JP2020115867A - かん流培地 - Google Patents

Abstract

【課題】優れた細胞密度、力価および生成物品質を提供するかん流培地を用いた、治療タンパク質の製造方法の提供。【解決手段】７０ｍＭ未満の総アミノ酸濃度を含むフィード培地の存在下でのかん流を介してタンパク質を産生する工程を含むタンパク質の製造方法。【選択図】図１

Description

本発明は、かん流方法における治療タンパク質を製造するために適切な培地に関する。

薬学的適用のために意図されるものなどのタンパク質は、バッチ法、フィードバッチ法またはかん流法のいずれかを使用して製造することができる。本発明は、治療タンパク質の製造のために使用されるものを含む、かん流方法に関する。

治療タンパク質を製造するためのかん流方法は、培養培地の組成、温度、代謝廃棄物の蓄積およびバイオリアクターの物理化学的パラメーターの変化に対して敏感である。不適切なまたは変動する条件は、タンパク質の翻訳後修飾、例えば、このグリコプロファイルに影響を与え、後者は薬物動態学的特性と相関することが知られている。

かん流処理は、物品のコストの改善を伴って、所定の時間内により多くの生成物の製造を可能にするので、フィード溶液処理を超えて望ましい。従って、かん流方法をサポートする適切なフィード条件を開発することの困難さを解消することが望ましい。

米国特許第７，３００，７７３号およびＥＰ１，７８１，８０２は、フィードバッチ方法を使用する融合タンパク質ＴＮＦＲ−ＩＧの製造を開示しており、ここでは、特定の濃度のアミノ酸および／または無機イオンを有するフィード培地が開示されている。

米国特許第７，３００，７７３号明細書 欧州特許第１，７８１，８０２号明細書

本発明者らは、本発明において、かん流方法において使用される培地が、栄養含量、特に、アミノ酸含量に関して、バッチまたはフィードバッチ方法における使用のために意図される培地よりも、実質的により貧栄養でなければならないことを発見した。この目的のために、栄養含量は、かん流リアクター容量中の所定の栄養の濃度として理解されるべきである。特に、本発明は、７０ｍＭ以下、好ましくは、約１５ｍＭ−約６５ｍＭの範囲にある総アミノ酸濃度を含有するフィード培地の存在下でかん流が実施されるかん流方法に関する。本発明の種々の実施形態において、総アミノ酸濃度は、約１５−２０ｍＭ；約２０−２５ｍＭ；約２５−３０ｍＭ；約３０−３５ｍＭ；約３５−４０ｍＭ；約４０−４５ｍＭ；約４５−５０ｍＭ；約５０−５５ｍＭ；約５５−６０ｍＭ；約６０−６５ｍＭ；および６５ｍＭと７０ｍＭとの間から選択される範囲にある。

本明細書で処方される総アミノ酸濃度は、米国特許第７，３００，７７３号において、フィードバッチとかん流方法の両方について推奨されたものよりも低い。比較すると、米国特許第７，３００，７７３号は、７０ｍＭよりも上である総アミノ酸濃度を必要とする。このような濃度はかん流システムにおいて利用することが可能であると当業者には理解されるという’７７３特許における主張にもかかわらず（カラム１８、５−１１行を参照のこと）、これとは反対に、本開示は、’７７３特許において処方された高い総アミノ酸濃度を満たすフィード培地を使用する治療タンパク質の製造のためのかん流方法を実施することは、実質的に減少した量の所望のタンパク質の産生をもたらすこと、従って、かん流のために意図される培地中のアミノ酸濃度は、必然的に減少されなければならず、好ましくは、総アミノ酸濃度によって実質的に減少されなければならないという本発明者らの発見に部分的に基づいている。本発明のアミノ酸濃度の制約が満たされているならば、フィード培地中で典型的に利用される様々な非アミノ酸成分（例えば、ビタミン、加水分解物など）が、本教示の技術思想および範囲から逸脱することなく、公知の様式で経験的に調整されてもよいことが当業者によって理解されるべきである。

本発明のさらなる実施形態において、生物学的タンパク質を製造するためのかん流方法は、上記に言及された総アミノ酸濃度の減少を満たすフィード培地を利用し、ここで、このフィード培地は、以下の特徴の１つ以上によってさらに特徴付けられる：グルタミン対累積アスパラギンモル濃度比が２より大きい；グルタミン対総アミノ酸濃度モル濃度比が０．２より大きい；無機イオン対総アミノ酸モル濃度比が１より大きい；ならびに単位体積あたりのグルタミンおよびアスパラギンの合わせた量が１６ｍＭ未満。これらの判断基準は、かん流反応容器中での定常状態濃度および量を示すものとして理解されるべきである。

本発明はさらに、治療タンパク質を製造するためのかん流方法における使用のためにフィード培地を適切にするために、治療タンパク質のフィードバッチ製造のために他の点では適切であるフィード培地を改変することに関し、ここで、この改変は、フィードバッチ培地の栄養の豊富さを減少させることを含み、この結果、かん流リアクター中で使用されるとき、フィード培地の総アミノ酸濃度は、フィードバッチフィード培地の総アミノ酸濃度の約４０−約９５パーセント、好ましくは約５０−７０パーセントの範囲である。好ましくは、この方法は、（ｉ）より高い栄養フィードを使用するフィードバッチ方法を用いて達成可能であるものに匹敵する製造力価、および／または（ｉｉ）このようなかん流方法がフィードバッチ方法において使用されるものと同じ培地を使用して実施されるならば、かん流リアクター中で他のやり方では生成されるアンモニアのレベルの実質的な減少のいずれかまたは両方を達成する。

本発明の１つの実施形態において、かん流方法は以下の工程を使用する：（ａ）所望の治療タンパク質を発現することが可能である細胞、およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程；（ｂ）この混合物を含有する適切な容器中で、細胞にタンパク質を産生させる工程；および（ｃ）定期的にまたは連続的に、この反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、この反応容器に新鮮な培養培地を加える工程。

本発明は、任意の治療タンパク質の製造に適用できる。この１つの実施形態において、治療タンパク質は、任意の融合タンパク質または任意の抗体から選択できる。融合タンパク質はＴＮＦＲ−Ｆｃ（ＴＮＦＲ−Ｉｇと呼ばれることもある。）融合タンパク質を含むことができる。抗体は抗ＴＮＦ抗体を含むことができる。本発明における製造のために適切なタンパク質のさらなる非限定的な例には、エタネルセプト、リツキシマブ、アダリムマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、エクリズマブおよびナタリズマブならびにそのバイオシミラーバリアントまたはバイオベターバリアントが挙げられる。本発明のかん流方法は、任意の特定の治療タンパク質に限定されないことが理解されるべきである。従って、本明細書に言及されたもの以外のタンパク質、例えば、エリスロポエチンなどが産生できる。

さらなる実施形態において、本発明は、（ａ）治療タンパク質を発現することが可能であるＣＨＯ細胞、およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）この混合物を含有する適切な容器中で、これらの細胞にこのタンパク質を産生させる工程ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、この反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、この反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含む、治療タンパク質を産生するための方法であって、ここで、この培養培地は、（ｉ）約１５−６５ｍＭの総アミノ酸濃度；ならびに適切な基本培地（例えば、ＳＦＭ４ＣＨＯ、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ、ＨｙＣｅｌｌ ＣＨＯなど）、複合的な化学的に規定されたフィード（例えば、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １）、デキサメタゾン、ＭａｎＮＡｃ、綿実加水分解物、およびＤ−（＋）−ガラクトースの少なくとも１つを含む。

本発明のかん流方法のさらなる実施形態において、工程（ａ）の前に、エタネルセプトを発現することが可能である細胞を、（ｉ）約２８℃から約３７℃；および（ｉｉ）約３５℃から約３６℃から選択される温度において増殖相で増殖させる。

本発明のかん流方法の別の実施形態において、上記の工程（ｂ）および（ｃ）において起こるエタネルセプトの産生の間に、反応容器は、（ｉ）約３２℃より高く；（ｉｉ）約３４℃より高く；（ｉｉｉ）約３５℃より高く；（ｉｖ）約３３℃から約３６℃の範囲；（ｖ）約３５℃から約３６℃の範囲；（ｖｉ）３２．５℃；（ｖｉｉ）３３．５℃；（ｖｉｉｉ）３４．５℃；および（ｉｘ）３５．５℃から選択される温度に維持される。これらの温度において、優れた製品品質、適切にフォールディングされたタンパク質、および優れた力価を生じる能力は、タンパク質製造工程における製造相の間に（増殖相と比較して）より低い温度の使用を指向する当該分野における、驚くべきことにおよび予想外に与えられた逆の教示である。

組成物として、本発明は、治療タンパク質を製造するためのかん流方法における所望の総アミノ酸濃度を提供するために処方された培地組成物に向けられ、ここで、この所望の濃度は、このような方法において使用されるかん流リアクターの容量に基づいて、約１５−２０ｍＭ；約２０−２５ｍＭ；約２５−３０ｍＭ；約３０−３５ｍＭ；約３５−４０ｍＭ；約４０−４５ｍＭ；約４５−５０ｍＭ；約５０−５５ｍＭ；約５５−６０ｍＭ；約６０−６５ｍＭからなる群より選択される範囲にあり、ここで、この組成物は、安全のために提供され、推奨され、または広告されるときには、このようなかん流方法における意図されるこの使用をサポートまたは示唆する、書かれたかまたは口頭による推奨または指示を伴う。

本発明のさらなる組成物の実施形態は、約１５−２０ｍＭ；約２０−２５ｍＭ；約２５−３０ｍＭ；約３０−３５ｍＭ；約３５−４０ｍＭ；約４０−４５ｍＭ；約４５−５０ｍＭ；約５０−５５ｍＭ；約５５−６０ｍＭ；約６０−６５ｍＭからなる群より選択される範囲にある総アミノ酸濃度を含むフィード培地組成物であり、この組成物は、好ましくは、綿実加水分解物、デキサメタゾン、ＭａｎＮＡｃ、および／またはＤ−（＋）−ガラクトースの少なくとも１つをさらに含む。

上記の実施形態のいずれかにおいて、アミノ酸濃度の好ましい範囲は、約１５−約３０ｍＭであり、培地は、合成培地および非合成培地を含むことができる。

「培養」、「細胞密度」、「細胞生存度」、「力価」、「培地」、「播種」、「増殖相」、「産生相」などの用語は、当該分野において十分に理解される意味を有するものとして理解されてもよい。例えば、米国特許第７，３００，７７３号に対する参照がなされてもよい。

本発明に従う低濃度フィード（ＳＦ３およびＳＦ４）を含有する培養の生細胞密度（ＶＣＤ）のチャートである。 より高度に富化された栄養培地を含有する培養のＶＣＤのチャートである。 より高度に富化された栄養培地を含有する培養中のアンモニアレベルのチャートである。 減少された栄養培地およびより高度に富化された栄養培地におけるタンパク質産生のバーチャートである。 ２つの異なる濃度のＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ５フィードを補充したＳＦＭ４ＣＨＯ基本培地の荷電種の分布を含有する等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルの画像、ならびに市販のエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ））のＩＥＦゲルの画像である。 １０％および２０％ ＣＨＯＺＮフィードを含有する培養のＶＣＤのチャートである。 これもまた、１０％および２０％ ＣＨＯＺＮフィードを含有する培養のＶＣＤのチャートである。 １０％および２０％フィード培養を含有する培養から単離された生成物中のアイソフォーム分布を含有するＩＥＦゲルの画像；ならびに参照標準のＩＥＦゲルの画像である。 より乏しい（１０％）フィード濃度およびより豊富な（２０％）フィード濃度を含有する培養におけるタンパク質産生のバーチャートである。 実施例７に記載されるように増殖させた培養のＶＣＤおよび生存度のチャートである。

本発明は、かん流として知られる方法を介して融合タンパク質または抗体を製造する方法を提供する。「かん流」という用語は、本明細書で使用される場合、バイオリアクターに含有される生成物が連続的に収集でき、使用済み培地中に存在する使用済み物質および毒性物質がバイオリアクターから取り除きができるために、懸濁細胞培養が連続的にまたは定期的に、最も好ましくは連続的に、使用済みの培養培地を連続的に取り除きながら、即ち、（好ましくは、生成物とともに）収集しながら、バイオリアクターに新鮮な培養培地を供給する方法を一般的に示すことが意図される。当該分野において周知である適切なろ過手段を使用して、次に、細胞は、収集流から連続的にろ過され、バイオリアクターに戻されて一定の培養体積を維持する。典型的には、連続的に実行されるこのような方法は、細胞が高密度に到達することを可能にする。従って、１０００万−７５００万細胞／ｍＬまで高い密度が、例えば、少なくとも２週間、典型的には、２０−６０日間の期間の長さにわたって、日常的に到達および維持できる。このことは、バッチ培養またはフィードバッチ培養とは反対に、より長い時間の間産生できる、非常に高い生産性の細胞培養を生じることができる。また、取り除かれた使用済み培地から生成物を連続的に収集するのではなく、生成物は、培養物中で維持および濃縮でき、次いで、定期的に、または培養の最後に収集できる。当該分野において周知であるように、適切なサイズのフィルターの利用が、バイオリアクター培養中の組換え産物の保持を伴って、廃棄物のみの除去を可能にできる。本発明の目的は、かん流方法、特に、融合タンパク質または抗体などの治療タンパク質を製造するための方法における使用のための適切なフィード培地を提供することである。

細胞培養かん流方法は，典型的には、１日あたり０．５−２バイオリアクター容量のフィード培地交換速度を受けることができる。本発明は、このようなかん流方法が、フィードバッチ方法において使用されるフィード培地において典型的に利用されるものと同程度に高い栄養濃度を要求せず、実際には、実質的により少ない濃度を要求するという本発明者らの発見に基づいている。特に、本発明者らは、治療タンパク質（例えば、融合タンパク質または抗体）を製造するためのフィードバッチ方法において使用される栄養の濃度、特に，アミノ酸の濃度が、一方では、定常状態レベルにおける細胞の代謝の必要性を支持するためになお十分に栄養が豊富であるが、他方では他の有害な効果、とりわけ、培地の細胞生存度、全体の力価および生成物の品質を減少するアンモニアまたは乳酸の過剰産生などを引き起こす程には栄養が高くないというレベルまで減少されなければならないことを見出した。本発明は、総アミノ酸濃度レベルの減少によって栄養レベルの減少を要求している。得られる栄養レベルの減少が本発明において特定される全体のアミノ酸濃度レベルの中にあるならば、さらなる栄養成分が、細胞密度、かん流速度および比産生速度（ｐｃｄ）に基づく周知の様式において経験的に決定されてもよい。本発明は、（増殖ではなく産生を刺激するために）かん流のために処方された培地中のアミノ酸の消費が減少されるという発見をさらに前提としている。従って、このような培地は、有意により低い濃度のアミノ酸を用いて所望の生産性を支持する。グルコース、ビタミンなどのような他のフィード成分の減少もまた実行可能である。

本発明のかん流方法は、エタネルセプトとして知られている融合タンパク質（バイオシミラーバリアントまたはバイオベターバリアントを含む。）の製造に対して特に良好に適合されている。エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ））は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合ポリペプチドである。これは９３４アミノ酸からなり、およそ１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．）。エタネルセプトのＦｃ成分は、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインは含有しない。Ｆｃドメインは上記のドメインの１つまたはすべてを含有することができる。エタネルセプトは、通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系において、組換えＤＮＡ技術によって産生される。

本発明のかん流方法は、アダリムマブとして知られる抗ＴＮＦ抗体の製造に対してもまた良好に適合されている。アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（Ｒ））は、ヒトＴＮＦに特異的な組換えヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。アダリムマブはＤ２Ｅ７としてもまた知られている。アダリムマブは、各々がおよそ２４キロダルトン（ｋＤａ）の分子量である２つの軽鎖、および各々がおよそ４９ｋＤａの分子量である２つのＩｇＧ１重鎖を有する。各軽鎖は２１４アミノ酸残基からなり、各重鎖は４５１アミノ酸残基からなる。従って、アダリムマブは１３３０アミノ酸残基からなり、およそ１４８ｋＤａの総分子量を有する。アダリムマブという用語は、市販のＨｕｍｉｒａ（Ｒ）において使用されているアダリムマブタンパク質のいわゆるバイオシミラーバリアントまたはバイオベターバリアントを包含することもまた意図される。

本発明において使用されるフィード培地は、好ましくは、デキサメタゾンが補充されたＢａｌａｎＣＤ（Ｒ）およびＨｙＣｅｌｌ（Ｒ）などの基本培地を含む。タンパク質（例えば、エタネルセプトまたはこのバイオシミラーバリアントもしくはバイオベターバリアント）を産生する細胞は、少なくとも１０，０００，０００細胞／ｍｌの密度で、好ましくは少なくとも５，０００，０００細胞／ｍｌの密度、および最も好ましくは少なくとも約１０，０００，０００細胞／ｍｌの密度で、かん流容器中に存在する。工程（ａ）の前に、所望のタンパク質を発現することが可能な細胞の増殖相の間に（実質的な産生の開始の前に）、タンパク質を発現することが可能なこのような細胞は、（ｉ）約２８℃から約３７℃；および（ｉｉ）好ましくは約３５℃から約３６℃から選択される温度で増殖できる。かん流方法を含む、引き続く産生相の間、エタネルセプト産生は、（ｉ）約３２℃より高く；（ｉｉ）約３４℃より高く；（ｉｉｉ）約３５℃より高く；（ｉｖ）約３３℃から約３６℃の範囲；（ｖ）約３５℃から約３６℃の範囲；（ｖｉ）３２．５℃；（ｖｉｉ）３３．５℃；（ｖｉｉｉ）３４．５℃；および（ｉｘ）３５．５℃から選択される温度で実行される。本発明の方法は、連続的にまたは定期的に、しかし好ましくは連続的に、かん流方法の産生相の間にエタネルセプトを収集することを好ましく含む。さらに、使用済み培地の取り除きおよび新鮮な培養培地との交換が好ましくは連続的に行われる。連続的に引き出された培養培地中に存在する所望のタンパク質の収集が、好ましくは連続的に実行される。

本発明のかん流方法は、例えば、融合タンパク質およびモノクローナル抗体を含む任意の治療タンパク質について使用できる。本発明のかん流方法における産生のために適切なタンパク質の例には、エタネルセプト、アダリムマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、エクリズマブおよびナタリズマブ、ならびにこのようなタンパク質のバイオシミラーバリアントまたはバイオベターバリアントが挙げられる。しかし、本発明のかん流方法は任意の特定のタンパク質に限定されないことが理解されるべきである。

記載される製法の容積生産性および生産されたエタネルセプトの品質は、当業者に周知である幾つかの方法を使用することによって評価できる。これらの方法には、全体のおよび活性なタンパク質（力価）を定量し、タンパク質シアリル化のレベルを認定する、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル、疎水的相互作用クロマトグラフィーなどのようなアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明のかん流方法は、優れた収量で、好ましくは、当該分野において以前に必要であるかまたは望ましいと考えられていたものよりも高い産生温度で、正しくフォールディングされたタンパク質を産生できる。

以下の材料が実施例において使用されている。

［実施例１］
本実験において、本発明者らは、ＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＨＯＺＮおよびＦｅｅｄ １フィード、綿実加水分解物、ガラクトース、Ｌ−グルタミンおよびグルコースが補充された、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ ＡおよびＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ＨｙＣｅｌｌ培地の１：１混合物から構成されるフィード培地を使用した。幾つかの条件は、ビタミン、アミノ酸のさらなる補充、ならびにより高い濃度のＣＨＯＺＮおよびＦｅｅｄ １を含んで、培地をより顕著に富化させた（以下のＳＦ５、ＳＦ６およびＳＦ７を参照のこと）。フィード培地の付加の前に、シード密度は、培養のミリリットルあたり４０００万細胞であった。かん流処理は、培養が播種の２４時間後の培地の完全な交換を受け、次いで、この培養は９６時間継続されたという点でシミュレートされた（さらなるフィードまたは培地の交換なしで）。培養の性能は、生細胞密度、生存度、代謝プロフィール（アンモニアおよび乳酸の産生、Ｌ−グルタミンおよびグルコースの消費、ｐＨレベル、グルタミン酸産生）および生産性に関してモニターされた。以下に提示されるデータに示されるように、より多くのビタミンおよびアミノ酸補充を伴う培養（以下のＳＦ５およびＳＦ６を参照のこと）は、非常に高いレベルのアンモニア（＞４０ｍＭ）を産生し、早期の生存度の減少を生じた。本発明者らは、例外的に高いアンモニアレベル以外の、生存細胞について得られたデータと比較したときに、いかなる他の代謝的変化も観察しなかった。すべての培養間で生存度が比較可能であった時間の間でさえ、より高い栄養の栄養培地で得られた力価もまた、ネガティブな影響を受けた。余分なビタミンおよびアミノ酸がないより低い影響の培養（ＳＦ３およびＳＦ４）は、高い生存度のままであり、良好な生産性でありおよび良好な生成物品質の物質を産生した（以下のデータセクションを参照のこと）。

この実施例１は、２４時間の単独フィード置き換え、続いて９６時間の産生相を使用し（９６時間の間にさらなる培地交換がない。）、かん流における使用のための意図される培地（培地は連続的にまたは定期的に交換される。）が、ＳＦ３およびＳＦ４におけるフィードのために使用されるものよりも低いレベルで、減少したレベルの栄養を必然的に要求することを実証する。従って、以下の実施例２および３において提供されるように、かん流方法において使用されるフィード培地は、７０ｍＭ未満の総アミノ酸含量、好ましくは約１５−約３０ｍＭの範囲の総アミノ酸含量を利用すべきであり、なおさらに、優れた細胞密度、細胞生存度および産生力価を生じる。本明細書で使用される総アミノ酸含量は、かん流反応容器の容積に基づいて、全体の、定常状態の、アミノ酸濃度を意味するものと理解されるべきである。

実施例１の結果
以下の表１は、５つの実験（ＳＦ３からＳＦ７まで）において使用されるフィード培地を要約しており、ここでは、上記のように、培地は、播種後、２４時間で交換され、次いで、この工程は、さらに９６時間、継続させられる（いかなるさらなる培地の交換もない。）。この実験は、より低い栄養フィード（ランＳＦ３、ＳＦ４）をより高い栄養フィード（ランＳＦ５、ＳＦ６、ＳＦ６およびＳＦ７）と比較した。この表に示されたフィードは、ＢａｌａｎＣＤおよびＨｙｃｅｌｌからなる基本培地を補充するために使用された（上記に列挙される材料において同定される。）。ビタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１１２０−０５２）およびアミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１１３０−０３６）は、１００×ストックから１×濃度として加えられた。

図１は、本発明に従う低濃度フィード（ＳＦ３およびＳＦ４）を含有する培養の生細胞密度（ＶＣＤ）についてのデータを示す。非常に高い培養密度が得られたことに注目のこと。比較的乏しい培地（１０％ ＣＨＯＺＮ＋７．５％綿実加水分解物（ＣＳＨ）および１０％Ｆｅｅｄ １、ビタミンまたはアミノ酸のさらなる補充なし）（ＳＦ３およびＳＦ４を参照のこと）は、細胞が少なくとも９６時間、高い生存度を持続するために十分な栄養補助を提供した。

図２は、（フィードＳＦ５、ＳＦ６およびＳＦ７の場合には）より高度に富化された栄養培地（ビタミンおよびアミノ酸または複合フィードの補充から生じる。）が培養の寿命の減少を生じたことを実証する。特に、本発明者らは、培養の代謝的要求を超えるような濃度のアミノ酸の付加が生存度の急速な減少を生じることを発見した。より短い寿命を有するすべての培養（例えば、ＳＦ６およびＳＦ７）が高レベルのアンモニアを産生することがさらに注目された（図３を参照のこと）。

図３は、より高栄養のフィード培地を使用する培養（上記の表１におけるＳＦ６およびＳＦ７を参照のこと）は、受け入れがたい高いアンモニア産生を示し、これは早期の生存度の減少を引き起こすかまたはこれに寄与する可能性があると本発明者らは仮定している。

図４は、より高い栄養培地（例えば、ＳＦ５、ＳＦ６およびＳＦ７）中のタンパク質産生が、力価の減少によって示されるように、ネガティブに影響されることを示す。本発明に従うＳＦ３およびＳＦ４の栄養が減少されたフィードを使用する培養からの産生を、ＳＦ５、ＳＦ６およびＳＦ７のより高度に富化されたフィードを使用する培養から達成された産生と比較のこと。

［実施例２］
実施例１において得られたデータに基づいて、および本発明に従って、本発明者らは、上記の実施例１におけるランＳＦ３およびＳＦ４において利用されたものなどの栄養が減少された培地が、連続的なまたは定期的な培地交換を受けるかん流方法において利用されるときに、総アミノ酸濃度をさらに実質的に減少させるように修飾できることを見出した。特に、このようなかん流方法において、７０ｍＭ未満、および好ましくは約１５ｍＭ−約６５ｍＭの範囲、および最も好ましくは約２０ｍＭ−約３０ｍＭの範囲の総アミノ酸濃度が、例えば、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質または抗ＴＮＦモノクローナル抗体などの治療タンパク質を製造するためのかん流方法において細胞培養の代謝的必要性を補助する。従って、定期的な培地交換を含むかん流方法において、本発明に従うかん流方法が利用され、ここでは、７０ｍＭ未満、および好ましくは約１５−約６５ｍＭの範囲、および最も好ましくは約２０−約３０ｍＭの総アミノ酸濃度を有するフィード培地が、２４時間毎に新鮮な培地と交換される。かん流をシミュレートするこのような方法は、１日あたり１バイオリアクター容積のかん流速度と等価である。細胞は、好ましくは、ミリリットルあたり５０００万細胞の密度で接種され、培地は２４時間毎に計３回交換される。培養は４日目に終了する（合計時間９６時間）。生細胞密度および生存度は毎日記録される。力価および生成物品質を反映するアイソフォームプロフィールは、当該分野において公知である適切なアッセイを使用して各収集サンプルについて決定される。力価および生成物品質の改善によって反映されるように（９６時間サンプル）、代謝から産生モードに次第に切り替わるために、細胞はおよそ３日間（７２時間）を要するかもしれない。総累積アミノ酸濃度が７０ｍＭを超えて要求される米国特許第７，３００，７７３号において推奨されるようなフィードバッチ方法において典型的に利用される培地と比較した場合に、実質的に低い総アミノ酸濃度を含有するフィード培地の使用にも関わらず、本発明の方法は、優れた細胞密度および細胞生存度ならびに優れた力価を生じる。

［実施例３］
連続的な培地交換を伴うかん流
連続的なかん流方法が利用される以外、実施例２が反復され、ここでは、新鮮な培地が連続的にリアクターに導入され、使用済み培地が当該分野において周知の様式で連続的に取り除かれ、これによって、本発明に従って、リアクター中のフィード培地の定常状態の総アミノ酸濃度は、７０ｍＭ未満、および好ましくは１５ｍＭ−約６５ｍＭの範囲、および最も好ましくは約２０ｍＭ−約５５ｍＭの範囲である。連続的なかん流方法は、優れた細胞密度、細胞生存度および力価を生じる。総アミノ酸濃度の要求に加えて、フィード培地は、かん流リアクター中の定常状態培地濃度において、以下の判断基準の１つ以上を満たすように好ましく処方される：（ｉ）約７０ｍＭ未満の単位容量あたりの定常状態総アミノ酸量；（ｉｉ）約２より大きい定常状態グルタミン対累積アスパラギン比率；（ｉｉｉ）約０．２より大きい定常状態グルタミン対総アミノ酸比率；（ｉｖ）１より大きい定常状態モル濃度無機イオン対総アミノ酸比率；および（ｖ）１６ｍＭ未満の単位容量あたりの定常状態のグルタミンとアスパラギンの合わせた量。定常状態という用語は、上記に表現されるように、フィード成分の濃度および比率が、かん流反応容器の中で言及されたレベルで本質的に一定のままであることを示すことが意図される。

［実施例４］
本発明者らは、増殖、生産性および生成物品質に関して、かん流条件下での強固な培養性能を可能にする様々な培養組成物を評価した。ミリリットルあたり１０００万細胞の細胞密度を達成する本発明者らの実験の１つにおいて、本発明者らは、２つの異なる濃度のＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５フィードを補充したＳＦＭ４ＣＨＯ基本培地を試験し、およそ５０ｍＭの総アミノ酸濃度を生じるより乏しい溶液（１０％フィード）が、およそ１００ｍＭの総アミノ酸濃度を生じる２０％フィードを補充した培養よりも、より良好な生成物品質を生じたことを見出した。品質の違いは、図５に示されるデータによって実証される。レーン２および４は、市販のエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ））（レーン６）と非常に類似している荷電種の分布を示し、さらにゲルに移動する酸性バンドが優勢である。対照的に、より豊富なフィードからのサンプル（レーン３および５）は、酸性のより迅速に移動する種が少ないことを示し、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）とはあまり類似していない。

続く実験は、正確に同じフィード条件を使用して、より高い培養密度（ｍｌあたり２５００万細胞）を試験した。本発明者らは、より低い含量のＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５フィードを有する培養処方が細胞生存度を持続することができず、最終的には、生成物品質の低下を生じることを見出した。しかし、著者らはまた、より高い総アミノ酸濃度（およそ１００ｍＭ）を含有するフィード培地が高い生存度を補助した一方、生成物品質は低い細胞密度で観察されたものには匹敵しなかったことも見出した。ｍｌあたり２５００万−５０００万細胞の細胞密度を補助しながら、良好な生成物品質を提供できる他の培地およびフィードを見出すためには、この結果はさらなる研究を必要とした。それゆえに、本発明者らは、培養のｍＬあたり３０００万−５０００万細胞で播種された培養の最高の寿命を補助することが可能であった培地組成を同定するために、バッチモードで幾つかの基本培地および培地の組み合わせを調べた。この研究は、上記の実施例１に示された実験および知見を含んだ。

［実施例５］
ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質のかん流産生における培地の要求性
本発明者らは、エタネルセプトのバイオシミラーとしての開発中のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の産生において高密度培養（２５×１０^６細胞／ｍｌ）を使用してかん流をシミュレートする様々な培地交換実験を行った。これらの実験において、本発明者らは、高い生存度が、栄養の濃度の減少を提供するフィードを用いて達成できることを一貫して見出した。著者らの知見は、培養のミリリットルあたり２５００万細胞を各々含有する２つの高密度培養が樹立され、両方の培養が同じ基本培地（ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ、１：１）ならびに１０ｍＭ ガラクトースおよび１０ｍＭ ＭａｎＮＡｃのさらなる補充を利用する実験によって例示される。両方の培養の間の違いはＣＨＯＺＮフィード（１０％対２０％）および綿実加水分解物（７．５％対１５％）の補充のレベルである。両方のフィードは、培養へのさらなるアミノ酸供給を提供した。より低い濃度のフィードを用いる培養の生存度は、より豊富な培地を受容した培養の生存度と一致した。この結果は、２０％（９８ｍＭ 総アミノ酸含量）から１０％（７８ｍＭ 総アミノ酸含量）までのフィード濃度の減少が、この培養の栄養要求を制限しなかったことを示し、総アミノ酸濃度が本発明において本発明者らが今回処方したレベルまでさらに減少できることを明確に示した。データは図６および図７に示される。

アミノ酸含量に関する使用済み培地分析は、よりフィード含量が少ない培養が、４８時間の培養後でさえ、提供されたいずれのアミノ酸においても有意なやり方で枯渇することはなかったことを示した。このことは、アミノ酸含量が培養の栄養要求よりも高く、本発明に従って、７８ｍＭのレベルよりも下にさらに減少できることを実証する。従って、本発明者らは、一定速度で培地をかん流した細胞がはるかにより低いレベルのアミノ酸を必要とすること、および１日あたり１バイオリアクター容量に等しいかん流速度は、約２０−５０ｍＭの範囲の定常状態総アミノ酸濃度を必要とするはずであることを見出す。

生成物開発プロジェクトにおける主要な用件の１つは、所望の品質を有する生成物の高力価発現である。大部分のタンパク質は、これらの治療活性のために適切な翻訳後修飾を必要とする。例えば、この実施例において産生されるＴＮＦＲ−ＦＣ融合タンパク質は、分子電荷プロフィールに基づいて、特定のアイソフォームの分布を生じる顕著な程度のシアル化を必要とする。ＩＥＦゲルによって示される等電点電気泳動分析（図８）は、フィード含量の減少が、市販の参照標準および２０％フィードを与えられた培養から得られたサンプルと比較して、生成物アイソフォーム分布の変化を生じなかったことを実証する。

図８において、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルは、アミノ酸が豊富な（２０％）フィード培養から単離されたもの（ウェル２および５、第１および第２の培地交換、ＭＥにおいて示される。）と比較して、より低い（１０％）フィード濃度を含有する培養から単離された生成物中で比較し得るアイソフォーム分布を示す（ウェル１および４、第１および第２の培地交換、ＭＥにおいて示される。）。参照標準のプロフィールはウェル３に示される。

図９において見られるように、より乏しいもの（１０％フィード）およびより豊富なもの（２０％）を与えられた培養について得られた力価は、より高い濃度のフィードがより低い培養生産性を生じることができることを示す。本発明において特定されるかん流のための栄養要求を細胞に供給すること、従って、不必要に豊富な培地を回避することによって、これまで当該分野において推奨されてきた培地要求と比較して、より良好な生産性および生成物品質を生じるかん流方法において、培養代謝状態を達成することができる（例えば、米国特許第７，３００，７７３号を参照のこと）。

［実施例６］
エタネルセプトのバイオシミラーとしての開発中のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の産生のために、シードトレインは、ＳＦＭ４ＣＨＯ中３７℃の大容量振盪フラスコ中で拡大される。産生バイオリアクターは、培地中１−５×１０^６細胞／ｍＬの播種密度で接種され、ここで、総アミノ酸濃度を、この実験の約１５−約７０ｍＭの９つの別個の反復において変動させる（以下の表を参照のこと）。ランの各々において、産生相（連続的かん流を伴う。）の間の温度は３３．５℃から３５℃である。１分あたり０．０５−２．０実用培養量の再循環速度を用いて、中空繊維フィルターを通して培地（使用済み生成物および所望の生成物を含有している。）を再循環させるために、ＡＴＦ（商標）細胞保持デバイス（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が使用される。この培養は、０−２日間の増殖相で最初に拡大され、次いで、１日あたり０．２−２培養量の速度でかん流が開始されて産生相を容易にする。使用済み培地（生成物を含有する。）が０．２μｍポアサイズ中空繊維フィルターを通して収集されるにつれて、新たな培地が加えられる。収集された液体は２−８℃に冷却され、プロテインＡ樹脂上での捕捉によって精製される。力価について、ならびにＮ−グリカン分布およびＨＩＣ分析などの生成物品質特性についてアリコートが分析される（不適切にフォールディングした／凝集した（不活性型）物質に対する、適切にフォールディングしたエタネルセプトの相対量を評価するため）。これらのランにおいて調べられた総アミノ酸濃度は以下に示される。

ラン１から９までの各々についての生細胞密度、生存度、生成物品質および力価の分析は、１５−７０ｍＭ、好ましくは約１５−約３０ｍＭの総アミノ酸濃度範囲の下端においてこれらの特徴に関して優れた結果を実証し、範囲の上端に進むにつれてこれらの特徴の悪化が増大する。

［実施例７］
エタネルセプトのバイオシミラーとして開発中のＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の産生のために、シードトレインが、ＳＦＭ４ＣＨＯ中３７℃で大容量振盪フラスコ中で拡大された。産生バイオリアクターは、総アミノ酸濃度が約２０−約５６ｍＭであった培地中で、一連のかん流バイオリアクター中で、０．３−０．７５×１０^６細胞／ｍＬの播種密度で接種された。ランの各々において、産生相（連続的かん流を伴う。）の間の温度は３５−３７℃であった。１日あたり０．５−２．０実用培養量の再循環速度を用いて、中空繊維フィルターを通して培地（使用済み生成物および所望の生成物を含有している。）を再循環させるために、ＡＴＦ（商標）細胞保持デバイス（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が使用された。この培養は、８日間まで増殖相で最初に拡大され、１日あたり細胞あたり０．０５−０．１ｎＬの細胞特異的かん流速度のかん流を用いた。温度は、例えば、産生相を容易にするために３３．５℃まで低下された。使用済み培地（生成物を含有する。）が０．２μｍポアサイズ中空繊維フィルターを通して収集されるにつれて、新たな培地が加えられた。収集された液体は、プロテインＡ樹脂上での捕捉に備えて２−８℃に冷却された。力価について、ならびにＮ−グリカン分布およびＨＩＣ分析などの生成物品質特性についてアリコートが分析された（不適切にフォールディングした／凝集した（不活性型）物質に対する、適切にフォールディングしたエタネルセプトの相対量を評価するため）。

各ランについての生細胞密度、生存度、生成物品質および力価の分析は、２０−５６ｍＭ、好ましくは約１５−約３０ｍＭの総アミノ酸濃度範囲の下端においてこれらの特徴に関して優れた結果を実証した。図１０において示されるように、本明細書に記載されるように増殖された培養は、９日間の増殖相の間に約３０００万細胞／ｍＬを達成し、さらなる１１−１２日に拡大された産生相の間に高い生存度の細胞濃度を維持した。

Claims (20)

1. ７０ｍＭ未満の総アミノ酸濃度を含むフィード培地の存在下でのかん流を介してタンパク質を産生する工程を含むタンパク質の製造方法。
2. フィード培地が、約１５−２０ｍＭ；約２０−２５ｍＭ；約２５−３０ｍＭ；約３０−３５ｍＭ；約３５−４０ｍＭ；約４０−４５ｍＭ；約４５−５０ｍＭ；約５０−５５ｍＭ；約５５−６０ｍＭ；約６０−６５ｍＭ；および６５ｍＭと７０ｍＭとの間からなる群より選択される範囲の総アミノ酸濃度を含む、請求項１に記載の方法。
3. タンパク質が融合タンパク質または抗体である、請求項１に記載の方法。
4. タンパク質がＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項３に記載の方法。
5. タンパク質が抗ＴＮＦ抗体である、請求項３に記載の方法。
6. タンパク質が、エタネルセプト、アダリムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、エクリズマブおよびそのバイオシミラーバリアントまたはバイオベターバリアントからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
7. フィード培地が、ＳＦＭ４ＣＨＯ（Ｒ）基本培地、ＢａｌａｎＣＤ基本培地、Ｈｙｃｅｌｌ基本培地、綿実加水分解物、デキサメタゾン、ＭａｎＮＡｃおよび／またはＤ−（＋）−ガラクトースの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
8. （ａ）所望の治療タンパク質を発現することが可能である細胞、およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）混合物を含有する適切な容器中で、細胞にタンパク質を産生させる工程ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含む、請求項１に記載の方法。
9. 細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の方法。
10. タンパク質を発現することが可能である細胞を、工程（ａ）の前に、約２８℃から約３７℃；および（ｉｉ）約３５℃から約３６℃から選択される温度において増殖相で増殖させる、請求項８に記載の方法。
11. 産生相（増殖相とは区別され、増殖相の後）が、（ｉ）約３２℃より高く；（ｉｉ）約３４℃より高く；（ｉｉｉ）約３５℃より高く；（ｉｖ）約３３℃から約３６℃の範囲；（ｖ）約３５℃から約３６℃の範囲；（ｖｉ）３２．５℃；（ｖｉｉ）３３．５℃；（ｖｉｉｉ）３４．５℃；および（ｉｘ）３５．５℃から選択される温度において実行される、請求項１０に記載の方法。
12. 産生されるタンパク質がエタネルセプトのバイオシミラーである、請求項１１に記載の方法。
13. 治療タンパク質を産生するためのかん流方法であって、（ａ）タンパク質を発現することが可能であるＣＨＯ細胞、およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）混合物を含有する適切な容器中で、細胞に前記タンパク質を産生させる工程、ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含み、ここで、培養培地は、（ｉ）約１５−約６５ｍＭの総アミノ酸濃度；ならびに複合的な化学的に規定されたフィード、デキサメタゾン、ＭａｎＮＡｃ、綿実加水分解物およびＤ−（＋）−ガラクトースからなる群より選択される少なくとも１つを含む、方法。
14. 治療タンパク質が、エタネルセプト、リツキシマブ、アダリムマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、エクリズマブおよびそのバイオシミラーバリアントまたはバイオベターバリアントからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 治療タンパク質が、エタネルセプトまたはそのバイオシミラーバリアントもしくはバイオベターバリアントである、請求項１４に記載の方法。
16. エタネルセプトを発現することが可能である細胞を、工程（ａ）の前に、（ｉ）約２８℃から約３７℃；および（ｉｉ）約３５℃から約３６℃から選択される温度において増殖相で増殖させる、請求項１５に記載のかん流方法。
17. 工程（ｂ）および（ｃ）において起こるエタネルセプトの産生の間に、反応容器が、（ｉ）約３２℃より高く；（ｉｉ）約３４℃より高く；（ｉｉｉ）約３５℃より高く；（ｉｖ）約３３℃から約３６℃の範囲；（ｖ）約３５℃から約３６℃の範囲；（ｖｉ）３２．５℃；（ｖｉｉ）３３．５℃；（ｖｉｉｉ）３４．５℃；および（ｉｘ）３５．５℃から選択される温度に維持される、請求項１６に記載のかん流方法。
18. 約１５−２０ｍＭ；約２０−２５ｍＭ；約２５−３０ｍＭ；約３０−３５ｍＭ；約３５−４０ｍＭ；約４０−４５ｍＭ；約４５−５０ｍＭ；約５０−５５ｍＭ；約５５−６０ｍＭ；および約６０−６５ｍＭからなる群より選択される範囲の総アミノ酸濃度を含み、ならびに複合的な化学的に規定されたフィード、綿実加水分解物、デキサメタゾン、ＭａｎＮＡｃ、および／またはＤ−（＋）−ガラクトースからなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む、フィード培地組成物。
19. かん流反応容器が融合タンパク質および抗体からなる群より選択されるタンパク質を含有する、請求項１８に記載のフィード培地組成物。
20. 治療タンパク質を製造するためのかん流方法において所望の総アミノ酸濃度を提供するように処方されたフィード培地組成物であって、前記所望の濃度は、このような方法において使用されるかん流リアクターの容量に基づいて、約１５−２０ｍＭ；約２０−２５ｍＭ；約２５−３０ｍＭ；約３０−３５ｍＭ；約３５−４０ｍＭ；約４０−４５ｍＭ；約４５−５０ｍＭ；約５０−５５ｍＭ；約５５−６０ｍＭ；および約６０−６５ｍＭから選択される範囲であり、ここで、組成物は、綿実加水分解物、デキサメタゾン、ＭａｎＮＡｃおよび／またはＤ−（＋）−ガラクトースの少なくとも１つをさらに含む、フィード培地組成物。

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