PL215234B1 - Wolne od bialka zwierzecego i wolne od surowicy podloze do hodowania komórek ssaka, zastosowanie podloza, sposób hodowania komórek, sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi, kompozycja hodowli komórkowej i sposób wytwarzania podloza - Google Patents

Wolne od bialka zwierzecego i wolne od surowicy podloze do hodowania komórek ssaka, zastosowanie podloza, sposób hodowania komórek, sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi, kompozycja hodowli komórkowej i sposób wytwarzania podloza

Info

Publication number
PL215234B1
PL215234B1 PL355233A PL35523300A PL215234B1 PL 215234 B1 PL215234 B1 PL 215234B1 PL 355233 A PL355233 A PL 355233A PL 35523300 A PL35523300 A PL 35523300A PL 215234 B1 PL215234 B1 PL 215234B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
medium
free
serum
protein
Prior art date
Application number
PL355233A
Other languages
English (en)
Other versions
PL355233A1 (pl
Inventor
Manfred Reiter
Wolfgang Mundt
Friedrich Dorner
Leopold Grillberger
Artur Mitterer
Original Assignee
Baxter Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3518214&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL215234(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Baxter Ag filed Critical Baxter Ag
Publication of PL355233A1 publication Critical patent/PL355233A1/pl
Publication of PL215234B1 publication Critical patent/PL215234B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/005—Protein-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest wolne od białka zwierzęcego i wolne od surowicy podłoże do hodowania komórek ssaka, zastosowanie podłoża, sposób hodowania komórek, sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi, kompozycja hodowli komórkowej i sposób wytwarzania podłoża. Hodowla komórek, szczególnie komórek eukariotycznych lub komórek ssaków, ciągle wymaga stosowania specjalnych podłoży hodowlanych, które dostarczają komórkom substancji odżywczych i substancji wzrostowych, potrzebnych do efektywnego wzrostu i wytwarzania żądanych białek. Z tego względu regułą jest stosowanie surowicy lub składników pochodzących z surowicy (np. surowicy wołowej) jako składowej podłoża.
Jednak w przypadku stosowania w hodowlach komórkowych surowicy lub dodatków białkowych pochodzących ze źródeł ludzkich lub zwierzęcych istnieją liczne problemy, szczególnie jeśli materiału wyjściowego do wytworzenia czynnika medycznego, który ma być podawany ludziom, dostarcza hodowla komórkowa.
Zatem w przypadku takich preparatów surowiczych kompozycja i jakość różni się już w zależności od serii, właśnie z powodu odmienności organizmów dawców dla takich preparatów. Stanowi to ważny problem, szczególnie w standaryzacji wytwarzania komórek i w ustaleniu standardowych warunków hodowli tych komórek. W każdym przypadku wymagana jest intensywna i stała kontrola jakości stosowanego materiału surowiczego. Jednak, szczególnie w przypadku tak złożonych kompozycji jak surowica, jest ona skrajnie czasochłonna i kosztowna.
Ponadto takie złożone preparaty zawierają różnorodne białka, które mogą działać w sposób zaburzający, szczególnie w kontekście procesu oczyszczania rekombinowanego białka, które jest pozyskiwane z hodowli komórkowej. Dotyczy to szczególnie tych białek, które są homologiczne lub podobne do pozyskiwanego białka.
Naturalnie problemy te szczególnie zaostrzają się, ponieważ biogenicznego uzupełnienie w podłożu, które jest stosowane (np. białko bydlęce), które może być całkowicie usunięte podczas oczyszczania tylko drogą całkowicie swoistego oczyszczania różnicowego (np. z przeciwciałami skierowanymi swoiście tylko przeciw rekombinowanemu białku, a nie przeciw białku bydlęcemu (Bjorck,
L., J. Immunol., 1988, Vol. 140, str. 1194-1197; Nilson i współ., J. Immunol Meth., 1993, 164, str. 33-40).
Jednak wyraźnym problemem w stosowaniu surowicy lub związków pochodzących z surowicy w podłożu hodowlanym jest również ryzyko zanieczyszczenia przez mykoplazmę, wirusy lub czynniki BSE. W związku z preparatami, które pochodzą z krwi ludzkiej, należy w szczególności podkreślić ryzyko zanieczyszczenia przez wirusy, takie jak wirusy zapalenia wątroby lub HIV. W przypadku surowicy lub składników surowiczych, podchodzących z materiału bydlęcego istnieje w szczególności niebezpieczeństwo zanieczyszczenia BSE. W dodatku, wszystkie materiały pochodzące z surowicy mogą być ponadto zanieczyszczone nieznanymi jeszcze czynnikami chorobotwórczymi.
Dodawanie składników surowiczych w celu zapewnienia odpowiedniej adhezji komórek do ich powierzchni i zapewnienia odpowiedniego wytwarzania żądanych substancji przez komórki, oprócz kilku wyjątków, było uprzednio uważane jako ściśle niezbędne do hodowli komórek na podłożach stałych. Zatem sposobem, który opisano na przykład w WO 91/09935, stało się możliwe przeprowadzenie procesu hodowli wolnej od surowicy i wolnej od białka, wirusa FSME/antygenu wirusowego, drogą wolnej od surowicy i wolnej od białka hodowli powierzchniowo-zależnych trwałych komórek, korzystnie komórek vero (patrz WO 96/15231). Jednak nie były one komórkami rekombinowanymi ale raczej komórkami gospodarza, które są stosowane do wytwarzania antygenu wirusowego w procesie litycznym.
W przeciwieństwie do tego komórki, które są przeważnie stosowane w rekombinowanym preparacie, na przykład, komórki CHO, są zdolne do adhezji tylko w ograniczonym zakresie. Zatem komórki CHO, które wyhodowano konwencjonalnymi sposobami, wiążą się zarówno z mikronośnikami gładkimi, jak i porowatymi tylko w warunkach zawierających surowicę (patrz US 4973616; Cytotechnology 9 (1992), 247-253). Jednak, gdy komórki takie są hodowane w warunkach wolnych od surowicy, tracą tę właściwość i nie przylegają do gładkich nośników lub zaczynają się łatwo od nich odrywać, jeśli inne dodatki sprzyjające adhezji, takie jak np. fibronektyna, insulina lub transferyna nie są dostarczone do podłoża. Jednak, są one również białkami pochodzącymi z surowicy.
Alternatywnie, komórki mogą być hodowane z zastosowaniem techniki hodowli w zawiesinie, jak również np. z zastosowaniem procesu okresowego lub z zastosowaniem techniki hodowli ciągłej. Hodowla korzystnie odbywa się z zastosowaniem procesu chemostatowego (Ozturk S.S. i współp., 1996, Abstr. Pap. Am. Chem. Soc., BIOT 164, Payne G.F. i współp., „Large Scale Cell Culture TechPL 215 234 B1 nology, 1987, red. Lydersen B.K., wydawcy Hauser; str. 206-212). Kattinger H. i współp. (Advances Mol. Cell. Biology, 1996, 15A, 193-207) opisali długotrwałą hodowlę komórek na wolnym od białka podłożu, ale komórki te musiały być hodowane na nośnikach i nie stanowiły alternatywy dla technik ciągłej hodowli. Stwierdzono, że komórki te wykazywały długoterminową stabilność tylko wtedy, gdy przylegały do powierzchni nośników z powodu zmniejszonego wzrostu, a w konsekwencji zmniejszonego zapotrzebowanie na czynniki wzrostu.
W dodatku, przy kilku okazjach w stanie techniki poczyniono próby adaptacji komórek do wolnego od białka podłoża, zaczynając od warunków zawierających surowicę. Jednak, w przypadku takiej adaptacji stwierdzono wielokrotnie, że w porównaniu z warunkami zawierającymi surowicę, wydajność wyrażanego białka i produktywność rekombinowanych komórek wyraźnie maleje w wolnym od białka podłożu po adaptacji (Appl. Microbiol. Biotechnol. 40 (1994), 691-658).
Stwierdzono również, że w przypadku wysokiej gęstości komórkowej wytwarzanie rekombinowanych białek jest czasami znacznie ograniczone. Podczas prób adaptacji komórek do wolnych od białek lub wolnych od surowicy podłoży, również wielokrotnie stwierdzono niestabilność ze zmniejszeniem wzrostu zastosowanych komórek tak, że były wytwarzane komórki ze zmniejszoną ekspresją lub nawet komórki nieprodukujące, przy czym miały one przewagę wzrostu, w stosunku do komórek produkujących w wolnych od białka i wolnych od surowicy podłożach. Prowadzi to do okoliczności, że te komórki nieprodukujące przerastają komórki produkujące i wtedy ostatecznie cała hodowla wykazuje teraz bardzo niskie wydajności wytwarzania.
Niniejszy wynalazek ma zatem na celu poprawę możliwości hodowli rekombinowanych komórek wolnej od białka i wolnej od surowicy i wytwarzania w niej różnych czynników i poprawę dostępnych procesów, w których rekombinowane komórki mogą być efektywnie hodowane w sposób wolny od surowicy lub wolny od białka. Ponadto mogłoby wówczas być możliwe hodowanie nie tylko komórek powierzchniowo-zależnych, ale również stosowanie techniki hodowli zawiesinowej, przy której wymagane jest, aby niestabilność w produktywności komórek była jak najbardziej stłumiona.
Nieoczekiwanie stało się możliwe wykazanie, że określone powyżej cele można osiągnąć hodując komórki w podłożu, które zawiera hydrolizat soi, bez konieczności tolerowania wad związanych z hodowlą wolną od surowicy, które opisano w stanie techniki. W przeciwieństwie do innych znanych w dziedzinie hydrolizatów, takich jak, na przykład, hydrolizaty pszenicy, hydrolizaty ryżu lub hydrolizaty drożdży, stwierdzono, że tylko hydrolizat soi nadaje właściwości zgodnie z wynalazkiem i prowadzi, na przykład, do znacznego wzrostu wydajności rekombinowanego docelowego białka. Gdy mamy do czynienia z określeniami to zarówno określenie hydrolizat soi, jak i określenie pepton soi mogą być stosowane w tym samym znaczeniu.
Niniejszy wynalazek dotyczy wolnego od białka zwierzęcego i wolnego od surowicy podłoże do hodowania komórek ssaka, które zawiera od 10% wagowych ultrafiltrowanego hydrolizatu soi w stosunku do całkowitej suchej masy podłoża, przy czym co najmniej 40% tego hydrolizatu soi ma masę cząsteczkową < 500 u (Daltonów).
Korzystnie podłoże zawiera oczyszczony hydrolizat soi.
Korzystnie hydrolizat soi ma zawartość endotoksyny < 500 U/g.
Korzystnie co najmniej 50% hydrolizatu soi ma masę cząsteczkową < 500 u, korzystniej co najmniej 55% hydrolizatu soi ma masę cząsteczkową < 500 u.
Korzystnie podłoże zawiera również aminokwas, korzystniej wybrany z grupy składającej się z L-asparaginy, L-cysteiny, L-cystyny, L-proliny, L-tryptofanu, L-glutaminy lub ich mieszaniny.
Korzystnie podłoże zawiera również substancje pomocnicze wybrane z grupy składającej się z substancji buforujących, stabilizatorów utleniania, stabilizatorów przeciwdziałających bodźcom mechanicznym i inhibitorów proteazy.
W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie podłoża określonego powyżej do hodowania komórek ssaków.
Korzystnie do hodowania komórek ssaków wybranych z grupy składającej się z komórek CHO i komórek BHK.
Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu hodowania komórek ssaka obejmującego wprowadzenie komórek do podłoża i hodowanie ich w tym podłożu, którym jest o podłoże określone powyżej.
Ponadto w zakres wynalazku wchodzi sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi w hodowli komórkowej polegający na wprowadzeniu komórek ssaka do podłoża i hodowaniu komórek, przy czym podłożem jest podłoże określone powyżej, a komórkami są komórki wyrażające żądany rekombinowany czynnik krwi, przy czym kulturę komórek wyrażających rekombinowany czynnik krwi
PL 215 234 B1 hoduje się z otrzymaniem mieszaniny komórek i rekombinowanego czynnika krwi w tym podłożu, po czym przeprowadza się oczyszczanie rekombinowanego czynnika z tej mieszaniny.
Korzystnie rekombinowanym czynnikiem krwi jest rekombinowany czynnik VIII.
Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji hodowli komórkowej, która obejmuje komórki ssaków i podłoże określone powyżej.
W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania podłoża do hodowli komórkowej określonego powyżej, który obejmuje: otrzymywanie hydrolizatu soi, ultrafiltrowanie hydrolizatu soi z zastosowaniem procesu ultrafiltracji, oczyszczanie frakcji hydrolizatu soi z zastosowaniem chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, selekcję frakcji hydrolizatu soi składających się z hydrolizatu soi o masie cząsteczkowej < 500 u.
Podłoże według wynalazku zawiera hydrolizat soi w ilości od 10% wagowych w odniesieniu do całkowitej suchej masy podłoża. Z reguły hydrolizat soi w podłożu jest dostarczany się w ilości
10-40%.
Zgodnie z wynalazkiem wybór hydrolizatu soi nie jest krytyczny. W podłożu według wynalazku można stosować wiele preparatów soi które znajdują się na rynku, np. peptony z mąki sojowej, trawione enzymatycznie (np. przez papainę), o wartości pH między 6,5 i 7,5 i całkowitej zawartości azotu między 9% i 9,7% i zawartości popiołu między 8 i 15%. Są to peptony z ziaren soi w postaci, w której są zasadniczo stosowane przez ekspertów w dziedzinie.
W podłożu według wynalazku stosuje się korzystnie oczyszczony preparat hydrolizatu sojowego lub jego nieprzetworzone frakcje. Zanieczyszczenia, które mogą przeszkadzać w efektywnej hodowli, są korzystnie eliminowane podczas tego oczyszczania lub poprawia się jakość hydrolizatu np. w odniesieniu do masy cząsteczkowej.
Dowiedziono, że wprowadzenie etapu ultrafiltracji w czasie tego oczyszczania jest szczególnie cenne w praktyce; z tego powodu, zastosowanie ultrafiltrowanego hydrolizatu soi jest szczególnie korzystne w podłożu według wynalazku.
Ultrafiltracja może mieć miejsce zgodnie z procesem opisanym w stanie techniki, np. z zastosowaniem filtrów membranowych o określonej granicy odcięcia.
Oczyszczanie ultrafiltrowanego peptonu sojowego można przeprowadzić za pomocą chromatografii żelowej, np. za pomocą chromatografii z Sefadeksem, na przykład, z Sefadeksem G25 lub Sefadeksem G10 lub równoważnymi materiałami, chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa, chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek lub chromatografii z odwróconymi fazami. Są to procesy ze stanu techniki, które są znane specjaliście w tej dziedzinie. Stosując ten sposób można wyodrębnić te frakcje, które zawierają hydrolizat soi o określonej masie cząsteczkowej, np. < 1000 u, korzystnie < 500 u, korzystniej < 350 u.
Szczególnie korzystny hydrolizat soi charakteryzuje się cechą taką, że ma zawartość wolnych aminokwasów między 10,3 i 15,6% lub korzystnie między 12 i 13,5%, całkowitą zawartość azotu między 7,6 i 11,4% lub korzystnie między 8,7 i 9,5% i zawartość endotoksyn < 500 U/g, przy czym co najmniej 40% lub korzystnie co najmniej 50% lub szczególnie korzystnie co najmniej 55% tego hydrolizatu ma masę cząsteczkową 200-500 u i co najmniej 10% lub korzystnie 15% ma masę cząsteczkową 500-1000 u. Bardziej korzystnie co najmniej 90% hydrolizatu soi ma masę cząsteczkową < 500 u. Taki hydrolizat soi jest szczególnie odpowiedni dla produkcji przemysłowej rekombinowanych białek, ponieważ ze względu na jego wyjątkowe cechy może być standaryzowany szczególnie łatwo i jest można go stosować w rutynowych procesach.
Dodatkowo, oprócz hydrolizatu soi podłoże może również zawierać znane podłoża syntetyczne takie jak np. DMEM/HAM F12, Podłoże 199 lub RPMI, które są odpowiednio znane z literatury.
Ponadto podłoże według wynalazku korzystnie zawiera również aminokwasy: L-asparaginę (w ilości 0,001-1 g/l podłoża, korzystnie 0,1-0,05 g/l, szczególnie korzystnie 0,015-0,03 g/l); L-cysteinę (0,001-1 g/l, korzystnie 0,005-0,05 g/l, szczególnie korzystnie 0,015-0,03); L-prolinę (0,001-1,5 g/l, korzystnie 0,01-0,07 g/l, szczególnie korzystnie 0,02-0,05 g/l); L-tryptofan (0,001-1 g/l, korzystnie 0,01-0,05 g/l, szczególnie korzystnie 0,015-0,03 g/l); i L-glutaminę (0,05-1 g/l, korzystnie 0,1-1 g/l).
Aminokwasy opisane powyżej mogą być dodane do podłoża według wynalazku zarówno indywidualnie, jak i w kombinacji. Dodatek mieszaniny, która zawiera wszystkie wyżej wspomniane aminokwasy, jest szczególnie korzystny.
Wolne od surowicy i wolne od białka podłoże stosowano w szczególnym wykonaniu, w której podłoże to dodatkowo zawierało kombinację wyżej wymienionej mieszaniny aminokwasów i oczyszczony ultrafiltrowany pepton sojowy.
PL 215 234 B1
Nieoczekiwanie, stwierdzono, na przykład, iż w celu inaktywacji wirusów lub innych patogenów, podłoże można ogrzewać, bez negatywnych skutków, przez w przybliżeniu 5-20 minut, lub korzystnie 15 minut w 70-95°C, lub korzystnie 85-95°C.
W kombinacji z hydrolizatem soi można stosować każde znane podłoże syntetyczne. Konwencjonalne syntetyczne podłoża mogą zawierać nieorganiczne sole, aminokwasy, witaminy, źródła węglowodanów i wodę. Na przykład, można stosować podłoże DMEM/HAM F12. Stężenie ekstraktu soi może korzystnie wynosić pomiędzy 0,1 i 100 g/l, szczególnie korzystne 1 i 5 g/l. Według szczególnie korzystnego wykonania można zastosować, pepton sojowy, który standaryzowano ze względu na jego masę cząsteczkową. Masa cząsteczkowa peptonu soi korzystnie jest mniejsza niż 50 ku, szczególnie korzystnie mniejsza niż 10 ku, najkorzystniej mniejsza niż 1 ku.
Udowodniono, że dodanie ultrafiltrowanego peptonu sojowego jest szczególnie korzystne dla produktywności rekombinowanych linii komórkowych, przy czym średnia masa cząsteczkowa peptonu sojowego wynosi 350 u (Quest Company). Jest to izolat soi o całkowitej zawartości azotu w przybliżeniu 9,5% i zawartości wolnych aminokwasów w przybliżeniu 13%.
Korzystne jest zastosowanie oczyszczonego, ultrafiltrowanego peptonu soi o masie cząsteczkowej < 1000 u, korzystnie < 500 u szczególnie korzystnie < 350 u.
Korzystnie podłoże według wynalazku zawiera również substancje pomocnicze, takie jak np. substancje buforujące, stabilizatory utleniania, stabilizatory przeciwdziałające sile mechanicznej lub inhibitory proteazy.
Szczególnie stosuje się podłoże o następującym składzie: syntetyczne podłoże minimalne (1-25 g/l), pepton sojowy (0,5-50 g/l), L-glutamina (0,05-1 g/l), NaHCO3 (0,1-10 g/l), kwas askorbinowy (0,0005-0,05 g/l), etanoloamina (0,0005-0,05 g/l) i selenin Na (1-15 μg/l).
W razie potrzeby można dodać do podłoża niejonowy surfaktant, taki jak np. glikol polipropylenowy (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 lub PLURONIC F-108) jako czynnik przeciwpieniący.
Czynnik ten jest na ogół stosowany w celu ochrony komórek przed negatywnymi wpływami napowietrzania, ponieważ bez dodania surfaktantu wznoszące się i pękające pęcherzyki powietrza mogą prowadzić do uszkodzenia tych komórek, które są zlokalizowane na powierzchni tych pęcherzyków powietrza („sparging) (Murhammer i Goochee, 1990, Biotechnol. Prog. 6:142-148).
Ilość niejonowego surfaktantu może niniejszym wynosić między 0,05 i 10 g/l, chociaż szczególnie korzystnie najmniejsza możliwa ilość wynosi między 0,1 i 5 g/l.
W dodatku podłoże może zawierać również cyklodekstrynę lub jej pochodną.
Korzystnie wolne od surowicy i wolne od białka podłoże zawiera inhibitor proteazy, taki jak serynowe inhibitory proteazy, które są odpowiednie dla hodowli tkankowej i są pochodzenia syntetycznego lub roślinnego.
Korzystnie stosuje się komórki, które uprzednio zaadaptowano jako komórki do hodowania na podłożu według wynalazku, np. komórki, które uprzednio zaadaptowano do wzrostu w wolnych od białka i wolnych od surowicy podłożach. Stwierdzono, że z takimi uprzednio zaadaptowanymi komórkami można osiągnąć nie tylko zwiększone wydajności, ale ich stabilność w wolnej od surowicy i wolnej od białka hodowli również wyraźnie poprawia się przez stosowanie podłoża według wynalazku.
Jednak udowodniono, że rekombinowane klony komórkowe są szczególnie wartościowe, przy czym są one trwałe od samego początku przez co najmniej 40 pokoleń, korzystnie przez co najmniej 50 pokoleń w wolnych od surowicy i wolnych od białka podłożach i wykazują ekspresję rekombinowanych produktów.
Takie klony komórkowe można otrzymać z hodowli komórkowej, którą otrzymano w następstwie hodowania rekombinowanego pierwotnego klonu komórkowego na podłożu zawierającym surowicę i readaptacji komórek do wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża.
Określenie „pierwotny klon komórkowy może być rozumiane w znaczeniu rekombinowanego klonu komórkowego poddanego transfekcji, który po transfekcji komórek gospodarza rekombinowaną sekwencją nukleotydową w warunkach laboratoryjnych w sposób trwały wyraża rekombinowany produkt. Pierwotny klon jest hodowany na podłożu zawierającym surowicę w celu zoptymalizowania jego wzrostu. W celu zwiększenia produktywności pierwotny klon jest hodowany, ewentualnie w obecności wybranego czynnika, z podziałem na znacznik selekcji i/lub znacznik amplifikacji. W produkcji przemysłowej na dużą skalę pierwotny klon komórkowy jest hodowany w warunkach hodowlanych zawierających surowicę do osiągnięcia wysokiej gęstości komórkowej, a następnie jest poddawany readaptacji
PL 215 234 B1 do podłoża wolnego od surowicy i wolnego od białka tuż przed fazą produkcji. Korzystnie w tym przypadku hodowanie odbywa się bez presji selekcyjnej.
Hodowanie rekombinowanego pierwotnego klonu komórkowego może od początku odbywać się na wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu, wynikiem czego dłuższa readaptacja nie jest konieczna. W razie potrzeby można, w tym przypadku, użyć czynnika selekcyjnego i selekcja może odbywać się na znaczniku selekcji i/lub znaczniku amplifikacji. Proces ten opisano, na przykład, w EP 0 711 835.
Hodowlę komórkową, którą otrzymano po readaptacji do wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża, badano na te klony komórkowe populacji komórek, które w wolnych od surowicy i wolnych od białka warunkach w sposób trwały wytwarzały produkty, ewentualnie w nieobecności presji selekcyjnej. Badanie to może się odbywać, na przykład, za pomocą immunofluorescencji ze znakowanymi swoistymi przeciwciałami, które są skierowane przeciw rekombinowanemu polipeptydowi lub białku. Komórki, które są identyfikowane jako producenci produktu, są izolowane z hodowli komórkowej i ponownie hodowane w wolnych od surowicy i wolnych od białka warunkach, które korzystnie są równoważne z warunkami produkcji. Izolacja komórek może tym samym odbywać się przez izolowanie komórek i badanie ich jako producentów produktu.
Hodowlę komórkową zawierającą stabilne komórki można ponownie testować na trwałe rekombinowane klony, a te są izolowane z hodowli komórkowej i subklonowane. Trwałe rekombinowane klony komórkowe, które otrzymuje się w wolnych od surowicy i wolnych od białka warunkach, można następnie dalej hodować w wolnych od surowicy i wolnych od białka warunkach.
Rekombinowane klony komórkowe lub populacje komórkowe, które są wytworzone w ten sposób w podłożu według wynalazku odznaczają się trwałością przez co najmniej 40 pokoleń, korzystnie przez co najmniej 50 pokoleń, a w szczególności przez więcej niż 60 pokoleń i wykazują ekspresję rekombinowanego produktu.
Przykład takiego rekombinowanego trwałego klonu komórkowego lub populacji komórek zdeponowano zgodnie z Konwencją Budapesztańską pod numerem 98012206 w ECACC (UK).
Hodowla komórkowa, która ma być hodowana sposobem według wynalazku, korzystnie pochodzi od rekombinowanej komórki ssaka. Rekombinowanymi komórkami ssaczymi mogą tym samym być wszystkie takie komórki, które zawierają sekwencje kodujące rekombinowany polipeptyd lub białko. W niniejszym wynalazku można wykorzystać wszystkie rosnące w sposób ciągły komórki, które rosną zarówno adhezyjnie jak i nieadhezyjnie. Rekombinowane komórki CHO lub BHK są szczególnie korzystne. Rekombinowanymi polipeptydami lub białkami mogą być czynniki krwi, czynniki wzrostu lub inne biomedycznie stosowne produkty.
Korzystne są klony komórkowe, które zawierają sekwencję kodującą rekombinowany czynnik krwi, taki jak Czynnik II, Czynnik V, Czynnik VII, Czynnik VIII, Czynnik IX, Czynnik X, Czynnik XI, Białko S, Białko C, aktywną postać jednego z tych czynników lub vWF i które są zdolne do ich ekspresji w sposób trwały przez kilka pokoleń. Rekombinowane komórki CHO, które wykazują ekspresję vWF lub polipeptydu z aktywnością vWF, Czynnika VIII, Czynnika IX lub Czynnika II są pod tym względem szczególnie korzystne.
W celu uruchomienia banku komórek wzorcowych wymaganych jest 30 pokoleń. Co najmniej około 40 pokoleń jest wymaganych w celu przeprowadzenia przeciętnej hodowli okresowej na skalę 1000I. Wychodząc z pojedynczego klonu komórkowego można wytworzyć w podłożu według wynalazku „bank komórek wzorcowych (MCB) (ang. master cell bank) i „bank komórek pracujących (WCB) (ang. working cell bank) z około 8-10 pokoleń i skutkiem tego hodowlę komórkową aż do 20-25 pokoleń w wolnych od białka i wolnych od surowicy warunkach na skalę produkcyjną (wytwarzanie biomasy). Przeciwnie, pewne pokolenia z wcześniejszych klonów komórkowych stają się nietrwałe po wzroście na podłożu wolnym od surowicy i wolnym od białka w wyniku czego a) nie jest możliwa jednorodna hodowla komórkowa z producentami produktu i b) nie jest możliwa trwała produktywność produktu w przedłużonym czasie.
Jednak, przeciwnie, według wynalazku, możliwa jest nawet zwiększona produktywność produktu, nawet w porównaniu z pierwotnym klonem komórkowym, który był hodowany w zawierającym surowicę podłożu.
Bardziej szczegółowo wynalazek będzie wyjaśniony za pomocą następujących poniżej przykładów, jak również figur na rysunkach, ale nie jest do nich ograniczony.
Figura 1 przedstawia wyniki hodowli klonu komórkowego rFVIII-CHO w 10-I bioreaktorze perfuzyjnym.
PL 215 234 B1
a) Aktywność Czynnika VIII (milijednostki/ml) i szybkość perfuzji (1-5/dzień) przez okres 42 dni;
b) produktywność wolumetryczna (jednostki Czynnika VIII/1/dzień) w bioreaktorze perfuzyjnym;
Figura 2 przedstawia porównanie produktywności Czynnika VIII (mU/ml) w przypadku hodowli w procesie okresowym, komórek CHO, które wyrażają rekombinowany Czynnik VIII, w różnych podłożach. Mix 1 składa się z wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża bez hydrolizatu soi, ale zawierającego mieszaninę aminokwasów jak wymieniono w tabeli 4; Mix 2 składa się z wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża zawierającego hydrolizat soi; Mix 3 składa się z a wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża zawierającego hydrolizat soi i mieszaninę aminokwasów jak wymieniono w tabeli 4, a Mix 4 składa się z wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża, zawierającego 2,5 g/l oczyszczonego ultrafiltrowanego hydrolizatu soi i mieszaninę aminokwasów jak wymieniono w tabeli 4. Do oczyszczenia ultrafiltrowanego hydrolizatu soi zastosowano kolumnę Sephadex®.
Figura 3 przedstawia produktywność Czynnika VIII (U/l) w przypadku ciągłego wzrostu komórek CHO, które wykazują ekspresję rekombinowanego Czynnika VIII, w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu po rozpoczęciu dodawania oczyszczonego, ultrafiltrowanego peptonu sojowego, mianowicie szóstego dnia hodowli; i
Figura 4 przedstawia komórki BHK wykazujące ekspresję rekombinowanego Czynnika II, które hodowano na wolnym od białka i wolnym od surowicy podłożu zawierającym hydrolizat soi.
Przykłady
P r z y k ł a d 1:
Stabilność komórek rvWF-CHO po przeniesieniu z podłoża zawierającego surowicę do podłoża wolnego od surowicy i wolnego od białka
Komórki CHO-dhfr transfekowano plazmidem phAct-rvWF i pSV-dhfr, a klony wyrażające vWF subklonowano, jak to opisał Fischer i współp. (1994, FEBS Letters 351:354-348). Bank komórek pracujących (WCB) zapoczątkowały subklony, które wyrażały rvWF w sposób trwały w warunkach z zawartością surowicy ale w nieobecności MTX i komórki immobilizowano na porowatych mikronośnikach (Cytopore®) w warunkach z zawartością surowicy. Przeniesienie komórek do wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża odbywało się po osiągnięciu gęstości komórkowej 2 x 107 komórek/ml matrycy. Komórki hodowano dalej przez kilka pokoleń w warunkach wolnych od surowicy i wolnych od białka. Komórki badano w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu za pomocą immunofluorescencji ze znakowanymi przeciwciałami anty-vWF. Ocenę stabilności komórek przeprowadzono z zastosowaniem banku komórek pracujących przed zmianą podłoża, po 10 pokoleniach i po 60 pokoleniach w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu. Podczas gdy bank komórek pracujących ciągle wykazywał 100% producentów rvWF, stosunek producentów rvWF obniżył się do około 50% po 10 pokoleniach na wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu. Po 60 pokoleniach więcej niż 95% komórek identyfikowano jako nieprodukujące.
P r z y k ł a d 2:
Klonowanie trwałych rekombinowanych klonów CHO
Z hodowli komórkowej zawierającej komórki rvWF-CHO według przykładu 1 wytworzono serie rozcieńczeń (ten trwały klon komórkowy, który został oznaczony r-vWF-CHO F7 zdeponowano zgodnie z Konwencją Budapesztańską w ECACC (European Collection of Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK 22 stycznia 1998 i uzyskał on numer depozytu 98012206), które hodowano przez 60 pokoleń w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu i 0,1 komórek wysiano w każdej studzience płytki do mikromiareczkowania. Komórki hodowano przez około 3 tygodnie w DMEM/HAM F12 bez dodatków surowiczych lub dodatków białkowych i bez presji selekcyjnej i komórki badano immunofluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami anty-vWF. Klon komórkowy, który zidentyfikowano jako pozytywny, zastosowano jako klon wyjściowy do wytworzenia banku komórek potomnych (ang. seed cell bank). Bank komórek wzorcowych (MCB) został zapoczątkowany przez bank komórek posianych na wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu, a pojedyncze ampułki były odkładane i mrożone do dalszego wytwarzania banku komórek pracujących. Bank komórek pracujących wytwarzano w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu z pojedynczej ampułki. Komórki immobilizowano na porowatych mikronośnikach i dalej hodowano przez kilka pokoleń w warunkach wolnych od surowicy i wolnych od białka. Komórki badano na produktywność w różnych punktach czasowych w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu za pomocą immunofluorescencji ze znakowanymi przeciwciałami anty-vWF. Ocenę stabilności komórek przeprowadzono na etapie banku komórek pracujących i po 10 i 60 pokoleniach w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu. Około 100%
PL 215 234 B1 komórek zidentyfikowano jako pozytywne trwałe klony, które wyrażają rvWF na etapie banku komórek pracujących, po 10 pokoleniach i 60 pokoleniach.
P r z y k ł a d 3
Swoista produktywność komórkowa rekombinowanych klonów komórkowych
Określoną liczbę komórek usunięto w określonych fazach podczas hodowli rekombinowanych komórek i inkubowano przez 24 godziny w świeżym podłożu. Aktywność rvWF: Risto-CoF określono w ciekłych supernatantach hodowli komórkowych. Tabela 1 pokazuje, że w przypadku trwałych rekombinowanych klonów komórkowych swoista komórkowa produktywność była trwała nawet po 60 pokoleniach w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu i nawet wzrosła w porównaniu z pierwotnym klonem, który hodowano na podłożu zawierającym surowicę.
T a b e l a 1
Klon komórkowy Swoista komórkowa produktywność komórek pracujących w mU rvWF/106 komórek/dzień Swoista komórkowa produktywność po 10 pokoleniach w mU rvWF/106 komórek/dzień Swoista komórkowa produktywność po 60 pokoleniach w mU rvWF/106 komórek/dzień
rvWF-CHO #808,68 pierwotny klon komórkowy 55 30 <10
trwały klon r-vWF-CHO F7*) 62 65 60
*) zdeponowany 22 stycznia 1998 (ECACC (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK); numer depozytowy 98012206)
P r z y k ł a d 4
Kompozycja syntetycznego wolnego od surowicy i wolnego od białka podłoża:
T a b e l a 2
Składnik g/l Korzystna ilość (według naszej wiedzy w czasie zgłoszenia patentowego) w g/l
Syntetyczne podłoże minimalne (DMEM/HAM F12) 1-100 11,00-12,00
Pepton sojowy 0,5-50 2,5
L-glutaminian 0,05-1 0,36
Kwas askorbinowy 0,0005-0,05 0,0035
NaHCOa 0,1-10 2,0
Etanoloamina 0,0005-0,05 0,0015
Selenin Na 1-15 gg/l 8,6 gg/l
Ewentualnie: Synperonic F68 0,01-10 0,25
P r z y k ł a d 5:
Hodowla komórek rFVIII-CHO na wolnym od białka i wolnym od surowicy podłożu
Hodowlę komórkową zawierająca komórki rFVIII-CHO hodowano w 10 I zbiorniku perfuzyjnym z mieszaniem. W tym przypadku zastosowano podłoże według przykładu 4. Komórki unieruchamiano ® tym samym na porowatych mikronośnikach (Cytopore®, Pharmacia) i hodowano następnie przez 6 tygodni. Szybkość perfuzji wynosiła 4 zmiany objętości na dzień; pH wynosiło 6,9-7,2; stężenie O2 wynosiło około 20-50% i temperatura wynosiła 37°C.
Figura 1 przedstawia wyniki hodowania klonu komórkowego rFVIII-CHO w 10 I bioreaktorze perfuzyjnym.
a) Aktywność Czynnika VIII (milijednostki/ml) i szybkość perfuzji (1-5/dzień) w okresie 42 dni. b) Produktywność wolumetryczna (jednostki Czynnika VIII/l/dzień) w bioreaktorze perfuzyjnym.
PL 215 234 B1
T a b e l a 3
Dni hodowli Swoista produktywność komórkowa (mU/106 komórek/dzień) Immunofluorescencja (% komórek FVIII pozytywnych)
15 702 nie dotyczy
21 1125 nie dotyczy
28 951 >95%
35 691 >95%
42 970 nie dotyczy
Tabela 3 przedstawia trwałą i swoistą produktywność komórek wyrażających rFVIII. W celu otrzymania takich rezultatów próbki pobierano po 15, 21, 28, 35 i 42 dniach i wówczas wirowano przy 300 g i zawieszano w świeżym wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu. Stężenie Czynnika VIII w cieczach supernatantowych hodowli komórkowych i liczbę komórek określono po dalszych 24 h. Swoistą produktywność FVIII obliczono na podstawie tych danych.
Osiągnięto trwałą średnią produktywność 888 milijednostek/106 komórek/dzień. Tą trwałą produktywność potwierdzono również za pomocą immunofluorescencji ze znakowanymi przeciwciałami anty-FVIII po 15, 21, 28, 35 i 42 dniach na wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu.
P r z y k ł a d 6:
Porównanie produktywności rekombinowanych komórek FVIII-CHO w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu zawierającym dodatkowe składniki.
Hodowlę komórkową zawierającą komórki rFVIII-CHO hodowano okresowo. W tym przypadku zastosowano podłoże według przykładu 4, do którego dodano następujące aminokwasy:
T a b e l a 4
Aminokwas: mg/l Korzystna ilość (według naszej wiedzy w czasie zgłoszenia patentowego) w mg/I
L-Aspargina 1-100 20
L-Cysteina HCl H2O 1-100 15
L-Cysteina 1-100 20
L-Prolina 1-150 35
L-Glutamina 50-1000 240
Komórki hodowano w 37°C i pH 6,9-7,2. Komórki hodowano stosując proces okresowy w okresach 24-72 godzin.
Produktywność rekombinowanych komórek FVIII-CHO mierzono w następujących kompozycjach podłoży:
Mix 1: obejmujący wolne od surowicy i wolne od białka podłoże, bez peptonu sojowego i zawierający dodatkowo mieszaninę aminokwasów według opisanej powyżej tabeli.
Mix 2: obejmujący wolne od surowicy i wolne od białka podłoże, zawierające pepton sojowy.
Mix 3: obejmujący wolne od surowicy i wolne od białka podłoże, zawierające pepton sojowy i zawierający dodatkowo mieszaninę aminokwasów według opisanej powyżej tabeli.
Mix 4: obejmujący wolne od surowicy i wolne od białka podłoże, i zawierający dodatkowo mieszaninę aminokwasów według opisanej powyżej tabeli i 2,5 g/l oczyszczonego, ultrafiltrowanego peptonu sojowego. Oczyszczanie ultrafiltrowanego peptonu sojowego przeprowadzono chromatograficz® nie na kolumnie Sephadex®.
P r z y k ł a d 7:
Hodowanie rekombinowanych komórek FVIII-CHO w wolnym od białka i wolnym od surowicy podłożu z zastosowaniem chemostatycznego sposobu hodowli
Hodowlę komórkową zawierającą komórki rFVIII-CHO hodowano w 10 I zbiorniku bioreaktora z mieszaniem. W tym przypadku zastosowano podłoże według Przykładu 4, bez peptonu sojowego, zawierające mieszaninę aminokwasów według Przykładu 6. Komórki hodowano w 37°C i pH 6,9-7,2; stężenie tlenu wynosiło 20-50% wysycenia powietrza. Próbki pobierano co 24 godziny w celu określe10
PL 215 234 B1 nia miana Czynnika VIII i stężenia komórkowego w cieczy supernatantowej hodowli. Od drugiego do czternastego dnia całkowite stężenie komórkowe było stałe. Począwszy od szóstego dnia do podłoża dodawano ultrafiltrowany pepton sojowy. Produktywność Czynnika VIII zilustrowano na fig. 3; pomiary przeprowadzono za pomocą układu CHROMOGENIX CoA FVIII;C/4.
Immunofluorescencję przeprowadzono ze znakowanymi przeciwciałami anty-FVIII. Z danych można było zauważyć, że wyraźne zwiększenie produktywności Czynnika VIII i skutkiem tego zwiększenie produktywności wolumetrycznej układu bioreaktora, występowało jako wynik dodania peptonu sojowego, przy czym nie prowadziło to do wyraźnego zwiększenia wzrostu komórkowego. Nieobecność peptonu sojowego w ciągłej hodowli prowadzi do wyraźnego obniżenia produktywności Czynnika VIII po kilku dniach, podczas gdy dodanie peptonu sojowego prowadzi w konsekwencji do prawie dziesięciokrotnego zwiększenia produktywności. Jednak z powodu tego dodania nie zwiększa się liczba komórek, co wyraźnie wskazuje, że ultrafiltrowany pepton sojowy prowadzi w konsekwencji do wyraźnego zwiększenia produktywności, która jest niezależne od wzrostu komórkowego.
P r z y k ł a d 8:
Porównanie szybkości wzrostu i produktywności rekombinowanych komórek FVIII w wolnym od białka i wolnym od surowicy podłożu zawierającym różne hydrolizaty
Hodowlę komórek rFVIII-CHO prowadzono okresowo. W tym przypadku zastosowano wolne od surowicy i wolne od białka podłoże jak opisane w przykładzie 4, do którego dodano różne hydrolizaty (z soi, drożdży, ryżu i pszenicy). Jako kontrolne zastosowano wolne od surowicy i wolne od białka podłoże, do którego nie dodano hydrolizatu.
Początkowa gęstość komórkowa wynosiła odpowiednio 0,6 x 105 i 0,4 x 106. Komórki hodowano w 37°C stosując proces okresowy przy pH 6,9-7,2.
Tabela 5: przedstawia wyniki doświadczeń hodowlanych z komórkami rFVIII-CHO na wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu, do którego dodano hydrolizat soi (ultrafiltrowany) i hydrolizat 5 drożdży. Początkowa gęstość komórkowa wynosiła 0,6 x 105 komórek. Jako kontrolne zastosowano wolne od surowicy i wolne od białka podłoże bez dodatków hydrolizatów.
T a b e l a 5
Hydrolizat Końcowa gęstość komórkowa (x 106/ml) Miano FVIII (mU/ml) Aktywność zakrzepowa FVIII (mU/ml)
Soja 3,6 485 508
Drożdże 3,3 226 230
Tabela 6: przedstawia wyniki doświadczeń hodowlanych z komórkami rFVIII-CHO w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu, do którego dodano hydrolizat soi (ultrafiltrowany), hydrolizat ryżu 5 i hydrolizat pszenicy. Początkowa gęstość komórkowa wynosiła 0,6 x 105 komórek. Jako kontrolne zastosowano wolne od surowicy i wolne od białka podłoże bez dodatków hydrolizatów.
T a b e l a 6
Hydrolizat Końcowa gęstość Komórkowa (x 106/ml) Miano FVIII (mU/ml) VWF-Antygen (Pg/ml)
Soja 3,7 1142 6,7
Ryż 3,0 479 3,2
Pszenica 3,4 522 3,9
Kontrola 3,0 406 3,1
Tabela 7: przedstawia wyniki doświadczeń hodowlanych z komórkami rFVIII-CHO w wolnym od surowicy i wolnym od białka podłożu zawierającym hydrolizat soi (ultrafiltrowany) i hydrolizat pszenicy.
Początkowa gęstość komórkowa wynosiła 0,4 x 106 komórek.
T a b e l a 7
Hydrolizat Końcowa gęstość komórkowa (x 106/ml) Miano FVIII (Mu/ml) Antygen FVIII (Pg/ml) Antygen VWF (Pg/ml)
Soja 1,6 1427 166 17,2
Pszenica 1,0 1120 92 7,9
PL 215 234 B1
P r z y k ł a d 9
Hodowanie Komorek BHK w wolnym od białka i wolnym od surowicy podłożu zawierającym hydrolizat soi
Komórki BHK-21 (ATCC CCL 10) kontransfekowano trzy razy następującymi plazmidami za pomocą procedury CaPO4: 25 ąg plazmidu pSV-FII (Fischer B. I współp., J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, str. 2 3737-23742), który zawiera cDNA ludzkiego Czynnika II (protrombiny) pod kontrolą promotora SV40 (SV40 wczesny promotor genowy); 4 ąg plazmidu pSV-DHFR na oporność na metotreksat i 1 ąg plazmidu pUCSV-neo (Schlokat U. i współp., Biotech. Appl. Biochem., 1996, Vol. 24, str. 257-267), który pośredniczy w oporności na G418/neomycynę. Trwałe klony komórkowe wybrano za pomocą hodowania w podłożu, które zawierało 500 ąg/ml G418, przez zwiększanie stężenia metotreksatu w sposób stopniowy do stężenia 3 μΜ.
Klony, które otrzymano tą drogą, subklonowano i zaadaptowano do wolnego od białka i wolnego od surowicy podłoża. Hodowanie przeprowadzono z zastosowaniem zawiesinowej techniki hodowlanej.
Wyniki można zobaczyć w tabeli 6; komórki BHK, które hodowano w wolnym od białka i wolnym od surowicy podłożu zawierającym hydrolizat soi, wykazywały wysoką i trwałą szybkość produkcji rekombinowanego Czynnika II.

Claims (15)

1. Wolne od białka zwierzęcego i wolne od surowicy podłoże do hodowania komórek ssaka, znamienne tym, że zawiera od 10% wagowych ultrafiltrowanego hydrolizatu soi w stosunku do całkowitej suchej masy podłoża, przy czym co najmniej 40% tego hydrolizatu soi ma masę cząsteczkową < 500 u.
2. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera oczyszczony hydrolizat soi.
3. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że hydrolizat soi ma zawartość endotoksyny <500 U/g.
4. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że co najmniej 50% hydrolizatu soi ma masę cząsteczkową < 500 u.
5. Podłoże według zastrz. 4, znamienne tym, że co najmniej 55% hydrolizatu soi ma masę cząsteczkową < 500 u.
6. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera również aminokwas.
7. Podłoże według zastrz. 6, znamienne tym, że aminokwas jest wybrany z grupy składającej się z L-asparaginy, L-cysteiny, L-cystyny, L-proliny, L-tryptofanu, L-glutaminy lub ich mieszaniny.
8. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera również substancje pomocnicze wybrane z grupy składającej się z substancji buforujących, stabilizatorów utleniania, stabilizatorów przeciwdziałających bodźcom mechanicznym i inhibitorów proteazy.
9. Zastosowanie podłoża określonego w zastrz. 1, do hodowania komórek ssaków.
10. Zastosowanie podłoża według zastrz. 1 do hodowania komórek ssaków wybranych z grupy składającej się z komórek CHO i komórek BHK.
11. Sposób hodowania komórek ssaka obejmujący wprowadzenie komórek do podłoża i hodowanie ich w tym podłożu, znamienny tym, że jest to podłoże określone w zastrz. 1.
12. Sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi w hodowli komórkowej polegający na wprowadzeniu komórek ssaka do podłoża i hodowaniu komórek, znamienny tym, że podłożem jest podłoże określone w zastrz. 1, a komórkami są komórki wyrażające żądany rekombinowany czynnik krwi, przy czym kulturę komórek wyrażających rekombinowany czynnik krwi hoduje się z otrzymaniem mieszaniny komórek i rekombinowanego czynnika krwi w tym podłożu, po czym przeprowadza się oczyszczanie rekombinowanego czynnika z tej mieszaniny.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że rekombinowanym czynnikiem krwi jest rekombinowany czynnik VIII.
14. Kompozycja hodowli komórkowej, znamienna tym, że obejmuje komórki ssaków i podłoże określone w zastrz. 1.
PL 215 234 B1
15. Sposób wytwarzania podłoża do hodowli komórkowej określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje: otrzymywanie hydrolizatu soi, ultrafiltrowanie hydrolizatu soi z zastosowaniem procesu ultrafiltracji, oczyszczanie frakcji hydrolizatu soi z zastosowaniem chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, selekcję frakcji hydrolizatu soi składających się z hydrolizatu soi o masie cząsteczkowej < 500 u.
PL355233A 1999-09-28 2000-09-27 Wolne od bialka zwierzecego i wolne od surowicy podloze do hodowania komórek ssaka, zastosowanie podloza, sposób hodowania komórek, sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi, kompozycja hodowli komórkowej i sposób wytwarzania podloza PL215234B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0165999A AT409379B (de) 1999-06-02 1999-09-28 Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL355233A1 PL355233A1 (pl) 2004-04-05
PL215234B1 true PL215234B1 (pl) 2013-11-29

Family

ID=3518214

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL355233A PL215234B1 (pl) 1999-09-28 2000-09-27 Wolne od bialka zwierzecego i wolne od surowicy podloze do hodowania komórek ssaka, zastosowanie podloza, sposób hodowania komórek, sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi, kompozycja hodowli komórkowej i sposób wytwarzania podloza

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20030203448A1 (pl)
EP (1) EP1220893B2 (pl)
JP (6) JP5441288B2 (pl)
CN (2) CN1318577C (pl)
AT (2) AT409379B (pl)
AU (1) AU780791B2 (pl)
CA (1) CA2385299A1 (pl)
CY (1) CY1106135T1 (pl)
CZ (1) CZ305307B6 (pl)
DE (1) DE60028989T3 (pl)
DK (1) DK1220893T4 (pl)
ES (1) ES2265991T5 (pl)
HU (1) HU228210B1 (pl)
IL (4) IL148642A0 (pl)
PL (1) PL215234B1 (pl)
PT (1) PT1220893E (pl)
RU (3) RU2266325C2 (pl)
SI (1) SI1220893T1 (pl)
SK (1) SK288059B6 (pl)
TR (1) TR200200757T2 (pl)
WO (1) WO2001023527A1 (pl)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
CA2466881A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Cell culture process
US7195905B2 (en) 2001-12-10 2007-03-27 Baxter Healthcare S.A. Enveloped virus vaccine and method for production
JP3916516B2 (ja) * 2002-06-10 2007-05-16 独立行政法人科学技術振興機構 硬組織−軟組織界面再生用足場材料
EP1520008B1 (en) 2002-07-09 2012-09-05 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
CA2548162C (en) * 2003-12-19 2013-10-29 Wyeth Serum-free vero cell banking process
ME01218B (me) 2004-03-01 2013-06-20 Ares Trading Sa Upotreba podloge za ćelijsku strukturu bez sadrzaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
AU2011221414B2 (en) * 2004-10-29 2012-09-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Animal Protein-Free Media for Cultivation of Cells
CA2585547A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
FR2879214A1 (fr) * 2004-12-14 2006-06-16 Pierre Fabre Medicament Sa Fractions peptidiques favorisant la croissance et la synthese de produit(s) d'interet en culture de cellules et/ou de tissus
WO2006084826A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Novo Nordisk Health Care Ag Production of a polypeptide in a serum-free cell culture liquid containing plant protein hydrolysate
EP1862537B1 (en) * 2005-03-10 2013-05-08 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
KR100670105B1 (ko) 2005-06-29 2007-01-17 주식회사 셀트리온 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴
US7375188B2 (en) * 2005-07-29 2008-05-20 Mallinckrodt Baker, Inc. Vegetarian protein a preparation and methods thereof
PL3121266T3 (pl) 2006-01-04 2020-07-13 Baxalta Incorporated Wolne od oligopeptydów pożywki do hodowli komórkowej
CA2644926A1 (en) * 2006-03-06 2007-09-13 Humagene, Inc. A method for the preparation of recombinant human thrombin and fibrinogen
SG174804A1 (pl) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
EP2500415A1 (en) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Cell culture improvements
EP2084265A2 (en) * 2006-11-13 2009-08-05 Schering Corporation Method for reducing protease activity in plant hydrolysate
US20090294288A1 (en) 2006-12-11 2009-12-03 Schering Corporation High-sensitivity proteolysis assay
EP1988101A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-05 Novo Nordisk A/S Improvement of factor VIII polypeptide titers in cell cultures
KR101190605B1 (ko) 2007-06-15 2012-10-15 재단법인 목암생명공학연구소 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
WO2009115495A1 (de) * 2008-03-19 2009-09-24 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Methode zur steigerung der reklonierungseffizienz
WO2009127098A1 (zh) 2008-04-18 2009-10-22 上海中信国健药业有限公司 一种浓缩培养液及其使用方法
TW201012930A (en) 2008-06-16 2010-04-01 Intervet Int Bv Method of replicating viruses in suspension
JP5458536B2 (ja) * 2008-09-17 2014-04-02 不二製油株式会社 乳酸の製造方法及び乳酸発酵用添加剤
CA2737580A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Schering Corporation High titer antibody production
EP2356247B2 (en) * 2008-11-12 2019-05-15 Baxalta Incorporated Method of producing serum-free insulin-free factor vii
KR101737645B1 (ko) 2008-12-30 2017-05-18 박스알타 인코퍼레이티드 알킬-아민-ｎ-옥시드 (ａａｎｏｘ)를 사용하는 세포 성장 증진 방법
CN101603026B (zh) * 2009-06-19 2011-01-19 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
KR101574056B1 (ko) 2009-07-31 2015-12-02 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 Ａｄａｍｔｓ 단백질 발현을 위한 세포 배양 배지
CN102115728B (zh) * 2009-12-31 2012-09-26 北京清大天一科技有限公司 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
AU2011246502B2 (en) 2010-04-26 2014-08-28 Novartis Ag Improved cell cultivation process
SG185038A1 (en) * 2010-04-26 2012-11-29 Novartis Ag Improved cell culture medium
TWI670073B (zh) 2010-07-08 2019-09-01 美商巴克斯歐塔公司 在細胞培養物中生產重組高分子量ｖＷＦ的方法
CN101914485A (zh) * 2010-08-05 2010-12-15 乐能生物工程股份有限公司 一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法
KR20130101034A (ko) 2010-08-31 2013-09-12 프리슬랜드 브랜즈 비브이 진핵 세포를 위한 배양 배지
CN103154233A (zh) * 2010-10-05 2013-06-12 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 生产蛋白质的方法
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
CN103160458A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 西南民族大学 一种适合Vero细胞生长的低血清培养基
JP2015509376A (ja) * 2012-03-08 2015-03-30 フリーズランド ブランズ ビー．ブイ． 真核細胞のための培養培地
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
CN104593317B (zh) * 2013-10-31 2018-05-04 中国食品发酵工业研究院 一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
SG11201605146VA (en) 2013-12-30 2016-07-28 Baxalta GmbH A method of predicting a performance characteristic of a plant or yeast hydrolysate and its use
RU2558253C1 (ru) * 2014-02-10 2015-07-27 Федеральное Казенное Предприятие " Щелковский Биокомбинат" Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих
ES2909630T3 (es) 2014-06-04 2022-05-09 Amgen Inc Métodos de recolección en cultivos de células de mamífero
TWI743024B (zh) 2014-06-06 2021-10-21 美商健臻公司 灌注培養方法及其用途
CN104560893B (zh) * 2015-01-30 2017-11-14 肇庆大华农生物药品有限公司 一种用于培养病毒的培养基及其制备方法
RU2588666C1 (ru) * 2015-03-23 2016-07-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих
CN105002242A (zh) * 2015-07-23 2015-10-28 苏州康聚生物科技有限公司 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
EP3328403A4 (en) * 2015-07-31 2019-04-17 Zen-Bio, Inc. EXOSOME COMPOSITIONS AND USE THEREOF FOR SOFTWARE SAVING
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
US11070703B2 (en) * 2016-07-29 2021-07-20 Robert Bosch Tool Corporation 3D printer touchscreen interface lockout
JP6258536B1 (ja) 2017-03-03 2018-01-10 協和発酵キリン株式会社 ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法
SG11201912548XA (en) * 2017-07-06 2020-01-30 Regeneron Pharma Cell culture process for making a glycoprotein
CN113151183A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 赵峻岭 一种促进蛋白表达的培养基添加物及其应用
WO2024024671A1 (ja) * 2022-07-27 2024-02-01 不二製油グループ本社株式会社 動物細胞増殖促進剤

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT165999B (de) 1947-06-26 1950-05-25 Delle Atel Const Electr Einirchtung zum Schutz von Drehstrommotoren gegen Überstrom
FR2196386A1 (en) 1972-08-17 1974-03-15 Cudennec Alain Culture media selection - for identification of unknown bacteria
US4443540A (en) 1980-05-09 1984-04-17 University Of Illinois Foundation Protein hydrolysis
DK207980A (da) * 1980-05-13 1981-11-14 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et skumnings- eller emulgeringsmiddel paa sojaproteinbasis
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
FI86885C (fi) 1984-04-20 1992-10-26 Genentech Inc Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill
EP0217822B1 (en) 1985-02-13 1993-05-12 Scios Nova Inc. Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
ZA862768B (en) 1985-04-17 1986-12-30 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
GB8608020D0 (en) 1986-04-02 1986-05-08 Beecham Group Plc Compounds
EP0318487B1 (en) 1986-08-04 1993-10-13 The University Of New South Wales Serum free tissue culture medium containing polymeric cell-protective agent
AU627427B2 (en) 1987-06-30 1992-08-27 Amgen, Inc. Production of kallikrein
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
JP2507882B2 (ja) 1988-02-17 1996-06-19 工業技術院長 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
JP2815613B2 (ja) 1989-03-24 1998-10-27 株式会社リコー 静電荷像現像用トナー
US5573937A (en) 1989-12-07 1996-11-12 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Serum free culture medium
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
AT393356B (de) 1989-12-22 1991-10-10 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen
WO1991010726A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-25 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Co-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JP2844484B2 (ja) * 1990-02-22 1999-01-06 味の素株式会社 組換え蛋白質の生産方法
JP2859679B2 (ja) 1990-03-01 1999-02-17 協和醗酵工業株式会社 新規細胞株
JP2696001B2 (ja) 1991-04-15 1998-01-14 財団法人化学及血清療法研究所 組換え蛋白質産生用培地
US5378612A (en) 1990-05-11 1995-01-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Culture medium for production of recombinant protein
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
JPH04228066A (ja) 1990-10-23 1992-08-18 Rikagaku Kenkyusho 外来遺伝子発現用培養細胞
EP0531562A1 (de) * 1991-09-11 1993-03-17 Doerr, Hans-Wilhelm, Prof. Dr. med. Kultivierung von Säugetierzellen
JPH05123178A (ja) * 1991-11-01 1993-05-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−フエニルアラニンの製造法
DK53792D0 (da) 1992-04-24 1992-04-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
RU2057176C1 (ru) 1992-05-20 1996-03-27 Институт генетики АН Республики Молдова Питательная среда для культивирования клеток человека и животных
DE4313620A1 (de) 1993-04-26 1994-10-27 Biotechnolog Forschung Gmbh Hamsterzellinien und Verfahren zur Glykoproteingewinnung
AU7895898A (en) 1993-04-26 1998-10-08 Hans Wolf Mammal cell lines and method of obtaining glycoproteins
US5405637A (en) 1993-06-30 1995-04-11 Bristol-Myers Squibb Company Milk protein partial hydrolysate and infant formula containing same
JP2766165B2 (ja) * 1993-08-02 1998-06-18 株式会社バイオポリマー・リサーチ バクテリアセルロースの製造方法
CN1088984A (zh) * 1993-11-11 1994-07-06 江西省医学科学研究所 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基
US5719050A (en) 1993-12-24 1998-02-17 Eiken Chemical Co., Ltd. Animal cell culturing media containing N-acetyl-L-glutamic acid
EP0666312A1 (en) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Process for the improvement of mammalian cell growth
US5789247A (en) 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
JP2684521B2 (ja) 1994-08-19 1997-12-03 ハムス株式会社 ベルトループ縫付けミシンにおけるテープ折り曲げ端の形成維持方法及びその装置
WO1996007730A2 (de) 1994-09-09 1996-03-14 Renner Wolfgang A Chemisches verfahren zur förderung der proliferation von tierischen zellen
ATE542891T1 (de) 1994-11-10 2012-02-15 Baxter Healthcare Sa Verfahren zur herstellung von biologischen produkten in protein-freier kultur
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
JP3244391B2 (ja) 1994-12-08 2002-01-07 財団法人国際超電導産業技術研究センター 複合基板及びそれを用いた単結晶基板の製造方法
EP0799310A1 (en) 1994-12-16 1997-10-08 Novartis AG Production of recombinant secretory component
JP3649249B2 (ja) * 1995-02-23 2005-05-18 クエスト・インターナショナル・サービシーズ・ビー・ブイ 組織および細胞培養用ペプチド
US5741705A (en) 1995-02-23 1998-04-21 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Method for in vitro cell growth of eucaryotic cells using low molecular weight peptides
WO1996040866A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Serum-free media for primitive hematopoietic cells and methods of use thereof
AUPN442295A0 (en) 1995-07-26 1995-08-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulated autocrine growth of mammalian cells
JPH09107955A (ja) * 1995-10-24 1997-04-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 動物細胞培養用培地
ATE222064T1 (de) * 1996-04-09 2002-08-15 Du Pont Isoflavon angereichertes sojaeiweissprodukt und verfahren zur herstellung
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
JP2000517188A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
DE69738806D1 (de) * 1996-10-10 2008-08-14 Invitrogen Corp Tierzellkulturmedium mit pflanzlichen nährstoffen
JPH10211488A (ja) 1997-01-28 1998-08-11 Akai Electric Co Ltd 紫外線殺菌装置
US6383810B2 (en) * 1997-02-14 2002-05-07 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
PT1849860E (pt) 1997-05-28 2011-02-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Processo de preparação de um factor imunogénico de corynebacterium diphtheriae utilizando um meio de cultura com extracto de levedura como fonte de aminoácidos e sem complexos proteicos de origem animal
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
DK0986644T3 (da) 1997-07-23 2007-01-29 Roche Diagnostics Gmbh Fremstilling af erythropoietin ved endogen genaktivering med virale promotorer
JPH11211488A (ja) 1998-01-21 1999-08-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 携帯情報端末を用いたデータ転送システム
FR2775983B1 (fr) * 1998-03-13 2000-11-10 Pasteur Merieux Serums Vacc Milieu et procede de propagation et de multiplication virales
WO1999057246A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) * 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
DK1200561T3 (da) 1999-08-05 2006-10-16 Baxter Ag Rekombinant stabil celleklon, dens fremstilling og anvendelse
PT1210411E (pt) 1999-08-25 2006-12-29 Immunex Corp Composições e métodos para cultura celular melhorada
WO2002024876A2 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
EP1208966A1 (en) 2000-11-27 2002-05-29 Cheng-Kun Liao Manufacturing process of patio tabletop glass with broken protection
EP1520008B1 (en) 2002-07-09 2012-09-05 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
JP4316484B2 (ja) 2004-12-10 2009-08-19 シャープ株式会社 画像形成装置、トナー濃度制御方法、トナー濃度制御プログラムおよびその記録媒体

Also Published As

Publication number Publication date
DE60028989T3 (de) 2017-01-19
US20030203448A1 (en) 2003-10-30
IL250619B (en) 2018-04-30
PL355233A1 (pl) 2004-04-05
AT409379B (de) 2002-07-25
CN101173246A (zh) 2008-05-07
JP6348521B2 (ja) 2018-06-27
ES2265991T3 (es) 2007-03-01
DK1220893T3 (da) 2006-10-23
US20170002392A1 (en) 2017-01-05
SK288059B6 (sk) 2013-03-01
EP1220893B2 (en) 2016-08-31
JP2013135691A (ja) 2013-07-11
US20150072415A1 (en) 2015-03-12
JP2011135880A (ja) 2011-07-14
JP5777653B2 (ja) 2015-09-09
AU780791B2 (en) 2005-04-14
IL148642A0 (en) 2002-09-12
JP2017212977A (ja) 2017-12-07
IL250619A0 (en) 2017-06-29
JP5441288B2 (ja) 2014-03-12
US20110287482A1 (en) 2011-11-24
HUP0202759A3 (en) 2004-10-28
HUP0202759A2 (hu) 2002-12-28
AU7908300A (en) 2001-04-30
US8021881B2 (en) 2011-09-20
US8722406B2 (en) 2014-05-13
PT1220893E (pt) 2006-10-31
DE60028989T2 (de) 2007-01-25
JP2019030306A (ja) 2019-02-28
ES2265991T5 (es) 2017-05-03
EP1220893B1 (en) 2006-06-21
CZ20021096A3 (cs) 2003-01-15
US9982286B2 (en) 2018-05-29
US20080182297A1 (en) 2008-07-31
IL219969A (en) 2017-06-29
RU2536244C2 (ru) 2014-12-20
DK1220893T4 (en) 2016-12-05
US9441203B2 (en) 2016-09-13
SI1220893T1 (sl) 2006-12-31
CA2385299A1 (en) 2001-04-05
EP1220893A1 (en) 2002-07-10
SK4002002A3 (en) 2002-07-02
IL148642A (en) 2012-08-30
CN1318577C (zh) 2007-05-30
DE60028989D1 (de) 2006-08-03
US20160369316A1 (en) 2016-12-22
CY1106135T1 (el) 2011-06-08
RU2380412C2 (ru) 2010-01-27
TR200200757T2 (tr) 2002-09-23
JP2003510070A (ja) 2003-03-18
CZ305307B6 (cs) 2015-07-29
RU2009131610A (ru) 2011-02-27
CN101173246B (zh) 2011-03-09
IL219969A0 (en) 2012-06-28
HU228210B1 (en) 2013-01-28
RU2005123274A (ru) 2007-01-27
ATE331025T2 (de) 2006-07-15
ATA165999A (de) 2001-12-15
RU2266325C2 (ru) 2005-12-20
WO2001023527A1 (en) 2001-04-05
JP2016127839A (ja) 2016-07-14
CN1391604A (zh) 2003-01-15
JP6467459B2 (ja) 2019-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9982286B2 (en) Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
US6475725B1 (en) Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
ES2267280T3 (es) Clon celular recombinante estable, su preparacion y utilizacion del mismo.