EA037238B1 - Перфузионная среда - Google Patents
Перфузионная среда Download PDFInfo
- Publication number
- EA037238B1 EA037238B1 EA201691542A EA201691542A EA037238B1 EA 037238 B1 EA037238 B1 EA 037238B1 EA 201691542 A EA201691542 A EA 201691542A EA 201691542 A EA201691542 A EA 201691542A EA 037238 B1 EA037238 B1 EA 037238B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- medium
- perfusion
- culture medium
- production
- Prior art date
Links
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 70
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 81
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 69
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 49
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 claims description 38
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 claims description 11
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 9
- OVRNDRQMDRJTHS-ZTVVOAFPSA-N N-acetyl-D-mannosamine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-ZTVVOAFPSA-N 0.000 claims description 7
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 65
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 65
- 239000000047 product Substances 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 18
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 9
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 9
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 7
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 2
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 2
- 235000021049 nutrient content Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019195 vitamin supplement Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/10—Perfusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Приводится описание перфузионной среды, обеспечивающей превосходную плотность клеток, титр и качество продукта для производства терапевтического белка в перфузионном способе.
Description
КОХЕРУ С БАЙОСАЙЕНСИС, ИНК (US) (72) Изобретатель:
Пухач Эла, Грув Джеймс Расселл (US (74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Приводится описание перфузионной среды, обеспечивающей превосходную плотность клеток, титр и качество продукта для производства терапевтического белка в перфузионном способе.
037238 Bl
037238 В1
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к питательной среде, подходящей для производства терапевтического белка перфузионным способом.
Предпосылки создания изобретения
Белки, такие как предназначенные для фармацевтического применения, могут быть произведены с использованием либо единовременной загрузки, периодическим способом или способом перфузии. Настоящее изобретение направлено на перфузионные способы, включая те, что используются для производства терапевтических белков.
Перфузионные способы производства терапевтических белков чувствительны к изменениям состава культуральной среды, температуры, к накоплению метаболических отходов, а также к физикохимическим параметрам биореактора. Несоответствующие или колеблющиеся условия влияют на белковые посттрансляционные модификации, такие как гликопрофиль, который, как известно, коррелирует с фармакокинетическими свойствами.
Использование перфузионного способа более целесообразно в сравнении с периодическим производством, поскольку первый позволяет получать больше продукта в течение определенного периода времени при меньшей стоимости товаров. Следовательно, требуется преодолеть проблемы разработки подходящих питательных условий, которые поддерживают перфузионный способ.
В патентном документе с номером U.S. Patent 7300773 и патентном документе с номером ЕР 1781802 приводится описание производства слитого белка TNFR-IG с использованием периодического процесса, в котором питательной среде предписаны заданные концентрации аминокислот и/или неорганических ионов.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен график плотности жизнеспособных клеток (ПЖК) культур с низкой концентрацией питательных веществ (прогоны SF3 и SF4) в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 2 представляет собой график ПЖК культур, содержащих более высокообогащенную питательную среду.
Фиг. 3 представляет собой график уровней содержания аммиака в культурах, содержащих более высокообогащенную питательную среду.
Фиг. 4 представляет собой гистограмму производства белка в пониженной питательной среде и в более высокообогащенной питательной среде.
Фиг. 5 представляет собой изображение изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в геле, которое содержит распределение заряженных частиц базальной среды под торговым названием SFM4CHO, дополненной двумя различными концентрациями питательной среды под торговым названием Cell Boost 5, таких же как в коммерческом этанерцепте (продукт под наименованием ENBREL®).
Фиг. 6 представляет собой график ПЖК культур, содержащих 10 и 20% добавки CHOZN.
Фиг. 7 также представляет собой график ПЖК культур, содержащих 10 и 20% добавки CHOZN.
Фиг. 8 представляет собой изображение геля ИЭФ, который содержит распределение изоформ в продукте, выделенном из культур, содержащих 10 и 20% питательных сред, так же как в эталонном стандарте.
Фиг. 9 представляет собой гистограмму производства белка в культурах, содержащих упрощенную (10%) и обогащенную (20%) питательные концентрации.
Фиг. 10 представляет собой ПЖК и жизнеспособность культуры, выращенной согласно описанию в примере 7.
Сущность изобретения
Нами выявлено, что среда, используемая в перфузионном способе, должна быть существенно менее насыщенной с точки зрения содержания питательных веществ, в частности, с точки зрения содержания аминокислот, чем среда, предназначенная для использования в способе с единовременной загрузкой или в периодическом способе. Для целей настоящего изобретения под содержанием питательных веществ следует понимать концентрацию указанных питательных веществ в объеме перфузионного реактора. В частности, данное изобретение относится к способу, в котором перфузионный способ проводят в присутствии питательной среды с суммарной концентрацией аминокислот меньше или равной 70 мМ и предпочтительно в диапазоне приблизительно от 15 до 65 мМ. В различных вариантах исполнения настоящего изобретения суммарная концентрация аминокислот находится в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из приблизительно от 15 до 20 мМ; приблизительно от 20 до 25 мМ; приблизительно от 25 до 30 мМ; приблизительно от 30 до 35 мМ; приблизительно от 35 до 40 мМ; приблизительно от 40 до 45 мМ; приблизительно от 45 до 50 мМ; приблизительно от 50 до 55 мМ; приблизительно от 55 до 60 мМ; приблизительно от 60 до 65 мМ и приблизительно между 65 и 70 мМ.
Суммарные концентрации аминокислот, прописанные в данном описании, меньше тех, которые рекомендованы как для способа с единовременной загрузкой, так и для перфузионных способов в патентном документе с номером U.S Patent 7300773. Для сравнения, в патентном документе с номером US Patent 7300773 требуется общая концентрация аминокислот выше 70 мМ. Несмотря на утверждение в патентном документе '773, что такие концентрации могут быть понятны специалистам в данной области
- 1 037238 техники как пригодные для использования в перфузионных системах (см. столбец 18, строки 5-11), настоящее изобретение частично основано на нашем открытии, что, напротив, проведение перфузионного способа производства терапевтического белка с помощью питательной среды, удовлетворяющей высоким суммарным концентрациям аминокислот, прописанных в патентном документе '773, приводит к получению значительно заниженных количеств требуемого белка и, следовательно, концентрации аминокислот в средах, предназначенных для перфузии, обязательно должны быть понижены и предпочтительно понижены существенно, с точки зрения суммарной концентрации аминокислот. При условии, что выполнены ограничения по концентрации аминокислот в настоящем изобретении, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные неаминокислотные компоненты, обычно используемые в питательной среде (например, витамины, гидролизаты и т.д.), могут быть подобраны опытным путем известным способом без отклонения от сущности и объема настоящего исследования.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения в перфузионном способе производства биологического белка использована питательная среда, удовлетворяющая указанной выше пониженной суммарной концентрации аминокислот, в которой питательная среда дополнительно характеризуется одним или несколькими из следующих критериев: мольное соотношение глютамина и суммарного аспарагина составляет больше чем 2; мольное соотношение глутамина и суммарной концентрации аминокислот составляет больше чем 0,2; мольное соотношение неорганических ионов к суммарной аминокислоте составляет больше чем 1 и суммарное количество глутамина и аспарагина в единице объема составляет менее 16 мм. Эти критерии следует понимать как обозначающие концентрации и количества устойчивого состояния в сосуде перфузионной реакции.
Наше изобретение также относится к модификации питательной среды, которая в ином случае подходит для производства терапевтического белка периодическим способом, для получения среды, пригодной для использования в перфузионном способе производства белка, в которой модификация включает уменьшение питательной ценности подаваемой среды, такое, что при использовании в перфузионном реакторе суммарная концентрация аминокислот в питательной среде находится в интервале от приблизительно 40 до 95% и предпочтительно от приблизительно 50 до 70% от суммарной концентрации аминокислот подаваемой питательной среды. В предпочтительном варианте данным способом достигается одно или оба из условий: (i) производственный титр, сравнимый с достигаемым при периодическом способе с использованием среды с большей питательной ценностью; и/или (ii) существенное снижение уровней содержания аммиака, который, в любом случае, вырабатывается в перфузионном реакторе, если такой перфузионный процесс проводят с использованием тех же сред, что используют в периодическом способе.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в перфузионном способе задействованы следующие стадии: (а) подготовка смеси, содержащей клетки, способные экспрессировать требуемый терапевтический белок, и культуральной среды, подходящей для осуществления такой экспрессии; (b) в подходящем сосуде, содержащем смесь, инициирующую производство белка клетками; и (с) периодическое или непрерывное удаление отработанной культуральной среды из реакционного сосуда и добавление свежей культуральной среды в него.
Изобретение может быть применено к производству любого терапевтического белка. В одном варианте осуществления настоящего изобретения терапевтический белок может быть выбран из любого слитого белка или любого антитела. Слитые белки могут включать в себя TNFR-Fc (иногда упоминаемые как TNFR-Ig). Антитела могут включать в себя антитела к TNF. Другие неограниченные примеры белков, пригодных для изготовления в настоящем изобретении, включают этанерцепт, ритуксимаб, адалимумаб, трастузумаб, бевацизумаб, натализумаб, экулизумаб или лучшие биоварианты таковых. Следует понимать, что перфузионный способ согласно изобретению не ограничен каким-либо конкретным терапевтическим белком. Таким образом, могут быть получены другие белки, отличные от тех, которые упомянуты в данном документе, например эритропоэтины.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет собой способ производства терапевтического белка, включающий следующие стадии: (а) подготовка смеси, содержащей клетки СНО, способные к экспрессии белка, и культуральной среды, подходящей для проведения такой экспрессии; (b) в подходящем сосуде, содержащем смесь, инициирующую производство белка клетками; и (с) периодическое или непрерывное удаление отработанной культуральной среды из и добавление свежей культуральной среды в реакционный сосуд, в котором культуральная среда содержит (i) суммарную концентрацию аминокислот от приблизительно 15 до 65 мМ; и по меньшей мере одно из перечисленного: подходящая базовая среда (например, под торговым названием SFM4CHO, BalanCD CHO Growth A, HyCell CHO и т.д.), сложная химически определенная питательная добавка (например, под торговым названием BalanCD CHO Добавка 1), дексаметазон, ManNAc, гидролизат хлопковых семян и D-(+)-галактоза.
В еще одном варианте осуществления перфузионного способа перед стадией (а) клетки, способные к экспрессии этанерцепта, выращивают в фазе роста при температуре, выбранной из интервала (i) приблизительно от 28 до 37°C; и (ii) приблизительно от 35 до 36°C.
В другом варианте осуществления перфузионного способа во время производства этанерцепта, происходящего на стадиях (b) и (с), в реакционном сосуде поддерживают температуру, выбранную из (i)
- 2 037238 больше чем приблизительно 32°C; (ii) больше чем приблизительно 34°C; (iii) больше чем приблизительно 35°C; (iv) из диапазона приблизительно от 33 до 36°C; (v) из диапазона приблизительно от 35 до 36°C; (vi) 32,5°C; (vii) 33,5°C; (viii) 34,5°C и (ix) 35,5°C. Возможность производить превосходный по качеству продукт, правильно свернутые белки и превосходные титры при этих температурах является удивительным и неожиданным фактом, учитывая противоположные по результатам исследования в области техники, направленные на применение более низких температур в течение фазы производства (по сравнению с фазой роста) в процессе производства белка.
С точки зрения композиции, наше изобретение направлено на создание композиции среды, подобранной для обеспечения требуемой суммарной концентрации аминокислот в перфузионном способе производства терапевтического белка, причем указанная требуемая концентрация, основанная на объеме перфузионного реактора, используемого в данном способе, находится в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из приблизительно от 15 до 20 мМ; приблизительно от 20 до 25 мМ; приблизительно от 25 до 30 мМ; приблизительно от 30 до 35 мМ; приблизительно от 35 до 40 мМ; приблизительно от 40 до 45 мМ; приблизительно от 45 до 50 мМ; приблизительно от 50 до 55 мМ; приблизительно от 55 до 60 мМ; приблизительно от 60 до 65 мМ; и в которой композиция при ее предложении, рекомендации или рекламировании на продажу сопровождается письменной или устной рекомендациями или инструкциями, поддерживающими или предлагающими ее предполагаемое использование в таком перфузионном способе.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция представляет собой композицию питательной среды, содержащей суммарную концентрацию аминокислот в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из приблизительно от 15 до 20 мМ; приблизительно от 20 до 25 мМ; приблизительно от 25 до 30 мМ; приблизительно от 30 до 35 мМ; приблизительно от 35 до 40 мМ; приблизительно от 40 до 45 мМ; приблизительно от 45 до 50 мМ; приблизительно от 50 до 55 мМ; приблизительно от 55 до 60 мМ; приблизительно от 60 до 65 мМ, и дополнительно содержащий по меньшей мере один из компонентов и предпочтительно один из следующих: гидролизат хлопковых семян, дексаметазон, ManNAc и/или D-(+)-галактоза.
В любом из указанных выше вариантов осуществления предпочтительный диапазон концентраций аминокислот составляет от приблизительно 15 до 30 мМ, и среда может включать в себя установленные и неустановленные среды.
Такой термин, как культура, плотность клеток, жизнеспособность клеток, титр, среды (или культуральная среда) пассирование, фаза роста, фаза производства может пониматься как имеющий значение, хорошо известное в данной области техники. Например, может быть дана ссылка на патентный документ с номером US Patent 7300773.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам изготовления слитого белка или антитела с помощью способа, известного как перфузия. Термин перфузия, используемый в данном описании, предназначен, как правило, для обозначения способа, в котором суспензионную клеточную культуру непрерывно или периодически и наиболее предпочтительно непрерывно подают со свежей средой в биореактор в то время, как расходуемую культуральную среду непрерывно удаляют, то есть собирают (предпочтительно, с продуктом) для того, чтобы продукт, содержащийся в ней, мог непрерывно собираться, а отходы и токсичные материалы, присутствующие в отработанной среде, могли быть удалены из биореактора. С помощью соответствующих средств фильтрации, хорошо известных в данной области техники, клетки затем непрерывно фильтруют из потока продукта и возвращают в биореактор для поддержания постоянного объема культуры. Такой процесс, как правило, проводимый непрерывно, позволяет достигать высоких плотностей клеток. Соответственно, плотность более чем 10-75 млн клеток/мл, как правило, может быть достигнута и поддерживаться в течение продолжительного периода времени, например по меньшей мере, двух недель и, как правило, от 20 до 60 дней. Это может приводить к очень высокопродуктивному способу культивирования клеток, который может производить в течение более длительного периода времени, в отличие от единовременной загрузки и периодической подачи культур. В качестве альтернативы, вместо непрерывного сбора продукта из удаленной отработанной среды, продукт может быть сохранен и концентрирован в культуре, а затем собран периодически или в конце культивирования. Как хорошо известно в данной области техники, использование фильтров соответствующего размера может обеспечить удаление только отходов с сохранением рекомбинантного продукта в культуре биореактора. Задачей настоящего изобретения является обеспечение надлежащей питательной среды для использования в способе перфузии, в частности, в способах изготовления терапевтических белков, таких как слитые белки или антитела.
Перфузионные способы культивирования клеток, как правило, могут протекать при скорости подачи среды от 0,5 до 2 объемов биореактора в день. Настоящее изобретение основано на обнаружении, что такие перфузионные способы не требуют столь же высокой концентрации питательных веществ, которая обычно используется в питательной среде, используемой в периодическом способе обработки, и, по сути, требуют значительно меньших концентраций. В частности, нами обнаружено, что концентрация питательных веществ, в частности концентрация аминокислот, используемых в периодических способах из
- 3 037238 готовления терапевтического белка (например, слитого белка или антитела) должна быть понижена до уровней, которые, с одной стороны, по-прежнему достаточно богаты питательными веществами для поддержания метаболических потребностей клеток на стационарном уровне, но с другой стороны, не так высоки в отношении питательных веществ, чтобы вызывать другие побочные эффекты, такие как, помимо всего прочего, перепроизводство аммиака или лактата, что приводит к снижению жизнеспособности культуры, общего титра и качества продукции. Изобретение требует понижения уровня питательных веществ с точки зрения снижения суммарных уровней концентрации аминокислот. Дополнительные компоненты питательной среды могут быть определены эмпирическим путем хорошо известным способом на основании плотности клеток, скорости перфузии и удельной производительности (УП), при условии, что снижающийся уровень питательных веществ попадает в общий уровень концентрации аминокислот, указанный в настоящем изобретении. Наше изобретение далее основывается на обнаружении того факта, что потребление аминокислот в среде, подобранной для перфузии (для стимулирования производства, а не пролиферации) снижается. Соответственно, такая среда поддерживает требуемую производительность при значительно более низких концентрациях аминокислот. Сокращение других питательных элементов, таких как глюкоза, витамины и т.д., также является возможным.
Перфузионный способ по настоящему изобретению в особенности хорошо подходит для изготовления слитого белка, известного как этанерцепт (в том числе биоподобные или лучшие биоварианты). Этанерцепт (продукт под наименованием ENBREL®) представляет собой димерный слитый полипептид, состоящий из внеклеточной лиганд-связывающей части человеческого фактора некроза опухоли (TNFR) массой 75 кДа (р75), связанной с Fc-участком IgG1 человека. Он состоит из 934 аминокислот и обладает кажущейся молекулярной массой приблизительно 150 кДа (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.). Fc-компонент этанерцепта содержит константный тяжелый домен 2 (СН2), константный тяжелый домен 3 (CH3) и шарнирный участок, но не константный тяжелый домен 1 (СН1) человеческого IgG1. Fc-домен может содержать один или все домены, описанные выше. Этанерцепт, как правило, получают с помощью технологии рекомбинантной ДНК в системе экспрессии на основе млекопитающей клетки яичника китайского хомячка (СНО).
Перфузионный способ по настоящему изобретению также хорошо подходит для изготовления антитела к TNF, известного как адалимумаб. Адалимумаб (продукт под наименованием Humira®) представляет собой рекомбинантное моноклональное антитело IgG1 человека, специфичное к TNF человека. Адалимумаб также известен как D2E7. Адалимумаб имеет две легкие цепи, каждая из которых обладает молекулярной массой приблизительно 24 килодальтон (кДа), и две тяжелые цепи IgG1, каждая с молекулярной массой приблизительно 49 кДа. Каждая легкая цепь состоит из 214 аминокислотных остатков, и каждая тяжелая цепь состоит из 451 аминокислотных остатков. Таким образом, адалимумаб состоит из 1330 аминокислотных остатков и имеет общую молекулярную массу приблизительно 148 кДа. Термин адалимумаб также предназначается для охвата так называемых являющихся биоподобными или лучших биовариантов адалимумаба, используемых в коммерчески доступном Humira®.
Питательная среда, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно, содержит базовую среду, такую как под торговым наименованием BalanCD® и под торговым наименованием HyCell®, дополненную дексаметазоном. Клетки, продуцирующие белок (например, этанерцепт или являющиеся биоподобными или лучшими биовариантами), присутствуют в перфузионном сосуде при плотности по меньшей мере 10,000,000 клеток/мл, и предпочтительно при плотности по меньшей мере 5,000,000 и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10,000,000 клеток/мл. Перед стадией (а) во время фазы роста для клеток, способных экспрессировать требуемый белок (до существенного инициирования производства), такие клетки, способные к экспрессии белка, могут быть выращены при температуре, выбранной из: (i) от приблизительно 28 до приблизительно 37°C; и (ii) предпочтительно от приблизительно 35 до приблизительно 36°C. На последующей стадии производства, включая перфузионный процесс, производство этанерцепта протекает при температуре, выбранной из (i) выше чем приблизительно 32°C; (ii) больше чем приблизительно 34°C; (iii) больше чем приблизительно 35°C; (iv) в диапазоне приблизительно от 33 до приблизительно 36°C; (v) в диапазоне приблизительно от 35 до приблизительно 36°C; (vi) 32,5°C; (vii) 33,5°C; (viii) 34,5°C и (ix) 35,5°C. Способ по настоящему изобретению предпочтительно включает непрерывный или периодический, но предпочтительно непрерывный сбор этанерцепта в ходе производственной фазы перфузионного способа. Более того, удаление отработанной среды и замены свежей культуральной средой происходит предпочтительно непрерывно. Сбор требуемого белка, присутствующего в непрерывно отбираемой культуральной среде, предпочтительно осуществляют непрерывно.
Перфузионный способ по настоящему изобретению может быть использован для получения любого терапевтического белка, в том числе, например, слитых белков и моноклональных антител. Примеры белков, пригодных для производства в перфузионном способе по изобретению, включают этанерцепт, адалимумаб, трастузумаб, ритуксимаб, бевацизумаб, инфликсимаб, экулизумаб и натализумаб, а также являющиеся биоподобными или лучшие биоварианты таких белков. Следует понимать, однако, что перфузионный способ по настоящему изобретению не ограничивается каким-либо конкретным белком.
- 4 037238
Объемная производительность описанного способа и качество производимого этанерцепта может быть оценено с использованием нескольких методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Эти методы включают, но не ограничиваются, анализы, в которых количественно оценивают общий и активный белок (титры), квалифицируют уровень сиалилирования белка, такие как изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в гелях, гидрофобная хроматография и другие.
Перфузионный способ по настоящему изобретению позволяет производить правильно свернутые белки с превосходными выходами, и предпочтительно, при производственных температурах, превышающих ранее считавшиеся необходимыми или желательными в данной области техники.
Примеры
Нижеследующие материалы использованы в примерах._______________________________
Описание исходного материала | Фирма-производитель | Номер в каталоге фирмыпроизводителя | Категория | Применимый диапазон | Отметки об использовании |
Продукт под торговым наименованием BalanCD™ CHO Growth А | Irvine Scientific | 94120-10L | Базовая среда | нет данных | базовая среда |
Продукт под торговым наименованием HyClone™ HyCell CHO | Thermo Scientific | SH30933 | Базовая среда | нет данных | базовая среда |
Продукт под торговым наименованием HyClone™ SFM4CHO | Thermo Scientific | SH30518.04 | Базовая среда | нет данных | используется в системе посевных ферментеров; |
О-(+)-Галактоза | SAFC | G5388 | Гликановая питательная среда | <10 | используется при конечной концентрации 10 мМ; для оптимизации качества продукта |
Дексаметазон | SAFC | D4902 | Гликановая питательная среда | <1 мкМ | используется при 0,81,0 мкМ; для оптимизации качества продукта |
ManNAc (Nацетилманнозамин) | SAFC | А8176 | Гликановая питательная среда | <20 | используется при конечной концентрации 10 мМ; для оптимизации качества продукта |
Продукт под торговым наименованием BalanCD™ CHO Добавка 1 | Irvine Scientific | 94119-10L | Питательная среда для титрования | 10% (об.) | Активирует титр при добавлении в качестве самостоятельного компонента или с другой титровальной средой |
Продукт под торговым наименованием HyClone™ Cell Boost 5 | Thermo Scientific | SH30865.04 | Питательная среда для титрования | 10-20% (об.) | Используется в контрольном опыте |
Гидролизат хлопковых семян («ГХС») | FrieslandCampina Domo | CNE50M-UF | Питательная среда для титрования | 15% (об.) | Повышает удельную продуктивность |
Продукт под торговым наименованием ЕХ-Се11 CHOZN Platform Feed | SAFC | 24331C-10L | Питательная среда для титрования | 10-20% (об.) | Сложная питательная среда для периодического способа |
Среда Роста | SAFC | 87509CP | Базовая среда | нет данных | Базовая среда для начального роста в производственном биореакторе |
Производственная среда | SAFC | 87496CP | Сложная среда | нет данных | Базовая среда для фазы производства в производственном биореакторе |
Производственная среда | SAFC | 87612CP | Базовая среда | нет данных | Базовая среда для фазы производства в производственном биореакторе |
Пример 1.
В этом эксперименте нами использована питательная среда, состоящие из смеси 1:1 продукта под торговым наименованием BalanCD™ CHO Growth А и НуС1опе™НуСеП, дополненной продуктом под торговым наименованием EX-CELL CHOZN и Добавкой 1, гидролизатом хлопковых семян, галактозой, L-глютамином и глюкозой. Некоторые условия включают дополнительные добавки с витаминами, аминокислотами и более высокие концентрации CHOZN и Питательной Среды 1, что делает среду значительно богаче (см. прогоны SF5, SF6 и SF7 ниже). Перед добавлением питательной среды посевная плот- 5 037238 ность составляет 40 млн клеток на миллилитр культуры. Перфузионный способ моделировали в этой культуре с получением полной замены среды за 24 ч после пассирования и культивирование затем продолжают в течение 96 ч (без дополнительной подпитки или замены среды). Производительность культуры контролируют в отношении к жизнеспособной плотности клеток, жизнеспособности, метаболического профиля (производство аммиака и лактата, поглощение L-глутамина и глюкозы, уровни рН, производство глутамата) и производительности. Как показано на данных, представленных ниже, культуры с большим содержанием витаминных добавок и аминокислот (см. прогоны SF5 и SF6, ниже) производят очень высокий уровень аммиака (>40 мМ), что приводит к преждевременному снижение жизнеспособности. Мы не наблюдали каких-либо других изменений метаболизма, по сравнению с данными, полученными для оставшихся в живых клеток, отличных от исключительно высоких уровней аммиака. На титры, полученные в питательных средах с более высокой питательной ценностью, также сказалось отрицательное влияние даже в течение времени, когда жизнеспособность является сопоставимой для всех культур. Меньшие по питательной ценности культуры без дополнительных витаминов и аминокислот (прогоны SF3 и SF4) сохраняют высокую жизнеспособность при хорошей производительности и дают материал хорошего качества (смотри раздел Данных ниже).
В этом примере 1 с использованием одной замены питательной среды через 24 ч с последующей 96часовой фазой производства (без дальнейшей замены среды в течение 96-часового периода) показано, что среда, предназначенная для использования в перфузии (в которой среду непрерывно или периодически заменяют), обязательно требует пониженных уровней питательных веществ до уровней ниже, чем при использовании питательной среды в прогонах SF3 и SF4. Соответственно, как следует из примеров 2 и 3 ниже, в питательной среде, используемой в перфузионном способе, следует применять суммарное содержание аминокислот менее 70 мМ и предпочтительно, суммарное содержание аминокислот в пределах от приблизительно 15 до приблизительно 30 мМ также приводит к превосходной плотности клеток, жизнеспособности клеток и продукции титра. Под суммарным содержанием аминокислот в данном описании следует понимать суммарное устойчивое состояние концентрации аминокислот на основании объема реакционного перфузионного сосуда.
Результаты примера 1.
В табл. 1 ниже приведены питательные среды, используемые в пяти экспериментах (прогоны от SF3 до SF7), в которых, как описано выше, происходит замена среды после пассирования в течение 24 ч и затем процесс продолжают (без какой-либо дальнейшей замены среды) в течение еще 96 ч. В этом эксперименте сравнивают низкие по питательной ценности среды (прогоны SF3, SF4) с более высокими по питательной ценности средами (прогоны SF5, SF6, SF6 и SF7). Питательные среды, показанные в таблице, использованы для дополнения базовой среды, состоящей из продуктов BalanCD и Hycell (как указано в перечисленных выше материалах). Витамины (наименование Invitrogen, номер по каталогу Cat # 11120052) и аминокислоты (наименование Invitrogen, номер по каталогу Cat # 11130-036) добавляют в концентрации от 1 х из стока 100 х.
Таблица 1. Перфузионные питательные среды
Добавки | SF3 Питательная среда с более низкой питательной ценностью | SF4 Питательная среда с более низкой питательной ценностью | SF5 Питательная среда с более высокой питательной ценностью | SF6 Питательная среда с более высокой питательной ценностью | SF7 Питательная среда с более высокой питательной ценностью |
CHOZN | 10% | 10% | 10% | 10% | 2 0% |
ГСХ | 7,5% | 7,5% | 7,5% | ||
Добавка 1 | 10% | 10% | 10% | 10% | 2 0% |
L-Глутамин | 8 мМ | 8 мМ | 8 мМ | 8 мМ | 8 мМ |
Витамины | 1 х | 1 х | |||
АК | 1 х | ||||
Гал | 10 мМ | 10 мМ | 10 мМ | 10 мМ | 10 мМ |
На фиг. 1 приведены данные по плотности жизнеспособных клеток (ПЖК) культур, содержащих низкие концентрации питательной среды (прогоны SF3 и SF4) в соответствии с настоящим изобретением. Следует отметить, что получают очень высокие плотности культур. Относительно менее насыщенная среда (10% CHOZN+7,5% гидролизата хлопковых семян (ГХС) и 10% Добавки 1 и без дополнительных добавок витаминов или аминокислот) (прогоны SF3 и SF4) при условии достаточной питательной поддержки клеток для поддержания высокой жизнеспособности по меньшей мере в течение 96 ч.
На фиг. 2 показано (в случае прогонов SF5, SF6 и SF7), что более обогащенные питательные среды (в результате добавок витаминов и аминокислот или сложных питательных сред) приводят в результате к снижению продолжительности жизни культуры. В частности, нами обнаружено, что добавление аминокислот в концентрациях, которые, предположительно, превышают требования метаболизма культуры, приводит к быстрому снижению жизнеспособности. Также отмечено, что все культуры с более короткой
- 6 037238 продолжительностью жизни (например, прогоны SF6 и SF7) производят высокие уровни аммиака (см.
фиг. 3).
На фиг. 3 показано, что культуры (см. прогоны SF6 и SF7 в табл. 1 выше) с использованием более обогащенных питательных сред проявляют неприемлемо высокую производительность по аммиаку, которая, как мы полагаем, может вызывать или приводить к преждевременному снижению жизнеспособности.
На фиг. 4 показано, что производство белка в среде с более высокой питательной ценностью (например, прогоны SF5, SF6 и SF7) претерпевает отрицательное влияние, что показано сокращением титра. Сравните производство культур в среде с использованием питательных сред с пониженной питательной ценностью SF3 и SF4 согласно изобретению с производством в культуральной среде с использованием питательных сред с повышенной питательной ценностью SF5, SF6 и SF7.
Пример 2.
На основании данных, полученных в примере 1, и в соответствии с нашим изобретением нами обнаружено, что среда с пониженной питательной ценностью, такая как применяемая в прогонах SF3 и SF4 в примере 1 выше, может быть модифицирована для дальнейшего существенного снижения суммарной концентрации аминокислот при использовании в перфузионном способе, подвергающемся непрерывной или периодической замене среды. В частности, в таком перфузионном способе при общей концентрации аминокислот менее 70 мМ и предпочтительно в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 65 мМ и наиболее предпочтительно в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 30 мМ поддерживаются метаболические потребности клеточной культуры в перфузионном способе производства терапевтических белков, таких как, например, слитый белок TNFR-Fc, или моноклональные антитела к TNF. Соответственно в перфузионном способе с периодической заменой среды используют перфузионный процесс согласно изобретению, в котором питательную среду, имеющую суммарную концентрацию аминокислот менее 70 мМ, и предпочтительно, в интервале от приблизительно 15 до приблизительно 65 мМ, и наиболее предпочтительно, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мМ, заменяют через каждые 24 часа свежей средой. Такой способ, в котором имитируют перфузию, эквивалентен скорости перфузии 1 объема биореактора в день. Клетки инокулируют при плотности предпочтительно 50 млн клеток на миллилитр и среду заменяют через каждые 24 ч в течение в общей сложности 3 замен. Культивирование завершают на 4-й день (всего 96 ч). Жизнеспособную плотность клеток и жизнеспособность регистрируют ежедневно. Титр и профиль изоформы, отражающие качество продукта, определяют для каждого отобранного образца с использованием соответствующих аналитических методов, известных в данной области техники. Клеткам может требоваться приблизительно 3 дня (72 ч) для постепенного перехода к рабочему режиму метаболизма, что отражается улучшенным титром и качеством продукции (96-часовые образцы). Результатом процесса является превосходная плотность клеток и жизнеспособность клеток, а также превосходный титр, несмотря на использование питательной среды, содержащей существенно более низкие суммарные концентрации аминокислот, по сравнению со средами, обычно используемыми в периодических способах, таких как рекомендовано в патентном документе с номером U.S. Patent 7300773, в котором требуется превышение суммарной концентрации аминокислот уровня 70 мМ.
Пример 3. Перфузия с непрерывной заменой среды
Повторяют пример 2, за исключением того, что используют непрерывный перфузионный процесс, в котором свежую среду непрерывно подают в реактор и отработанную среду непрерывно удаляют способом, хорошо известным в данной области техники, в результате чего в соответствии с настоящим изобретением концентрации в устойчивом состоянии аминокислоты в питательной среде в реакторе составляют менее 70 мМ и предпочтительно в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 65 мМ, и наиболее предпочтительно в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 55 мМ. Непрерывный перфузионный способ приводит к превосходной плотности клеток, выживаемости клеток и титру. В дополнение к требованиям по суммарной концентрации аминокислот, питательную среду предпочтительно составляют таким образом, что при концентрации в устойчивом состоянии среды в перфузионном реакторе соблюдается один или более из следующих критериев: (i) суммарное количество в устойчивом состоянии аминокислот на единицу объема меньше чем приблизительно 70 мМ; (ii) мольное соотношение в устойчивом состоянии глютамина и суммарного аспарагина составляет больше чем приблизительно 2; (iii) мольное соотношение в устойчивом состоянии глутамина и суммарной концентрации аминокислот составляет больше чем приблизительно 0,2; (iv) мольное соотношение в устойчивом состоянии неорганических ионов и суммарной аминокислоты больше чем 1 и (v) суммарное количество в устойчивом состоянии глутамина и аспарагина в единице объема составляет менее 16 мМ. Термин в устойчивом состоянии предназначен для обозначения того, что концентрация и соотношение компонентов в питательной среде, выраженное выше, остаются, по существу, постоянными на указанных уровнях в реакционном перфузионном сосуде.
Пример 4.
Нами оценивались различные композиции сред, делающие возможным надежную производительность культуры в условиях перфузии в отношении роста, производительности и качества продукции. В одном из наших экспериментов, в котором достигается плотность клеток 10 млн клеток на миллилитр,
- 7 037238 мы тестировали базальную среду SFM4CHO, дополненную двумя различными концентрациями питательной среды Cell Boost 5, и обнаружили, что менее насыщенная (10%-ная питательная среда), приводящая к суммарной концентрации аминокислот приблизительно до 50 мМ, приводит к улучшению качества продукта, в отличие от культуры, которая дополнена 20%-ной питательной средой, приводящей к суммарной концентрации аминокислоты приблизительно 100 мМ. Разница в качестве демонстрируется данными, представленными на фиг. 5. Дорожки 2 и 4 демонстрируют распределение заряженных частиц довольно схожее с коммерческим этанерцептом (продукт под наименованием ENBREL®) (дорожка 6), с преобладанием кислотных полос, мигрирующих далее в гель. В противоположность этому образцы из более богатых питательных сред (дорожки 3 и 5) демонстрируют меньшее содержание кислотных, быстро мигрирующих соединений и в меньшей степени похожи на продукт под наименованием ENBREL®.
В последующем эксперименте испытаны более высокие плотности культуральной среды (25 млн клеток на мл) с использованием точно таких же условий питательной среды. Нами обнаружено, что рецептура среды с более низким содержанием питательной среды Cell Boost 5 не способна к поддержанию жизнеспособности культуральной среды, в конечном счете, приводя в результате к снижению качества продукта. Тем не менее, нами также обнаружено, что в то время, как питательная среда, содержащая более высокую суммарную концентрацию аминокислот (прибл. 100 мМ), поддерживает высокую жизнеспособность, качество продукции несравнимо с наблюдаемым при более низкой плотности клеток. Этот результат показал необходимость дальнейших исследований для нахождения других сред и питательных сред, которые могли бы обеспечивать хорошее качество продукции, поддерживая плотности клеток в диапазоне 25-50 млн клеток на мл. Поэтому мы исследовали несколько базальных сред и комбинаций сред в режиме единовременной загрузки для выявления композиций среды, которая способна поддерживать самую высокую долговечность культуры, пассированной в концентрации от 30 до 50 млн клеток на мл культуры. Это исследование включает эксперимент и открытия, указанные в примере 1 выше.
Пример 5. Требования к среде в перфузионном производстве слитого белка TNFR-Fc
Нами проведен ряд экспериментов по замене среды, имитирующей перфузию, с использованием культур высокой плотности (25х106 клеток/мл) в производстве слитого белка TNFR-Fc на стадии разработки, в качестве биоподобного этанерцепту. В этих экспериментах нами последовательно обнаружено, что высокая жизнеспособность может быть достигнута с использованием питательных сред, которые обеспечивают сокращение концентрации питательных веществ. Наши результаты проиллюстрированы экспериментом, в котором были установлены две культуры с высокой плотностью, каждая из которых содержит 25 млн клеток на миллилитр культуры, причем в обеих культурах использованы те же базальные среды (под наименованиями BalanCD/Hycell, 1:1) и дополнительные добавки 10 мМ галактозы и 10 мМ ManNAc. Различие между обеими культурами состоит в уровне содержания питательной среды CHOZN (10% против 20%) и гидролизата хлопковых семян (7,5% против 15%). Обе питательные среды несут дополнительные источники аминокислот в культуральной среде. Жизнеспособность культуры с более низкой концентрацией питательной среды соответствует культуре, которая получает более насыщенную среду. Этот результат показывает, что понижение концентрации питательной среды с 20% (суммарное содержание аминокислот 98 мМ) до 10% (суммарное содержание аминокислот 78 мМ) не ограничивает потребности в питании этой культуры и четко указывает, что суммарная концентрация аминокислоты может быть снижена далее до уровней, которые мы в настоящее время предписываем в настоящем изобретении. Данные показаны на фиг. 6 и 7.
Проведенный анализ среды в отношении содержания аминокислот показывает, что культура с более низким содержанием питательной среды, даже после 48 ч культивирования, существенным образом не истощает запас любой представленной аминокислоты. Это свидетельствует о том, что содержание аминокислот выше, чем потребности культуры в питании и в соответствии с настоящим изобретением, может быть дополнительно сокращена ниже уровня 78 мМ. Соответственно нами обнаружено, что клетки, подвергаемые перфузии в среде при постоянной скорости требуют гораздо более низкие уровни аминокислот и что для скорости перфузии 1 объем биореактора в день обычно требует суммарной концентрации аминокислот в устойчивом состоянии в диапазоне приблизительно 20-50 мМ.
Одним из основных требований в проектах по разработке продукта является высокий уровень экспрессии титра продукта с желаемым качеством. Большинство белков требуют точной посттрансляционной модификации для их терапевтической активности. Например, слитый белок TNFR-FC, произведенный в этом примере, требует существенной степени сиалилирования, что приводит к специфическому распределению изоформ на основании профиля молекулярного заряда. Анализ методом изоэлектрической фокусировки, продемонстрированный в ИЭФ геле (фиг. 8), показывает, что снижение содержания питательной среды не приводит к изменению распределения изоформы продукта по сравнению с коммерческим стандартом и эталонными образцами, полученными из культур, питаемых 20%-ной питательной средой.
На фиг. 8 изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в геле показывает сравнимое распределение изоформ продукта, выделенного из культур, содержащих более низкую (10%-ную) концентрацию питательной среды (как показано на лунках 1 и 4, первая и вторая замены среды, ЗС), по сравнению с изолированны- 8 037238 ми из богатых аминокислотами (20%-ных) питательных сред (как показано на лунках 2 и 5, первая и вторая замены питательной среды, ЗС).
Профиль стандарта показан в лунке 3.
Как видно на фиг. 9, титры, полученные для культур, питаемых менее насыщенной (10%-ной) и богатой (20%-ными) питательными средами, показывают, что более высокая концентрация питательных сред может приводить к снижению производительности культуры. Удовлетворяя потребность клеток в питательных веществах для перфузии, указанной в настоящем изобретении, и, таким образом, избегая излишне обогащенной среды, можно достигать состояния метаболизма культуры при перфузионной обработке, которое приводит к повышению производительности и качества продукта, по сравнению с требованиями к среде, рекомендованными до настоящего времени в данной области техники (см., например, патентный документ с номером US 7300773).
Пример 6.
Для получения слитого белка TNFR-Fc в стадии разработки в качестве биоподобного этанерсепта система посевных ферментеров расширена до качалочных колб большого объема при 37°C в среде SFM4CHO. В производственном биореакторе производят инокулирование пассированием при плотности от 1 до 5х106 клеток/мл в среде, где суммарная концентрация аминокислот варьируется в каждом из девяти отдельных повторений этого эксперимента от приблизительно 15 до приблизительно 70 мМ (см. таблицу ниже). В каждом из прогонов температура во время фазы производства (при непрерывной перфузии) составляет от 33,5 до 35°C. Устройство удержания клеток марки ATF™ (Refine Technology) используют для рециркуляции среды (содержащей отходы и желаемый продукт) через полый волоконный фильтр с частотой рециркуляции от 0,05 до 2,0 рабочих объемов культуры в минуту. Культуру сначала расширяют в фазе роста в течение от 0 до 2 дней и затем инициируют перфузию при скорости от 0,2 до 2 объемов культуральной среды в день для облегчения фазы производства. Новую среду добавляют, как только отработанную среду (содержащую продукт) собирают через полый волоконный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Собранную жидкость охлаждают до 2-8°C, очищают захватом в среде Protein A Resin. Аликвоты анализируют на титр и параметры качества продукции, такие как распределение N-гликанов и анализ Hi-C (для оценки относительных количеств правильно свернутого этанерцепта, по сравнению с неправильно свернутым/агрегированным (неактивным) материалом). Суммарные концентрации аминокислот, исследованные в этих опытах, показаны ниже:
Суммарная (в устойчивом состоянии) концентрация аминокислот (прим.)
Анализ плотности клеток, жизнеспособности, качества жизнеспособного продукта и титр для каждого из прогонов от 1 до 9 демонстрируют превосходные результаты в отношении этих характеристик при нижнем уровне диапазона суммарной концентрации аминокислот от 15 до 70 мМ, предпочтительно, в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 30 мМ с усиленным ухудшением этих характеристик при движении в сторону более высокого значения диапазона.
Пример 7.
Для получения слитого белка TNFR-Fc в стадии разработки в качестве биоподобного этанерсепту, система посевных ферментеров расширена до качалочных колб большого объема при 37°C в среде SFM4CHO. В производственном биореакторе производят инокулирование пассированием при плотности от 0,3 до 0,75х106 клеток/мл в серии перфузионных биореакторов в среде, где суммарная концентрация аминокислот равна от приблизительно 20 до приблизительно 56 мМ. В каждом из прогонов температура во время фазы производства (при непрерывной перфузии) составляет от 35 до 37°C. Устройство удержания клеток марки ATF™ (Refine Technology) используют для рециркуляции среды (содержащей отходы и желаемый продукт) через полый волоконный фильтр с частотой рециркуляции от 0,5 до 2,0 рабочих объемов культуры в день. Культуру сначала расширяют в фазе роста вплоть до 8 дней, с перфузией при клеточно-специфической скорости перфузии от 0,05 до 0,1 нл на клетку в день. Температуру понижают до, например, 33,5°C, чтобы способствовать фазе производства. Новую среду добавляют, как только отработанную среду (содержащую продукт) собирают через полый волоконный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Собранную жидкость охлаждают до 2-8°C, очищают захватом в среде Protein A Resin. Аликвоты анализируют на титр и параметры качества продукции, такие как распределение N-гликанов и анализ Hi-C (для оценки относительных количеств правильно свернутого этанерцепта, по сравнению с неправильно
- 9 037238 свернутым/агрегированным (неактивным) материалом).
Анализ жизнеспособной плотности клеток, жизнеспособности, качества продукта и титра для каждого прогона демонстрирует превосходные результаты в отношении этих характеристик при нижнем уровне диапазона суммарной концентрации аминокислот от 20 до 56 мм, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 30 мМ. Как показано на фиг. 10, культура, выращенная в соответствии с настоящим описанием, достигает приблизительно 30 млн клеток/мл в течение фазы роста длительностью девять дней и эта концентрация клеток поддерживается при высокой жизнеспособности во время фазы производства, которая продлевается еще на 11 до 12 дней.
Claims (14)
1. Способ производства белка, включающий стадию получения белка посредством перфузии в присутствии питательной среды с суммарной концентрацией аминокислот от 15 до менее 70 мМ, где в стадии получения белка достигается титр белка, составляющий по меньшей мере 300 мкг/мл, и где указанный белок представляет собой слитый белок TNFR-Fc.
2. Способ по п.1, где питательная среда содержит суммарную концентрацию аминокислот в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из от 15 до 20 мМ; от 20 до 25 мМ; от 25 до 30 мМ; от 30 до 35 мМ; от 35 до 40 мМ; от 40 до 45 мМ; от 45 до 50 мМ; от 50 до 55 мМ; от 55 до 60 мМ; от 60 до 65 мМ и между 65 и 70 мМ.
3. Способ по п.1, где слитый белок TNFR-Fc представляет собой этанерцепт.
4. Способ по п.1, где питательная среда содержит один или более из следующих компонентов: базовая среда SFM4CHO®, базовая среда BalanCD, базовая среда Hycell, гидролизат хлопковых семян, дексаметазон, ManNAc и/или D-(+)-галактоза.
5. Способ по п.1, включающий следующие стадии: (a) подготовка смеси, содержащей клетки, способные экспрессировать требуемый терапевтический белок, и культуральной среды, подходящей для осуществления такой экспрессии; (b) экспрессия указанного терапевтического белка в подходящем сосуде, содержащем указанную смесь, посредством инициирования производства белка клетками и (с) периодическое или непрерывное удаление отработанной культуральной среды из реакционного сосуда и добавление в него свежей культуральной среды.
6. Способ по п.5, где клетки являются клетками СНО.
7. Способ по п.5, где перед стадией (а) клетки, способные к экспрессии белка, выращивают в фазе роста при температуре, выбранной из (i) от 28 до 37°C и (ii) от 35 до 36°C.
8. Способ по п.7, где фазу производства, обособленную от фазы роста и следующую за ней, проводят при температуре, выбранной из (i) больше чем 32°C; (ii) больше чем 34°C; (iii) больше чем 35°C; (iv) диапазона от 33 до 36°C; (v) диапазона от 35 до 36°C; (vi) 32,5°C; (vii) 33,5°C; (viii) 34,5°C и (ix) 35,5°C.
9. Способ по п.8, где вырабатываемый белок представляет собой этанерцепт.
10. Перфузионный способ получения терапевтического белка, включающий следующие стадии: (а) подготовка смеси, содержащей клетки СНО, способные к экспрессии белка, и культуральной среды, подходящей для проведения такой экспрессии; (b) в подходящем сосуде, содержащем указанную смесь, инициирование производства белка клетками и (с) периодическое или непрерывное удаление отработанной культуральной среды из и добавление свежей культуральной среды в реакционный сосуд, где культуральная среда содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из сложной химически определенной питательной среды, дексаметазона, ManNAc, гидролизата хлопковых семян и D-(+)-галактозы, и указанная культуральная среда имеет суммарную концентрацию аминокислот от 15 до 65 мМ, где в стадии получения белка достигается титр белка, составляющий по меньшей мере 300 мкг/мл, и где указанный белок представляет собой слитый белок TNFR-Fc.
11. Способ по п. 10, где слитый белок TNFR-Fc представляет собой этанерцепт.
12. Перфузионный способ по п.11, где перед стадией (а) клетки, способные к экспрессии этанерцепта, выращивают в фазе роста при температуре, выбранной из (i) от 28 до 37°C и (ii) от 35 до 36°C.
13. Перфузионный способ по п.12, где во время производства этанерцепта, происходящего на стадиях (b) и (с), в реакционном сосуде поддерживают температуру, выбранную из (i) больше чем 32°C; (ii) больше чем 34°C; (iii) больше чем 35°C; (iv) из диапазона от 33 до 36°C; (v) из диапазона от 35 до 36°C; (vi) 32,5°C; (vii) 33,5°C; (viii) 34,5°C и (ix) 35,5°C.
14. Композиция питательной среды для получения терапевтического слитого белка TNFR-Fc в сосуде перфузионной реакции, содержащая суммарную концентрацию аминокислот в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из концентраций от 15 до 20 мМ; от 20 до 25 мМ; от 25 до 30 мМ; от 30 до 35 мМ; от 35 до 40 мМ; от 40 до 45 мМ; от 45 до 50 мМ; от 50 до 55 мМ; от 55 до 60 мМ; от 60 до 65 мМ, и по меньшей мере одно из гидролизата хлопковых семян, дексаметазона, ManNAc и D-(+)-галактозы.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461933665P | 2014-01-30 | 2014-01-30 | |
PCT/US2015/013524 WO2015116820A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-01-29 | Perfusion media |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201691542A1 EA201691542A1 (ru) | 2016-12-30 |
EA037238B1 true EA037238B1 (ru) | 2021-02-25 |
Family
ID=53678412
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA202092845A EA202092845A1 (ru) | 2014-01-30 | 2015-01-29 | Перфузионная среда |
EA201691542A EA037238B1 (ru) | 2014-01-30 | 2015-01-29 | Перфузионная среда |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA202092845A EA202092845A1 (ru) | 2014-01-30 | 2015-01-29 | Перфузионная среда |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10047141B2 (ru) |
EP (2) | EP3099324B1 (ru) |
JP (2) | JP6749838B2 (ru) |
KR (1) | KR20160113710A (ru) |
AU (2) | AU2015210930B2 (ru) |
BR (1) | BR112016017630A2 (ru) |
CA (1) | CA2937965A1 (ru) |
EA (2) | EA202092845A1 (ru) |
ES (1) | ES2784775T3 (ru) |
IL (2) | IL246816B (ru) |
MX (2) | MX362923B (ru) |
SG (1) | SG11201605860SA (ru) |
WO (1) | WO2015116820A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8883146B2 (en) | 2007-11-30 | 2014-11-11 | Abbvie Inc. | Protein formulations and methods of making same |
JP6749838B2 (ja) * | 2014-01-30 | 2020-09-02 | コヒラス・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド | かん流培地 |
US20220315887A1 (en) * | 2019-08-01 | 2022-10-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of improving protein productivity in fed-batch cell cultures |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080108106A1 (en) * | 2006-11-03 | 2008-05-08 | Wyeth | Glycolysis-inhibiting substances in cell culture |
US20090068705A1 (en) * | 2007-03-02 | 2009-03-12 | Wyeth | Use of Copper Glutamate in Cell Culture for Production of Polypeptides |
US20110091936A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-04-21 | Martin Gawlitzek | Production of proteins in glutamine-free cell culture media |
US20130150554A1 (en) * | 2010-08-20 | 2013-06-13 | Wyeth Llc | Cell culture of growth factor-free adapted cells |
US20130224855A1 (en) * | 2010-08-31 | 2013-08-29 | Abhishek Gupta | Culture medium for eukaryotic cells |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7294481B1 (en) | 1999-01-05 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Method for producing recombinant proteins |
ES2354610T5 (es) * | 2002-12-23 | 2020-09-14 | Bristol Myers Squibb Co | Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína |
TWI364458B (en) * | 2004-08-27 | 2012-05-21 | Wyeth Res Ireland Ltd | Production of tnfr-lg |
CN103172737A (zh) * | 2005-06-30 | 2013-06-26 | Abbvie公司 | Il-12/p40结合蛋白 |
AT503429B1 (de) | 2006-08-14 | 2007-10-15 | Sticht Fertigungstech Stiwa | Übergabevorrichtung, transportanlage und verfahren zum handhaben von teileträgern |
WO2008024769A2 (en) * | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Raven Biotechnologies, Inc. | Intensified perfusion production method |
US8039231B2 (en) * | 2008-04-17 | 2011-10-18 | Wyeth Llc | Methods for enhanced production of bone morphogenetic proteins |
US9540426B2 (en) * | 2009-10-06 | 2017-01-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Mammalian cell culture processes for protein production |
SG185038A1 (en) | 2010-04-26 | 2012-11-29 | Novartis Ag | Improved cell culture medium |
CN107988166B (zh) | 2011-07-01 | 2022-03-15 | 美国安进公司 | 哺乳动物细胞培养 |
CA2862433A1 (en) * | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
SG10201610788VA (en) * | 2012-02-29 | 2017-03-30 | Gilead Biologics Inc | Antibodies to matrix metalloproteinase 9 |
CN104271734A (zh) * | 2012-03-08 | 2015-01-07 | 菲仕兰产品有限公司 | 用于真核细胞的培养基 |
JP6749838B2 (ja) * | 2014-01-30 | 2020-09-02 | コヒラス・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド | かん流培地 |
-
2015
- 2015-01-29 JP JP2016549376A patent/JP6749838B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-01-29 BR BR112016017630A patent/BR112016017630A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2015-01-29 ES ES15742902T patent/ES2784775T3/es active Active
- 2015-01-29 SG SG11201605860SA patent/SG11201605860SA/en unknown
- 2015-01-29 EA EA202092845A patent/EA202092845A1/ru unknown
- 2015-01-29 EA EA201691542A patent/EA037238B1/ru unknown
- 2015-01-29 US US14/609,225 patent/US10047141B2/en active Active
- 2015-01-29 AU AU2015210930A patent/AU2015210930B2/en not_active Ceased
- 2015-01-29 EP EP15742902.8A patent/EP3099324B1/en active Active
- 2015-01-29 CA CA2937965A patent/CA2937965A1/en not_active Abandoned
- 2015-01-29 EP EP20162652.0A patent/EP3683316A1/en not_active Withdrawn
- 2015-01-29 KR KR1020167023816A patent/KR20160113710A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-01-29 WO PCT/US2015/013524 patent/WO2015116820A1/en active Application Filing
- 2015-01-29 MX MX2016009980A patent/MX362923B/es active IP Right Grant
-
2016
- 2016-07-18 IL IL246816A patent/IL246816B/en active IP Right Grant
- 2016-07-29 MX MX2019002182A patent/MX2019002182A/es unknown
-
2018
- 2018-08-13 US US16/102,157 patent/US11001623B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-20 IL IL267558A patent/IL267558B/en unknown
-
2020
- 2020-03-25 JP JP2020053939A patent/JP2020115867A/ja active Pending
- 2020-07-22 AU AU2020207824A patent/AU2020207824A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080108106A1 (en) * | 2006-11-03 | 2008-05-08 | Wyeth | Glycolysis-inhibiting substances in cell culture |
US20090068705A1 (en) * | 2007-03-02 | 2009-03-12 | Wyeth | Use of Copper Glutamate in Cell Culture for Production of Polypeptides |
US20110091936A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-04-21 | Martin Gawlitzek | Production of proteins in glutamine-free cell culture media |
US20130150554A1 (en) * | 2010-08-20 | 2013-06-13 | Wyeth Llc | Cell culture of growth factor-free adapted cells |
US20130224855A1 (en) * | 2010-08-31 | 2013-08-29 | Abhishek Gupta | Culture medium for eukaryotic cells |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150210750A1 (en) | 2015-07-30 |
WO2015116820A1 (en) | 2015-08-06 |
IL267558A (en) | 2019-08-29 |
BR112016017630A2 (pt) | 2017-08-08 |
KR20160113710A (ko) | 2016-09-30 |
AU2020207824A1 (en) | 2020-08-06 |
MX362923B (es) | 2019-02-25 |
AU2015210930B2 (en) | 2020-04-30 |
IL267558B (en) | 2022-02-01 |
US10047141B2 (en) | 2018-08-14 |
MX2016009980A (es) | 2016-11-15 |
US11001623B2 (en) | 2021-05-11 |
IL246816A0 (en) | 2016-08-31 |
JP6749838B2 (ja) | 2020-09-02 |
EA201691542A1 (ru) | 2016-12-30 |
EP3099324A4 (en) | 2017-07-12 |
US20180346550A1 (en) | 2018-12-06 |
EA202092845A1 (ru) | 2021-06-30 |
ES2784775T3 (es) | 2020-09-30 |
IL246816B (en) | 2019-07-31 |
SG11201605860SA (en) | 2016-08-30 |
AU2015210930A1 (en) | 2016-08-04 |
EP3099324B1 (en) | 2020-04-01 |
EP3683316A1 (en) | 2020-07-22 |
CA2937965A1 (en) | 2015-08-06 |
JP2017508448A (ja) | 2017-03-30 |
MX2019002182A (es) | 2020-11-12 |
EP3099324A1 (en) | 2016-12-07 |
JP2020115867A (ja) | 2020-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11634476B2 (en) | Mammalian cell culture | |
US20210061890A1 (en) | Methods of shifting an isoelectric profile of a protein product and uses thereof | |
CN103080300B (zh) | 增加细胞培养物的产率和活力的二肽 | |
US11952605B2 (en) | Methods for increasing mannose content of recombinant proteins | |
AU2020207824A1 (en) | Perfusion media | |
JP2020073503A (ja) | タンパク質産生方法 | |
AU2017200458B2 (en) | A cell culture medium and methods for enhancing recombinant antibody purity | |
CN108823267A (zh) | 调节cho-k1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法 |