CZ305307B6

CZ305307B6 - Bezbílkovinné a bezsérové médium pro kultivaci savčích buněk a jeho použití

Info

Publication number: CZ305307B6
Application number: CZ2002-1096A
Authority: CZ
Inventors: Manfred Reiter; Wolfgang Mundt; Friedrich Dorner; Leopold Grillberger; Artur Mitterer
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-09-28
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2015-07-29
Also published as: JP2003510070A; AU780791B2; HUP0202759A2; HU228210B1; JP6348521B2; US8722406B2; JP2019030306A; SK4002002A3; US20030203448A1; RU2266325C2; IL250619B; CN101173246B; RU2005123274A; TR200200757T2; CN1391604A; JP2011135880A; JP5777653B2; HUP0202759A3; CY1106135T1; US20160369316A1

Abstract

Vynález se týká bezbílkovinného a bezsérového média pro kultivaci savčích buněk, které obsahuje více než 10 % hmotn. sójového hydrolyzátu, vztaženo na celkovou sušinu média, přičemž alespoň 40 % sójového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost .<=. 500 daltonů, jeho použití pro kultivaci savčích buněk, způsobu kultivace buněk, buněčné kultury a způsobu produkce média pro ni.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká média pro proteinu prostou a séra prostou kultivaci buněk.

Dosavadní stav techniky

Kultivace buněk, zejména eukaryotických buněk nebo savčích buněk, stále volá po používání speciálních kultivačních médií, která dodávají buňkám živné látky a růstové látky, jež jsou vyžadovány pro účinný růst a produkci požadovaných proteinů. Z tohoto hlediska jsou jako složka média zpravidla užívány sérum nebo sloučeniny ze séra pocházející (např. hovězí sérum).

Avšak v případě, že se v buněčných kulturách použijí séra nebo proteinová aditiva, která pocházejí z lidských nebo zvířecích zdrojů, existují mnohé problémy, zejména když výchozí materiál pro přípravu medicínského preparátu, který má být lidem podáván, byl zpřístupněn cestou kultivace buněk.

V případě takových sérových přípravků tudíž složení a kvalita vždy kolísá od vsádky k vsádce právě kvůli různosti organismu dárce takových přípravků. To představuje závažný problém zejména pro standardizaci produkce buněk a stanovení standardních podmínek růstu pro takové buňky. Nicméně v každém případě se vyžaduje intenzivní a konstantní kontrola kvality materiálu séra, které se používá. To je však neobyčejně časově náročné a velmi nákladné, zejména v případě takové složité kompozice jako je sérum.

Kromě toho takové komplexní přípravky obsahují množství proteinů, které mohou působit rozkladným způsobem, zvláště v kontextu rafmačního procesu pro rekombinantní protein, který má být z buněčné kultury získán. To se týká zejména těch proteinů, které jsou homologické nebo podobné s proteinem, který má být získán. Tyto problémy jsou zvláště akutní, protože biogenní protějšek v použitém médiu (např. hovězí protein) může být spolehlivě odstraněn v souvislosti s rafinací pouze cestou zcela specifické rozlišovací rafinace (např. s protilátkami, které jsou specificky zaměřeny pouze proti rekombinantnímu proteinu a nikoliv proti hovězímu proteinu [Bjórck L., J. Immunol. 140, 1194-1197 (1988); Nilson a spol., J. Immunol. Meth. 164, 33—40 (1933)].

Avšak výslovným problémem při používání séra nebo sloučenin pocházejících ze séra v kultivačním médiu, je také riziko kontaminace mykoplazmou, viry nebo BSE působky. V souvislosti s preparáty, které pocházejí z lidské krve musí být zejména zdůrazněno riziko nakažení viry, jako hepatitidou nebo HIV. V případě séra, nebo složek séra pocházejících z hovězího materiálu, existuje zejména nebezpečí BSE nákazy. Vedle toho všechny materiály pocházející ze séra mohou být kontaminovány navíc choroby vyvolávajícími působky, které jsou dosud neznámé.

Odhlížeje od mála výjimek, bylo dříve pro kultivaci buněk na tuhých površích považováno za nezbytné, přesné přidání komponent séra, aby se zaručila adekvátní adheze buněk kjejich povrchům, a aby se zaručila adekvátní produkce požadovaných substancí. Tak pomocí metody, která je popsána například v WO 91/09 935 bylo možné provádět proces séra prosté a proteinu prosté kultivace FSME virus / antigen virus, pomocí séra prosté a proteinu prosté kultivace na povrchu závislých permanentních buněk, přednostně vero buněk (viz WO 96/15 231). Ty však nejsou rekombinantními buňkami, ale spíše hostitelskými buňkami, jež jsou používány pro produkci virového antigenu při lytickém procesu.

Na rozdíl od toho buňky, které vysoko převažují v používání pro rekombinační preparaci, například CHO buňky, jsou schopné adheze pouze v omezeném rozsahu. Tak CHO buňky, které byly

- 1 CZ 305307 B6 pěstovány konvenčními metodami, se vážou jak na hladké tak porézní mikronosiče pouze za podmínek obsahujících sérum [viz US 4 973 616; Cytotechnology 9, 247-253 (1992)]. Jsou-li však buňky pěstovány za podmínek séra prostých, tuto vlastnost ztrácejí a nepřilnou k hladkým nosičům, nebo se dají od nich snadno oddělit, pokud médiem nebyly poskytovány jiné adhezi podporující substance, jako např. fibronektin, inzulín nebo transferin. To jsou však také proteiny, které pocházejí ze séra.

Jako alternativa k tomu, mohou být buňky pěstovány při aplikaci techniky suspenzní kultivace právě tak jako např. při použití procesu po jednotlivých násadách nebo při využití techniky kontinuální kultury. Kultivace přednostně probíhá za použití procesu chemostat (Ozturk S. S. a spol., 1996, Abstr. Pap. Chem. Soc., BIOT 164; Payne G. F. a spol., v „Large Scale Cell Culture Technology“, 206-212, 1987, editor Lydersen Β. K., Hauser Publishers). Kattinger H. a spol. [Advances Mol. Cell. Biology, 15A, 193-207 (1996)] popisuje dlouhodobou kultivaci buněk v protein prostém médiu, avšak tyto buňky musí být pěstovány na nosičích a nedovolují alternativy jako kontinuální kultivační techniky. Konstatuje se, že tyto buňky vykazují dlouhodobou stabilitu pouze, když lnou k povrchu nosičů, protože mají zredukovaný růst jako důsledek sníženého požadavku na růstové faktory.

Kromě toho byly původně činěny pokusy adaptovat buňky na proteinu prosté médium vycházející z podmínek sérum obsahujících. Avšak v případě takové adaptace bylo opakovaně zjišťováno, že ve srovnání s podmínkami sérum obsahujícími, výtěžek exprimovaného proteinu a produktivita rekombinantních buněk je po adaptaci v proteinu prostém médiu znatelně snížena [Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 691-658 (1994)].

Bylo také zjištěno, že v případě vysoké hustoty buněk je podle příležitosti produkce rekombinantních proteinů podstatně omezena. Během pokusů adaptovat buňky na proteinu prostá a séra prostá média, se u buněk, které jsou používány, opakovaně zjišťuje nestabilita se sníženým růstem, takže se produkují buňky se sníženou expresí, nebo se produkují i neproduktivní buňky, čímž tyto mají ve vztahu k produkujícím buňkám v proteinu prostém a séra prostém médiu v růstu převahu a to vede ke skutečnosti, že tyto přerostou produkující buňky a potom konečně právě celá kultura dává velice nízké výtěžky produktu.

Podstata vynálezu

Předložený vynález má proto tedy za cíl zlepšit možnosti pro proteinu prostou a séra prostou kultivaci rekombinantních buněk a vytvoření činidel a dostupných procesů, pomocí nichž mohou být rekombinantní buňky účinně kultivovány séra prostým nebo proteinu prostým způsobem. Navíc by mělo být možné nejen kultivovat na povrchu závislé buňky, ale užívat také suspenzní kultivační techniku, čímž se chce, aby nestabilita v produktivitě buněk byla potlačena tak, jak je to jen možné.

Dalším předmětem předloženého vynálezu dodatečně je účinně zvýšit produkci rekombinantních buněk.

Konečně v souhlase s vynálezem je zapotřebí, aby se zlepšila a vytvořila adaptace rekombinantních buněk na séra prostá a proteinu prostá média.

V souhlase s vynálezem jsou tyto úkoly plněny pomocí bezbílkovinného a bezsérového média pro kultivaci savčích buněk, které obsahuje více než 10 % hmotn. sójového hydrolyzátu, vztaženo na celkovou sušinu média, přičemž alespoň 40 % sójového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů.

Překvapivě bylo možné ukázat, že cílů, které jsou shora definovány, může být dosaženo kultivací buněk v médiu, které obsahuje sójový hydrolyzát, bez nutnosti snášet nevýhody séra prosté kulti-2CZ 305307 B6 vace, které jsou v dřívější praxi popisovány. Na rozdíl od jiných, z dřívější praxe známých hydrolyzátů, jako jsou například pšeničné hydrolyzáty, rýžové hydrolyzáty nebo kvasničné hydrolyzáty, bylo zjištěno, že pouze sójové hydrolyzáty zprostředkují vlastnosti v souhlase s vynálezem a vedou například k výrazně zvýšenému výtěžku cílového rekombinantního proteinu. Při zacházení s těmito termíny, může být používán buď termín sójový hydrolyzát, nebo sójový pepton, aniž by měly různé významy.

Médium v souhlase s vynálezem obsahuje sójový hydrolyzát v množství více než 10 hmotn. % vztaženo na celkovou hmotnost média. Zpravidla je sójový hydrolyzát v médiu poskytován v množství 4 až 40 %.

Volba specifického sójového hydrolyzátu není v souhlase s vynálezem rozhodující. Podle vynálezu může být používáno velké množství sójových preparátů, které se vyskytují na trhu, např. peptony ze sójové moučky, enzymaticky štěpené (např. papainem), s hodnotou pH mezi 6,5 a 7,5, celkovým obsahem dusíku mezi 9 a 9,7 % a obsahem popela mezi 8 a 15 %. Toto jsou peptony ze sóji ve formě, ve které jsou odborníky v tomto oboru pro buněčnou kulturu obecně používány.

V souhlase s preferovanou formou provedení se v médiu podle vynálezu používá rafinovaný preparát sójového hydrolyzátu nebo jeho surová frakce. Nečistoty, které by mohly s účinnou kultivací interferovat, jsou nej vhodněji odstraněny během této rafinace nebo se vylepší přesnost hydrolyzátu, např. co se týká molekulové hmotnosti.

Podle vynálezu se během této rafinace v praxi osvědčilo zařazení ultrafiltračního kroku jako zvláště cenné; vzhledem k tomu je v médiu podle vynálezu speciálně dávána přednost používání sójového hydrolyzátu po ultrafiltraci.

Ultrafiltrace může probíhat v souhlase s procesem, jak je zevrubně popisován v dřívější technice, např. při používání membránových filtrů s definovanou mezní velikostí.

Rafinace sójového peptonu po ultrafiltraci může probíhat pomocí gelové chromatografie, např. chromatografie na Sephadexu, například se Sephadexem G25 nebo Sephadexem G10 nebo ekvivalentními materiály, chromatografie na iontoměničích, afinitní chromatografie, velikostně vylučovací chromatografie nebo chromatografie na obrácených fázích. To jsou technické procesy, se kterými je odborník na tomto poli obeznámen. Při aplikaci těchto metod mohou být voleny takové frakce, které obsahují sójový hydrolyzát o definované molekulové hmotnosti, tj. < 1000 daltonů, výhodně < 500 daltonů a zejména <350 daltonů.

Proto vynález také zahrnuje postup produkce séra prostého a proteinu prostého média pro kultivaci buněk, skládající se ze získání sójového hydrolyzátu, ultrafiltrování řečeného sójového hydrolyzátu ultrafiltračním procesem, rafinování frakce řečeného sójového hydrolyzátu za použití velikostně vylučovací chromatografie a vybrání frakcí sójového hydrolyzátu, které tvoří sójový hydrolyzát mající molekulovou hmotnost < 1000 daltonů, výhodně < 500 daltonů a zejména <350 daltonů.

Charakteristickým rysem zvláště výhodného sójového hydrolyzátu je, že má obsah volných aminokyselin mezi 10,3 % a 15,6 %, nebo raději mezi 12% a 13,54 %, celkový obsah dusíku mezi 7,6% a 11,4 % nebo lépe mezi 8,7 % a 9,5 % a obsah endotoxinu < 500 jednotek/g a přičemž nejméně 40 %, výhodně nejméně 50 % anebo lépe zejména pak 55 %, má molekulovou hmotnost 200 až 500 daltonů a nejméně 10 % nebo lépe 15 %, má molekulovou hmotnost 500 až 1000 daltonů. Nejvýhodnější je, když nejméně 90 % sójového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů. Takový hydrolyzát se zvlášť dobře hodí pro průmyslovou produkci rekombinantních proteinů, protože vzhledem ke svým speciálním charakteristickým rysům, může být zvlášť snadno standardizován aje využitelný v rutinních postupech.

-3 CZ 305307 B6

Kromě sójového hydrolyzátu může médium v souhlase s vynálezem obsahovat o sobě známým způsobem také syntetická média, jako např. DMEM / HAM's F12, Medium 199 nebo RPMI, která jsou z literatury dostatečně známa.

Nad to navíc obsahuje médium podle vynálezu výhodně také aminokyseliny, nejlépe takové, které jsou zvoleny ze skupiny, jež obsahuje L-asparagin, L-cystein, L-cystin, L-prolin, L-tryptofan, L-glutamin nebo jejich směsi.

Následující kyseliny jsou podle vynálezu k médiu výhodně i přidávány: L-asparagin (v množství 0,001 až 1 g/1 média, výhodně 0,1 až 0,05 g/1 a zejména 0,015 až 0,03 g/1); L-cystein (0,001 až 1 g/1, výhodně 0,005 až 0,05 g/1 a zejména 0,01 až 0,03 g/1); L-cystin (0,001 až 1 g/1, výhodně 0,01 až 0,05 g/1 a zejména 0,015 až 0,03 g/1); L-prolin (0,001 až 1,5 g/1, výhodně 0,01 až 0,07 g/1 a zejména 0,02 až 0,05 g/1); L-tryptofan (0,001 až 1 g/1, výhodně 0,01 až 0,05 g/1 a zejména 0,015 až 0,03 g/1); L-glutamin (0,05 až 1 g/1, výhodně 0,1 až 1 g/1).

Výše uvedené aminokyseliny mohou být podle vynálezu přidávány k médiu buď individuálně, nebo v kombinaci. Kombinovaná adice směsi aminokyselin, která obsahuje všechny shora zmíněné aminokyseliny je zvláště preferována.

Séra prosté a proteinu prosté médium se používá při speciální formě provedení, při níž toto médium dodatečně obsahuje kombinaci shora zmíněné směsi aminokyselin a rafinovaný, ultrafiltrovaný sójový pepton.

Bylo například překvapivě zjištěno, že kvůli inaktivaci virů nebo jiných patogenů může být médium bez negativních vlivů zahříváno přibližně 5 až 20 min, výhodně 15 min na 70 až 95 °C a zejména 85 až 95 °C.

Podle vynálezu lze používat v kombinaci se sójovým hydrolyzátem každé známé syntetické médium. Běžná syntetická média mohou obsahovat anorganické soli, aminokyseliny, vitaminy, sacharidové zdroje a vodu. Použito může být například médium DMEM / HAM's F12. Koncentrace sójového extraktu v médiu může být vhodně mezi 0,1 a 100 g/1, zejména pak 1 a 5 g/1. V souhlase se zvlášť preferovanou formou provedení může být použit sójový pepton, který byl z hlediska své molekulové hmotnosti standardizován. Vhodná molekulová hmotnost sójového peptonuje méně než 50 kD, lépe méně než 10 kD a nejlépe méně než 1 kD.

Přidávání ultrafiltrovaného sójového peptonu se ukázalo jako zvláště výhodné pro produktivitu řad rekombinantních buněk, přičemž průměrná molekulová hmotnost sójového peptonu je 350 daltonů (Quest Company). To je sójový izolát s celkovým obsahem dusíku kolem 9,5 % a obsahem volných aminokyselin kolem 13 %.

Dává se přednost zejména používání ultrafialového sójového peptonu s molekulovou hmotností < 1.000 daltonů, výhodně < 500 daltonů a zejména < 350 daltonů.

Podle vynálezu obsahuje médium vhodně také pomocné látky, jako např. pufrovací substance, stabilizátory oxidace, stabilizátory působení proti mechanickému tlaku nebo inhibitory proteázy.

Užívá se zejména médium s následujícím složením: minimální syntetické médium (1 až 25 g/1), sójový pepton (0,5 až 50 g/1), L-glutamin (0,5 až 1 g/1), NaHCO₃ (0,1 až 10 g/1), kyselina askorbová (0,0005 až 0,05 g/1), ethanolamin (0,0005 až 0,05 g/1) a seleničitan sodný (1 až 15 pg/l).

Pokud je zapotřebí, může být podle vynálezu k médiu přidáván jako odpěňovací činidlo neiontový tenzid jako např. polypropylenglykol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 nebo PLURONIC F-108).

-4CZ 305307 B6

Toto činidlo se používá obvykle, aby chránilo buňky před negativními účinky aerace, protože bez přidání tenzidu stoupající a praskající vzduchové bubliny mohou vést k poškození těch buněk, které jsou umístěny na povrchu těchto vzduchových bublin („vystřelování“) [Murhammer a Goochee, Biotechnol. Prog., 6, 142-148 (1990)].

Množství neiontového tenzidu může být takto mezi 0,05 a 10 g/1, nicméně se však dává přednost zejména nejmenšímu možnému množství mezi 0,1 a 5 g/1.

Mimoto může médium podle vynálezu obsahovat také cyklodextrin nebo jeho deriváty.

Séra prosté a proteinu prosté médium obsahuje výhodně inhibitor proteasy, který je vhodný pro tkáňovou kulturu aje syntetického nebo rostlinného původu.

V souhlase s vynálezem jsou jako buňky pro kultivaci v médiu výhodně používány buňky, které již byly adaptovány, tj. buňky, které již byly adaptovány pro růst v proteinu prosté a séra prostém médiu. Bylo zjištěno, že s takovými předem adaptovanými buňkami mohou být dosahovány nejen vyšší výtěžky, ale i jejich stálost vůči kultivaci v séra prostém a proteinu prostém médiu je při použití média podle vynálezu zřetelně zlepšena.

Avšak bylo dokázáno, že v souhlase s vynálezem jsou zvláště cenné rekombinantní buněčné klony, protože ty jsou v séra prostých a proteinu prostých médiích stálé od počátku až do nejméně 40 generací, výhodně až nejméně 50 generací a exprimují rekombinantní produkty.

Takové buněčné klony se dají získat z buněčné kultury, která se obdrží po kultivaci rekombinantního originálního buněčného klonu v sérum obsahujícím médiu a readaptací buněk na séra prosté a proteinu prosté médium.

Výrazu „originální buněčný klon“ je možné rozumět tak, že znamená transfektant rekombinantního buněčného klonu, který po transfekci hostitelských buněk rekombinantní nukleotidovou sekvencí, exprimuje za laboratorních podmínek stabilním způsobem rekombinantní produkt. Aby se optimalizoval jeho růst, množství se originální klon v médiu obsahujícím sérum. Pro zvýšení jeho produktivity se originální klon množí, popřípadě v přítomnosti selekčního činidla, se selekcí na selekční markér a/nebo amplifikační markér. Pro průmyslovou produkci ve velkém měřítku se originální buněčný klon množí se sérum obsahujících podmínek kultivace do vysoké hustoty buněk a potom je právě před produkční fází readaptován na séra prosté nebo proteinu prosté médium. V tomto případě probíhá kultivace výhodně bez selekčního tlaku.

Kultivace rekombinantního originálního buněčného klonu může probíhat od začátku v séra prostém a proteinu prostém médiu a výsledkem potom je, že readaptace dále již není nutná. Pokud se požaduje, může i v tomto případě být použito selekční činidlo a selekce proběhne na selekčním markéru a/nebo amplifíkačním markéru. Postup je popsán například v EP 0 711 385.

Buněčná kultura, která se získá po readaptací na séra prosté a proteinu prosté médium, se testuje na ty klony buněk buněčné populace, které dávají produkty za séra prostých a proteinu prostých podmínek stabilním způsobem, popřípadě v absenci selekčního tlaku. Může to probíhat například pomocí imunofluorescence se značkovanými specifickými protilátkami, které jsou zaměřeny na rekombinantní polypeptid nebo protein. Buňky, které jsou identifikovány jako producenti produktu, se izolují z buněčné kultury a jsou znovu namnoženy ze séra prostých a proteinu prostých podmínek, které jsou výhodně ekvivalentní podmínkám produkce. Izolace buněk může takto proběhnout oddělením buněk ajejich testováním na producenty produktu.

Buněčná kultura, obsahující stabilní buňky, může být znovu testována na stabilní rekombinantní klony a ty jsou z buněčné kultury izolovány a subklonovány. Stabilní rekombinantní buněčné klony, které se získaly za séra prostých a proteinu prostých podmínek, mohou být pak za séra prostých a proteinu prostých podmínek dále množeny.

-5 CZ 305307 B6

Rekombinantní buněčné klony nebo buněčné populace, které byly touto cestou v souhlase s vynálezem připraveny, vynikají zejména tím význačným rysem, že jsou stálé nejméně po 40 generací, výhodně nejméně 50 generací a zejména pak více než 60 generací a exprimují rekombinantní produkt.

Příklad takového rekombinantního stabilního buněčného klonu nebo buněčné populace byl v souhlase s Budapešťskou konvencí registrován pod číslem 98012206 u ECACC (UK).

Buněčná kultura, která má být podle vynálezu kultivována, pochází přednostně z rekombinantních buněk savců. Rekombinantními savčími buňkami mohou takto být všechny ty buňky, jež obsahují sekvence, které kódují rekombinantní polypeptid nebo protein. Z tohoto hlediska jsou zahrnovány všechny kontinuálně rostoucí buňky, které rostou adherentně nebo neadherentně. Preferovány jsou zejména rekombinantní CHO buňky nebo BHK buňky. Rekombinantními polypeptidy nebo proteiny mohou být krevní faktory, růstové faktory nebo jiné biomedicínsky relevantní produkty.

Podle předkládaného vynálezu jsou preferovány buněčné klony, které obsahují kódující sekvenci pro rekombinantní krevní faktor jako Faktor II, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein S, protein C, aktivovanou formu některého z těchto Faktorů nebo vWF a jsou schopny tyto exprimovat po několik generací stabilním způsobem. Z tohoto hlediska jsou speciálně preferovány rekombinantní CHO buňky, které exprimují vWF nebo polypeptid s vWF aktivitou, Faktor VIII nebo polypeptid s VIII aktivitou, vWF a Faktor VIII, Faktor IX nebo Faktor II.

K nastartování hlavní buněčné banky je zapotřebí 30 generací. Nejméně kolem 40 generací je třeba, aby se uskutečnila průměrná várka kultury v 1000 1 měřítku. Při startu z individuálního klonu je s médiem podle vynálezu možné připravit „hlavní buněčnou banku“ (MCB) a „pracovní buněčnou banku“ (WCB) s přibližně 8-10 generacemi a odtud buněčnou kulturu až do 20 až 25 generací za proteinu prostých a séra prostých podmínek v produkčním měřítku (produkční biomasa), zatímco v porovnání s předchozími buněčnými klony a médii se některé generace stávají po růstu v séra prostém a proteinu prostém médiu nestálé a výsledkem je, že a) není možná jednotná buněčná kultura s producenty produktu a b) není možná stabilní produktivita produktu v dosti dlouhém časovém úseku.

Avšak ve shodě s vynálezem bylo naproti tomu dokonce možné zjistit zvýšenou produktivitu produktu i ve srovnání s originálním buněčným klonem, který byl kultivován v sérum obsahujícím médiu.

V souladu s dalším aspektem se vynález také vztahuje na způsob kultivace buněk, zejména savčích buněk, který spočívá v tom, že tyto buňky jsou zavedeny do média podle vynálezu a pak jsou v tomto médiu kultivovány.

Vynález se tudíž také týká použití média podle vynálezu pro kultivaci rekombinantních buněk, výhodně eukaryotických buněk a zejména buněk savců.

Předmětem předkládaného vynálezu je tudíž také buněčná kultura, která obsahuje médium podle vynálezu a buňky, výhodně eukaryotické buňky a zejména savčí buňky.

Vynález bude podrobněji objasněn níže následujícími příklady stejně jako obrázky na výkresech, ale není tímto omezován.

-6CZ 305307 B6

Objasnění výkresů

Obr. 1 ukazuje výsledky kultivace buněčného klonu rFVIII-CHO v průtočném bioreaktoru:

a) aktivita faktoru VIII (milijednotky / ml) a rychlost průtoku (1-5 / den) po dobu 42 dní;

b) volumetrická produktivita (jednotky Faktoru VIII /1 / den) v průtočném bioreaktoru.

Obr. 2 ukazuje srovnání produktivity Faktoru VIII (milijednotky / ml) při použití postupu po dávkách v různých médiích pro případ kultivace CHO buněk, které exprimují rFaktor VIII. Mix 1 tvoří séra prosté a proteinu prosté médium bez sójového hydrolyzátu, obsahující ale směs aminokyselin jak se uvádí v tabulce 4; Mix 2 tvoří séra prosté a proteinu prosté médium se sójovým hydrolyzátem; Mix 3 tvoří séra prosté a proteinu prosté médium obsahující sójový hydrolyzát a směs aminokyselin, jak se uvádí v tabulce 4, a Mix 4 tvoří séra prosté a proteinu prosté médium obsahující 2,5 g / 1 rafinovaného, ultrafiltrovaného sójového hydrolyzátu a směs aminokyselin, jak se uvádí v tabulce 4. Pro rafinaci ultrafiltrovaného sójového hydrolyzátu byla použita kolona se Sephadexem®.

Obr. 3 ukazuje produktivitu Faktoru VIII (jednotky / 1) v případě kontinuálního pěstování CHO buněk, které exprimují rFaktor VIII v séra prostém a proteinu prostém médiu po počátku přidávání rafinovaného, ultrafiltrovaného sójového peptonu, jmenovitě šestého dne kultivace a

Obr. 4 ukazuje BHK buňky exprimující rekombinantní Faktor II, které byly množeny v proteinu prostém a séra prostém médiu obsahujícím sójový hydrolyzát.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Stabilita rvWF-CHO buněk po výměně ze sérum obsahujícího média do séra prostého a proteinu prostého média

CHO-dhfr buňky byly ko-transfektovány plazmidem phAct-rwWF a pSV-dhfr a vWFexprimující klony byly subklonovány jak popisuje Fischer a spol. [FEBS Letters 351. 345-348 (1994). Ze subklonů byla startována pracovní buněčná banka (WCB), která stabilním způsobem exprimuje rvWF za sérum obsahujících podmínek, ale za nepřítomnosti MTX a buňky byly imobilizovány na mikroporézním nosiči (Cytopore®) za sérum obsahujících podmínek. Přehození buněk do séra prostého a proteinu prostého média se uskutečnilo potom, až bylo na matrici dosaženo buněčné hustoty 2 x 10⁷ buněk / ml. Buňky byly dále za séra prostých a proteinu prostých podmínek kultivovány po několik generací. Buňky byly v séra prostém a proteinu prostém médiu v různých časových intervalech testovány pomocí imunofluorescence značkovanými anti-vWF protilátkami. Zhodnocení stability buněk se uskutečnilo použitím pracovní buněčné banky před přehozením média po 10 generacích a po 60 generacích do séra prostého a proteinu prostého média. Zatímco pracovní buněčná banka stále exprimovala 100 % rvWF producentů, podíl rvWF producentů pokles přibližně na 50 % po 10 generacích v séra prostém a proteinu prostém médiu. Po 60 generacích bylo více než 95 % buněk identifikováno jako neproduktivních.

-7CZ 305307 B6

Příklad 2

Klonování stabilních rekombinantních CHO klonů

Byly připraveny série ředění z buněčné kultury obsahující rvWF-CHO buňky podle příkladu 1 [tento stabilní buněčný klon, který byl označen r-vWF-CHO byl podle Budapešťské konvence 22. ledna 1998 zaregistrován u ECACC (European Collection of Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK a získal depoziční číslo 98012206], a ty byly kultivovány po 60 generací v séra prostém a proteinu prostém médiu a 0,1 buněk bylo vysazeno do každé jamky na mikrotitrační desce. Buňky byly přibližně 3 týdny kultivovány v DMEM / HAM's F12, bez přidání séra nebo proteinu a bez nátlaku na selekci a buňky byly testovány pomocí imunofluorescence značkovanými anti-vWF protilátkami. Buněčný klon, který byl shledán jako pozitivní, byl použit jako startovací klon pro přípravu semenné buněčné banky. Hlavní buněčná banka (MCB) byla počata ze semenné buněčné banky v séra prostém a proteinu prostém médiu, jednotlivé ampule byly dány stranou a zmrazený pro další preparaci pracovní buněčné banky. Pracovní buněčná banka byla připravena v séra prostém a proteinu prostém médiu z jednotlivé ampule. Buňky byly imobilizovány na porézních mikronosičích a po několik generací dále kultivovány za séra prostých a proteinu prostých podmínek. Buňky byly v séra prostém a proteinu prostém médiu v různých časových intervalech testovány pomocí imunofluorescence se značkovanými anti-vWF protilátkami. Zhodnocení stability buněk se uskutečnilo ve stádiu pracovní buněčné banky a po 10 a 60 generacích v séra prostém a proteinu prostém médiu. Kolem 100 % buněk bylo identifikováno jako pozitivní stabilní klony, které exprimují rvWF ve stadiu pracovní buněčné banky po 10 generacích a 60 generacích.

Příklad 3

Specifická produktivita buněk rekombinantních buněčných klonů

Definovaný počet buněk byl během kultivace rekombinantních buněk v definovaných stadiích odebrán a tyto buňky byly 24 hodin inkubovány v čerstvém médiu. V kapalinách supematantu z buněčných kultur byla stanovena rvWF: Risto-CoF-aktivita. Tabulka 1 ukazuje, že v případě klonů stabilních rekombinantních buněk podle vynálezu, specifická produktivita buněk byla v séru prostém a proteinu prostém médiu stabilní i po 60 generacích a dokonce vzrostla ve srovnání s původním klonem, který byl kultivován v médiu obsahujícím sérum.

Tabulka 1

Buněčný klon	Specifická buněčná produktivita pracovních buněk v milijednotkách rvWF/10⁶ buněk/ /den	Specifická buněčná produktivita po 10 generacích v milijednotkách rvWF/10⁶ buněk/ /den	Specifická buněčná produktivita po 60 generacích v milijednotkách rvWF/10⁶buněk/ /den
rvWF-CHO č 808.68 originální buněčný kion	55	30	< 10
r-vWF-CHO F7‘) stabilní klon	62	65	60

*) zaregistrován 22. ledna 1998 [ECACC (European Collection of Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK; depoziční číslo 98012206]

-8CZ 305307 B6

Příklad 4

Složení syntetického séra prostého a proteinu prostého média

Tabulka 2

Komponenta	g/i	Preferované množství (podle našich znalostí v době patentové přihlášky) v g /1
Minimální syntetické medium (DMEM / HAM's F12)	1 -100	11,00-12,00
Sojový pepton	0,5 - 50	2,5
L-Glutamin	0,05 -1	0,36
Kyselina askorbová	0,0005 - 0,05	0,0035
NaHCO₃	0,1 -10	2,00
Ethanolamin	0,0005 -0,05	0,0015
Seleničitan sodný	1 - 15pg/l	8,6 μg 11
Případně: Synperonic F68	0,1 -10	0,25

Příklad 5

Kultivace rFVIII-CHO buněk v proteinu prostém a séra prostém médiu

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována v 10 1, míchaném průtočném tanku. V tomto případě bylo použito médium podle příkladu 4. Buňky byly při tom imobilizovány na porézním mikronosiči (Cytopore®, Pharmacia) a potom kultivovány nejméně 6 týdnů.

Rychlost průtoku byla 4 změny objemu za den; pH bylo 6,9 až 7,2; koncentrace O₂ byla kolem 20 až 50 % a teplota byla 37 °C.

Obrázek 1 ukazuje výsledky kultivace klonu rFVIII-CHO buněk v 10 1 průtočném bioreaktoru.

a) Aktivita Faktoru VIII (milijednotky / 1) a rychlost průtoku (1 až 5 / den) během periody 42 dnů.

-9CZ 305307 B6

Tabulka 3

Dny kultivace	Specifická produktivita buněk (milijednotky / 10^G buněk / den)	Imunofluorescence (% FVIII pozitivních buněk)
15	702	neanalyzováno
21 ,	1125	neanalyzováno
28	951	> 95%
35	691	> 95%
42	970	neanalyzováno

Tabulka 3 ukazuje stabilitu a specifickou produktivitu rFVIII-exprimujících buněk. K získání těchto výsledků byly odebrány vzorky po 15, 21, 28, 35 a 42 dnech, potom byly centrifugovány při 300 g a znovu suspendovány v čerstvém séra prostém a proteinu prostém médiu. Koncentrace Faktoru VIII v kapalinách supematantu buněčných kultur a počet buněk byl stanovován po dalších 24 hodinách. Z těchto dat byla vypočítána specifická produktivita FVIII.

Byla dosažena stabilní průměrná produktivita 888 milijednotek / 10⁶ buněk / den. Tato stabilní produktivita byla potvrzena také imunofluorescencí se značkovanými anti-FVIII protilátkami po 15, 21, 28, 35 a 42 dnech v séra prostém a proteinu prostém médiu.

Příklad 6

Srovnání produktivity rekombinantních FVIII-CHO buněk v séra prostém a proteinu prostém médiu obsahujícím další složky média

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována po jednotlivých vsádkách. V tomto případě se použilo médium podle příkladu 4 a k němu byly přidávány následující aminokyseliny:

Tabulka 4

Aminokyselina	mg/l	Preferované množství v mg /1 (podle našich znalostí v době patentové přihlášky)
L-Asparagin	1 -100	20
L-Cystein . HCI . H₂O	1 -100	15
L-Cystin	1 -100	20
L-Prolin	1 - 150	35
L-Glutamin	50-1000	240

Buňky byly množeny při 37 °C a pH 6,9 - 7,2. Buňky byly množeny postupem po dávkách během doby 24 až 72 h.

Produktivita rekombinantních FVIII-CHO buněk byla stanovována v následujících směsích média:

Mix 1: tvoří séra prosté a proteinu prosté médium bez sójového peptonu a obsahuje dodatečně směs aminokyselin podle tabulky 4 uvedené shora.

- 10CZ 305307 B6

Mix 2: tvoří séra prosté a proteinu prosté médium obsahující sójový pepton.

Mix 3: tvoří séra prosté a proteinu prosté médium obsahující sójový pepton a dodatečně obsahuje směs aminokyselin podle tabulky 4 uvedené shora.

Mix 4: tvoří séra prosté a proteinu prosté médium a dodatečně obsahuje směs aminokyselin podle tabulky 4 uvedené shora a 2,5 g / 1 rafinovaného, ultrafiltrovaného sójového peptonu. Rafinace ultrafiltrovaného sójového peptonu byla provedena chromatografický na Sephadex® koloně.

Příklad 7

Kultivace rekombinantních FVII1-CHO buněk v proteinu prostém a séra prostém médiu metodou chemostat kultury

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována vmíchaném, 10 1 tanku bioreaktoru. Jako médium bylo v tomto případě použito médium podle příkladu 4, bez sójového peptonu, obsahující směs aminokyselin podle příkladu 6. Buňky byly množeny při 37 °C a pH 6,9 - 7, 2; koncentrace kyslíku byla 20 až 50 % nasycení vzduchu. Pro stanovení titru Faktoru VIII a koncentrace buněk v kapalině supematantu kultury, byly odebírány vzorky každých 24 hodin. Celková koncentrace buněk byla od druhého dne do čtrnáctého dne konstantní. Počátkem šestého dne byl do média přidán ultrafiltrovaný sójový pepton. Produktivita Faktoru VIII je ilustrována obr. 3; měření byla prováděna systémem CHROMOGENIX CoA FVIII : C / 4. Imunofluorescence byla provedena značkovanými anti-FVIII protilátkami. Z dat lze vidět, že ke zřetelnému vzrůstu produktivity Faktoru VIII a tedy i vzrůstu volumetrické produktivity systému bioreaktoru, došlo jako následek přidání sójového peptonu, při čemž to ke zřetelnému zvýšení růstu buněk nevedlo. Nepřítomnost sójového peptonu v kontinuální kultuře vede po málo dnech k poklesu produktivity Faktoru VIII, zatímco přidání sójového peptonu má za následek téměř desetinásobný vzrůst produktivity. Nicméně vzhledem k tomu, že toto přidání počet buněk nezvyšuje, je tak doloženo, že ultrafiltrovaný sójový pepton má za následek zřetelný vzrůst produktivity, který je na růstu buněk nezávislý.

Příklad 8

Srovnání rychlosti růstu a produktivity rekombinantních FVIII-CHO buněk v proteinu prostém a séra prostém médiu obsahujícím různé hydrolyzáty

Buněčná kultura obsahující rFVIII-CHO buňky byla kultivována po jednotlivých vsádkách. V tomto případě se použilo séra prosté a proteinu prosté médium, jak je popisováno v příkladu 4, a k němu byly přidávány různé hydrolyzáty (ze sóji, kvasnic, rýže a pšenice). Jako kontrola bylo použito séra prosté a proteinu prosté médium, ke kterému nebyl přidán žádný hydrolyzát.

Počáteční hustota buněk byla 0,6 x 10⁶, respektive 0,4 x 10⁶. Buňky byly kultivovány po jednotlivých vsádkách při 37 °C a pH 6,9 až 7,2.

Tabulka 5 uvádí výsledky kultivačních experimentů s rFVIII-CHO buňkami v séra prostém a proteinu prostém médiu, ke kterému byl přidán sójový hydrolyzát (ultrafiltrovaný) a kvasnicový hydrolyzát. Počáteční hustota buněk byla 0,6 x 10⁶. Jako kontrola bylo použito séra prosté a proteinu prosté médium bez hydrolyzátu.

- 11 CZ 305307 B6

Tabulka 5

Hydrolyzát	Konečná hustota buněk (x 10⁶/ml,	Titr FVIII (milijednotky / ml)	Srážecí aktivita FVIII (milijednotky / ml)
Sója	3,6	485	508
Kvasnice	3,3	226	230

Tabulka 6 uvádí výsledky kultivačních experimentů s rFVIII-CHO buňkami v séra prostém a proteinu prostém médiu, ke kterému byl přidán sójový hydrolyzát (ultrafiltrovaný), rýžový hydrolyzát a pšeničný hydrolyzát. Počáteční hustota buněk byla 0,6 x 10⁶. Jako kontrola bylo použito séra prosté a proteinu prosté médium bez přidávání hydrolyzátu.

Tabulka 6

Hydrolyzát	Konečná hustota buněk (x10⁶/ml)	Titr FVIII (milijednotky / ml)	vWF - antigen (pg / ml)
Sója	3,7	1142	6,7
Rýže	3,0	479	3,2
Pšenice	3,4	522	3,9
Kontrola	3,0	406	3,1

Tabulka 7 uvádí výsledky kultivačních experimentů s rFVIII-CHO buňkami v séra prostém a proteinu prostém médiu, ke kterému byl přidán sójový hydrolyzát (ultrafdtrovaný) a pšeničný hydrolyzát. Počáteční hustota buněk činila 0,4 x 10⁶.

Tabulka 7

Hydrolyzát	Konečná hustota buněk (x 10^G/ml)	Titr FVIII (milijednotky / ml)	FVIII - antigen (pg/ml)	vWF - antigen (pg / ml)
Sója	1,6	1427	166	17,2
Pšenice	1,0	1120	92	7,9

Příklad 9

Kultivace BHK buněk v proteinu prostém a séra prostém médiu obsahujícím sójový hydrolyzát

BHK-21 (ATCC CCF 10) buňky byly třikrát ko-transfektovány následujícími plazmidy pomocí CaPO₄ postupu: 25 pg plazmidu pSV-FII [Fischer B. a spol., J. Biol. Chem. 271, 23737 - 23742 (1996)], který obsahuje lidský Faktor II (protrombin)-cDNA za kontroly SV40 promotorem (SV40 promotor počátečního genu); 4 pg plazmidu pSV-DHFR plazmidu pro methotrexatovou resistenci a 1 pg plazmidu pUCSV-neo plazmidu [Schlokat U. a spol., Biotech. Appl. Biochem.

24, 257-267 (1996)], který zprostředkovává G418 / neomycinovou resistenci. Stabilní buněčné klony byly vybrány pomocí kultivace v prostředí, které obsahovalo 500 pg /1 G418, zvyšováním koncentrace methotrexatu postupným způsobem až na koncentraci 3 pM.

- 12CZ 305307 B6

Klony, které byly touto cestou získány, byly subklonovány a adaptovány na proteinu prosté a séra prosté médium. Kultivace byla prováděna za použití suspenzní kultivační techniky.

Výsledky lze vidět v tabulce 6; BHK buňky, které byly množeny v proteinu prostém a séra prostém médiu obsahujícím sójový hydrolyzát, projevily vysokou a stabilní rychlost produkce rekombinantního Faktoru II.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Bezbílkovinné a bezsérové médium pro kultivaci savčích buněk, vyznačující se tí m , že obsahuje více než 10 % hmotn. sójového hydrolyzátu, vztaženo na celkovou sušinu média, přičemž alespoň 40 % sójového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů.

2. Médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že médium obsahuje ultrafiltrovaný sójový hydrolyzát.

3. Médium podle nároku 2, vyznačující se tím, že médium obsahuje rafinovaný sójový hydrolyzát.

4. Médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že sójový hydrolyzát má obsah endotoxinu < 500 jednotek/g.

5. Médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň 50 % sójového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost <500 daltonů.

6. Médium podle nároku 5, vyznačující se tím, že alespoň 55 % sójového hydrolyzátu má molekulovou hmotnost < 500 daltonů.

7. Médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že médium obsahuje také aminokyselinu.

8. Médium podle nároku 7, vyznačující se tím, že aminokyselina je zvolena ze skupiny, kterou tvoří L-asparagin, L-cystein, L-cystin, L-prolin, L-tryptofan, L-glutamin nebo jejich směsi.

9. Médium podle nároku 1, vyznačující se tím, že médium obsahuje také pomocné substance zvolené ze skupiny, kterou tvoří pufrovací substance, stabilizátoiy oxidace, stabilizátory působení proti mechanickému tlaku nebo inhibitory proteázy.

10. Použití média podle nároku 1 pro kultivaci buněk savců.

11. Použití média podle nároku 1 pro kultivaci savčích buněk zvolených ze skupiny, kterou tvoří CHO buňky a BHK buňky.

12. Způsob kultivace buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení buněk do média podle nároku 1 a pěstování těchto buněk v tomto médiu.

- 13 CZ 305307 B6

13. Způsob produkce proteinu z buněčné kultury, vyznačující se t í m , že zahrnuje: zavedení buněk do média podle nároku 1, přičemž tyto buňky exprimují požadovaný protein;

pěstování těchto buněk v uvedeném médiu a exprimování uvedeného proteinu a tím produkování směsi uvedených buněk a uvedeného proteinu v médiu; rafmaci uvedeného proteinu z uvedené směsi.

14. Buněčná kultura, vyznačující se tím, že zahrnuje buňky savců a médium podle nároku 1.

15. Způsob produkce média pro buněčnou kulturu, vy z n a č u j í c í se t í m , že zahrnuje: získání sójového hydrolyzátu;

ultrafiltraci tohoto sójového hydrolyzátu při použití ultrafiltračního procesu;

rafmaci frakce tohoto sójového hydrolyzátu pomocí velikostně vylučovací chromatografie;

vybrání frakcí sójového hydrolyzátu tvořených sójovým hydrolyzátem majícím molekulovou hmotnost < 500 daltonů.