JP2013536683A - 真核細胞のための培養培地 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)好ましくは単一アミノ酸、特により大きいアミノ酸、例えばロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、オルニチン、リジン、シトルリン、アルギニンなどのN−アセチルアミノ酸。好ましいN−アセチルアミノ酸は、N−アセチル−メチオニン、N−アセチル−フェニルアラニンおよびN−アセチル−オルニチンである;
(b)特により大きい芳香族アミノ酸フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンのガンマ−グルタミルアミノ酸。ガンマ−グルタミル誘導体は、γ−カルボキシル基によって他のアミノ酸に結合している。好ましいγ−グルタミルアミノ酸は、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニンである;
(c)ピログルタミルアミノ酸、例えばピログルタミル−グルタミンおよびピログルタミル−グリシン。ピログルタミル基は、グルタミル基であり(ここで、α−アミノ基は、γ−カルボキシル基と縮合して、環状基を形成する)、したがって、ピログルタミル基は、5−オキソピロリジン−2−イルカルボニルアミノ基である;
(d)グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、例えばバリニル(valinyl)−グルタメートおよびグリシルプロリン;環状ジペプチド、例えばシクロ−(グリシル−グルタメート)も含まれる;
(e)オキソ−アミノ酸、例えば5−オキソプロリンおよびS−オキソ−メチオニン(メチオニンスルホキシド);
(f)ホモ−アミノ酸(ここで、「ホモ」は、標準のアミノ酸(遺伝コードの翻訳によって直接的に得られる20種のアミノ酸の1種)の主鎖における1個のメチレン基の添加を意味する)、例えばβ−アラニン、ホモセリン、および2−アミノ−ブチラート(「ホモ−アラニン」)
を含む。
Morris and Thompson,(1962)Biochemistry 1(4):706−709の方法に従った:黄ダイズ(25kg)を、粉末化し、70%エタノールで室温で徹底的に抽出した。抽出物を5℃まで冷却し、本温度で数日間放置した後、清澄な上清を、Dowex 50カラム(水素型、5℃)に通した。抽出前にマメを脱脂しなかったので、樹脂カラム上にかなりの材料の沈殿があった。本材料は、アルコールまたは水洗浄によって除去せず、溶出中に2Nアンモニアで再溶解した。
Sato他,Journal of Agricultural and Food chemistry 46(9):3403−3405.(1998)およびHigaki−Sato他 Journal of Agricultural and Food chemistry 51:8−13(2003)の方法に従った:
N末端ブロックペプチドの単離:AG50WX8強力な陽イオン交換体(Bio−Rad、Hercules、CA)を、ミニスピンカラム(10×5mm、i.d.、AB−1150、Atto、Tokyo、Japan)に充填した。50%メタノールおよび蒸留水で連続的に予洗したカラムを、10mMのギ酸で平衡化した。ペプチド試料(50μg/100μL)を、ミニスピンカラムに適用した。N末端ブロックペプチドを、10mMのギ酸(100mL×3回)で溶出した。
Leone−Bay,Journal of Medicinal chemistry 38:4263−4269(1995)の手順に従って、本明細書で記載したアシル化アミノ酸を調製した。N−シクロヘキサノイルフェニルグリシンの調製を、代表例として示す。フェニルグリシン(50.0g、331mmol)を、撹拌しながら、オープンフラスコにおける水酸化ナトリウム水溶液(414mL、2N)に溶解した。生じた溶液を、氷水浴において約10〜15℃まで冷却し、反応温度を約10〜15℃で維持しながら、シクロヘキサンカルボニルクロリド(44.2mL、331mmol)を、滴下添加した。添加が完了した後、反応溶液を、室温で2.5時間撹拌した。反応混合物のpHを、塩酸水溶液(37%)で9.5に調整し、未反応のフェニルグリシンを、白色固体として分離し、ろ過によって除去した。次いで、ろ液のpHを、さらに4.5に低下させ、粗N−シクロヘキサノイルフェニルグリシンを、溶液から沈殿させた。この固体を、ろ過によって除去し、メタノールから再結晶させて、N−シクロヘキサノイル−フェニルグリシンを得た。
商業的な植物タンパク質加水分解物、例えばFrieslandCampina Domo、USAから得られるSE50MAF−UF、WGE80M−UF、CNE80M−UF、PCE80Bを、エレクトロスプレーイオン化(ESI)供給源および線形イオントラップ(LIT)質量分析器からなるWaters Acquity UPLCおよびThermo−Finnigan LTQ質量分析計を使用して、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS、LC/MS2)によって分析した。試料抽出物を、2つのアリコートに分け、乾燥させ、次いで酸性または塩基性LC適合性溶媒中で元に戻した。別々の専用のカラムを使用した2つの独立的な注入において、1つのアリコートを、酸性陽イオン最適化条件を使用して、他方を、塩基性陰イオン最適化条件を使用して、分析した。酸性条件において元に戻した抽出物を、どちらも0.1%ギ酸を含有する水およびメタノールを使用して、他方、塩基性抽出物も、6.5mM重炭酸アンモニウムを含有する水/メタノールを使用して、勾配溶出した。MS分析は、ダイナミックイクスクルージョン(dynamic exclusion)を使用して、MSとデータ依存MS2スキャンを交互に行った。生化学的物質を、精製された標準または反復性の未知の実体(recurrent unknown entity)のメタボロミクスライブラリー登録との比較によって同定した。クロマトグラフィーの特性および質量スペクトルの組合せは、特定の化合物または同重体実体(isobaric entity)への適合の指標を示す。したがって、植物タンパク質加水分解物において存在する生化学的構成要素の概要およびそれらの相対濃度が、作成された。
細胞培養アッセイを、商業的に入手可能なIS CHO−CD培地(Irvine Scientific、Cat.No.91119)において行った。本培地に、L−グルタミン(2mM)、プルロニック酸、ヒポキサンチン(100μM)およびチミジン(15μM)を添加した。ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加して、増殖アッセイ中のあらゆる細菌増殖を防いだ。培地に、すべてSigma Aldrich、Germanyから購入した、β−アラニン、γ−グルタミルシステイン、グリシル−グリシン、L−ホモセリンまたはN−アセチルメチオニンを、異なる濃度(1×10−5から1×10−1%(w/v)、表2参照)で補充した。補充した培地を、ボルテックスミキサーで混合し、0.22μmフィルターを使用してろ過し、その後、増殖アッセイにおいて使用した。
細胞系
IgGを発現するCHO細胞系を使用した(CHO−2:ATCC CRL 11397、IgG4を産生)。細胞系を、接着条件において数継代の間、増殖させ、いったんコンフルエントになると、それらを、例5において記載した補充した培地における無動物条件に移した。
増殖および産生曲線を測定するために、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、バッフルドフラスコ(baffled flask)における懸濁培養において増殖させた。20×106個の細胞を、25mlの培地においてバッフルドフラスコに移した。添加されたアミノ酸誘導体を有するおよび有さない化学的に定義された培地を、試験した。新鮮な培地を、増殖アッセイ中に添加しなかった。細胞を、CEDEX HiRes細胞計数器(Innovatis、Germany)を使用して、計数した。細胞計数を使用して、増殖曲線下面積を計算し、Ling,C.X,Huang,J.and Zhang,H.(2003),International joint conferences on artificial intelligence,pp.329−341において詳細に報告されているように、無次元の曲線下面積(AUC)値として表した。上清試料を、IgG産生測定のために1日おきに採取した。IgG産生を、サンドイッチELISA法を使用して、測定した。特定のIgG産生を、累積のIgG産生(mg/mlで)対増殖アッセイの11日目に測定されたAUCの比をとることによって計算した。細胞を、位相差顕微鏡(Zeiss Axiovert 25、倍率400倍)を使用して、視覚的に検査した。細胞の外観は、アミノ酸誘導体の十分なレベルが培地において存在した場合、著しく改善された。単一の細胞のみが観察され、細胞の凝集は見られなかった。細胞の形も、正に影響された。細胞は、アミノ酸誘導体の十分なレベルを含有する培地において培養した場合、非常により円形かつ明るい外観を有した。これは、多くの細胞凝集体が、アミノ酸誘導体を有さない化学的に定義された培地において増殖したCHO細胞培養物において存在したという知見と、対照的であった。
液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)に基づく方法を使用して、加水分解物におけるアミノ酸誘導体L−ホモセリン、β−アラニン、N−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対濃度を決定した。純粋なL−ホモセリン、β−アラニン、N−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンを、Sigma−Aldrich、Germanyから得た。誘導体を、Millipore水で個々に希釈して、濃度域を得た。希釈した誘導体に関して得られたLC−MS保持域を、それぞれの構成要素の濃度に対してプロットして、検量線を得た。その後、ダイズタンパク質加水分解物(SE50MAF−UF、FrieslandCampina Domo)試料のLC−MSスペクトルにおいて同定されたピークを、個々のアミノ酸誘導体構成要素に特定のLC−MSピークと関連づけた。個々の構成要素に関する検量線を使用して、ダイズ加水分解物におけるアミノ酸誘導体L−ホモセリン、β−アラニン、N−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対量を、計算した。
液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)に基づく方法を使用して、加水分解物におけるアミノ酸誘導体L−ホモセリン、β−アラニン、N−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対濃度を決定した。純粋なL−ホモセリン、β−アラニン、N−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンを、Sigma−Aldrich、Germanyから得た。誘導体を、Millipore水で個々に希釈して、濃度域を得た。希釈した誘導体に関して得られたLC−MS保持域を、それぞれの構成要素の濃度に対してプロットして、検量線を得た。その後、ダイズタンパク質加水分解物(SE50MAF−UF、FrieslandCampina Domo)試料のLC−MSスペクトルにおいて同定されたピークを、個々のアミノ酸誘導体構成要素に特定のLC−MSピークと関連づけた。個々の構成要素に関する検量線を使用して、ダイズ加水分解物におけるアミノ酸誘導体L−ホモセリン、β−アラニン、N−アセチルメチオニン、およびグリシル−グリシンの絶対量を、計算した。
[1]
真核細胞を培養するための無血清培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および/または産生改善成分として、N−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも0.001mg/l、好ましくは少なくとも0.01mg/l、より好ましくは少なくとも0.1mg/l、最も好ましくは少なくとも1mg/lとなり、前記1種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、100gのタンパク質性の物質当たり少なくとも1g、好ましくは少なくとも10gの誘導体の濃度を有するプロセス。
[2]
前記N−アセチルアミノ酸が、N−アセチル−メチオニン、N−アセチル−フェニルアラニンおよびN−アセチル−オルニチンから選択される、[1]に記載のプロセス。
[3]
真核細胞を培養するための培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および/または産生改善成分として、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、N−アセチル−メチオニン、N−アセチル−フェニルアラニン、N−アセチル−オルニチンおよびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも0.001mg/l、好ましくは少なくとも0.01mg/l、より好ましくは少なくとも0.1mg/l、最も好ましくは少なくとも1mg/lとなり、前記1種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、100gのタンパク質性の物質当たり少なくとも1g、好ましくは少なくとも10gの誘導体の濃度を有するプロセス。
[4]
前記γ−グルタミルアミノ酸が、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニンから選択される、[1]から[3]のいずれか1に記載のプロセス。
[5]
前記ピログルタミルアミノ酸が、ピログルタミル−グルタミンおよびピログルタミル−グリシンから選択される、[1]から[4]のいずれか1に記載のプロセス。
[6]
前記グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチドが、バリニル−グルタメート、グリシルプロリンおよびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される、[1]から[5]のいずれか1に記載のプロセス。
[7]
前記オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸が、それぞれ、5−オキソプロリンおよびS−オキソ−メチオニン、ならびにβ−アラニン、2−アミノブチラートおよびホモセリンから選択される、[1]から[6]のいずれか1に記載のプロセス。
[8]
[1]〜[7]のいずれか1に記載のプロセスによって得られる細胞培養培地。
[9]
少なくとも0.001mg/l、好ましくは少なくとも0.01mg/l、より好ましくは少なくとも0.1mg/l、最も好ましくは少なくとも1mg/l、または乾燥物質1kg当たり少なくとも0.02mg、好ましくは少なくとも0.2mg、より好ましくは少なくとも2mg、さらにより好ましくは少なくとも20mg、最も好ましくは少なくとも50mgの濃度で、前記アミノ酸誘導体の1種以上を含有する、[8]に記載の細胞培養培地。
[10]
5mg/l〜30g/l、または乾燥物質1kg当たり100mg〜600g、好ましくは5mg/l〜3g/l、または乾燥物質1kg当たり100mg〜150g、より好ましくは250mg〜60gの濃度で、前記アミノ酸誘導体の1種以上を含有する、[9]に記載の細胞培養培地。
[11]
1l当たり少なくとも0.001mg、好ましくは1l当たり少なくとも0.01mg、より好ましくは1l当たり少なくとも0.1mg、さらにより好ましくは1l当たり少なくとも1mg、最も好ましくは1l当たり少なくとも5mg、または乾燥物質の1kg当たり少なくとも0.02mg、好ましくは1kg当たり少なくとも0.2mg、より好ましくは1kg当たり少なくとも2mg、さらにより好ましくは1kg当たり少なくとも20mg、最も好ましくは1kg当たり少なくとも250mgの、N−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含有する、真核細胞を培養するための培養培地。
[12]
0.01mg/l〜10g/l、好ましくは10mg/l〜10g/l、より好ましくは10mg/l〜1g/lの、N−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、およびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含む、[11]に記載の培養培地。
[13]
0.03mg/l〜30g/l、好ましくは30mg/l〜30g/l、より好ましくは30mg/l〜3g/lの、ピログルタミル−グリシン、グリシル−プロリンおよびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含む、[11]または[12]に記載の培養培地。
[14]
0.02mg/l〜20g/l、好ましくは20mg/l〜20g/l、より好ましくは20mg/l〜2g/lの、バリニルグルタメートβ−アラニン、2−アミノブチラート、オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸から選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含む、[11]から[13]のいずれか1に記載の培養培地。
[15]
ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖、抗生物質およびタンパク質加水分解物から選択される、培養培地の他の従来の構成成分をさらに含有する、[8]から[14]のいずれか1に記載の培養培地。
[16]
インビトロで真核細胞を培養する方法であって、[7]〜[14]のいずれか1に記載の培養培地において前記細胞を増殖させることを含み、前記真核細胞が、好ましくは、動物細胞、より好ましくは哺乳類および/または昆虫細胞を含む方法。
[17]
前記培養培地が、コムギ、ダイズ、ワタ、またはエンドウマメタンパク質由来の加水分解物を少なくともさらに含有する、[16]に記載の方法。
[18]
所望のタンパク質産物を作製するための方法であって、[16]または[17]に記載の方法を使用して、前記タンパク質産物を産生する真核細胞を培養すること、および前記培養培地から前記タンパク質産物を回収することを含む方法。
Claims (18)
- 真核細胞を培養するための無血清培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および/または産生改善成分として、N−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも0.001mg/l、好ましくは少なくとも0.01mg/l、より好ましくは少なくとも0.1mg/l、最も好ましくは少なくとも1mg/lとなり、前記1種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、100gのタンパク質性の物質当たり少なくとも1g、好ましくは少なくとも10gの誘導体の濃度を有するプロセス。 - 前記N−アセチルアミノ酸が、N−アセチル−メチオニン、N−アセチル−フェニルアラニンおよびN−アセチル−オルニチンから選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 真核細胞を培養するための培養培地を作製するプロセスであって、さらなる従来の培養培地成分に、増殖促進および/または産生改善成分として、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、N−アセチル−メチオニン、N−アセチル−フェニルアラニン、N−アセチル−オルニチンおよびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を添加するステップを含み、
その結果、前記培地における最終濃度が、個々のアミノ酸誘導体当たり少なくとも0.001mg/l、好ましくは少なくとも0.01mg/l、より好ましくは少なくとも0.1mg/l、最も好ましくは少なくとも1mg/lとなり、前記1種以上のアミノ酸誘導体が、純物質としてまたは濃縮物として添加され、前記濃縮物が、100gのタンパク質性の物質当たり少なくとも1g、好ましくは少なくとも10gの誘導体の濃度を有するプロセス。 - 前記γ−グルタミルアミノ酸が、γ−グルタミル−チロシンおよびγ−グルタミル−フェニルアラニンから選択される、請求項1から3のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記ピログルタミルアミノ酸が、ピログルタミル−グルタミンおよびピログルタミル−グリシンから選択される、請求項1から4のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチドが、バリニル−グルタメート、グリシルプロリンおよびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される、請求項1から5のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸が、それぞれ、5−オキソプロリンおよびS−オキソ−メチオニン、ならびにβ−アラニン、2−アミノブチラートおよびホモセリンから選択される、請求項1から6のいずれか1項に記載のプロセス。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロセスによって得られる細胞培養培地。
- 少なくとも0.001mg/l、好ましくは少なくとも0.01mg/l、より好ましくは少なくとも0.1mg/l、最も好ましくは少なくとも1mg/l、または乾燥物質1kg当たり少なくとも0.02mg、好ましくは少なくとも0.2mg、より好ましくは少なくとも2mg、さらにより好ましくは少なくとも20mg、最も好ましくは少なくとも50mgの濃度で、前記アミノ酸誘導体の1種以上を含有する、請求項8に記載の細胞培養培地。
- 5mg/l〜30g/l、または乾燥物質1kg当たり100mg〜600g、好ましくは5mg/l〜3g/l、または乾燥物質1kg当たり100mg〜150g、より好ましくは250mg〜60gの濃度で、前記アミノ酸誘導体の1種以上を含有する、請求項9に記載の細胞培養培地。
- 1l当たり少なくとも0.001mg、好ましくは1l当たり少なくとも0.01mg、より好ましくは1l当たり少なくとも0.1mg、さらにより好ましくは1l当たり少なくとも1mg、最も好ましくは1l当たり少なくとも5mg、または乾燥物質の1kg当たり少なくとも0.02mg、好ましくは1kg当たり少なくとも0.2mg、より好ましくは1kg当たり少なくとも2mg、さらにより好ましくは1kg当たり少なくとも20mg、最も好ましくは1kg当たり少なくとも250mgの、N−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、ピログルタミルアミノ酸、グルタメート含有またはプロリン含有ジペプチド、オキソ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、およびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含有する、真核細胞を培養するための培養培地。
- 0.01mg/l〜10g/l、好ましくは10mg/l〜10g/l、より好ましくは10mg/l〜1g/lの、N−アセチルアミノ酸、γ−グルタミルアミノ酸、およびシクロ−グリシル−グルタミンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項11に記載の培養培地。
- 0.03mg/l〜30g/l、好ましくは30mg/l〜30g/l、より好ましくは30mg/l〜3g/lの、ピログルタミル−グリシン、グリシル−プロリンおよびグリシル−グリシンから選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項11または12に記載の培養培地。
- 0.02mg/l〜20g/l、好ましくは20mg/l〜20g/l、より好ましくは20mg/l〜2g/lの、バリニルグルタメートβ−アラニン、2−アミノブチラート、オキソ−アミノ酸およびホモ−アミノ酸から選択される1種以上のアミノ酸誘導体を含む、請求項11から13のいずれか1項に記載の培養培地。
- ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖、抗生物質およびタンパク質加水分解物から選択される、培養培地の他の従来の構成成分をさらに含有する、請求項8から14のいずれか1項に記載の培養培地。
- インビトロで真核細胞を培養する方法であって、請求項7〜14のいずれか1項に記載の培養培地において前記細胞を増殖させることを含み、前記真核細胞が、好ましくは、動物細胞、より好ましくは哺乳類および/または昆虫細胞を含む方法。
- 前記培養培地が、コムギ、ダイズ、ワタ、またはエンドウマメタンパク質由来の加水分解物を少なくともさらに含有する、請求項16に記載の方法。
- 所望のタンパク質産物を作製するための方法であって、請求項16または17に記載の方法を使用して、前記タンパク質産物を産生する真核細胞を培養すること、および前記培養培地から前記タンパク質産物を回収することを含む方法。
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