HUP0202759A2 - Táptalaj sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztéséhez - Google Patents

Táptalaj sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztéséhez

Info

Publication number
HUP0202759A2
HUP0202759A2 HU0202759A HUP0202759A HUP0202759A2 HU P0202759 A2 HUP0202759 A2 HU P0202759A2 HU 0202759 A HU0202759 A HU 0202759A HU P0202759 A HUP0202759 A HU P0202759A HU P0202759 A2 HUP0202759 A2 HU P0202759A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
free
protein
culture medium
serum
Prior art date
Application number
HU0202759A
Other languages
English (en)
Inventor
Friedrich Dorner
Leopold Grillberger
Artur Mitterer
Wolfgang Mundt
Manfred Reiter
Original Assignee
Baxter Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3518214&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUP0202759(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Baxter Aktiengesellschaft filed Critical Baxter Aktiengesellschaft
Publication of HUP0202759A2 publication Critical patent/HUP0202759A2/hu
Publication of HUP0202759A3 publication Critical patent/HUP0202759A3/hu
Publication of HU228210B1 publication Critical patent/HU228210B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/005—Protein-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány tárgya táptalaj sejtek, főleg emlős sejtek fehérjementesés szérummentes tenyésztéséhez, amely táptalaj egy részszójahidrolizátumot tartalmaz. Ó

Description

A jelen találmány tárgya táptalaj sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztéséhez.
A sejtek, főleg eukarióta sejtek vagy emlős sejtek tenyésztése során folyamatosan felmerül az igény olyan speciális tenyésztő táptalajokra, amik hozzáférhetővé teszik a hatékony növekedéshez és a kívánt fehérje termeléséhez szükséges tápanyagokat és növekedési anyagokat. Ebből a szempontból az a szabály, hogy szérumot vagy szérumból származó vegyületeket (azaz például szarvasmarha szérumot) használunk a táptalaj komponenseként.
Azonban abban az esetben, amikor emberi vagy állati forrásból származó szérumot vagy fehérje adalékanyagot használunk sejttenyészetekben, számos probléma lép fel, különösen akkor, ha a kiindulási anyagot egy embernek beadandó gyógyászati hatóanyag sejttenyészettel történő előállításában használjuk.
Ennek következtében az ilyen szérum készítmények esetében az összetétel és a minőség sarzsról sarzsra változik, már csak azért is, mert az ilyen készítményekhez használt donor szervezetek eltérnek egymástól. Ez jelentős problémát jelent, különösen a sejtek termékeinek standardizálása miatt, valamint az ilyen sejtek standard növekedési körülményeinek meghatározása miatt. Minden ilyen esetben a használt szérum-anyag intenzív és állandó minőség-ellenőrzésére van szükség. Ez azonban rendkívül időigényes és költséges, különösen azokban az esetekben, amikor az ilyen komplex készítményeket szérumként használjuk.
Emellett, az ilyen komplex készítmények számos különböző fehérjét tartalmaznak, amiknek káros a hatásuk, különösen a sejttenyészetből kinyerendő rekombináns fehérje tisztítási eljárásában. Ez különösen azokra a fehérjékre igaz, amik homológok vagy hasonlítanak a kinyerendő fehérjéhez. Ezek a problémák természetesen különösen akutak abban az esetben, ha a használt táptalajban levő biogén párt (azaz például a szarvasmarha fehérjét) a tisztítás során megfelelő módon csak meglehetősen specifikus differenciál-tisztítási eljárással lehet eltávolítani (azaz például olyan ellenanyagokkal, amik specifikusan csak a rekombináns fehérje ellen irányulnak, és nem a szarvasmarha fehérje ellen) [Björck, L.: J. of Immunoi. 140, 1194-1197 (1988)]; Nilson és mtsai: J. Immunological Methods 164, 33-40 (1993)].
Azonban a szérumnak, vagy a szérumból származó vegyületeknek a tenyésztő táptalajban való használata egy másik komoly problémát vet fel, nevezetesen a mikoplazmával, vírusokkal vagy BSE ágensekkel való szennyezettséget. Az emberi vérből származó készítményekkel kapcsolatban leginkább a vírusokkal, azaz például hepatitisszel vagy HIV-vel való fertőzés kockázatát hangsúlyozzák. A szarvasmarhából származó szérum vagy szérum-komponensek esetében a BSE szennyeződés veszélye áll fenn. Ezek mellett, azonban az összes, szérumból származó anyag eddig ismeretlen betegség-indukáló ágensekkel lehet szennyezve.
A szérum-komponenseknek a hozzáadását, azzal a céllal, hogy garantáljuk a sejteknek a felszínekhöz való tapadását, és garantáljuk a kívánt anyagoknak a termelődését a sejtekben, korábban néhány kivétellel nélkülözhetetlennek tekintették, főleg a sejtek szilárd felszínen való tenyésztésére. így a WO 91/09935 számú szabadalmi leírásban ismertetett módszerrel ki lehet dolgozni olyan eljárást, amivel szérummentesen és fehérjementesen lehet tenyészteni az FSME vírus/vírus antigént, a felszín-dependens permanens sejtek, előnyösen verő sejtek szérummentes és fehérjementes tenyésztésével (lásd a WO 96/15231 számú szabadalmi leírást). Ezek azonban nem rekombináns sejtek, hanem inkább gazdasejtek, amiket egy lítikus folyamatban vírus antigén előállítására használnak.
Ezzel ellentétben a leginkább rekombináns készítmény előállítására használt sejtek, azaz például a CHO sejtek csak korlátozott mértékben képesek megtapadni. így a hagyományos módszerekkel tenyésztett CHO sejtek mind a sima, mind a porózus mikrohordozókhoz kizárólag szérumtartalmú körülmények között tapadnak [lásd a ,973,616 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást; Cytotechnology 9, 247-253 (1992)]. Ha azonban ezeket a sejteket szérummentes körülmények között tenyésztjük, akkor ezek elvesztik ezt a tulajdonságukat, és nem tapadnak a sima hordozókhoz, vagy könnyen leválnak róla, ha a táptalajhoz nem adunk más tapadást elősegítő adalékanyagot, azaz például fibronektint, inzulint vagy transzferrint. Azonban ezek is szérumból származó fehérjék.
Egy másik változat szerint a sejteket szuszpenziós tenyésztési technikákkal tenyészthetjük, valamint tenyészthetjük sarzs eljárással, vagy folyamatos tenyésztési technikával. A tenyésztést előnyösen a kemosztát eljárással hajthatjuk végre [Ozturk S.S. és mtsai: Abstr. Pap. Am. Chem. Soc., BIOT 164, Payne G.F. és mtsai: In: „Large Scale Cell Culture Technology” 206-212. old., szerk.: Lydersen B.K., Hauser kiadók (1987)].
Kattinger H. és munkatársai leírják a sejtek fehérjementes közegben való, hosszú idejű tenyésztését, de ezeket a sejteket hordozókon kell tenyészteni, és nem biztosít alternatívákat, mint például folyamatos tenyésztési technikákat [Kattinger, H. és mtsai: Advances Mol. Cell. Biology 15A, 193-207 (1996)]. Az az állítás, hogy ezek a sejtek csak akkor mutatnak hosszú idejű stabilitást, ha a csökkent növekedés miatt a hordozók felszínéhez tapadnak, és ennek következtében csökken a növekedési faktorok iránti igényük.
Emellett a szakirodalomban számos kísérletet tettek, hogy a sejteket a fehérjementes közeghez adaptálják, szérum-tartalmú körülményekből kiindulva. Azonban ilyen adaptáció esetében ismételten azt tapasztalták, a szérumtartalmú körülményekkel összehasonlítva, hogy az expresszált fehérje hozama és a rekombináns sejtek produktivitása jelentősen lecsökken a a fehérje mentes közeghez való adaptáció után [Applied Microbiology and Biotechnology 40, 691-658 (1994)].
Azt is kiderítették, hogy a magas sejtsűrúség esetében a rekombináns fehérjék termelődése alkalmanként erősen korlátozódik. Azoknak a kísérleteknek a során, amikor a sejteket fehérjementes vagy szérummentes közegekhez próbálták adaptálni, a használt sejtek instabilitása, a sejtek csökkent növekedésével ismételten előfordult, ezzel csökkent expressziót mutató sejtek termelődnek, miközben ezeknek a sejteknek a termelő sejtekhez viszonyítva növekedési előnyük van a fehérjementes és szérummentes közegben, és ez eredményezi azt a tényt, hogy túlnövik a termelő sejteket, majd végezetül a teljes tenyészet ennek következtében nagyon alacsony hozamot ad.
A jelen találmány tárgya tehát az, hogy javítsuk a rekombináns sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztésének valószínűségét, és olyan ágenseket és eljárásokat tegyünk hozzáférhetővé, amivel a rekombináns sejteket hatékonyan lehet tenyészteni szérummentes vagy fehérjementes körülmények között. Emellett az is lehetséges lehet, hogy nemcsak felszín-dependens sejteket tenyésszünk, hanem szuszpenziós tenyésztési technikát is használjunk, miközben a sejtek produktivitásának instabilitását a lehető legjobban el kell nyomni.
A jelen találmány tárgya továbbá az, hogy hatékonyan növeljük a rekombináns sejtek termelőképességét.
Végezetül, a jelen találmány szerint a rekombináns sejtek szérummentes és fehérjementes közeghez való adaptálását szükségesjavítani és hatékonyabban konfigurálni.
A jelen találmány szerint ezeket a feladatokat egy olyan, a sejtek, különösen emlős sejtek fehérjementes és szérummentes tenyésztésére alkalmas közeg használatával kell végrehajtani, amely közeget az a tulajdonság jellemzi, hogy egy rész szójahidrolizátumot tartalmaz.
Meglepő módon lehetséges volt annak kimutatása, hogy az előzőkben definiált célokat úgy lehet elérni, hogy a sejteket szójahidrolizátumot tartalmazó közegben tenyésztjük, anélkül hogy el kellene viselni a szérummentes tenyésztés hátrányait, amiket az előzőkben ismertettünk. Más, a szakirodalomból korábban ismert hidrolizátumokkal, mint például a búza-hidrolizátumokkal, rizs-hidrolizátumokkal vagy élesztő-hidrolizátumokkal ellentétben azt találtuk, hogy csak a szója-hidrolizátumok módosítják a jelen találmány szerint a tulajdonságokat, és például a rekombináns célfehérje szignifikánsan megnőtt hozamát eredményezte. Ha ezeket a szakkifejezéseket használjuk, akkor a szója-hidrolizátum vagy szójapepton szakkifejezést egymás helyettesítésére használhatjuk, anélkül hogy különböző jelentésük lenne.
A jelen találmány szerinti közeg előnyösen szója-hidrolizátumot tartalmaz, több mint 10 tömegszázalék mennyiségben, a közeg száraz-súlyára vonatkoztatva. A szabály az, hogy a közegben a szója-hidrolizátum mennyiségét 4-40%-ban biztosítjuk.
A specifikus szója-hidrolizátum megválasztása nem kritikus a jelen találmányban. A piacon található sok különböző szója készítmény használható a jelen találmány szerint, azaz például szójalisztből készített peptonok, enzimatikusan (azaz például papainnal) emésztve, a pH értéke 6,5 és 7,5 változik, az össz-nitrogéntartalom 9% és 9,7% között van, a hamutartalma 8 és 15% között van. Ezek szójababból származó peptonok, olyan formában, amiben a szakterület szakértői általánosan használják sejttenyésztésre.
Egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint egy szója-hidrolizátum tisztított készítményét, vagy annak nyers frakcióját használhatjuk a jelen találmány szerinti közegben. Ennek a tisztításnak a során előnyösen eltávolítjuk azokat a szennyeződéseket, amik zavarják a hatékony tenyésztést, vagy a hidrolizátum pontosságát javítjuk, például a molekulasúly szempontjából.
A jelen találmány szerint egy ultraszürési lépés különösen értékesnek bizonyult a tisztítás elvégzése során; emiatt az ultraszúrt szója-hidrolizátum használatát különösen előnyben részesítjük a jelen találmány szerinti közegekben.
Az ultraszúrést a szakirodalomban korábban részletesen ismertetett módszerrel hajthatjuk végre, azaz például meghatározott vágási értékű membránszúrőket használunk.
Az ultraszűrt szójapepton tisztítását gélkromatográfiával végezhetjük el, azaz például Sephadex kromatográfiával, például Sephadex G25 vagy Sephadex G10 vagy ekvivalens anyagú oszlopon, ioncserélő kromatográfiával, affinitáskromatográfiával, méretkizárásos kromatográfiával, vagy „fordított fázisú” kromatográfiával. Ezek a szakterületen régebben ismert eljárások, amikkel a szakterületen jártas szakember tisztában van. Ezeknek a módszereknek az alkalmazásával azok a frakciók választhatók ki, amik egy meghatározott molekulasúlyú szója-hidrolizátumot, azaz például < 1000 Dalton molekulasúlyút, előnyösen < 1000 Dalton molekulasúlyút, még előnyösebben < 350 Dalton molekulasúlyút tartalmaznak.
Tehát a jelen találmány tárgya eljárás szérummentes és fehérjementes sejttenyésztö táptalaj előállítására, ami abból áll, hogy előállítunk egy szója-hidrolizátumot, az említett szója-hidrolizátumot ultraszűrő berendezéssel ultraszürésnek vetjük alá, az említett szója-hidrolizátum frakciót méretkizárásos kromatográfiával megtisztítjuk, és kiválasztjuk azokat a szója-hidrolizátum frakciókat, amiknek a molekulasúlya < 1000 Dalton, előnyösen < 1000 Dalton, még előnyösebben < 350 Dalton.
Egy különösen előnyös szója-hidrolizátumot az jellemez, hogy szabad aminosav-tartalma 10,3 és 15,6%, vagy, előnyösen 12 és 13,5% között van, össz-nitrogén tartalma 7,6 és 11,4%, vagy előnyösen 8,7 és 9,5% között van, exotoxin tartalma <500 E/g, és ennek következtében legalább 40 százalékának, előnyösen legalább 50 százalékának, főleg előnyösen legalább 55 százalékának a molekulasúlya 200-500 Dalton, és legalább 10 százalékának, előnyösen 15 százalékának a molekulasúlya 500-1000 Dalton. A legelőnyösebb, ha a szója-hidrolizátum legalább 90 százalékának a molekulasúlya < 500 Dalton.
A szója-hidrolizátum mellett a jelen találmány szerinti közeg tartalmazhat szintetikus táptalajt, az eddig megismert módon, azaz például DMEM/HAM féle Fl2-t, Medium 199-et vagy RPMI-t, amik a szakirodalomból megfelelő módon ismertek.
Emellett a jelen találmány szerinti közeg előnyösen tartalmaz aminosavakat, előnyösen olyanokat, amiket az alábbi csoportból választunk ki: L-aszparagin, L-cisztein, L-cisztin, Lprolin, L-triptofán, L-glutamin és ezek keverékei.
Az alábbi aminosavakat előnyösen szintén hozzáadjuk a jelen találmány szerinti táptalajhoz: L-aszparagin (0,001-1 g/1 táptalaj mennyiségben, előnyösen 0,1-0,05 g/1, különösen előnyösen 0,015-0,03 g/1 mennyiségben); L-cisztein ( 0,001-1 g/1, előnyösen 0,005-0,05 g/1, különösen előnyösen 0,01-0,03 g/1); Lcisztein (0,001-1 g/1, előnyösen 0,01-0,05g/l, különösen előnyösen 0,015-0,03 g/1); L-prolin (0,001-1,5 g/1, előnyösen 0,01-0,07 g/1, különösen előnyösen 0,02-0,05 g/1); L-triptofán (0,01-1 g/1, előnyösen 0,01-0,05 g/1, különösen előnyösen 0,015-0,03 g/1); és L-glutamin (0,05-1 g/1, előnyösen 0,1-1 g/1).
Az előzőkben említett aminosavak a jelen találmány szerinti táptalajhoz vagy egyenként, vagy kombinációban adhatók hozzá. Különösen előnyben részesítjük olyan aminosav keverék kombinált hozzáadását, ami az előzőkben említett összes aminosavat tartalmazza.
Egy szérummentes és fehérjementes táptalajt használunk ennek a megvalósítási módnak egy speciális formájában, miköz ben a táptalaj tartalmazza még az előzőkben említett aminosavkeveréket, valamint tisztított ultraszűrt szójapeptont.
Meglepő módon azt találtuk például, hogy ahhoz, hogy inaktiváljuk a vírusokat vagy más patogéneket, a táptalaj negatív hatások nélkül megmelegíthető, például 5-20 percre, előnyösen 15 percre 70-95 °C-ra, vagy előnyösen 85-95 °C-ra.
A jelen találmány szerint minden ismert szintetikus táptalaj használható a szója-hidrolizátummal kombinálva. A hagyományos szintetikus táptalajok tartalmazhatnak szervetlen sókat, aminosavakat, vitaminokat, vagy szénhidrát-forrást és vizet. Használhatjuk a DMEM/HAM féle F12 táptalajt. A táptalajban a szójakivonat koncentrációja előnyösen 0,1 és 100 g/1, különösen előnyösen 1 és 5 g/1. Ennek a megvalósítási módnak egy különösen előnyös formája szerint az a szójapepton használható, amit a molekulasúlya alapján standardizáltak. A szójapepton molekulasúlya előnyösen kevesebb mint 50 kDa, különösen előnyösen kevesebb mint 10 kDa, és legelőnyösebben kevesebb mint 1 kDa.
Az ultraszúrt szójapepton hozzáadása különösen előnyösnek bizonyult a rekombináns sejtvonalak termelőképessége szempontjából, amikor a szójapepton molekulasúlya 350 Dalton (Quest Company). Ez egy olyan szója-izolátum, aminek a nitrogén-tartalma körülbelül 9,5%, és szabad aminosav-tartalma körülbelül 13%.
Különösen előnyös a < 1000 Dalton, előnyösen < 500
Dalton, különösen előnyösen < 350 Dalton molekulasúlyú tisztított, ultraszúrt szójapepton használata.
A jelen találmány szerinti táptalaj előnyösen tartalmaz kiegészítő anyagokat is, azaz például pufferelő anyagokat, oxidációstabilizátorokat, a mechanikai stressz elviselését segítő stabilizátorokat vagy proteáz inhibitorokat.
Különösen jól használható az alábbi összetételű táptalaj: szintetikus minimál táptalaj (1-25 g/1), szójapepton (0,5-50 g/1), L-glutamin (0,05-1 g/1), NaHCOe (0,1-10 g/1), aszkorbinsav (0,0005-0,05 g/1), etanolamin (0,0005-0,05 g/1) és nátriumszelenit (1-15 pg/l).
Ha szükséges, akkor egy nem-ionos felületaktív anyagot, azaz például polipropilén-glikolt (PLURONIC F-61, PLURONIC F68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 vagy PLURONIC F-108) adhatunk a táptalajhoz, a jelen találmány szerinti habgátló anyagként.
Ezt az ágenst általában azzal a céllal használják, hogy megóvják a sejteket a levegőztetés negatív hatásaitól, mivel egy habzásgátló hozzáadása nélkül a felszálló és kipukkadó levegő-buborékok azoknak a sejteknek a károsodását okozhatják, amik a szóban forgó levegőbuborékok felszínén találhatók („bekeverés”) [Murhammer és Gooche: Biotechnoi. Prog. 6, 142-18 (1990)].
Tehát a nem-ionos felületaktív anyagok mennyisége 0,05 és 10 g/1 között lehet, bár, a legkisebb mennyiség különösen előnyösen 0,1 és 5 g/1 között van.
Emellett a jelen találmány szerinti táptalaj tartalmazhat ciklodextrint vagy ciklodextrin-származékot.
A szérummentes és fehérjementes táptalaj előnyösen tartalmaz egy proteáz inhibitort, azaz például szerin proteáz inhibitorokat, amik megfelelnek a szövettenyészetekhez, és szintetikus vagy növényi eredetűek.
Előnyösen a már adaptált sejteket használjuk a jelen találmány szerinti táptalajban való tenyésztéshez, azaz olyan sejteket, amik már adaptálódtak ahhoz, hogy fehérjementes és szérummentes táptalajban szaporodjanak. Kiderült, hogy az ilyen előadaptált sejtekkel nemcsak nagyobb hozamok érhetők el, hanem a szérummentes és fehérjementes tenyésztéshez a stabilitásuk is világosan megnő, ha a jelen találmány szerinti táptalajt használjuk.
Azonban a rekombináns sejt-klónok különösen értékesnek bizonyultak a jelen találmány szerint, mivel ezek az indulástól számítva legalább 40 generáción keresztül, előnyösen legalább 50 generáción keresztül stabilak szérummentes és fehérjementes táptalajokban, és rekombináns termékeket expresszálnak.
Az ilyen sejt-klónok egy olyan sejttenyészetből nyerhetők ki, amit egy eredeti rekombináns sejt-klón szérum-tartalmú táptalajon való tenyésztésével kaptunk, és a sejteket újra szérummentes és fehérjementes táptalajhoz adaptáljuk.
Az „eredeti sejt-klón” szakkifejezés jelentése egy rekombináns sejt-klón transzfektáns, ami a gazdasejtek rekombináns nukleotid szekvenciával való transzfekciója után egy rekombináns terméket laboratóriumi körülmények között stabilan expresszál. Az eredeti kiónt szérumot tartalmazó táptalajban tartjuk fenn, hogy optimalizáljuk növekedését. Ahhoz, hogy termelőképességét fokozzuk, az eredeti kiónt szaporítjuk, adott esetben szelekciós ágens jelenlétében, a szelekciós markerrel és/vagy amplifikációs markerrel végzett szelekcióval. A nagymennyiségű, ipari termeléshez az eredeti sejt-klónt magas sejt-sűrűségig szaporítjuk, szérumot tartalmazó tenyésztési körülmények között, majd újra adaptáljuk szérummentes és fehérjementes táptalajhoz, közvetlenül a termelő fázis előtt. Ebben az esetben a tenyésztés előnyösen szelekciós nyomás nélkül megy végbe.
Az eredeti rekombináns sejt-klón tenyésztése az indulástól kezdve történhet szérummentes és fehérjementes táptalajban; ebben az esetben az újra-adaptálásra már nincs szükség. Ha szükséges, akkor ebben az esetben szelekciós ágenst használhatunk, és a szelekciót a szelekciós markerral és/vagy az amplifikációs markerrel hajthatjuk végre. Ezt az eljárást például az EP 0 711 835 számú szabadalmi leírásban ismertetik.
Az újra-adaptálás után kapott sejttenyészet szérummentes és fehérjementes táptalajhoz való újra-adaptálását teszteljük a sejtpopuláció azon sejt-klónjainál, amik a terméket stabilan termelik szérummentes és fehérjementes körülmények között, adott esetben szelekciós nyomás nélkül. Ez megtörténhet például immunfluoreszcenciával, jelzett specifikus ellenanyagokkal, amik a rekombináns polipeptid vagy fehérje ellen irányulnak. A termékelőállítóként azonosított sejteket izoláljuk a sejttenyészetből, és tovább szaporítjuk szérummentes és fehérjementes körülmények között, amik előnyösen ekvivalensek a termelési körülményekkel.
.:.. . .:. .
A sejtek izolálását tehát úgy hajthatjuk végre, hogy izoláljuk a sejteket, majd vizsgáljuk, hogy termelik-e a terméket.
A stabil sejteket tartalmazó sejttenyészet ismét megvizsgálható, hogy tartalmaz-e stabil rekombináns kiónokat, majd ezeket izoláljuk a sejttenyészetből és szubklónozzuk. A szérummentes és fehérjementes körülmények között kapott stabil rekombináns sejt-klónokat azután tovább tenyésztjük szérummentes és fehérjementes körülmények között.
Az ilymódon, a jelen találmány szerinti táptalajban készített rekombináns sejt-klónok vagy sejtpopulációk különösen azzal tűnnek ki, hogy legalább 40 generáción át stabilak, előnyösen legalább 50 generáción át, és különösen előnyösen több mint 60 generáción át, és egy rekombináns terméket expresszálnak.
Egy ilyen rekombináns stabil sejt-klón vagy sejtpopuláció egy példáját a Budapesti Egyezmény alapján az European Collection of Animal Cell Culture-nél (Nagy-Britannia) helyeztük letétbe 98012206 letéti számon.
A sejttenyészet, amit a jelen találmány szerint kell tenyészteni, előnyösen egy rekombináns emlős sejtből származik. A rekombináns emlős sejt lehet tehát az összes olyan sejt, ami egy rekombináns polipeptidet vagy fehérjét kódoló szekvenciát tartalmaz. Az összes folyamatosan szaporodó sejt, ami letapadva vagy nem-letapadva növekszik, ebből a szempontból ide tartozik. Különösen előnyben részesítjük a rekombináns CHO sejteket vagy BHK sejteket. A rekombináns polipeptidek vagy fehérjék lehetnek vér-faktorok, növekedési faktorok, vagy más biológiaigyógyászati szempontból releváns termékek.
A jelen találmány szerint azokat a sejt-klónokat részesítjük előnyben, amik egy rekombináns véralvadási faktor, azaz például a Il-es faktor, V-ös faktor, VII-es faktor, VIII-as faktor, IX-es faktor, X-es faktor, 11-es faktor, Protein S, Protein C, ezeknek a faktoroknak egy aktivált formája, vagy vWF kódoló szekvenciáját tartalmazzák, és képesek ezeket több generáción keresztül stabilan expresszálni. Ebből a szempontból előnyben részesítjük azokat a CHO sejteket, amik vWF-et, vagy vWF aktivitással rendelkező polipeptidet, VIII-as faktort, vagy VIII-as faktor aktivitással rendelkező polipeptidet, vWF-et és VIII-as faktort, IX-es faktort vagy ΙΙ-es faktort expresszálnak.
generációra van szükség ahhoz, hogy egy master sejtbankot beindítsunk. Legalább körülbelül 40 generációra van szükség ahhoz, hogy egy átlagos sarzs-tenyésztést elvégezzünk 1000 literes méretben. Egy egyedi sejt-klónból kiindulva lehetséges, hogy a jelen találmány szerinti táptalajjal 8-10 generáció alatt elkészítsünk egy „master sejt-bankot” (MCB), valamint egy „munka sejt-bankot” (WCB), és ezáltal egy sejttenyészetet 20-25 generáció alatt fehérjementes és szérummentes körülmények között termelési méretben (termelő biomassza), míg, ezzel szemben, a korábbi klónokkal és táptalajokkal való tenyésztés után néhány generáció instabillá válik, és ennek eredményeképpen a) nem kapunk uniform, termelő sejteket tartalmazó sejtte nyészeteket, és b) hosszú időtartamú stabil termék-előállítás nem lehetséges.
Azonban a jelen találmány szerint, ezzel szemben lehetséges megnőtt termelőképességet találni, még az eredeti sejtklónnal összehasonlítva is, amit szérumot tartalmazó táptalajban tenyésztettünk.
Egy további szempont szerint a jelen találmány tárgya eljárás sejtek, főleg emlős sejtek előállítására, amiket az jellemez, hogy ezeket a sejteket a találmány szerint bejuttatjuk a táptalajba, majd azután ebben a táptalajban tenyésztjük.
Ennek megfelelően a jelen találmány tárgya továbbá egy sejttenyészet, ami a a jelen találmány szerinti táptalajt és sejteket, előnyösen eukarióta sejteket, főleg emlős sejteket tartalmazza.
A találmányt részletesebben megvilágítják az alábbi példák, valamint a mellékelt ábrák, amiket nem tekintünk a jelen találmány oltalmi köre korlátozásának.
Az 1. ábra mutatja egy rFVIII-CHO sejt-klón tenyésztését egy tízliteres perfúziós bioreaktorban:
1. VIII-as faktor aktivitás (milliegység/ml) és perfúziós sebesség (1-5/nap) 42 nap alatt;
2. térfogati termelőképesség (VIII-as faktor egység/liter/nap) a perfúziós bioreaktorban.
A 2. ábra mutatja az rVIII-as faktort expresszáló CHO sejtek VIII-as faktor termelőképességének (mE/ml) összehasonlítását a sarzs eljárással különböző táptalajokban végzett te nyésztés során. Az 1. elegy tartalmaz egy szérummentes és fehérjementes táptalajt szója-hidrolizátum nélkül, de tartalmaz a 4. táblázatban felsorolt aminosav-keveréket; a 2. elegy szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szója-hidrolizátumot tartalmaz; a 3. elegy szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szója-hidrolizátumot és a 4. táblázatban felsorolt aminosavkeveréket tartalmaz; a 4. elegy szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami 2,5 g/1 tisztított, ultraszúrt szója-hidrolizátumot és a 4. táblázatban felsorolt aminosav-keveréket tartalmaz. Az ultraszúrt szója-hidrolizátum tisztítására egy Sephadex oszlopot használunk.
A 3. ábra mutatja a VIII-as faktor termelőképességet (E/liter) rVIII-as faktort expresszáló CHO sejtek szérummentes és fehérjementes táptalajban való folyamatos tenyésztése esetében, tisztított, ultraszürt szójapepton hozzáadásának megkezdése után, nevezetesen a tenyésztés 6. napján; és
A 4. ábra mutatja azokat a rekombináns Il-es faktort expresszáló BHK sejteket, amiket szója-hidrolizátumot tartalmazó fehérjementes és szérummentes táptalajban tenyésztettünk.
Példák
1. Példa
Az rvWF-CHO sejtek stabilitása szérumot tartalmazó táptalajról szérummentes és fehérjementes táptalajra való átállás után
A CHO-dhfr sejteket a phAct-rvWF és pSV-dhfr plazmidokkal ko-transzfektáljuk, majd a vWF-et expresszáló kiónokat
Fischer és munkatársai publikációja szerint szubklónozzuk [Fischer és mtsai: FEBS Letters 351, 345-348 (1994)]. Egy munka sejt-bankot (WCB) indítunk az rvWF-et szérumot tartalmazó, de MTX-et nem tartalmazó körülmények között stabilan expresszáló szubklónokból, majd a sejteket szérumot tartalmazó körülmények között egy porózus mikrohordozóra (Cytopore) immobilizáljuk. A sejteket szérummentes és fehérjementes táptalajra azután visszük át, hogy a sejtsúrúség elérte a 2xl07 sejt/ml hordozó értéket. A sejteket tovább tenyésztjük több generációban szérummentes és fehérjementes körülmények között. A sejteket különböző időpontokban szérummentes és fehérjementes táptalajban teszteljük, immunfluoreszcenciát használva anti-vWF ellenanyagokkal. A sejtek stabilitását a munka sejt-bankkal értékeljük ki, mielőtt kicseréljük a táptalajt, 10 generációval és 60 generációval a szérummentes és fehérjementes táptalajban való tenyésztés után. Eközben a munka sejt-bank még 100% rvWF termelőket tartalmaz, az rvWF termelők aránya körülbelül 50%ra csökken a szérummentes és fehérjementes táptalajban 10 generáció tenyésztése után. 60 generáció után a sejteknek több mint 95%-át nem-termelőkként lehetett azonosítani.
2. Példa
Stabil rekombináns CHO kiónok klónozása
Az 1. példa szerint higítási sorozatot készítünk az rvWFCHO sejteket tartalmazó sejttenyészetből (ez a stabil sejt-klón az r-vWF-CHO F7 jelölést kapta, és a Budapesti Egyezmény szerint az European Collection of Animal Cell Culture-nél (ECACC, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Nagy-Britannia) helyeztük letétbe 1988. január 22-én, 98012206 letéti számon), majd 60 generáción át szérummentes és fehérjementes táptalajban tenyésztjük, és 0,1 sejtet szélesztünk ki egy mikrotiter lemez minden egyes lukába. A sejteket körülbelül három hétig tenyésztjük DMEM/HAM féle F12 táptalajban, szérum vagy fehérje hozzáadása, és szelekciós nyomás nélkül, majd a sejteket immunfluoreszcenciával teszteljük, jelzett vWF ellenanyagok használatával. Egy pozitívként azonosított sejt-klónt használunk kiindulási klónként egy oltóanyag sejt-bank készítésére. Az oltóanyag sejtbankból szérummentes és fehérjementes közegben egy master sejt-bankot (MCB) indítunk, majd ampullákba szétmérjük és lefagyasztjuk, egy munka sejt-bank későbbi előállításához. Egy ampullából munka sejt-bankot készítünk szérummentes és fehérjementes táptalajban. A sejteket porózus mikrohordozókra immobilizáljuk, majd több generációban tovább tenyésztjük szérummentes és fehérjementes körülmények között. A sejtek termelőképességét különböző időpontokban teszteljük szérummentes és fehérjementes táptalajban, immunfluoreszcenciát használva jelzett anti-vWF ellenanyagokkal. A sejtek stabilitásának kiértékelését elvégezzük a munka sejt-bank állapotban, valamint 10 és 60 generáció után, ami szérummentes és fehérjementes táptalajban követi egymást. A sejteknek körülbelül 100%-át azonosítottuk rvWF-et expresszáló pozitív stabil klónként, a munka sejt-bank állapotban, 10 generáció és 60 generáció után.
3. Példa
A rekombináns sejt-klónok sejt-specifikus termelőképessége
A sejtek meghatározott számát a rekombináns sejtek tenyésztésének meghatározott pontjaiban eltávolítjuk, majd ezeket 24 óra hosszat friss táptalajban inkubáljuk. az rvWF: Risto-CoFaktivitását a sejttenyészetek felülúszójából határozzuk meg. Az 1. táblázat azt mutatja, hogy a jelen találmány szerinti stabil rekombináns sejttenyészetek esetében a sejtspecifikus termelőképesség még 60 generáció után is stabil volt egy szérummentes és fehérjementes táptalajban, sőt még meg is nőtt az eredeti kiónhoz viszonyítva, amit szérumot tartalmazó táptalajban tenyésztünk.
1. Táblázat
Sejt-klón A termelő sejtek sejtspecifikus termelőképessége mE rvWF/106 sejt/nap egységben Sejtspecifikus termelőképesség 10 generáció után mE rvWF/106 sejt/nap egységben Sejtspecifikus termelőképesség 60 generáció után mE rvWF/106 sejt/nap egységben
rvWF-CHO #808.68 eredeti sejt-klón 55 30 <10
r-vWF-CHO F7*) 62 65 60
stabil klón
*) az European Collection of Animal Cell Culture-nél (ECACC, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Nagy-Britannia) helyeztük letétbe 1988. január 22-én, 98012206 letéti számon
4. Példa
Szintetikus szérummentes és fehérjementes táptalaj összetétele
2. Táblázat
Komponens g/liter Előnyben részesített mennyiség (a találmány benyújtásakor érvényes ismereteink szerint) g/l-ben
Szintetikus minimál táptalaj (DMEM/HAM, FI2) 1-100 11,0-12,0
Szójapepton 0,5-50 2,5
L-glutamin 0,05-1 0,36
Aszkorbinsav 0,0005-0,05 0,0035
NaHCO3 0,1-10 2,00
Etanolamin 0,0005-0,05 0,0015
Na-szelenit 1-15 pg/ml 8,6 pg/l
Adott esetben: Synperonic F68 0,01-10 0,25
5. Példa rFVIII-CHO sejtek tenyésztése fehérjementes és szérummentes táptalajban rFVIII-CHO sejteket tartalmazó sejttenyészetet tenyésztünk tízliteres kevertetett tartályban, perfúzióval. Ebben az esetben a 4. példa szerinti táptalajt használunk. A sejteket egy porózus mikrohordozóra (Cytopore, Pharmacia) immobilizáljuk, majd legalább 6 hétig tenyésztjük. A perfúzió sebessége 4 térfogat-váltás per nap; a pH értéke 6,9-7,2; az oxigén-koncentráció körülbelül 20-50%, a hőmérséklet 37 °C.
Az 1. ábra mutatja egy rFVIII-CHO sejt-klón tenyésztésének eredményeit egy tízliteres perfúziós bioreaktorban.
1. VIII-as faktor aktivitás (milliegység/ml) és perfúziós sebesség (1-5/nap) 42 nap alatt;
2. térfogati termelőképesség (VIII-as faktor egység/liter/nap) a perfúziós bioreaktorban.
3. Táblázat
A tenyésztés napja Sejtspecifikus termelőképesség (mE/106 sejt/nap) Immunfluoreszcencia (% FVIII pozitív sejtek)
15 702 n.a.
21 1125 n.a.
28 951 >95%
35 691 >95%
42 970 n.a.
A 3. táblázat mutatja az rFVIII-at expresszáló sejtek stabilitását és specifikus termelőképességét. Ahhoz, hogy megkapjuk ezeket az eredményeket, a 15., 21., 28., 35. és 42 napon mintát veszünk, majd 300xg-vei centrifugáljuk, és friss szérummentes és fehérjementes táptalajban reszuszpendáljuk. 24 óra elteltével meghatározzuk a VIII-as faktor koncentrációját és a sejtszámot a sejttenyészetek felülúszójában. A specifikus VIII-as faktor termelőképességet ezekből az adatokból számítjuk ki.
Stabil, 888 miliegység/106 sejt/nap termelőképességet kaptunk. Ezt a stabil termelőképességet immunfluoreszcenciával is igazoltuk, ehhez jelzett anti-FVIII ellenanyagokat használva, 15, 21, 28, 35 és 42 napos, szérummentes és fehérjementes táptalajban való tenyésztés után.
6. Példa
A rekombináns FVIII-CHO sejtek termelőképességének összehasonlítása különböző táptalaj-komponenseket tartalmazó fehérjementes és szérummentes táptalajban
Egy rFVIII-CHO sejteket tartalmazó sejttenyészetet sarzsban tenyésztünk. Ebben az esetben a 4. példában ismertetett táptalajt használjuk, amihez az alábbi aminosavakat adjuk hozzá.
4. Táblázat
Aminosav mg/1 Előnyben részesített mennyiség (a találmány benyújtása-
kor érvényes ismereteink szerint) g/1-ben
L-aszp aragin 1-100 20
L-ciszteinxHClxHaO 1-100 15
L-cisztin 1-100 20
L-prolin 1-150 35
L-glutamin 50-1000 240
A sejteket 37 °C-on szaporítjuk, pH=6,9-7,2. A sejteket a sarzs eljárással szaporítjuk, 24-72 óra alatt.
A rekoníbináns FVIII-CHO sejtek termelőképességét az alábbi táptalaj összetételekkel mérjük:
1. elegy: tartalmaz egy szérummentes és fehérjementes táptalajt szójapepton nélkül, de tartalmaz a 4. táblázatban felsorolt amino sav-keveréket;
2. elegy: szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szójapeptont tartalmaz;
3. elegy: szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami szója-hidrolizátumot és a 4. táblázatban felsorolt aminosavkeveréket tartalmaz;
4. elegy: szérummentes és fehérjementes táptalaj, ami 2,5 g/1 tisztított, ultraszúrt szója-hidrolizátumot és a 4. táblázatban felsorolt aminosav-keveréket tartalmaz. Az ultraszúrt szójapeptont kromatográfiával tisztítjuk, Sephadex oszlopon.
7, Példa
Rekombináns FVHI-CHO sejtek tenyésztése fehérjementes és szérummentes táptalajban, kemosztát tenyésztési módszerrel
Az rFVIII-CHO sejteket tartalmazó sejttenyészetet tízliteres bioreaktor tartályban tenyésztjük. Ebben az esetben a 4. példában ismertetett táptalajt használjuk, szójapepton nélkül, és a 6. példában ismertetett aminosav-elegyet tartalmazza. A sejteket 37 °C-on szaporítjuk, pH=6,9-72; az oxigén-koncentráció 20-50%-os levegő-telítés. 24 óránként mintát veszünk, hogy a tenyészet felülúszójában meghatározzuk a VIII-as faktor titerét és a sejt-koncentrációját. Az össz-sejt koncentráció a 2. naptól a 14. napig állandó volt. Az ultraszürt szójapeptont a 6. naptól kezdve adjuk a táptalajhoz. A VIII-as faktor termelőképességet a 3. ábrán mutatjuk be; a méréseket CHROMOGENIX CoA FVIII:C/4 rendszerrel végezzük. Az immunfluoreszcenciát jelzett anti-FVIII ellenanyagokkal hajtjuk végre. Az látható az adatokból, hogy a VIII-as faktor termelőképesség jelentősen megnőtt, és ennek következtében a bioreaktor rendszer volumetrikus termelőképessége is megnőtt, a szójapepton hozzáadása következtében, miközben ez nem eredményezte a sejtek növekedésének jelentős erősödését. A szójapepton hiánya a folyamatos tenyészetben néhány nap elteltével az FVIII termelőképesség jelentős csökkenését eredményezi, míg a szójapepton hozzáadása viszont a termelőképesség körülbelül tízszeres növekedését eredményezi. Mivel azonban ez a hozzáadás nem növeli a sejtszámot, ez világosan arra utal, hogy az ült raszúrt szójapepton hozzáadása viszont jelentősen megnöveli a termelőképességet, a sejtnövekedéstől függetlenül.
8. Példa
Rekombináns FVIII-CHO sejtek növekedési sebességének és termelőképességének összehasonlítása különböző hidrolizátumokat tartalmazó fehérjementes és szérummentes táptalajban rFVIII-CHO sejteket tenyésztünk sarzsonként. Ebben az esetben a 4. példában ismertetett szérummentes és fehérjementes táptalajt használjuk, amihez különböző hidrolizátumokat (szója-, élesztő-, rizs- és búza-hidrolizátum) adunk. Kontrollként olyan szérummentes és fehérjementes táptalajt használunk, amihez semmilyen hidrolizátumot nem adtunk.
A kiindulási sejtsűrűség Ο,όχΙΟ5 illetve 0,4xl06. A sejteket 37 °C-on szaporítjuk, saras eljárással, pH=6,9-7,2.
Az 5. táblázat az rFVIII-CHO sejtek tenyésztési kísérleteinek eredményeit mutatja be, szérummentes és fehérjementes táptalajon, amihez ultraszűrt szója-hidrolizátumot és élesztő hidrolizátumot adtunk. A kiindulási sejtsúrűség Ο,όχΙΟ6 sejt. Kontrollként olyan szérummentes és fehérjementes táptalajt használunk, amihez semmilyen hidrolizátumot nem adtunk.
5. Táblázat
Hidrolizátum Végső sejtsűrűség (x 106/ml) FVIII titer (mE/ml) FVIII véralvadási aktivitás (mE/ml)
Szója 3,6 485 508
Élesztő 3,3 226 230
A 6. táblázat mutatja az rFVIII-CHO sejtek tenyésztési kísérleteinek eredményeit mutatja be, szérummentes és fehérjemolekul táptalajon, amihez ultraszürt szója-hidrolizátumot, rizs-hidrolizátumot és búza-hidrolizátumot adtunk. A kiindulási sejtsűrűség 0,6* 106 sejt. Kontrollként olyan szérummentes és fehérjementes táptalajt használunk, amihez semmilyen hidrolizátumot nem adtunk.
6. Táblázat
Hidrolizá- tum Végső sejtsűrűség (x 106/ml) FVIII titer (mE/ml) vWF - antigén (Bg/ml)
Szója 3,7 1142 6,7
Rizs 3,0 479 3,2
Búza 3,4 522 3,9
Kontroll 3,0 406 3,1
A 7. táblázat mutatja az rFVIII-CHO sejtek tenyésztési kísérleteinek eredményeit mutatja be, szérummentes és fehérjemolekul táptalajon, amihez ultraszúrt szója-hidrolizátumot és búzahidrolizátumot adtunk. A kiindulási sejtsúrűség 0,4><106 sejt.
7. Táblázat
Hidroli- Végső sejtsürú- FVIII titer FVIII - anti- vWF - anti-
zátum ség (xl06/ml) (mE/ml) gén (pg/ml) gén
(pg/ml)
szója 1,6 1427 166 47,2
Búza 1,0 1120 92 7,9
9. Példa
BHK sejtek tenyésztése fehérjementes és szérummentes táptalajban, ami szója-hidrolizátumot tartalmaz
BHK-21 (ATCC CCL 10) sejteket háromszorosan ko-transzfektálunk az alábbi plazmidokkal, CaPCU eljárás alkalmazásával!: 25 pg pSV-FII plazmid [Fischer, B. és mtsai: Journal of Biological Chemistry 271, 23737-23742 (1996)], ami a humán II-es faktort (protrombin) kódoló cDNS-t tartalmazza SV40 promoter vezérlésével (SV40 korai gén promoter); 4 pg pSV-DHFR plazmid a metotrexát rezisztencia biztosítására, és 1 mg pUCSV-neo [Schlokat, U. és mtsai: Biotech. Appl. Biochem. 24, 257-267 (1996)] plazmiddal, ami G418/neomicin rezisztenciát biztosít. A stabil sejt-klónokat olyan táptalajon való tenyésztéssel szelektáljuk, ami 500 pg/ml G418-at tartalmaz, a metotrexát koncentrációját lépésenként 3 pmol/l-ig növelve.
Az ílymódon kapott kiónokat szubklónozzuk, majd fehérjementes és szérummentes táptalajhoz adaptáljuk. A tenyésztést szuszpenziós tenyésztési technikákkal hajtjuk végre.
Az eredmények a 6. táblázatban láthatók; a BHK sejtek, amiket szója-hidrolizátumot tartalmazó fehérjementes és szé vámmentes táptalajban tenyésztettünk, a rekombináns FVIII magas és stabil termelődését mutatták.

Claims (16)

1. Fehérjementes és szérummentes táptalaj sejtek tenyésztésére, ami szója-hidrolizátumot tartalmaz, és az említett szója-hidrolizátum legalább 40%-ának molekulasúlya < 500 Dalton.
2. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, ami több mint 10 tömegszázalék szója-hidrolizátumot tartalmaz, a táptalaj száraz tömegére számítva.
3. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, ami ultraszűrt szójahidrolizátumot tartalmaz.
4. A3, igénypont szerinti táptalaj, ami tisztított szója- hidrolizátumot tartalmaz.
5. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, amiben a szója-hidrolizátum endotoxin tartalma <500 E/g.
6. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, amiben a szója-hidrolizátum legalább 50%-ának molekulasúlya < 500 Dalton.
7. A 6. igénypont szerinti táptalaj, amiben a szója-hidrolizátum legalább 55%-ának molekulasúlya < 500 Dalton.
8. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, ami tartalmaz még aminosavat is.
9. A 7. igénypont szerinti táptalaj, amiben az említett aminosavat a következő csoportból választjuk ki: L-aszparagin, L-cisztein, L-cisztin, L-prolin, L-triptofán, L-glutamin vagy ezek keverékei.
10. Az 1. igénypont szerinti táptalaj, ami tartalmaz még kiegészítő anyagokat is, azaz például pufferelő anyagokat, oxidáció-stabilizátorokat, a mechanikai stressz elviselését segítő stabilizátorokat vagy proteáz inhibitorokat.
11. Az 1. igénypont szerinti táptalaj használata emlős sejtek tenyésztésére.
12. Az 1. igénypont szerinti táptalaj használata emlős sejtek tenyésztésére, amely sejtek lehetnek CHO sejtek és BHK sejtek.
13. Eljárás sejtek tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy a az említett sejteket az 1. igénypont szerinti táptalajba visszük be, majd az említett sejteket az említett táptalajban szaporítjuk.
14. Eljárás fehérje előállítására egy sejttenyészetből, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:
a sejteket az 1. igénypont szerinti táptalajba juttatjuk be, és az említett sejtek a kívánt fehérjét expresszálják;
az említett sejteket szaporítjuk az említett táptalajban, és az említett fehérjét expresszáltatjuk, ezzel a táptalajban az említett sejtek és az említett fehérje keverékét állítva elő;
az említett fehérjét az említett keverékből tisztítjuk.
15. Sejttenyészet, ami emlős sejteket és az 1. igénypont szerinti táptalajt tartalmaz.
16. Eljárás az 1. igénypont szerinti sejttenyésztő táptalaj előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket hajtjuk végre:
szója-hidrolizátumot készítünk, * az említett szója-hidrolizátumot ultraszúrési eljárással ultr aszűrjük az említett szója-hidrolizátum frakciót méretkizárásos kromatográfiával tisztítjuk kiválasztjuk azokat a szója-hidrolizátum frakciókat, amik <500 Dalton molekulasúlyú szója-hidrolizátumot tartalmaznak.
HU0202759A 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells HU228210B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0165999A AT409379B (de) 1999-06-02 1999-09-28 Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
PCT/EP2000/009453 WO2001023527A1 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0202759A2 true HUP0202759A2 (hu) 2002-12-28
HUP0202759A3 HUP0202759A3 (en) 2004-10-28
HU228210B1 HU228210B1 (en) 2013-01-28

Family

ID=3518214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0202759A HU228210B1 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20030203448A1 (hu)
EP (1) EP1220893B2 (hu)
JP (6) JP5441288B2 (hu)
CN (2) CN1318577C (hu)
AT (2) AT409379B (hu)
AU (1) AU780791B2 (hu)
CA (1) CA2385299A1 (hu)
CY (1) CY1106135T1 (hu)
CZ (1) CZ305307B6 (hu)
DE (1) DE60028989T3 (hu)
DK (1) DK1220893T4 (hu)
ES (1) ES2265991T5 (hu)
HU (1) HU228210B1 (hu)
IL (4) IL148642A0 (hu)
PL (1) PL215234B1 (hu)
PT (1) PT1220893E (hu)
RU (3) RU2380412C2 (hu)
SI (1) SI1220893T1 (hu)
SK (1) SK288059B6 (hu)
TR (1) TR200200757T2 (hu)
WO (1) WO2001023527A1 (hu)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
US20050069979A1 (en) * 2001-11-28 2005-03-31 Steffen Zeng Cell culture process
US7195905B2 (en) 2001-12-10 2007-03-27 Baxter Healthcare S.A. Enveloped virus vaccine and method for production
JP3916516B2 (ja) * 2002-06-10 2007-05-16 独立行政法人科学技術振興機構 硬組織−軟組織界面再生用足場材料
DK1520008T3 (da) 2002-07-09 2012-10-15 Baxter Int Medium frit for dyreprotein til dyrkning af celler
BRPI0417775A (pt) * 2003-12-19 2007-03-20 Wyeth Corp meio de congelamento de células livre de soro; processo para gerar um banco de células vero estável livre de soro; e banco de célula vero estável livre de soro
ATE375385T1 (de) * 2004-03-01 2007-10-15 Ares Trading Sa Verwendung eines serumfreien zellkulturmediums zur produktion von il-18bp in säugerzellen
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
AU2011221414B2 (en) * 2004-10-29 2012-09-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Animal Protein-Free Media for Cultivation of Cells
EP1812557A4 (en) * 2004-10-29 2009-11-04 Centocor Ortho Biotech Inc COMPOSITIONS OF CHEMICALLY DEFINED MEDIA
FR2879214A1 (fr) * 2004-12-14 2006-06-16 Pierre Fabre Medicament Sa Fractions peptidiques favorisant la croissance et la synthese de produit(s) d'interet en culture de cellules et/ou de tissus
JP5523674B2 (ja) * 2005-02-11 2014-06-18 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 植物タンパク質加水分解産物を含有する血清フリーの細胞培養液におけるポリペプチドの生産
WO2006095431A1 (ja) 2005-03-10 2006-09-14 Kyoritsu Seiyaku Corporation 動物由来の成分なしで培養可能である細胞株及びその作出方法、これを用いたウイルスの生産方法、及びワクチンの生産方法
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
KR100670105B1 (ko) 2005-06-29 2007-01-17 주식회사 셀트리온 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴
US7375188B2 (en) * 2005-07-29 2008-05-20 Mallinckrodt Baker, Inc. Vegetarian protein a preparation and methods thereof
ES2474573T3 (es) 2006-01-04 2014-07-09 Baxter International Inc Medio de cultivo celular sin oligop�ptidos
RU2008139428A (ru) * 2006-03-06 2010-05-20 Хьюмэджин, Инк. (Us) Способ получения рекомбинантного тромбина и фибриногена человека
TW201516149A (zh) 2006-09-13 2015-05-01 Abbvie Inc 細胞培養改良
EP2500416A1 (en) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Cell culture improvements
US20100075415A1 (en) * 2006-11-13 2010-03-25 Schering Corporation Method for reducing protease activity in plant hydrolysate
US20090294288A1 (en) 2006-12-11 2009-12-03 Schering Corporation High-sensitivity proteolysis assay
EP1988101A1 (en) 2007-05-04 2008-11-05 Novo Nordisk A/S Improvement of factor VIII polypeptide titers in cell cultures
KR101229418B1 (ko) 2007-06-15 2013-02-05 재단법인 목암생명공학연구소 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
WO2009115495A1 (de) * 2008-03-19 2009-09-24 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Methode zur steigerung der reklonierungseffizienz
CN102007207B (zh) 2008-04-18 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种浓缩培养液及其使用方法
RU2377295C1 (ru) * 2008-06-11 2009-12-27 Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих
TW201012930A (en) 2008-06-16 2010-04-01 Intervet Int Bv Method of replicating viruses in suspension
JP5458536B2 (ja) * 2008-09-17 2014-04-02 不二製油株式会社 乳酸の製造方法及び乳酸発酵用添加剤
RU2011116319A (ru) * 2008-09-26 2012-11-10 Шеринг Корпорейшн (US) Производство высокого титра антител
PT2356247E (pt) * 2008-11-12 2015-10-26 Baxalta Inc Método de produção de fator vii isento de soro e de insulina
CA2751021A1 (en) 2008-12-30 2010-07-08 Baxter International Inc. Method of enhancing cell growth using alkyl-amine-n-oxide (aanox)
CN101603026B (zh) * 2009-06-19 2011-01-19 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
NZ597727A (en) 2009-07-31 2013-08-30 Baxter Int Cell culture medium for adamts protein expression
CN102115728B (zh) * 2009-12-31 2012-09-26 北京清大天一科技有限公司 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
AU2011246503B2 (en) * 2010-04-26 2013-09-26 Novartis Ag Improved cell culture medium
LT2563906T (lt) 2010-04-26 2018-02-26 Novartis Ag Cho ląstelių kultivavimo būdas
EA202090067A3 (ru) 2010-07-08 2020-07-31 Баксалта Инкорпорейтид Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
CN101914485A (zh) * 2010-08-05 2010-12-15 乐能生物工程股份有限公司 一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法
KR20130101034A (ko) * 2010-08-31 2013-09-12 프리슬랜드 브랜즈 비브이 진핵 세포를 위한 배양 배지
WO2012045769A1 (en) * 2010-10-05 2012-04-12 Novo Nordisk Health Care Ag Process for protein production
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
CN103160458A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 西南民族大学 一种适合Vero细胞生长的低血清培养基
US20150031128A1 (en) * 2012-03-08 2015-01-29 Friesland Brands B.V. Culture medium for eukaryotic cells
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
CN104593317B (zh) * 2013-10-31 2018-05-04 中国食品发酵工业研究院 一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
EP3069123B1 (en) 2013-12-30 2020-09-23 Baxalta GmbH A method of predicting a performance characteristic of a plant or yeast hydrolysate and its use
RU2558253C1 (ru) * 2014-02-10 2015-07-27 Федеральное Казенное Предприятие " Щелковский Биокомбинат" Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих
KR102391259B1 (ko) 2014-06-04 2022-04-26 암젠 인크 포유류 세포 배양물을 회수하는 방법
TWI743024B (zh) 2014-06-06 2021-10-21 美商健臻公司 灌注培養方法及其用途
CN104560893B (zh) * 2015-01-30 2017-11-14 肇庆大华农生物药品有限公司 一种用于培养病毒的培养基及其制备方法
RU2588666C1 (ru) * 2015-03-23 2016-07-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих
CN105002242A (zh) * 2015-07-23 2015-10-28 苏州康聚生物科技有限公司 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
HRP20230865T1 (hr) * 2015-07-31 2023-11-10 Exotropin, Llc Kompozicije egzosoma i postupci za njihovu pripremu i primjenu za reguliranje i kondicioniranje kože i kose
TW202440903A (zh) 2015-08-04 2024-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法（一）
EP3487987A4 (en) * 2016-07-19 2020-02-19 Accellta Ltd. CULTURAL MEDIA FOR THE CULTURE OF PLURIPOTENTAL STEM CELLS IN A SUSPENSION
US11070703B2 (en) * 2016-07-29 2021-07-20 Robert Bosch Tool Corporation 3D printer touchscreen interface lockout
JP6258536B1 (ja) 2017-03-03 2018-01-10 協和発酵キリン株式会社 ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法
KR20210084695A (ko) * 2017-07-06 2021-07-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 당단백질을 만들기 위한 세포 배양 과정
US10961500B1 (en) * 2019-04-23 2021-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium for eukaryotic cells
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
CN113151183A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 赵峻岭 一种促进蛋白表达的培养基添加物及其应用
TW202328442A (zh) * 2021-09-10 2023-07-16 美商安進公司 平臺宿主對ｉｇｆ—培養基之適應
CN119677836A (zh) * 2022-07-27 2025-03-21 不二制油集团控股株式会社 动物细胞增殖促进剂

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT165999B (de) 1947-06-26 1950-05-25 Delle Atel Const Electr Einirchtung zum Schutz von Drehstrommotoren gegen Überstrom
FR2196386A1 (en) 1972-08-17 1974-03-15 Cudennec Alain Culture media selection - for identification of unknown bacteria
US4443540A (en) 1980-05-09 1984-04-17 University Of Illinois Foundation Protein hydrolysis
DK207980A (da) * 1980-05-13 1981-11-14 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et skumnings- eller emulgeringsmiddel paa sojaproteinbasis
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
IL74909A (en) 1984-04-20 1992-01-15 Genentech Inc Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein
ATE89314T1 (de) 1985-02-13 1993-05-15 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
ZA862768B (en) 1985-04-17 1986-12-30 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
GB8608020D0 (en) * 1986-04-02 1986-05-08 Beecham Group Plc Compounds
EP0318487B1 (en) 1986-08-04 1993-10-13 The University Of New South Wales Serum free tissue culture medium containing polymeric cell-protective agent
WO1989000192A1 (en) 1987-06-30 1989-01-12 Amgen Inc. Production of kallikrein
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
JP2507882B2 (ja) 1988-02-17 1996-06-19 工業技術院長 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
JP2815613B2 (ja) 1989-03-24 1998-10-27 株式会社リコー 静電荷像現像用トナー
US5573937A (en) 1989-12-07 1996-11-12 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Serum free culture medium
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
AT393356B (de) 1989-12-22 1991-10-10 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen
CA2074363C (en) * 1990-01-22 2004-11-09 David Thomas Vistica Co2-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JP2844484B2 (ja) * 1990-02-22 1999-01-06 味の素株式会社 組換え蛋白質の生産方法
JP2859679B2 (ja) 1990-03-01 1999-02-17 協和醗酵工業株式会社 新規細胞株
JP2696001B2 (ja) 1991-04-15 1998-01-14 財団法人化学及血清療法研究所 組換え蛋白質産生用培地
US5378612A (en) 1990-05-11 1995-01-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Culture medium for production of recombinant protein
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
JPH04228066A (ja) 1990-10-23 1992-08-18 Rikagaku Kenkyusho 外来遺伝子発現用培養細胞
EP0531562A1 (de) * 1991-09-11 1993-03-17 Doerr, Hans-Wilhelm, Prof. Dr. med. Kultivierung von Säugetierzellen
JPH05123178A (ja) * 1991-11-01 1993-05-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−フエニルアラニンの製造法
DK53792D0 (da) 1992-04-24 1992-04-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
RU2057176C1 (ru) * 1992-05-20 1996-03-27 Институт генетики АН Республики Молдова Питательная среда для культивирования клеток человека и животных
AU7895898A (en) 1993-04-26 1998-10-08 Hans Wolf Mammal cell lines and method of obtaining glycoproteins
DE4313620A1 (de) 1993-04-26 1994-10-27 Biotechnolog Forschung Gmbh Hamsterzellinien und Verfahren zur Glykoproteingewinnung
US5405637A (en) 1993-06-30 1995-04-11 Bristol-Myers Squibb Company Milk protein partial hydrolysate and infant formula containing same
JP2766165B2 (ja) * 1993-08-02 1998-06-18 株式会社バイオポリマー・リサーチ バクテリアセルロースの製造方法
CN1088984A (zh) * 1993-11-11 1994-07-06 江西省医学科学研究所 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基
US5719050A (en) 1993-12-24 1998-02-17 Eiken Chemical Co., Ltd. Animal cell culturing media containing N-acetyl-L-glutamic acid
EP0666312A1 (en) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Process for the improvement of mammalian cell growth
US5789247A (en) 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
JP2684521B2 (ja) 1994-08-19 1997-12-03 ハムス株式会社 ベルトループ縫付けミシンにおけるテープ折り曲げ端の形成維持方法及びその装置
WO1996007730A2 (de) 1994-09-09 1996-03-14 Renner Wolfgang A Chemisches verfahren zur förderung der proliferation von tierischen zellen
ATE542891T1 (de) 1994-11-10 2012-02-15 Baxter Healthcare Sa Verfahren zur herstellung von biologischen produkten in protein-freier kultur
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
JP3244391B2 (ja) 1994-12-08 2002-01-07 財団法人国際超電導産業技術研究センター 複合基板及びそれを用いた単結晶基板の製造方法
EP0799310A1 (en) 1994-12-16 1997-10-08 Novartis AG Production of recombinant secretory component
US5741705A (en) 1995-02-23 1998-04-21 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Method for in vitro cell growth of eucaryotic cells using low molecular weight peptides
CA2211630A1 (en) * 1995-02-23 1996-08-29 Quest International B.V. Peptides for tissue and cell culture media
AU6125396A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novartis Ag Serum-free media for primitive hematopoietic cells and metho ds of use thereof
AUPN442295A0 (en) 1995-07-26 1995-08-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulated autocrine growth of mammalian cells
JPH09107955A (ja) * 1995-10-24 1997-04-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 動物細胞培養用培地
CN1226805A (zh) * 1996-04-09 1999-08-25 纳幕尔杜邦公司 新型富含异黄酮的大豆蛋白产品及其生产方法
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
EP2221361A3 (en) * 1996-08-30 2011-02-09 Life Technologies Corporation Method for producing a polypeptide in vitro in mammalian cells in a protein-free and serum-free culture medium
US6103529A (en) * 1996-10-10 2000-08-15 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising peptides derived from rice
JPH10211488A (ja) 1997-01-28 1998-08-11 Akai Electric Co Ltd 紫外線殺菌装置
US6383810B2 (en) * 1997-02-14 2002-05-07 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
PT1849860E (pt) 1997-05-28 2011-02-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Processo de preparação de um factor imunogénico de corynebacterium diphtheriae utilizando um meio de cultura com extracto de levedura como fonte de aminoácidos e sem complexos proteicos de origem animal
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
US6475725B1 (en) * 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
ES2273434T3 (es) 1997-07-23 2007-05-01 Roche Diagnostics Gmbh Obtencion de la eritropoyetina mediante activacion genica endogena.
JPH11211488A (ja) 1998-01-21 1999-08-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 携帯情報端末を用いたデータ転送システム
FR2775983B1 (fr) * 1998-03-13 2000-11-10 Pasteur Merieux Serums Vacc Milieu et procede de propagation et de multiplication virales
WO1999057246A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) * 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
ATE330003T1 (de) 1999-08-05 2006-07-15 Baxter Ag Rekombinanter stabiler zellklon, seine herstellung und verwendung
NZ529329A (en) 1999-08-25 2005-06-24 Immunex Corp Compositions and methods for improved cell culture
ATE434035T1 (de) 2000-09-25 2009-07-15 Polymun Scient Immunbio Forsch Lebender influenza impfstoff und verfahren zu seiner herstellung
EP1208966A1 (en) 2000-11-27 2002-05-29 Cheng-Kun Liao Manufacturing process of patio tabletop glass with broken protection
DK1520008T3 (da) 2002-07-09 2012-10-15 Baxter Int Medium frit for dyreprotein til dyrkning af celler
JP4316484B2 (ja) 2004-12-10 2009-08-19 シャープ株式会社 画像形成装置、トナー濃度制御方法、トナー濃度制御プログラムおよびその記録媒体

Also Published As

Publication number Publication date
JP6467459B2 (ja) 2019-02-13
JP2011135880A (ja) 2011-07-14
JP6348521B2 (ja) 2018-06-27
ES2265991T3 (es) 2007-03-01
AT409379B (de) 2002-07-25
US8021881B2 (en) 2011-09-20
TR200200757T2 (tr) 2002-09-23
PL215234B1 (pl) 2013-11-29
CA2385299A1 (en) 2001-04-05
EP1220893A1 (en) 2002-07-10
AU7908300A (en) 2001-04-30
IL250619A0 (en) 2017-06-29
ES2265991T5 (es) 2017-05-03
JP5777653B2 (ja) 2015-09-09
JP2016127839A (ja) 2016-07-14
IL219969A0 (en) 2012-06-28
IL219969A (en) 2017-06-29
IL148642A (en) 2012-08-30
US9982286B2 (en) 2018-05-29
CN1318577C (zh) 2007-05-30
SK4002002A3 (en) 2002-07-02
CZ305307B6 (cs) 2015-07-29
CN101173246A (zh) 2008-05-07
IL148642A0 (en) 2002-09-12
WO2001023527A1 (en) 2001-04-05
DE60028989T2 (de) 2007-01-25
CZ20021096A3 (cs) 2003-01-15
US20030203448A1 (en) 2003-10-30
RU2380412C2 (ru) 2010-01-27
RU2266325C2 (ru) 2005-12-20
DE60028989D1 (de) 2006-08-03
RU2009131610A (ru) 2011-02-27
US8722406B2 (en) 2014-05-13
JP2019030306A (ja) 2019-02-28
PT1220893E (pt) 2006-10-31
EP1220893B2 (en) 2016-08-31
ATE331025T2 (de) 2006-07-15
JP2013135691A (ja) 2013-07-11
US20170002392A1 (en) 2017-01-05
AU780791B2 (en) 2005-04-14
US9441203B2 (en) 2016-09-13
HUP0202759A3 (en) 2004-10-28
US20080182297A1 (en) 2008-07-31
JP2003510070A (ja) 2003-03-18
JP2017212977A (ja) 2017-12-07
ATA165999A (de) 2001-12-15
DK1220893T4 (en) 2016-12-05
PL355233A1 (en) 2004-04-05
RU2536244C2 (ru) 2014-12-20
DE60028989T3 (de) 2017-01-19
JP5441288B2 (ja) 2014-03-12
DK1220893T3 (da) 2006-10-23
CN101173246B (zh) 2011-03-09
CY1106135T1 (el) 2011-06-08
EP1220893B1 (en) 2006-06-21
SI1220893T1 (sl) 2006-12-31
CN1391604A (zh) 2003-01-15
SK288059B6 (sk) 2013-03-01
US20110287482A1 (en) 2011-11-24
US20160369316A1 (en) 2016-12-22
US20150072415A1 (en) 2015-03-12
HU228210B1 (en) 2013-01-28
IL250619B (en) 2018-04-30
RU2005123274A (ru) 2007-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
IL250619B (en) Substrate without proteins and without serum for cell cultivation
UY27972A1 (es) Derivados de hidantoína
ATE274588T1 (de) Mutante alpha-amylase mit zusätzlicher disulfidverbindung
ATE380820T1 (de) Murine alpha(1,3)-fucosyltransferase (fuc-tvii)
YU41801A (sh) Derivati fenilglicina
AU3877500A (en) Methods for preparing 3-aryloxy-3-arylpropylamines and intermediates thereof
AU3665199A (en) Inhibitors of impdh enzyme
WO1999015129A3 (en) SELECTIVE cPLA2 INHIBITORS
AU144678S (en) Bottle
DK0937074T3 (da) Benzonaphthyridiner som bronkiale terapeutiske midler
AU6571700A (en) Enzymatic synthesis of deoxyribonucleosides
AU6451494A (en) Peptidic phosphinyloxymethyl ketones as interleukin-1beta- converting enzyme inhibitors
AU5235299A (en) Spectral topography of mammalian matter
MXPA01010403A (es) Agentes quimiotacticos e inhibidores derivados de osteopontina y usos de los mismos.
AU2002220697A1 (en) Isolated luciferases lu164, lual and lu22, and the use of the same
DK0942992T3 (da) O-fucosyltransferase
UY26574A1 (es) &#34; procedimiento para la separación enzimática de racematos de derivados de aminometil-aril-ciclohexanol&#34;.
MXPA02007173A (es) Compuestos calciliticos.
AU2002230579A1 (en) Calcilytic compounds
AU2002346632A1 (en) Antisense modulation of mhc class ii transactivator expression
AU2002226085A1 (en) Active-site engineering of nucleotidyltransferases and enzymatic methods for the synthesis of natural and &#34;unnatural&#34; udp- and nucleotide sugars
MY128306A (en) Oct formulations
DE69823188D1 (de) Klonierung der udp-galaktose-epimerase
ID27656A (id) Turunan azabisikloheptana n-tersubstitusi, pembuatan dan penggunaannya
AU2002365903A1 (en) Method for the generation of proteins with new enzymatic function

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: BAXALTA GMBH, CH

Free format text: FORMER OWNER(S): BAXTER AKTIENGESELLSCHAFT, AT

Owner name: BAXALTA INCORPORATED, US

Free format text: FORMER OWNER(S): BAXTER AKTIENGESELLSCHAFT, AT