量２．７ｍｇのタキソールが得られたことが分か
った。これは、以下に示す無添加の場合（対照例２）の
５．６倍の産生量である。
０ｇをとり、Ｆ４Ｇ４液体培地１００ｍＬ入りの５００
ｍＬ三角フラスコに入れ、暗所２５℃において、１２０
ｒｐｍで振盪培養を３０日間行った。キトヘプタオース
水溶液１０ｍＬ（５ｍｇ／Ｌ、３．５７μＭ）を本培養
６日目に添加して培養を続行した。培養後、細胞の量は
１．３倍に増殖していた。タキソールの抽出操作は実施
例１と同様に行った。分析の結果、培養細胞のタキソー
ル含量は０．３０％（３．０ｍｇ／ｇ乾燥細胞) であ
り、総量２．７ｍｇのタキソールが得られたことが分か
った。これは、以下に示す無添加の場合（対照例２）の
５．６倍の産生量である。
【００４１】対照例２ キトヘプタオース水溶液の代わりに１ｍＬ／１ｇ新鮮カ
ルスの水を添加した以外は、実施例２と同様の操作を行
った。この細胞を３０日間培養し、細胞に含まれるタキ
ソールの量を定量すると０．０５４％（０．５４ｍｇ／
ｇ乾燥細胞) であることがわかった。
ルスの水を添加した以外は、実施例２と同様の操作を行
った。この細胞を３０日間培養し、細胞に含まれるタキ
ソールの量を定量すると０．０５４％（０．５４ｍｇ／
ｇ乾燥細胞) であることがわかった。
【００４２】比較例２ 実施例２と同時に並行して行った液体培養について、本
培養６日目にキトヘプタオース５ｍｇ／Ｌに代えてキト
酸加水分解物、ジベレリンＡ3 及びＬ−フェニルアラニ
ンの各５ｍｇ／Ｌを添加して培養を継続した。後の操作
は実施例２と同様に行った。細胞懸濁培養により得られ
た細胞のタキソール含量は、対照例２で得られたタキソ
ール含量を１とした場合のそれぞれ５．３倍、１．５倍
及び１．８倍であった。
培養６日目にキトヘプタオース５ｍｇ／Ｌに代えてキト
酸加水分解物、ジベレリンＡ3 及びＬ−フェニルアラニ
ンの各５ｍｇ／Ｌを添加して培養を継続した。後の操作
は実施例２と同様に行った。細胞懸濁培養により得られ
た細胞のタキソール含量は、対照例２で得られたタキソ
ール含量を１とした場合のそれぞれ５．３倍、１．５倍
及び１．８倍であった。
【００４３】比較例３ 実施例２と同時に並行して行った液体培養について、本
培養６日目にキトヘプタオースに代えてジャスモン酸メ
チル１００μＭ（２２．４ｍｇ／Ｌ）を添加して培養を
継続した。後の操作は実施例２と同様に行った。細胞懸
濁培養により得られた細胞のタキソール含量は０．１１
％（１．１ｍｇ／ｇ乾燥細胞) であった。
培養６日目にキトヘプタオースに代えてジャスモン酸メ
チル１００μＭ（２２．４ｍｇ／Ｌ）を添加して培養を
継続した。後の操作は実施例２と同様に行った。細胞懸
濁培養により得られた細胞のタキソール含量は０．１１
％（１．１ｍｇ／ｇ乾燥細胞) であった。
【００４４】
【発明の効果】本発明の方法によれば、大量生産が困難
であったタキソールを、特に細胞懸濁培養により、従来
の方法より高収率で得ることができる。
であったタキソールを、特に細胞懸濁培養により、従来
の方法より高収率で得ることができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｆ (72)発明者 東 昌弘 和歌山県橋本市賢堂170 (72)発明者 久保田 実 大阪府河内長野市清見台３丁目14−10
Claims (4)
- 【請求項１】 タキソール含有植物体から誘導されるカ
ルス又は細胞の培養によるタキソールの生産方法におい
て、キトヘプタオースを用いることを特徴とするタキソ
ールの培養生産方法。 - 【請求項２】 タキソール含有植物体がキャラボク、キ
ミノオンコ又はイチイ科植物であることを特徴とする請
求項１記載の培養生産法。 - 【請求項３】 該培養が細胞懸濁培養であることを特徴
とする請求項１又は請求項２記載の培養生産方法。 - 【請求項４】 該細胞懸濁培養がＦ４Ｇ４培地中で行わ
れることを特徴とする請求項３記載の培養生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8217896A JPH1042888A (ja) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | タキソールの培養生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8217896A JPH1042888A (ja) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | タキソールの培養生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1042888A true JPH1042888A (ja) | 1998-02-17 |
Family
ID=16711463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8217896A Pending JPH1042888A (ja) | 1996-07-30 | 1996-07-30 | タキソールの培養生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1042888A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| US8338143B2 (en) | 1996-05-24 | 2012-12-25 | Phyton Holdings, Llc | Enhanced production of paclitaxel and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| JP2013536683A (ja) * | 2010-08-31 | 2013-09-26 | フリエスランド ブランズ ビー．ブイ． | 真核細胞のための培養培地 |
| CN103598096A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-02-26 | 大连民族学院 | 优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法 |
-
1996
- 1996-07-30 JP JP8217896A patent/JPH1042888A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| US8338143B2 (en) | 1996-05-24 | 2012-12-25 | Phyton Holdings, Llc | Enhanced production of paclitaxel and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| JP2013536683A (ja) * | 2010-08-31 | 2013-09-26 | フリエスランド ブランズ ビー．ブイ． | 真核細胞のための培養培地 |
| CN103598096A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-02-26 | 大连民族学院 | 优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法 |
| CN103598096B (zh) * | 2013-11-12 | 2015-07-08 | 大连民族学院 | 优质东北红豆杉茎段愈伤组织一步诱导方法 |
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