JP2003510070A - 細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地 - Google Patents
細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地Info
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Abstract
(57)【要約】
本明細書中には、細胞（特に、哺乳動物細胞）の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地が、記載され、それによりその培地は、一定比率のダイズ加水分解産物を含む。本発明は、細胞の培養のための無タンパク質かつ無血清の培地を開示し、その培地は、ダイズ加水分解産物を含み、そのダイズ加水分解産物のうちの少なくとも４０％が５００ダルトン以下の分子量を有する。また、本発明は、そのような培地を使用する、細胞培養およびタンパク質産生のためのプロセスも開示する。本発明はまた、そのような培地の作製方法もまた、開示する。
Description
【０００１】
本発明は、細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地に関する。
【０００２】
細胞の培養、特に、真核生物細胞もしくは哺乳動物細胞の培養は、効率のよい
増殖および所望されるタンパク質の産生に必要とされる、栄養物質および増殖物
質をその細胞に利用可能にする、特別の培地の使用を絶えず必要とする。一般に
、血清または血清（例えば、ウシ血清）由来の化合物が、この点について培地の
成分として使用される。
増殖および所望されるタンパク質の産生に必要とされる、栄養物質および増殖物
質をその細胞に利用可能にする、特別の培地の使用を絶えず必要とする。一般に
、血清または血清（例えば、ウシ血清）由来の化合物が、この点について培地の
成分として使用される。
【０００３】
しかし、細胞培地におけるヒト供給源もしくは動物供給源由来の血清またはタ
ンパク質添加物の使用に関して、特に、ヒトに投与される医学的薬剤の調製のた
めの開始材料がその細胞培養を介して利用可能にされる場合に、多数の問題が存
在する。
ンパク質添加物の使用に関して、特に、ヒトに投与される医学的薬剤の調製のた
めの開始材料がその細胞培養を介して利用可能にされる場合に、多数の問題が存
在する。
【０００４】
従って、このような血清調製物に関して、その組成および質は、バッチ間です
でに変化する。これは、まさに、このような調製物のドナー生物の相違が原因で
ある。このことは、特に、細胞集団の標準化およびこのような細胞の標準的増殖
条件の確立について、かなりの問題を示す。しかし、使用される血清材料の集中
的かつ一定の品質管理が、すべての場合において必要とされる。しかし、これは
、特に血清のような複合組成物に関して、非常に時間がかかりかつコスト集約的
である。
でに変化する。これは、まさに、このような調製物のドナー生物の相違が原因で
ある。このことは、特に、細胞集団の標準化およびこのような細胞の標準的増殖
条件の確立について、かなりの問題を示す。しかし、使用される血清材料の集中
的かつ一定の品質管理が、すべての場合において必要とされる。しかし、これは
、特に血清のような複合組成物に関して、非常に時間がかかりかつコスト集約的
である。
【０００５】
さらに、このような複合調製物は、特に細胞培養から回収されるべき組換えタ
ンパク質についての精製プロセスの状況において、破壊的様式で作用し得る複数
のタンパク質を含む。これは特に、回収されるべきタンパク質と相同または類似
のタンパク質に当てはまる。当然、これらの問題は、特に深刻である。なぜなら
、使用される培地中の生体付属物（ｐｅｎｄａｎｔ）（例えば、ウシタンパク質
）は、（例えば、組換えタンパク質のみ特異的に指向するがそのウシタンパク質
は指向しない抗体を用いる）非常に特異的な示差的精製を介してのみ、精製の状
況において容易に除去され得るからである（Ｂｊｏｅｒｃｋ，Ｌ．、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、１９９８、第１４０巻、１１９４〜１１９７頁；Ｎｉｌｓｏｎら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．、１９９３、１６４、３３〜４０頁）。
ンパク質についての精製プロセスの状況において、破壊的様式で作用し得る複数
のタンパク質を含む。これは特に、回収されるべきタンパク質と相同または類似
のタンパク質に当てはまる。当然、これらの問題は、特に深刻である。なぜなら
、使用される培地中の生体付属物（ｐｅｎｄａｎｔ）（例えば、ウシタンパク質
）は、（例えば、組換えタンパク質のみ特異的に指向するがそのウシタンパク質
は指向しない抗体を用いる）非常に特異的な示差的精製を介してのみ、精製の状
況において容易に除去され得るからである（Ｂｊｏｅｒｃｋ，Ｌ．、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、１９９８、第１４０巻、１１９４〜１１９７頁；Ｎｉｌｓｏｎら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．、１９９３、１６４、３３〜４０頁）。
【０００６】
しかし、培養培地における、血清もしくは血清由来の化合物の使用における明
白な問題はまた、マイコプラスマ、ウイルスまたはＢＳＥ因子による汚染の危険
である。ヒト血液由来の調製物に関連して、ウイルス（例えば、肝炎ウイルスも
しくはＨＩＶ）による汚染の危険は、この関連において特に強調されなければな
らない。ウシ材料に由来する血清もしくは血清成分に関して、特に、ＢＳＥ汚染
の危険が存在する。これに加え、さらに、すべての血清由来材料は、未だ未知の
疾患誘導因子により汚染され得る。
白な問題はまた、マイコプラスマ、ウイルスまたはＢＳＥ因子による汚染の危険
である。ヒト血液由来の調製物に関連して、ウイルス（例えば、肝炎ウイルスも
しくはＨＩＶ）による汚染の危険は、この関連において特に強調されなければな
らない。ウシ材料に由来する血清もしくは血清成分に関して、特に、ＢＳＥ汚染
の危険が存在する。これに加え、さらに、すべての血清由来材料は、未だ未知の
疾患誘導因子により汚染され得る。
【０００７】
細胞がその表面に十分接着することを確保しそして細胞から所望の物質の十分
な産生を確保するための血清成分の添加は、少数の例外を除き、固体表面上での
細胞の培養にとって正に不可欠であると以前は見なされていた。従って、例えば
、ＷＯ９１／０９９３５に記載される方法を用いて、表面依存性永続（ｐｅｒｍ
ａｎｅｎｔ）細胞（好ましくは、ベロ細胞）の無血清かつ無タンパク質の培養に
よって、ＦＳＭＥウイルス／ウイルス抗原の無血清かつ無タンパク質の培養のた
めのプロセスを達成することが、可能であった（ＷＯ ９６／１５２３１を参照
のこと）。しかし、これらは、組換え細胞ではなく、むしろ、溶菌プロセスにお
けるウイルス抗原の産生のために使用される宿主細胞である。
な産生を確保するための血清成分の添加は、少数の例外を除き、固体表面上での
細胞の培養にとって正に不可欠であると以前は見なされていた。従って、例えば
、ＷＯ９１／０９９３５に記載される方法を用いて、表面依存性永続（ｐｅｒｍ
ａｎｅｎｔ）細胞（好ましくは、ベロ細胞）の無血清かつ無タンパク質の培養に
よって、ＦＳＭＥウイルス／ウイルス抗原の無血清かつ無タンパク質の培養のた
めのプロセスを達成することが、可能であった（ＷＯ ９６／１５２３１を参照
のこと）。しかし、これらは、組換え細胞ではなく、むしろ、溶菌プロセスにお
けるウイルス抗原の産生のために使用される宿主細胞である。
【０００８】
これとは対照的に、組換え調製のために顕著に使用される細胞、例えば、ＣＨ
Ｏ細胞は、限定される程度にしか接着できない。従って、従来の方法により増殖
されたＣＨＯ細胞は、血清含有条件下でのみ平滑および多孔性の両方のマイクロ
キャリアに結合する（米国特許第４，９７３，６１６号；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ９（１９９２）、２４７〜２５３を参照のこと）。しかし、このよう
な細胞は、無血清条件下で増殖された場合、それらは、この特性を失いそして平
滑なキャリアに接着しないか、または、他の接着促進添加物（例えば、フィブロ
ネクチン、インシュリンまたはトランスフェリン）が培地中に提供されなかった
場合は、それらは平滑なキャリアから容易に剥離する。しかし、これらもまた、
血清に由来するタンパク質である。
Ｏ細胞は、限定される程度にしか接着できない。従って、従来の方法により増殖
されたＣＨＯ細胞は、血清含有条件下でのみ平滑および多孔性の両方のマイクロ
キャリアに結合する（米国特許第４，９７３，６１６号；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ９（１９９２）、２４７〜２５３を参照のこと）。しかし、このよう
な細胞は、無血清条件下で増殖された場合、それらは、この特性を失いそして平
滑なキャリアに接着しないか、または、他の接着促進添加物（例えば、フィブロ
ネクチン、インシュリンまたはトランスフェリン）が培地中に提供されなかった
場合は、それらは平滑なキャリアから容易に剥離する。しかし、これらもまた、
血清に由来するタンパク質である。
【０００９】
これに代わって、これらの細胞は、懸濁培養技術を使用して、ならびに、例え
ば、バッチプロセスを使用して、または連続培養技術を使用して、増殖され得る
。培養は、好ましくは、ケモスタットプロセスを使用して行われる（Ｏｚｔｕｒ
ｋ Ｓ．Ｓ．ら、１９９６、Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、
ＢＩＯＴ １６４、Ｐａｙｎｅ Ｇ．Ｆ．ら、「Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｃｅ
ｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１９８７、Ｌｙｄｅｒｓｅｎ
Ｂ．Ｋ．編、Ｈａｕｓｅｒ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２０６〜２１２頁）。Ｋａ
ｔｔｉｎｇｅｒ Ｈ．ら（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、１９９６、１５Ａ、１９３〜２０７）は、無タンパク質培地における細胞の
長期培養を記載するが、これらの細胞は、キャリア上で培養されなければならず
、連続培養技術としての代替法を残さない。これらの細胞は、キャリアの表面に
接着した場合、増殖の減少、そして結果として増殖因子の需要の減少が原因で、
長期の安定性のみを示すと記載される。
ば、バッチプロセスを使用して、または連続培養技術を使用して、増殖され得る
。培養は、好ましくは、ケモスタットプロセスを使用して行われる（Ｏｚｔｕｒ
ｋ Ｓ．Ｓ．ら、１９９６、Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、
ＢＩＯＴ １６４、Ｐａｙｎｅ Ｇ．Ｆ．ら、「Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｃｅ
ｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１９８７、Ｌｙｄｅｒｓｅｎ
Ｂ．Ｋ．編、Ｈａｕｓｅｒ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２０６〜２１２頁）。Ｋａ
ｔｔｉｎｇｅｒ Ｈ．ら（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、１９９６、１５Ａ、１９３〜２０７）は、無タンパク質培地における細胞の
長期培養を記載するが、これらの細胞は、キャリア上で培養されなければならず
、連続培養技術としての代替法を残さない。これらの細胞は、キャリアの表面に
接着した場合、増殖の減少、そして結果として増殖因子の需要の減少が原因で、
長期の安定性のみを示すと記載される。
【００１０】
さらに、先行技術において、血清含有条件から開始する無タンパク質培地に細
胞を適応させる試みが、いくつかの場合においてなされている。しかし、このよ
うな適応に関して、血清含有条件と比較して、発現されるタンパク質の収量およ
び組換え細胞の生産性が、適応後に無タンパク質培地において顕著に減少するこ
とが、繰り返し見出された（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．４０（１９９４）、６９１〜６５８）。
胞を適応させる試みが、いくつかの場合においてなされている。しかし、このよ
うな適応に関して、血清含有条件と比較して、発現されるタンパク質の収量およ
び組換え細胞の生産性が、適応後に無タンパク質培地において顕著に減少するこ
とが、繰り返し見出された（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．４０（１９９４）、６９１〜６５８）。
【００１１】
高い細胞密度に関して、組換えタンパク質の産生は、時に、かなり限定される
こともまた、見出されている。細胞を無タンパク質培地または無血清培地に適応
させる試みの間に、使用される細胞の増殖が減少した不安定性もまた、繰り返し
見出され、その結果、発現が減少した細胞が産生されるかまたは非産生細胞が産
生され、それによりこれらは、無タンパク質かつ無血清培地において、産生細胞
と比較して、増殖の利点を有し、そしてこのことは、これらが、産生細胞を過剰
増殖し、そして最終的に、培養全体が非常に低い生成物収量を生じるという事実
をもたらす。
こともまた、見出されている。細胞を無タンパク質培地または無血清培地に適応
させる試みの間に、使用される細胞の増殖が減少した不安定性もまた、繰り返し
見出され、その結果、発現が減少した細胞が産生されるかまたは非産生細胞が産
生され、それによりこれらは、無タンパク質かつ無血清培地において、産生細胞
と比較して、増殖の利点を有し、そしてこのことは、これらが、産生細胞を過剰
増殖し、そして最終的に、培養全体が非常に低い生成物収量を生じるという事実
をもたらす。
【００１２】
（発明の要旨）
従って、本発明は、組換え細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための可能
性を改善し、そして組換え細胞が、無血清もしくは無タンパク質様式で効率的に
培養され得る、因子およびプロセスを利用可能にする、目的を有する。さらに、
表面依存性細胞を培養するのみでなく、懸濁培養技術を使用することもまた可能
であるはずであり、それにより細胞の生産性の不安定性が可能な程度抑制される
ことが必要である。
性を改善し、そして組換え細胞が、無血清もしくは無タンパク質様式で効率的に
培養され得る、因子およびプロセスを利用可能にする、目的を有する。さらに、
表面依存性細胞を培養するのみでなく、懸濁培養技術を使用することもまた可能
であるはずであり、それにより細胞の生産性の不安定性が可能な程度抑制される
ことが必要である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、さらに、組換え細胞の産生を効率的に増加すること
である。
である。
【００１４】
最後に、本発明に従って、組換え細胞を無血清かつ無タンパク質の培地に適応
させることが、改良されそしてより効率的に構成される必要がある。
させることが、改良されそしてより効率的に構成される必要がある。
【００１５】
本発明に従って、これらの課題は、細胞（特に、哺乳動物細胞）の無タンパク
質かつ無血清の培養のための培地によって達成され、この培地は、この培地が一
定比率のダイズ加水分解産物を含む特徴により特徴付けられる。
質かつ無血清の培養のための培地によって達成され、この培地は、この培地が一
定比率のダイズ加水分解産物を含む特徴により特徴付けられる。
【００１６】
驚くべきことに、上記に定義された目的が、ダイズ加水分解産物を含む培地に
おいて細胞を培養することによって、先行技術において記載される無血清培養の
不利益を許容する必要がなく達成され得ることを示すことが可能であった。先行
技術において公知の他の加水分解産物（例えば、コムギ加水分解産物、イネ加水
分解産物または酵母加水分解産物）と対照的に、ダイズ加水分解産物のみが、本
発明に従う特性を媒介し、そして例えば、組換え標的タンパク質の有意に増加し
た収量をもたらすことが、見出された。これらの用語を扱う場合、用語ダイズ加
水分解産物または用語ダイズペプトンのいずれもが、異なる意味を有することな
く使用され得る。
おいて細胞を培養することによって、先行技術において記載される無血清培養の
不利益を許容する必要がなく達成され得ることを示すことが可能であった。先行
技術において公知の他の加水分解産物（例えば、コムギ加水分解産物、イネ加水
分解産物または酵母加水分解産物）と対照的に、ダイズ加水分解産物のみが、本
発明に従う特性を媒介し、そして例えば、組換え標的タンパク質の有意に増加し
た収量をもたらすことが、見出された。これらの用語を扱う場合、用語ダイズ加
水分解産物または用語ダイズペプトンのいずれもが、異なる意味を有することな
く使用され得る。
【００１７】
本発明に従う培地は、好ましくは、その培地の総乾燥重量ベースで、１０重量
％を超える量のダイズ加水分解産物を含む。一般に、その培地中のダイズ加水分
解産物は、４〜４０％の量で提供される。
％を超える量のダイズ加水分解産物を含む。一般に、その培地中のダイズ加水分
解産物は、４〜４０％の量で提供される。
【００１８】
特定のダイズ加水分解産物の選択は、本発明に従って重要ではない。市場にて
見出される、複数のダイズ調製物（例えば、（例えば、パパインにより）酵素的
に消化された、ダイズ粉末由来のペプトン）が、６．５と７．５との間のｐＨ値
で、そして９％と９．７％との間の総窒素含量で、そして８％と１５％との間の
灰分で、本発明に従って使用され得る。これらは、当業者により細胞培養のため
に一般的に使用される形態の、ダイズ由来のペプトンである。
見出される、複数のダイズ調製物（例えば、（例えば、パパインにより）酵素的
に消化された、ダイズ粉末由来のペプトン）が、６．５と７．５との間のｐＨ値
で、そして９％と９．７％との間の総窒素含量で、そして８％と１５％との間の
灰分で、本発明に従って使用され得る。これらは、当業者により細胞培養のため
に一般的に使用される形態の、ダイズ由来のペプトンである。
【００１９】
好ましい形態の実施形態に従って、本発明に従う培地におけるダイズ加水分解
産物の精製調製物またはその粗画分の使用が、なされる。効率的な培養を妨げ得
る不純物が、好ましくはこの精製の間に除去されるか、またはこの加水分解産物
の精度が、例えば、分子量に関して、改善される。
産物の精製調製物またはその粗画分の使用が、なされる。効率的な培養を妨げ得
る不純物が、好ましくはこの精製の間に除去されるか、またはこの加水分解産物
の精度が、例えば、分子量に関して、改善される。
【００２０】
本発明に従って、限外濾過工程の提供は、実際に、この精製の間で特に価値が
あることが示されている。このことが原因で、限外濾過されたダイズ加水分解産
物の使用が、本発明に従う培地において特に好ましい。
あることが示されている。このことが原因で、限外濾過されたダイズ加水分解産
物の使用が、本発明に従う培地において特に好ましい。
【００２１】
限外濾過は、先行技術において包括的に記載されるプロセスに従って、行われ
得、例えば、規定のカットオフ値の膜フィルターが使用される。
得、例えば、規定のカットオフ値の膜フィルターが使用される。
【００２２】
限外濾過されたダイズぺプトンの精製は、ゲルクロマトグラフィーによって、
例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５もしくはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０または等価な材料を用いる）、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、または「逆相」クロマトグラフィーによって、行われ得る。これ
らは、当業者が精通している先行技術からのプロセスである。この方法を使用し
て、規定の分子量（すなわち、１０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルト
ン以下、より好ましくは３５０ダルトン以下）のダイズ加水分解産物を含む、画
分が選択され得る。従って、本発明はまた、無血清かつ無タンパク質の細胞培養
培地を作製するためのプロセスを包含し、このプロセスは、ダイズ加水分解産物
を得る工程、限外濾過プロセスを使用して、そのダイズ加水分解産物を限外濾過
する工程、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、そのダイズ加水分解産物
画分を精製する工程、および１０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン
以下、より好ましくは３５０ダルトン以下の分子量を有するダイズ加水分解産物
からなるダイズ加水分解産物画分を選択する工程、を包含する。
例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５もしくはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０または等価な材料を用いる）、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、または「逆相」クロマトグラフィーによって、行われ得る。これ
らは、当業者が精通している先行技術からのプロセスである。この方法を使用し
て、規定の分子量（すなわち、１０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルト
ン以下、より好ましくは３５０ダルトン以下）のダイズ加水分解産物を含む、画
分が選択され得る。従って、本発明はまた、無血清かつ無タンパク質の細胞培養
培地を作製するためのプロセスを包含し、このプロセスは、ダイズ加水分解産物
を得る工程、限外濾過プロセスを使用して、そのダイズ加水分解産物を限外濾過
する工程、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、そのダイズ加水分解産物
画分を精製する工程、および１０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン
以下、より好ましくは３５０ダルトン以下の分子量を有するダイズ加水分解産物
からなるダイズ加水分解産物画分を選択する工程、を包含する。
【００２３】
特に有利なダイズ加水分解産物は、以下の特徴によって、特徴付けられる：そ
れが１０．３％と１５．６％との間の遊離アミノ酸含量を有するか、または好ま
しくは１２％と１３．５％との間の遊離アミノ酸含量を有し、７．６％と１１．
４％との間の総窒素含量を有するか、または好ましくは８．７％と９．５％との
間の総窒素含量を有し、そして５００Ｕ／ｇ未満の内毒素含量を有し、そしてそ
れにより、その少なくとも４０％、もしくは好ましくはその少なくとも５０％、
もしくは特に好ましくはその少なくとも５５％が、２００〜５００ダルトンの分
子量を有し、そしてその少なくとも１０％、もしくは好ましくはその１５％が、
５００〜１０００ダルトンの分子量を有する。最も好ましくは、そのダイズ加水
分解産物のうちの少なくとも９０％は、５００ダルトン以下の分子量である。そ
のようなダイズ加水分解産物は、組換えタンパク質の工業的産生に特によく適す
る。なぜなら、その特定の特徴が原因で、それは特に容易に標準化され得、そし
て慣用的プロセスにおいて使用可能であるからである。
れが１０．３％と１５．６％との間の遊離アミノ酸含量を有するか、または好ま
しくは１２％と１３．５％との間の遊離アミノ酸含量を有し、７．６％と１１．
４％との間の総窒素含量を有するか、または好ましくは８．７％と９．５％との
間の総窒素含量を有し、そして５００Ｕ／ｇ未満の内毒素含量を有し、そしてそ
れにより、その少なくとも４０％、もしくは好ましくはその少なくとも５０％、
もしくは特に好ましくはその少なくとも５５％が、２００〜５００ダルトンの分
子量を有し、そしてその少なくとも１０％、もしくは好ましくはその１５％が、
５００〜１０００ダルトンの分子量を有する。最も好ましくは、そのダイズ加水
分解産物のうちの少なくとも９０％は、５００ダルトン以下の分子量である。そ
のようなダイズ加水分解産物は、組換えタンパク質の工業的産生に特によく適す
る。なぜなら、その特定の特徴が原因で、それは特に容易に標準化され得、そし
て慣用的プロセスにおいて使用可能であるからである。
【００２４】
ダイズ加水分解産物に加えて、本発明に従う培地はまた、それ自体公知である
様式で合成培地（例えば、文献から十分に公知である、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ
Ｆ１２、Ｍｅｄｉｕｍ １９９またはＲＰＭＩ）を含み得る。
様式で合成培地（例えば、文献から十分に公知である、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ
Ｆ１２、Ｍｅｄｉｕｍ １９９またはＲＰＭＩ）を含み得る。
【００２５】
さらに、本発明に従う培地はまた、好ましくは、アミノ酸を含み、このアミノ
酸は、好ましくは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミンまたはこれらの混合物からなる群
より選択される。
酸は、好ましくは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミンまたはこれらの混合物からなる群
より選択される。
【００２６】
以下のアミノ酸もまた、好ましくは、本発明に従う培地に添加される：Ｌ−ア
スパラギン（０．００１〜１ｇ／Ｌ（培地）の量で、好ましくは０．１〜０．０
５ｇ／Ｌの量で、特に好ましくは０．０１５〜０．０３ｇ／Ｌの量で）、Ｌ−シ
ステイン（０．００１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ、特
に好ましくは０．０１〜０．０３ｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン（０．００１〜１ｇ／
Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０１５〜０．０
３ｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン（０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜
０．０７ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０２〜０．０５ｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトフ
ァン（０．００１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｇ／Ｌ、特に好ま
しくは０．０１５〜０．０３ｇ／Ｌ）、およびＬ−グルタミン（０．０５〜１ｇ
／Ｌ、好ましくは０．１〜１ｇ／Ｌ）。
スパラギン（０．００１〜１ｇ／Ｌ（培地）の量で、好ましくは０．１〜０．０
５ｇ／Ｌの量で、特に好ましくは０．０１５〜０．０３ｇ／Ｌの量で）、Ｌ−シ
ステイン（０．００１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ、特
に好ましくは０．０１〜０．０３ｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン（０．００１〜１ｇ／
Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０１５〜０．０
３ｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン（０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜
０．０７ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０２〜０．０５ｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトフ
ァン（０．００１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｇ／Ｌ、特に好ま
しくは０．０１５〜０．０３ｇ／Ｌ）、およびＬ−グルタミン（０．０５〜１ｇ
／Ｌ、好ましくは０．１〜１ｇ／Ｌ）。
【００２７】
上記に示されるアミノ酸は、個別にかまたは組み合わせてかのいずれかで、本
発明に従う培地に添加され得る。上述のアミノ酸のすべてを含む、アミノ酸混合
物の組み合わせ添加が、特に好ましい。
発明に従う培地に添加され得る。上述のアミノ酸のすべてを含む、アミノ酸混合
物の組み合わせ添加が、特に好ましい。
【００２８】
無血清かつ無タンパク質の培地が、特定の形態の実施形態において使用され、
それによりこの培地は、上述のアミノ酸混合物と精製された限外濾過されたダイ
ズペプトンとの組み合わせをさらに含む。
それによりこの培地は、上述のアミノ酸混合物と精製された限外濾過されたダイ
ズペプトンとの組み合わせをさらに含む。
【００２９】
驚くべきことに、例えば、ウイルスもしくは他の病原体を不活化するために、
この培地が、負の効果を伴うことなく、約５〜２０分間、または好ましくは１５
分間、７０〜９５℃にて、または好ましくは８５〜９５℃にて、加熱され得るこ
とが見出された。
この培地が、負の効果を伴うことなく、約５〜２０分間、または好ましくは１５
分間、７０〜９５℃にて、または好ましくは８５〜９５℃にて、加熱され得るこ
とが見出された。
【００３０】
本発明に従って、既知のどの合成培地も、このダイズ加水分解産物と組み合わ
せて使用され得る。従来の合成培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖質供給
源および水を含み得る。例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地の使用が、
なされ得る。この培地におけるダイズ抽出物の濃度は、好ましくは、０．１ｇ／
Ｌと１００ｇ／Ｌとの間であり得、特に好ましくは１ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間で
あり得る。特に好ましい形態の実施形態に従って、その分子量に関して標準化さ
れたダイズペプトンが、使用され得る。そのダイズペプトンの分子量は、好まし
くは５０ｋＤ未満であり、特に好ましくは１０ｋＤ未満であり、最も好ましくは
１ｋＤ未満である。
せて使用され得る。従来の合成培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖質供給
源および水を含み得る。例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地の使用が、
なされ得る。この培地におけるダイズ抽出物の濃度は、好ましくは、０．１ｇ／
Ｌと１００ｇ／Ｌとの間であり得、特に好ましくは１ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間で
あり得る。特に好ましい形態の実施形態に従って、その分子量に関して標準化さ
れたダイズペプトンが、使用され得る。そのダイズペプトンの分子量は、好まし
くは５０ｋＤ未満であり、特に好ましくは１０ｋＤ未満であり、最も好ましくは
１ｋＤ未満である。
【００３１】
限外濾過されたダイズペプトンの添加は、組換え細胞株の生産性に特に有利で
あることが示されており、それにより、ダイズペプトンの平均分子量は３５０ダ
ルトンである（Ｑｕｅｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）。これは、総窒素含量が約９．５
％でありかつ遊離アミノ酸含量が約１３％である、ダイズ単離物である。
あることが示されており、それにより、ダイズペプトンの平均分子量は３５０ダ
ルトンである（Ｑｕｅｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）。これは、総窒素含量が約９．５
％でありかつ遊離アミノ酸含量が約１３％である、ダイズ単離物である。
【００３２】
１，０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン以下、特に好ましくは３
５０ダルトン以下の分子量である、精製された限外濾過されたダイズペプトンの
使用が、特に好ましい。
５０ダルトン以下の分子量である、精製された限外濾過されたダイズペプトンの
使用が、特に好ましい。
【００３３】
本発明に従う培地はまた、好ましくは、補助的物質（例えば、緩衝剤物質、酸
化安定剤、機械的応力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓ）を打ち消す安定
剤、またはプロテアーゼインヒビター）もまた含む。
化安定剤、機械的応力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓ）を打ち消す安定
剤、またはプロテアーゼインヒビター）もまた含む。
【００３４】
以下の組成を有する培地の使用が、特になされる：合成最少培地（１〜２５ｇ
／Ｌ）、ダイズペプトン（０．５〜５０ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．０５〜
１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（０．１〜１０ｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（０．００
０５〜０．０５ｇ／Ｌ）、エタノールアミン（０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）
および亜セレン酸ナトリウム（１〜１５μｇ／Ｌ）。
／Ｌ）、ダイズペプトン（０．５〜５０ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．０５〜
１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（０．１〜１０ｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（０．００
０５〜０．０５ｇ／Ｌ）、エタノールアミン（０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）
および亜セレン酸ナトリウム（１〜１５μｇ／Ｌ）。
【００３５】
必要な場合、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリプロピレングリコール（Ｐ
ＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩ
Ｃ Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−７１またはＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１０
８）が、本発明に従って、消泡剤としてこの培地に添加され得る。
ＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩ
Ｃ Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−７１またはＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−１０
８）が、本発明に従って、消泡剤としてこの培地に添加され得る。
【００３６】
この薬剤は、通気の負の効果から細胞を保護するために、一般的に使用される
。なぜなら、界面活性剤を添加しなければ、上昇しそして破裂する気泡が、これ
らの気泡の表面上に位置する細胞の損傷をもたらし得るからである（「スパージ
ング（ｓｐａｒｇｉｎｇ）」（ＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９
９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１４２〜１４８）。
。なぜなら、界面活性剤を添加しなければ、上昇しそして破裂する気泡が、これ
らの気泡の表面上に位置する細胞の損傷をもたらし得るからである（「スパージ
ング（ｓｐａｒｇｉｎｇ）」（ＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９
９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１４２〜１４８）。
【００３７】
非イオン性界面活性剤の量は、これにより０．０５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌとの間
であるが、特に好ましくは、可能な最小量は、０．１ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間で
ある。
であるが、特に好ましくは、可能な最小量は、０．１ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間で
ある。
【００３８】
さらに、本発明に従う培地はまた、シクロデキストリンまたはその誘導体を含
み得る。
み得る。
【００３９】
この無血清かつ無タンパク質の培地は、好ましくは、プロテアーゼインヒビタ
ー（例えば、組織培養に適切でありそして合成起源もしくは植物起源である、セ
リンプロテアーゼインヒビター）を含む。
ー（例えば、組織培養に適切でありそして合成起源もしくは植物起源である、セ
リンプロテアーゼインヒビター）を含む。
【００４０】
すでに適応されている細胞（すなわち、この無タンパク質かつ無血清の培地に
おける増殖にすでに適応されている細胞）が、好ましくは、本発明に従う培地に
おける培養のための細胞として使用される。このような予め適応された細胞を用
いて増加した収量が達成され得るだけでなく、無血清かつ無タンパク質の培養に
ついてのそれら細胞の安定性もまた、本発明に従う培地の使用によって明らかに
改善されることが、見出されている。
おける増殖にすでに適応されている細胞）が、好ましくは、本発明に従う培地に
おける培養のための細胞として使用される。このような予め適応された細胞を用
いて増加した収量が達成され得るだけでなく、無血清かつ無タンパク質の培養に
ついてのそれら細胞の安定性もまた、本発明に従う培地の使用によって明らかに
改善されることが、見出されている。
【００４１】
しかし、組換え細胞クローンは、本発明に従って特に価値があることがわかっ
ており、本発明によって、これらのクローンは、無血清かつ無タンパク質の培地
中で、開始から少なくとも４０世代の間そして好ましくは５０世代の間安定であ
り、組換え産物を発現する。
ており、本発明によって、これらのクローンは、無血清かつ無タンパク質の培地
中で、開始から少なくとも４０世代の間そして好ましくは５０世代の間安定であ
り、組換え産物を発現する。
【００４２】
このような細胞クローンは、血清含有培地上での元の組換え細胞クローンの培
養、および無血清かつ無タンパク質の培地へのこれらの細胞の再適応の後に得ら
れる、細胞培養物から入手され得る。
養、および無血清かつ無タンパク質の培地へのこれらの細胞の再適応の後に得ら
れる、細胞培養物から入手され得る。
【００４３】
用語「元の細胞クローン」とは、組換えヌクレオチド配列での宿主細胞のトラ
ンスフェクション後に、実験条件下で安定な様式で組換え産物を発現する、組換
え細胞クローントランスフェクタントを意味することが理解され得る。この元の
クローンを、その増殖を最適化するために、血清含有培地中で増殖させる。その
生産性を増加するために、元のクローンを、必要に応じて、選択薬剤の存在下で
選択マーカーおよび／または増殖マーカーでの選択を用いて増殖させる。ラージ
スケールの工業生産については、元の細胞クローンを、血清含有培養条件下で高
い細胞密度にまで増殖し、次いで、産生段階の直前に無血清または無タンパク質
培地に再適応させる。この場合、培養は、好ましくは、選択圧を用いずに行う。
ンスフェクション後に、実験条件下で安定な様式で組換え産物を発現する、組換
え細胞クローントランスフェクタントを意味することが理解され得る。この元の
クローンを、その増殖を最適化するために、血清含有培地中で増殖させる。その
生産性を増加するために、元のクローンを、必要に応じて、選択薬剤の存在下で
選択マーカーおよび／または増殖マーカーでの選択を用いて増殖させる。ラージ
スケールの工業生産については、元の細胞クローンを、血清含有培養条件下で高
い細胞密度にまで増殖し、次いで、産生段階の直前に無血清または無タンパク質
培地に再適応させる。この場合、培養は、好ましくは、選択圧を用いずに行う。
【００４４】
この元の組換え細胞クローンの培養は、無血清かつ無タンパク質の培地での開
始から行われ得；結果として、再適応は必要ではない。この場合において、必要
な場合には、選択薬剤をもまた使用し得、そして選択マーカーおよび／または増
殖マーカーでの選択を行い得る。このためのプロセスは、例えば、ＥＰ ０ ７
１１ ８３５に記載される。
始から行われ得；結果として、再適応は必要ではない。この場合において、必要
な場合には、選択薬剤をもまた使用し得、そして選択マーカーおよび／または増
殖マーカーでの選択を行い得る。このためのプロセスは、例えば、ＥＰ ０ ７
１１ ８３５に記載される。
【００４５】
無血清かつ無タンパク質の培地への再適応後に得られた細胞培養物を、無血清
かつ無タンパク質の条件下で（必要に応じて、選択圧の非存在下で）安定した様
式で産物を産生する、これらの細胞集団の細胞クローンについて試験する。これ
は、例えば、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質に対する標識された特
異的抗体を用いる免疫蛍光によって行い得る。産物のプロデューサーとして同定
された細胞を、この細胞培養物から単離し、そしてこの細胞を、好ましくは産生
条件に等しい無血清かつ無タンパク質の条件下で再増殖させる。従って、細胞の
単離は、細胞を単離し、そして細胞を産物プロデューサーについて試験すること
によって行い得る。
かつ無タンパク質の条件下で（必要に応じて、選択圧の非存在下で）安定した様
式で産物を産生する、これらの細胞集団の細胞クローンについて試験する。これ
は、例えば、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質に対する標識された特
異的抗体を用いる免疫蛍光によって行い得る。産物のプロデューサーとして同定
された細胞を、この細胞培養物から単離し、そしてこの細胞を、好ましくは産生
条件に等しい無血清かつ無タンパク質の条件下で再増殖させる。従って、細胞の
単離は、細胞を単離し、そして細胞を産物プロデューサーについて試験すること
によって行い得る。
【００４６】
安定な細胞を含む細胞培養物を、安定な組換えクローンについて再度試験し得
、そしてこれらのクローンを、細胞培養物から単離しそしてサブクローニングす
る。次いで、無血清かつ無タンパク質の条件下で得られる安定な組換え細胞クロ
ーンを、無血清かつ無タンパク質の条件下でさらに増殖させ得る。
、そしてこれらのクローンを、細胞培養物から単離しそしてサブクローニングす
る。次いで、無血清かつ無タンパク質の条件下で得られる安定な組換え細胞クロ
ーンを、無血清かつ無タンパク質の条件下でさらに増殖させ得る。
【００４７】
本発明に従う培地中でこのように調製される組換え細胞クローンまたは細胞集
団は、これらが、少なくとも４０世代の間、好ましくは少なくとも５０世代の間
、そして特に６０世代よりも長い間、安定であり、そして組換え産物を発現する
という特徴によって、特に優れている。
団は、これらが、少なくとも４０世代の間、好ましくは少なくとも５０世代の間
、そして特に６０世代よりも長い間、安定であり、そして組換え産物を発現する
という特徴によって、特に優れている。
【００４８】
このような安定な組換え細胞クローンまたは細胞集団の例は、ブダペスト条約
に準じて、ＥＣＡＣＣ（ＵＫ）に番号９８０１２２０６の下で寄託されている。
に準じて、ＥＣＡＣＣ（ＵＫ）に番号９８０１２２０６の下で寄託されている。
【００４９】
本発明に従って培養される細胞培養物は、好ましくは、組換え哺乳動物細胞か
ら誘導される。本明細書によると、組換え哺乳動物細胞とは、組換えポリペプチ
ドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含む全ての哺乳動物細胞であり得
る。接着的または非接着的のいずれかで増殖する、全ての連続的に増殖する細胞
が、この点において包含される。組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞が、
特に好ましい。組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質は、血液因子、増殖
因子または他の生物医学的に関連する産物であり得る。
ら誘導される。本明細書によると、組換え哺乳動物細胞とは、組換えポリペプチ
ドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含む全ての哺乳動物細胞であり得
る。接着的または非接着的のいずれかで増殖する、全ての連続的に増殖する細胞
が、この点において包含される。組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞が、
特に好ましい。組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質は、血液因子、増殖
因子または他の生物医学的に関連する産物であり得る。
【００５０】
本発明に従って、組換え血液因子（例えば、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ
因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プ
ロテインＣ、これらの因子のうちの１つの活性化形態、またはｖＷＦ）のコード
配列を含みそして数世代にわたって安定な様式でこれらの因子を発現し得る、細
胞クローンが好ましい。ｖＷＦまたはｖＷＦ活性を有するポリペプチド、第ＶＩ
ＩＩ因子またはＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド、ｖＷＦおよび第ＶＩＩＩ因
子、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現する組換えＣＨＯ細胞が、この点におい
て特に好ましい。
因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プ
ロテインＣ、これらの因子のうちの１つの活性化形態、またはｖＷＦ）のコード
配列を含みそして数世代にわたって安定な様式でこれらの因子を発現し得る、細
胞クローンが好ましい。ｖＷＦまたはｖＷＦ活性を有するポリペプチド、第ＶＩ
ＩＩ因子またはＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド、ｖＷＦおよび第ＶＩＩＩ因
子、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現する組換えＣＨＯ細胞が、この点におい
て特に好ましい。
【００５１】
マスターセルバンクを開始するために、３０世代が必要とされる。１０００Ｌ
スケールの平均的なバッチ培養を行うためには、少なくとも約４０世代が必要と
される。個々の細胞クローンから開始することによって、本発明に従う培地を用
いて、約８〜１０世代で「マスターセルバンク（ｍａｓａｔｅｒ ｃｅｌｌ ｂ
ａｎｋ）」（ＭＣＢ）および「ワーキングセルバンク（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｅｌ
ｌ ｂａｎｋ）」（ＷＣＢ）を調製することが可能であり、そしてそれゆえ、生
産スケール（生産バイオマス）での無タンパク質かつ無血清条件下で、２０〜２
５世代までで細胞培養物を調製することが可能であるが、対照的に、いくつかの
世代は、先の細胞クローンおよび培地を用いた無血清または無タンパク質培地上
での増殖後に不安定になり、結果として、ａ）産物プロデューサーを含む均一な
細胞培養が不可能であり、そして、ｂ）長期間にわたる安定な産物の生産性が不
可能である。
スケールの平均的なバッチ培養を行うためには、少なくとも約４０世代が必要と
される。個々の細胞クローンから開始することによって、本発明に従う培地を用
いて、約８〜１０世代で「マスターセルバンク（ｍａｓａｔｅｒ ｃｅｌｌ ｂ
ａｎｋ）」（ＭＣＢ）および「ワーキングセルバンク（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｅｌ
ｌ ｂａｎｋ）」（ＷＣＢ）を調製することが可能であり、そしてそれゆえ、生
産スケール（生産バイオマス）での無タンパク質かつ無血清条件下で、２０〜２
５世代までで細胞培養物を調製することが可能であるが、対照的に、いくつかの
世代は、先の細胞クローンおよび培地を用いた無血清または無タンパク質培地上
での増殖後に不安定になり、結果として、ａ）産物プロデューサーを含む均一な
細胞培養が不可能であり、そして、ｂ）長期間にわたる安定な産物の生産性が不
可能である。
【００５２】
しかし、対照的に、本発明に従って、血清含有培地中で培養した元の細胞クロ
ーンと比較してでさえ、増加した産物生産性を見い出すことがなお可能であった
。
ーンと比較してでさえ、増加した産物生産性を見い出すことがなお可能であった
。
【００５３】
さらなる局面に従って、本発明はまた、細胞（特に、哺乳動物細胞）の培養プ
ロセスに関し、このプロセスは、これらの細胞を本発明に従う培地中に導入し、
次いで、この培地中で培養するという特徴によって特徴付けられる。
ロセスに関し、このプロセスは、これらの細胞を本発明に従う培地中に導入し、
次いで、この培地中で培養するという特徴によって特徴付けられる。
【００５４】
従って、本発明はまた、組換え細胞（好ましくは、真核生物細胞、そして特に
、哺乳動物細胞）の培養のための、本発明に従う培地の使用に関する。
、哺乳動物細胞）の培養のための、本発明に従う培地の使用に関する。
【００５５】
従って、本発明の主題はまた、本発明に従う培地および細胞（好ましくは、真
核生物細胞、そして特に、哺乳動物細胞）を含む、細胞培養物である。
核生物細胞、そして特に、哺乳動物細胞）を含む、細胞培養物である。
【００５６】
本発明は、以下の実施例および図面によってより詳細に明らかにされるが、こ
れらに限定されない。
れらに限定されない。
【００５７】
（実施例）
（実施例１：血清含有培地から無血清かつ無タンパク質の培地に切り換えた後
のｒｖＷＦ−ＣＨＯ細胞の安定性） ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞を、プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒｖＷＦおよびｐＳＶ−ｄ
ｈｆｒで同時トランスフェクトし、そしてｖＷＦ発現クローンを、Ｆｉｓｃｈｅ
ｒら（１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５１：３４５−３４８）によっ
て記載されるようにサブクローニングした。ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を
、血清含有条件下であるがＭＴＸ非存在下で安定様式でｒｖＷＦを発現したサブ
クローンから開始し、そしてこれらの細胞を、血清含有条件下で多孔性のマイク
ロキャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標））上に固定した。無血清かつ無タン
パク質の培地への細胞の切り換えを、２×１０7細胞／１ｍＬマトリクスの細胞
密度に到達した後に行った。細胞を、無血清かつ無タンパク質の条件下で数世代
の間さらに培養した。細胞を、標識した抗ｖＷＦ抗体での免疫蛍光によって、種
々の時点で無血清かつ無タンパク質の培地中で試験した。細胞の安定性の評価を
、培地を切り換える前、無血清かつ無タンパク質の培地において１０世代後およ
び６０世代後で、ワーキングセルバンクを使用して行った。ワーキングセルバン
クは、依然として１００％ｒｖＷＦプロデューサーを示したが、ｒｖＷＦプロデ
ューサーの割合は、無血清かつ無タンパク質の培地中で１０世代後に約５０％に
減少した。６０世代後では、９５％を超える細胞が、非プロデューサーであるこ
とが同定された。
のｒｖＷＦ−ＣＨＯ細胞の安定性） ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞を、プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒｖＷＦおよびｐＳＶ−ｄ
ｈｆｒで同時トランスフェクトし、そしてｖＷＦ発現クローンを、Ｆｉｓｃｈｅ
ｒら（１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５１：３４５−３４８）によっ
て記載されるようにサブクローニングした。ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を
、血清含有条件下であるがＭＴＸ非存在下で安定様式でｒｖＷＦを発現したサブ
クローンから開始し、そしてこれらの細胞を、血清含有条件下で多孔性のマイク
ロキャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標））上に固定した。無血清かつ無タン
パク質の培地への細胞の切り換えを、２×１０7細胞／１ｍＬマトリクスの細胞
密度に到達した後に行った。細胞を、無血清かつ無タンパク質の条件下で数世代
の間さらに培養した。細胞を、標識した抗ｖＷＦ抗体での免疫蛍光によって、種
々の時点で無血清かつ無タンパク質の培地中で試験した。細胞の安定性の評価を
、培地を切り換える前、無血清かつ無タンパク質の培地において１０世代後およ
び６０世代後で、ワーキングセルバンクを使用して行った。ワーキングセルバン
クは、依然として１００％ｒｖＷＦプロデューサーを示したが、ｒｖＷＦプロデ
ューサーの割合は、無血清かつ無タンパク質の培地中で１０世代後に約５０％に
減少した。６０世代後では、９５％を超える細胞が、非プロデューサーであるこ
とが同定された。
【００５８】
（実施例２：安定な組換えＣＨＯクローンのクローニング）
希釈系列を、実施例１に従うｒｖＷＦ−ＣＨＯ細胞（ｒ−ｖＷＦ−ＣＨＯ Ｆ
７と命名されたこの安定な細胞クローンは、ブダペスト条約に準じて、ＥＣＡＣ
Ｃ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ、ＵＫに、
１９９８年１月２２日に寄託し、受託番号９８０１２２０６が付与された）を含
む細胞培養物から調製し、この細胞を、無血清かつ無タンパク質の培地中で６０
世代の間培養し、そして０．１細胞を、マイクロタイタープレートの各ウェルに
播種した。細胞を、血清の添加物もタンパク質添加物も含まずかつ選択圧なしの
ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓＦ１２において約３週間培養し、そして細胞を、標識した
抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光を介して試験した。陽性として同定された細胞ク
ローンを、シードセルバンクの調製のための開始クローンとして使用した。マス
ターセルバンク（ＭＣＢ）を、無血清かつ無タンパク質の培地中のシードセルバ
ンクから開始し、そして個々のアンプルを取り出し、そしてワーキングセルバン
クのさらなる調製のために冷凍した。ワーキングセルバンクを、個々のアンプル
から無血清かつ無タンパク質の培地中に調製した。細胞を、多孔性マイクロキャ
リア上に固定し、そして無血清かつ無タンパク質の条件下で数世代の間さらに培
養した。細胞を、標識抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光によって、無血清かつ無タ
ンパク質の培地中で種々の時点で生産性について試験した。細胞の安定性の評価
を、ワーキングセルバンク段階、および無血清かつ無タンパク質の培地中での１
０世代後および６０世代後に行った。約１００％の細胞が、陽性の安定なクロー
ンとして同定され、これらは、ワーキングセルバンク段階、１０世代後および６
０世代後に、ｒｖＷＦを発現する。
７と命名されたこの安定な細胞クローンは、ブダペスト条約に準じて、ＥＣＡＣ
Ｃ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ、ＵＫに、
１９９８年１月２２日に寄託し、受託番号９８０１２２０６が付与された）を含
む細胞培養物から調製し、この細胞を、無血清かつ無タンパク質の培地中で６０
世代の間培養し、そして０．１細胞を、マイクロタイタープレートの各ウェルに
播種した。細胞を、血清の添加物もタンパク質添加物も含まずかつ選択圧なしの
ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓＦ１２において約３週間培養し、そして細胞を、標識した
抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光を介して試験した。陽性として同定された細胞ク
ローンを、シードセルバンクの調製のための開始クローンとして使用した。マス
ターセルバンク（ＭＣＢ）を、無血清かつ無タンパク質の培地中のシードセルバ
ンクから開始し、そして個々のアンプルを取り出し、そしてワーキングセルバン
クのさらなる調製のために冷凍した。ワーキングセルバンクを、個々のアンプル
から無血清かつ無タンパク質の培地中に調製した。細胞を、多孔性マイクロキャ
リア上に固定し、そして無血清かつ無タンパク質の条件下で数世代の間さらに培
養した。細胞を、標識抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光によって、無血清かつ無タ
ンパク質の培地中で種々の時点で生産性について試験した。細胞の安定性の評価
を、ワーキングセルバンク段階、および無血清かつ無タンパク質の培地中での１
０世代後および６０世代後に行った。約１００％の細胞が、陽性の安定なクロー
ンとして同定され、これらは、ワーキングセルバンク段階、１０世代後および６
０世代後に、ｒｖＷＦを発現する。
【００５９】
（実施例３：組換え細胞クローンの細胞特異的生産性）
規定された数の細胞を、組換え細胞の培養中の規定された段階で取り出し、そ
してこれらを、新鮮な培地と共に２４時間インキュベートした。ｒｖＷＦ：Ｒｉ
ｓｔｏ−ＣｏＦ−活性を、細胞培養物の上清液中で決定した。表１は、本発明に
従う安定な組換え細胞クローンの場合において、細胞特異的生産性が、無血清か
つ無タンパク質の培地中で６０世代後でさえ安定であり、そしてそれが、血清含
有培地中で培養した元のクローンと比較して増加されたことを示す。
してこれらを、新鮮な培地と共に２４時間インキュベートした。ｒｖＷＦ：Ｒｉ
ｓｔｏ−ＣｏＦ−活性を、細胞培養物の上清液中で決定した。表１は、本発明に
従う安定な組換え細胞クローンの場合において、細胞特異的生産性が、無血清か
つ無タンパク質の培地中で６０世代後でさえ安定であり、そしてそれが、血清含
有培地中で培養した元のクローンと比較して増加されたことを示す。
【００６０】
【表１】
（実施例４：合成の無血清かつ無タンパク質の培地の組成）
【００６１】
【表２】
（実施例５：無タンパク質かつ無血清の最少培地中でのｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ
細胞の培養） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含有する細胞培養物を、灌流を伴う１０Ｌ攪拌タ
ンク中で培養した。実施例４に従う培地を、この場合において使用した。これに
よって、細胞を多孔性マイクロキャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）上に固定し、次いで、少なくとも６週間培養した。灌流速度は
、４容量交換／日であり；ｐＨは、６．９〜７．２であり；Ｏ2濃度は、約２０
〜５０％であり、そして温度は、３７℃であった。
細胞の培養） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含有する細胞培養物を、灌流を伴う１０Ｌ攪拌タ
ンク中で培養した。実施例４に従う培地を、この場合において使用した。これに
よって、細胞を多孔性マイクロキャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）上に固定し、次いで、少なくとも６週間培養した。灌流速度は
、４容量交換／日であり；ｐＨは、６．９〜７．２であり；Ｏ2濃度は、約２０
〜５０％であり、そして温度は、３７℃であった。
【００６２】
図１は、１０Ｌ灌流バイオリアクター中のｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞クローン
の培養の結果を示す： ａ）４２日の期間にわたる第ＶＩＩＩ因子活性（ミリユニット（ｍＵ）／ｍＬ
）および灌流速度（１〜５／日）； ｂ）この灌流バイオリアクターにおける容量生産性（第ＶＩＩＩ因子のユニッ
ト（Ｕ）／Ｌ／日）。
の培養の結果を示す： ａ）４２日の期間にわたる第ＶＩＩＩ因子活性（ミリユニット（ｍＵ）／ｍＬ
）および灌流速度（１〜５／日）； ｂ）この灌流バイオリアクターにおける容量生産性（第ＶＩＩＩ因子のユニッ
ト（Ｕ）／Ｌ／日）。
【００６３】
【表３】
表３は、ｒＦＶＩＩＩ発現細胞の安定性および特異的生産性を示す。これらの
結果を得るために、サンプルを、１５日後、２１日後、２８日後、３５日後およ
び４２日後に採取し、次いで、３００ｇで遠心分離し、そして新鮮な無血清かつ
無タンパク質の培地中に再懸濁した。細胞培養物の上清液中の第ＶＩＩＩ因子濃
度および細胞数を、さらに２４時間後に測定した。特異的なＦＶＩＩＩ生産性を
、これらのデータから計算した。
結果を得るために、サンプルを、１５日後、２１日後、２８日後、３５日後およ
び４２日後に採取し、次いで、３００ｇで遠心分離し、そして新鮮な無血清かつ
無タンパク質の培地中に再懸濁した。細胞培養物の上清液中の第ＶＩＩＩ因子濃
度および細胞数を、さらに２４時間後に測定した。特異的なＦＶＩＩＩ生産性を
、これらのデータから計算した。
【００６４】
８８８ミリユニット／１０6細胞／日の安定な平均生産性が達成された。この
安定な生産性をまた、無血清かつ無タンパク質の培地中で１５日後、２１日後、
２８日後、３５日後および４２日後に、標識抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いる免疫蛍光
によって確かめた。
安定な生産性をまた、無血清かつ無タンパク質の培地中で１５日後、２１日後、
２８日後、３５日後および４２日後に、標識抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いる免疫蛍光
によって確かめた。
【００６５】
（実施例６：さらなる培地成分を含有する無タンパク質かつ無血清の培地中の
組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の生産性の比較） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、バッチ様式で培養した。この
場合において、以下のアミノ酸を添加した実施例４に従う培地を使用した：
組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の生産性の比較） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、バッチ様式で培養した。この
場合において、以下のアミノ酸を添加した実施例４に従う培地を使用した：
【００６６】
【表４】
細胞を、３７℃でかつｐＨ６．９〜７．２で増殖させた。細胞を、２４〜７２
時間にわたってバッチプロセスを使用して増殖させた。
時間にわたってバッチプロセスを使用して増殖させた。
【００６７】
組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の生産性を、以下の培地組成において測定した
： Ｍｉｘ１：ダイズペプトンを含有せずそして上記の表に従うアミノ酸混合物を
さらに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む； Ｍｉｘ２：ダイズペプトンを含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む
； Ｍｉｘ３：ダイズペプトンを含有しそして上記の表に従うアミノ酸混合物をさ
らに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む； Ｍｉｘ４：上記の表に従うアミノ酸混合物および２．５ｇ／ｌの精製し、限外
濾過したダイズペプトンをさらに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含
む。限外濾過したダイズペプトンの精製は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラ
ム上でのクロマトグラフィーによって行った。
： Ｍｉｘ１：ダイズペプトンを含有せずそして上記の表に従うアミノ酸混合物を
さらに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む； Ｍｉｘ２：ダイズペプトンを含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む
； Ｍｉｘ３：ダイズペプトンを含有しそして上記の表に従うアミノ酸混合物をさ
らに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む； Ｍｉｘ４：上記の表に従うアミノ酸混合物および２．５ｇ／ｌの精製し、限外
濾過したダイズペプトンをさらに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含
む。限外濾過したダイズペプトンの精製は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラ
ム上でのクロマトグラフィーによって行った。
【００６８】
（実施例７：ケモスタット培養法を用いる無タンパク質かつ無血清の培地中で
の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の培養） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、１０Ｌの攪拌バイオリアクタ
ータンクにおいて培養した。この場合において、ダイズペプトンを含有せず、実
施例６に従うアミノ酸混合物を含有する、実施例４に従って作製した培地を使用
した。細胞を、３７℃でかつｐＨ６．９〜７．２で増殖させ；酸素濃度は、２０
〜５０％の空気飽和度であった。サンプルを２４時間毎に採取し、第ＶＩＩＩ因
子力価および培養物の上清液中の細胞濃度を測定した。全細胞濃度は、２日目か
ら１４日目までで一定であった。限外濾過したダイズペプトンを、６日目から開
始して、培地に添加した。第ＶＩＩＩ因子の生産性を、３に例示する；測定は、
ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ ＣｏＡ ＦＶＩＩＩ：Ｃ／４システムによって行った
。免疫蛍光を、標識した抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて行った。第ＶＩＩＩ因子の生
産性における明確な増加、それゆえ、このバイオリアクター系の容量生産性の増
加が、ダイズペプトンの添加の結果として生じ、これによって、ダイズペプトン
の添加が、細胞増殖の明確な増加を導かなかったことが、データから理解され得
る。連続培養におけるダイズペプトンの非存在は、数日後の第ＶＩＩＩ因子の生
産性の明確な減少を導き、これに対して、ダイズペプトンの添加は、結果として
、ほぼ１０倍の生産性の増加を導く。しかし、この添加は、細胞数を増加しない
ので、これによって、限外濾過したダイズペプトンが、結果として、生産性にお
ける明確な増加を導き、この生産性が細胞増殖に非依存性であることが明確に示
される。
の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の培養） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、１０Ｌの攪拌バイオリアクタ
ータンクにおいて培養した。この場合において、ダイズペプトンを含有せず、実
施例６に従うアミノ酸混合物を含有する、実施例４に従って作製した培地を使用
した。細胞を、３７℃でかつｐＨ６．９〜７．２で増殖させ；酸素濃度は、２０
〜５０％の空気飽和度であった。サンプルを２４時間毎に採取し、第ＶＩＩＩ因
子力価および培養物の上清液中の細胞濃度を測定した。全細胞濃度は、２日目か
ら１４日目までで一定であった。限外濾過したダイズペプトンを、６日目から開
始して、培地に添加した。第ＶＩＩＩ因子の生産性を、３に例示する；測定は、
ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ ＣｏＡ ＦＶＩＩＩ：Ｃ／４システムによって行った
。免疫蛍光を、標識した抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて行った。第ＶＩＩＩ因子の生
産性における明確な増加、それゆえ、このバイオリアクター系の容量生産性の増
加が、ダイズペプトンの添加の結果として生じ、これによって、ダイズペプトン
の添加が、細胞増殖の明確な増加を導かなかったことが、データから理解され得
る。連続培養におけるダイズペプトンの非存在は、数日後の第ＶＩＩＩ因子の生
産性の明確な減少を導き、これに対して、ダイズペプトンの添加は、結果として
、ほぼ１０倍の生産性の増加を導く。しかし、この添加は、細胞数を増加しない
ので、これによって、限外濾過したダイズペプトンが、結果として、生産性にお
ける明確な増加を導き、この生産性が細胞増殖に非依存性であることが明確に示
される。
【００６９】
（実施例８：異なる加水分解産物を含有する無タンパク質かつ無血清の培地中
の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の増殖速度および生産性の比較） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞培養物を、バッチ様式で培養した。この場合、異な
る加水分解産物（ダイズ、酵母、イネおよびコムギ由来）を添加した、実施例４
に記載のように無血清かつ無タンパク質の培地を使用した。加水分解産物を添加
しない無血清かつ無タンパク質の培地を、コントロールとして使用した。
の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の増殖速度および生産性の比較） ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞培養物を、バッチ様式で培養した。この場合、異な
る加水分解産物（ダイズ、酵母、イネおよびコムギ由来）を添加した、実施例４
に記載のように無血清かつ無タンパク質の培地を使用した。加水分解産物を添加
しない無血清かつ無タンパク質の培地を、コントロールとして使用した。
【００７０】
開始細胞密度は、それぞれ、０．６×１０5および０．４×１０6であった。細
胞を、ｐＨ６．９〜７．２でバッチプロセスを使用して３７℃で培養した。
胞を、ｐＨ６．９〜７．２でバッチプロセスを使用して３７℃で培養した。
【００７１】
表５：ダイズ加水分解産物（限外濾過した）および酵母加水分解産物を添加し
た無血清かつ無タンパク質の培地中でｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を用いた培養実
験の結果を示す。開始細胞密度は、０．６×１０5細胞であった。加水分解産物
を添加しなかった無血清かつ無タンパク質の培地を、コントロールとして使用し
た。
た無血清かつ無タンパク質の培地中でｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を用いた培養実
験の結果を示す。開始細胞密度は、０．６×１０5細胞であった。加水分解産物
を添加しなかった無血清かつ無タンパク質の培地を、コントロールとして使用し
た。
【００７２】
【表５】
表６：ダイズ加水分解産物（限外濾過した）、イネ加水分解産物およびコムギ
加水分解産物を添加した無血清かつ無タンパク質の培地中でｒＦＶＩＩＩ−ＣＨ
Ｏ細胞を用いた培養実験の結果を示す。開始細胞密度は、０．６×１０5細胞で
あった。加水分解産物を添加しなかった無血清かつ無タンパク質の培地を、コン
トロールとして使用した。
加水分解産物を添加した無血清かつ無タンパク質の培地中でｒＦＶＩＩＩ−ＣＨ
Ｏ細胞を用いた培養実験の結果を示す。開始細胞密度は、０．６×１０5細胞で
あった。加水分解産物を添加しなかった無血清かつ無タンパク質の培地を、コン
トロールとして使用した。
【００７３】
【表６】
表７：ダイズ加水分解産物（限外濾過した）およびコムギ加水分解産物を添加
した無血清かつ無タンパク質の培地中のｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞での培養実験
の結果を示す。開始細胞密度は、０．４×１０6細胞であった。
した無血清かつ無タンパク質の培地中のｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞での培養実験
の結果を示す。開始細胞密度は、０．４×１０6細胞であった。
【００７４】
【表７】
（実施例９：ダイズ加水分解産物を含有する無タンパク質かつ無血清培地中の
ＢＨＫ細胞の培養） ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）細胞を、ＣａＰＯ4手順によって以
下のプラスミドを用いて３回同時トランスフェクトした：２５μｇのプラスミド
ｐＳＶ−ＦＩＩ（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９
６，第２７１巻、２３７３７−２３７４２頁）（これは、ＳＶ４０プロモーター
（ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター）の制御下にヒト第ＩＩ因子（プロトロンビ
ン）ｃＤＮＡを含む）；４μｇのプラスミドｐＳＶ−ＤＨＦＲ（メトトレキサー
ト耐性）；および１μｇのプラスミドｐＵＣＳＶ−ｎｅｏ（Ｓｃｈｌｏｋａｔ、
Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６、第２４巻、
２５７−２６７頁）（これは、Ｇ４１８／ネオマイシン耐性を媒介する）。安定
な細胞クローンを、メトトレキサート濃度を３μＭの濃度にまで段階様式で増加
させることにより、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含んだ培地中での培養によっ
て選択した。
ＢＨＫ細胞の培養） ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）細胞を、ＣａＰＯ4手順によって以
下のプラスミドを用いて３回同時トランスフェクトした：２５μｇのプラスミド
ｐＳＶ−ＦＩＩ（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９
６，第２７１巻、２３７３７−２３７４２頁）（これは、ＳＶ４０プロモーター
（ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター）の制御下にヒト第ＩＩ因子（プロトロンビ
ン）ｃＤＮＡを含む）；４μｇのプラスミドｐＳＶ−ＤＨＦＲ（メトトレキサー
ト耐性）；および１μｇのプラスミドｐＵＣＳＶ−ｎｅｏ（Ｓｃｈｌｏｋａｔ、
Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６、第２４巻、
２５７−２６７頁）（これは、Ｇ４１８／ネオマイシン耐性を媒介する）。安定
な細胞クローンを、メトトレキサート濃度を３μＭの濃度にまで段階様式で増加
させることにより、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含んだ培地中での培養によっ
て選択した。
【００７５】
この様式で得られたクローンをサブクローニングし、無タンパク質かつ無血清
培地に適応させた。培養を、懸濁培養技術を使用して行った。
培地に適応させた。培養を、懸濁培養技術を使用して行った。
【００７６】
結果は、表６に示され得る；ダイズ加水分解産物を含有する無タンパク質かつ
無血清培地中で増殖させたＢＨＫ細胞は高速度かつ安定な速度の、組換え第ＩＩ
因子の産生を示した。
無血清培地中で増殖させたＢＨＫ細胞は高速度かつ安定な速度の、組換え第ＩＩ
因子の産生を示した。
【図１】
図１は、１０Ｌ灌流バイオリアクターにおけるｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞クロ
ーンの培養の結果を示す： ａ）４２日の期間にわたる第ＶＩＩＩ因子活性（ミリユニット／ｍＬ）および
灌流速度（１〜５／日）； ｂ）この灌流バイオリアクターにおける容量生産性（第ＶＩＩＩ因子のユニッ
ト／Ｌ／日）。
ーンの培養の結果を示す： ａ）４２日の期間にわたる第ＶＩＩＩ因子活性（ミリユニット／ｍＬ）および
灌流速度（１〜５／日）； ｂ）この灌流バイオリアクターにおける容量生産性（第ＶＩＩＩ因子のユニッ
ト／Ｌ／日）。
【図２】
図２は、種々の培地中での組換え第ＶＩＩ因子を発現するＣＨＯ細胞の培養（
バッチプロセスを使用する）の場合における、第ＶＩＩＩ因子の生産性（ｍＵ／
ｍＬ）の比較を示す。Ｍｉｘ１は、ダイズ加水分解産物を含まないが、表４に列
挙したアミノ酸混合物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなり；Ｍｉｘ
２は、ダイズ加水分解産物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなり；Ｍ
ｉｘ３は、ダイズ加水分解産物および表４に列挙したアミノ酸混合物を含む、無
血清かつ無タンパク質の培地からなり；そしてＭｉｘ４は、２．５ｇ／ｌの精製
し、限外濾過したダイズ加水分解産物および表４に列挙したアミノ酸混合物を含
む、無血清かつ無タンパク質の培地からなる。限外濾過したダイズ加水分解産物
の精製のために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムを使用した。
バッチプロセスを使用する）の場合における、第ＶＩＩＩ因子の生産性（ｍＵ／
ｍＬ）の比較を示す。Ｍｉｘ１は、ダイズ加水分解産物を含まないが、表４に列
挙したアミノ酸混合物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなり；Ｍｉｘ
２は、ダイズ加水分解産物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなり；Ｍ
ｉｘ３は、ダイズ加水分解産物および表４に列挙したアミノ酸混合物を含む、無
血清かつ無タンパク質の培地からなり；そしてＭｉｘ４は、２．５ｇ／ｌの精製
し、限外濾過したダイズ加水分解産物および表４に列挙したアミノ酸混合物を含
む、無血清かつ無タンパク質の培地からなる。限外濾過したダイズ加水分解産物
の精製のために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムを使用した。
【図３】
図３は、精製し、限外濾過したダイズペプトンの添加開始（すなわち、培養の
６日目）の後の無血清かつ無タンパク質の培地における、組換え第ＶＩＩＩ因子
を発現するＣＨＯ細胞の連続増殖の場合における、第ＶＩＩＩ因子生産性（Ｕ／
Ｌ）を示す。
６日目）の後の無血清かつ無タンパク質の培地における、組換え第ＶＩＩＩ因子
を発現するＣＨＯ細胞の連続増殖の場合における、第ＶＩＩＩ因子生産性（Ｕ／
Ｌ）を示す。
【図４】
図４は、ダイズ加水分解産物を含む無タンパク質かつ無血清の培地中で増殖さ
せた、組換え第ＩＩ因子を発現するＢＨＫ細胞を示す。
せた、組換え第ＩＩ因子を発現するＢＨＫ細胞を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，
ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，
ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ
Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ
Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ
，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 グリルベルガー， レオポルト
オーストリア国 アー−1200 ウィーン，
ドレストナーシュトラーセ 51／８
(72)発明者 ミッテラー， アルトゥーア
オーストリア国 アー−2304 オルト，
シュバルツェッカーヴェーク 10
Ｆターム(参考） 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24
4B065 AA90X AA91X AA91Y AB01
AC14 BA02 BB12 BB27 BB32
BB40 CA24
Claims (16)
- 【請求項１】 細胞の培養のための無タンパク質かつ無血清の培地であって
、ダイズ加水分解産物を含み、該ダイズ加水分解産物のうちの少なくとも４０％
が５００ダルトン以下の分子量を有する、培地。 - 【請求項２】 請求項１に記載の培地であって、該培地は、該培地の総乾燥
重量ベースで１０重量％を超える量のダイズ加水分解産物を含む、培地。 - 【請求項３】 請求項１に記載の培地であって、該培地は、限外濾過された
ダイズ加水分解産物を含む、培地。 - 【請求項４】 請求項３に記載の培地であって、該培地は、精製されたダイ
ズ加水分解産物を含む、培地。 - 【請求項５】 請求項１に記載の培地であって、前記ダイズ加水分解産物は
、５００Ｕ／ｇ未満の内毒素含量を有する、培地。 - 【請求項６】 請求項１に記載の培地であって、前記ダイズ加水分解産物の
うちの少なくとも５０％が、５００ダルトン以下の分子量を有する、培地。 - 【請求項７】 請求項６に記載の培地であって、前記ダイズ加水分解産物の
うちの少なくとも５５％が、５００ダルトン以下の分子量を有する、培地。 - 【請求項８】 請求項１に記載の培地であって、該培地はアミノ酸もまた含
む、培地。 - 【請求項９】 請求項７に記載の培地であって、前記アミノ酸が、Ｌ−アス
パラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファン
、Ｌ−グルタミンまたはこれらの混合物からなる群より選択される、培地。 - 【請求項１０】 請求項１に記載の培地であって、該培地は、緩衝剤物質、
酸化安定剤、機械的応力を打ち消す安定剤、およびプロテアーゼインヒビターか
らなる群より選択される、補助的物質もまた含む、培地。 - 【請求項１１】 哺乳動物細胞の培養のための請求項１に記載の培地の使用
。 - 【請求項１２】 哺乳動物細胞の培養のための請求項１に記載の培地の使用
であって、該哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞からなる群より選択
される、使用。 - 【請求項１３】 細胞の培養のためのプロセスであって、 該細胞を、請求項１に記載の培地中に導入する工程、および 該細胞を、該培地中で増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
- 【請求項１４】 細胞培養からのタンパク質の産生のためのプロセスであっ
て、 細胞を、請求項１に記載の培地中に導入する工程であって、該細胞が所望のタ
ンパク質を発現する、工程； 該細胞を該培地中で増殖させ、そして該タンパク質を発現させ、それにより、
該培地中で該細胞と該タンパク質との混合物を産生する、工程； 該混合物から該タンパク質を精製する工程、 を包含する、プロセス。 - 【請求項１５】 細胞培養組成物であって、哺乳動物細胞、および請求項１
に記載の培地を含む、組成物。 - 【請求項１６】 請求項１に記載の細胞培養培地を作製するためのプロセス
であって、 ダイズ加水分解産物を得る工程、 限外濾過プロセスを使用して、該ダイズ加水分解産物を限外濾過する工程、 サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、該ダイズ加水分解産物画分を精製
する工程、 ５００ダルトン以下の分子量を有するダイズ加水分解産物からなるダイズ加水
分解産物画分を選択する工程、 を包含する、プロセス。
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