JPH03244391A - 組換え蛋白質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換えＤＮＡ技術より形質転換された大腸菌
を用いて、効率よく有用蛋白質を生産する方法に関する
。

〔従来の技術］ 組換えＤＮＡ技術を用いて大腸菌により真核生物由来の
有用蛋白質、例えば、各種インターフェロン、インター
ロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン、ヒト血
清アルブ逅ン等を直接発現法により大量に生産させたい
場合、それらの発現プラスくド自体の改良の他、生産菌
の培養方法の改良による高生産法が考えられる。特に、
目的としている有用蛋白質を医薬品として使用する時な
どは、大腸菌での遺伝子翻訳開始コドンに対応するアミ
ノ末端メチオニン残基の付加した有用蛋白質は抗原性の
もたらす可能性もあり、この観点からメチオニン残基は
可能な限り除去しておく必要があること、さらに蛋白質
の分離精製段階でのコストダウンを図るためにも、生産
菌培養段階で、大量かつアミノ末端メチオニン低含有の
目的蛋白質を生産でき得る技術を確立しておく必要があ
ると考えられる。

一般に、組換え大腸菌の培養方法については従来、ＬＢ
（酵母エキス０．５％、バタトトリプトン１．０％、　
　ＮａＣ１０，５％、グルコース０．２％、　ｐＨ６、
５〜７．５　”）培地やＭ９（０，６％ＮａＪＰＯｎ　
、　０．３％ＫＨｚＰＯａ、　０．０５％ＮａＣｊ！、
０．１％ＮＨ，Ｃｆ、　０．２％グルコース、　　０．
００１４７％ＣａＣ１ｚ　　・２　Ｈｚｏ、　０．０５
％Ｍｇ５Ｏ，・７　Ｈ，Ｏ）培地、さらにそれにカザミ
ノ酸、酵母エキス等を加えた半合成培地による培養が一
般に知られている。

しかしながら、これらの方法では取得目的の有用蛋白質
の生産性、及び生産蛋白質のアミノ末端メチオニン残基
除去の点で、まだ十分ではなく、さらなる培養条件の改
善が望まれていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、大腸菌を用いて有用蛋白質を生産するに際し
、培養方法による生産物の生産量向上と同時にアミノ末
端メチオニン残基の除去効率の向上化を目的とするもの
である。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的は、以下の本発明により達成される。

すなわち、本発明は有用蛋白質を発現生産するように組
換えＤＮＡ技術により工夫された発現プラスミドにより
形質転換された大腸菌を培養して、有用目的蛋白質を生
産するに際し、主要栄養源として、大豆加水分解物を添
加した培地で培養することを特徴とする有用蛋白質の生
産方法である。

本発明の有用蛋白質とは組換えＤＮＡ技術により生産で
きるものであれば、特に限定はなく、例えば、インター
ロイキン−２，ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦと略する
）、またα−９β−１Ｔ−インターフェロン等のリンホ
カイン類、族長ホルモン。

インシュリン、ソマトスタチン等のホルモン、ヒト血清
アルブミン等の血液関連蛋白質などが挙げられる。尚、
ヒトＢＣ叶はヒトインターロイキン６（ＩＬ−６）とも
Ｂ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）とも呼ばれるが、ここで
は従来より用いられているヒトＢＣ叶という名称を用い
る。

本発明の発現プラスミドは、基本的には、有用蛋白質が
大腸菌体内で生産されるよう該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ断片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に
組み込まれているプラスミドであり、さらには構造遺伝
子の下流にター旦ネーターが導入されていてもよい。こ
のプラスミドは公知の方法（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、
Ｄ、ｖ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅｒｃｈ、８．４０５７（１９８０））により作
成することができる。

該発現プラスミドにより、大腸菌を形質転換する方法と
しては、公知の方法（例えば、Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ。

＆　Ｍａｇａ、Ａ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、５３．
１５４（１９７０））にて行なうことができる。

宿主である大腸菌は特に種類は限定されないが、例えば
、Ｋ−１２系のＣ−６００，ＨＢＩ　０１．　ＪＭｌ　
０５　、　Ｗ３１１０等が挙げられる。

培地としてはグルコース、ラクトース、ソルビトール等
の炭素源、アンモニア、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム等の窒素源、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分
解物、及びペプトン等の有機栄養源、リン酸塩などの無
機塩、マグネシウム。

カリウム、その他微量金属等を適宜含有する産生培地が
使用できる。しかしながら、本発明者らは、種々の培地
を検討した結果、大豆加水分解物を上記Ｍ９培地（０，
６％ＮａｚＨＰＯ４，０，３％ＫＨ，ＰＯ，。

０．０５％Ｎａ（ｆ！、０．１％ＮＨ４Ｃｆ、　０．２
％グルコース、　　０．００１４７％ＣａＣｊ２ｚ　　
・２ＨｚＯ，０，０５％Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２０の組成よ
り構成される）に、カザ旦ノ酸の代わりに添加した培地
を用いることにより、有用蛋白質の生産性、及びそのア
ミノ末端に付加しているメチオニン残基の除去率が向上
する事を見いだした。大豆加水分解物とは例えば、総合
アミノ酸（味の素株式会社製、大豆の塩酸加水分解物）
、味液、バタトソイトン（ＤＩＦＣＯ製）等である。大
豆加水分解物の添加濃度は、基本とする培地組成、培養
条件、により多少異なるが、通常培地あたり１％から１
０（重量）％、特に２％から４（重量）％が好ましい。

培養温度は２０°Ｃから４５°Ｃ１好ましくは３６°Ｃ
から３９°Ｃであり、培養中の培地のｐＨは５から９、
好ましくは６から７である。培養期間は通常約６時間か
ら約２日である。

〔発明の効果〕

有用蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた発現
プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養し、有用
組換え蛋白質を製造する方法に於て、当該大腸菌を大豆
加水分解物を添加した培地で培養することを特徴とする
、Ｎ末端に翻訳開始コドンＡＴＧに対応するメチオニン
残基が効率よく除去された有用蛋白質の増収法を提供す
るものであり、本発明による培養方法は、有用蛋白質の
生産性を向上させると同時に、目的蛋白質のアミノ末端
に付加しているメチオニン残基の除去効率も向上させる
ことができる。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が、これにより本発明の有用性が限定されるものではな
い。

〔実施例］ 実施例１ ヒトＢｃ叶発現プラスミドを保持する大腸菌ＨＢ１０１
　／ｐＢＳＦ２−５Ｄ７を３Ｌ、容ミニジャーを用いて
、従来のカザミノ酸を主要栄養源とした培地と大豆加水
分解物である総合アミノ酸（味の素株式会社製）を主要
栄養源とした培地で比較培養した。なお、プラスミドｐ
ＢｓＦ　２−５Ｄ　７はプラスミドｐＵｃ１９（Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａ
ｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｊ、：Ｇｅｎｅ　３３（１９８５００３−１１９に記載
）上のＥＣＯＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ　クローニング部位
に、ＥＣ０ＲＩ側より、ｔｒｐブｔ）モーター、ｔｒｐ
ＬのＳＤ配列、合成ＳＤ配列、ヒ）ＢＣ叶合台底伝子、
ｔｒｐＡターもネーターが組み込まれた構造をしている
。（第１図）本プラスミドを大腸菌８８１０１株へ形質
転換する事により、ヒトＢＣＤＦ生産菌を得た。大腸菌
ＨＢ　１０１　／ｐＢＳＦ　２−５Ｄ７　（ＡＪ−１２
４４８）はＦＥＲＭ　Ｐ−１０７５８として、既に寄託
されている。　（特願平１−１８９２７０に記載）Ｍ９
カザミノ酸培地組成は、カザミノ酸１．０　ｇ／ｄ１．
酵母エキス０．２ｇ／ｄｆｆｉ、塩化アンモニウム０．
５ｇ／ｄｆ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／ｄ
ｆ、塩化カルシウム三水和物０．００５　ｇ／　ｃＲｌ
、　　Ｌ−ロイシン４０ｍｇ／ｄｆ、Ｌ−プロリン４０
ｍｇ／ｄ　ｆ　。

ビタミンＢＩ　　０．４＋ｗｇ／ｄｆ、グルコース２．
０ｇ／ｄＩ２゜リン酸−カリ０．１ｇ／ｄｉ！、、であ
り、一方、Ｍ９総合アミノ酸培地組成は、上記組成のう
ちカザミノ酸、ロイシン、プロリンの代わりに総合アミ
ノ酸（味の素株式会社製）を用いた組成の培地となって
いる。また培養時には両培地に抗生物質であるアンピシ
リン１００Ｄｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン２５μｇ／
ｍ　ｆｌを添加した。

再生産培地３１．を５１．容ミニジャーに仕込み、Ｌブ
ロス（酵母エキス０．５％、バタトトリプトン１．０％
　Ｎａ（／！０．５％、グルコース０．２％。

ｐＨ６，５〜７．５）培地にて一晩培養した大腸菌）Ｉ
Ｂｌ　０１　／ｐＢＳＦ　２−３Ｄ　７　’（ＦＥＲＭ
　Ｐ−１０７５８）を１５０ｍ１ずつ各々のミニジャー
に加え、攪拌数７０Ｏｒｐｍ、通気量Ｑ、５　ｖｖｍ、
培養温度３７°Ｃ１制御ｐＨ６，７にて運転した。培養
開始後、３〜５時間で培養液の０Ｄ６６０　ｎｍが４〜
５に達したので、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であるイ
ンドールアクリル酸整、及びフィード培地加えた。フィ
ード培地としてはＭ９カザミノ酸培地培養には、カザミ
ノ酸１．０ｇ／ｄｆｆｉ、Ｌ−ｔ］イシン４０ｍｇ７ｄ
ｌ、Ｌ−プロリン４０ｍｇ／ｄ　ｌ　、　　ビタミン８
１　０．４　ｍｇ／ｄｉ　、　（ｐＨ６，７）の組成の
ちのを、そして総合アミノ酸培地培養には総合アミノ酸
１．０ｇ／ｄＩ２．ビタミンＢＩ　　０．４ｍｇ／ｄｆ
ｆ。

（ｐＨ６，７）の組成のものを用いた。

両培養は１６時間行なった。各々の培養経過図を第２図
に示す。また、菌体濃度は最終的に０Ｄ６６０ｒ＋＋＋
＋でＭ９−カザミノ酸培地では１６、Ｍ９−総合アミノ
酸培地では２１に達した。

次に、両端養液より菌体を遠心分離により集め、２０ｗ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、　　３０ｍＭ
　ＮａＣ１にて懸濁後、リゾチーム、ＥＤＴＡをそれぞ
れ終濃度０．２１１ｇ／ｌｌｌ、Ｏ，１Ｍとなるよう添
加し、０℃で１時間処理した。その後、超音波破砕機に
て菌体液を７０Ｗ、２０ａ＋ｉｎで破砕し、６０００ｒ
ｐａａ　、　　１０ｍ１ｎの低速遠心にてヒ）　ＢＣＤ
Ｆを含む菌体内封入体を回収した。その封入体を上記緩
衝液２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、　　
３０ＤＭ　ＮａＣ１で３回洗浄した後、１０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ６，０）にて懸濁し、ヒトＢＣ叶封人体懸濁
液を得た。

続いて、その封入体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　
（ｐ）１８．３）　、　　１０ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、６Ｍ
塩酸グアニジン溶液にて室温１時間で可溶化し、その可
溶化溶液を逆相ＨＰＬＣ（ＹＭＣＣ８カラム４．６％ｍ
ｍＸ　２５０　ｍｍ）にかけ、ヒ）ＢＣ叶画分を単離精
製した。

両培養で得られたヒ）ＢＣ叶の生産量はＵＶ２８０ｎ−
の吸収量により、算出した。またＮ末端ア稟ノ酸配列は
、上記サンプルをプロテインシークエンサー（ＡＢ１社
製４７０Ａ）にかけることにより検定した。結果を下記
の第１表に示した。

以上のように、大豆加水分解物である総合アミノ酸を主
要栄養源として用いることで、従来のＭ９−カザミノ酸
培地に比べ、ヒトＢＣＤＦの生産量は約２倍に、またア
ミノ末端のメチオニン除去率が８５％から９８％に向上
した。このように、総合アミノ酸培地による培養の結果
、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒ）ＢＣ
叶を大量に取得することができた。

第　　１　　表 実施例２ ヒトインターロイキン２発現プラスミドを保持する大腸
菌ＨＢ　１０１　／　ｐＴ１３ｓＮｃｏを３Ｌ、容ミニ
ジャーを用いて実施例１と同様に比較培養した。

ヒトインターロイキン２生産用のプラスミドｐＴ１３ｓ
Ｎｃｏ　（Ｔｏｎｏｕｃｈｉら、、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ
、１０４．３Ｏ−３４（１９８８）　）はｔｒｐプロモ
ーターの制御下にヒトインターロイキン２が発現するよ
うに設計された発現プラスミドであり、本プラスミドを
大腸菌８８１０１株に形質転換したヒトインターロイキ
ン２生産菌ＨＢ　１０１　／１）Ｔ１３ＳＮｃｏ　（Ａ
Ｊ　　１２４４７）ＦＥＲＭ　Ｐ　　１０７５７として
既に寄託されている。

培地組成、培養条件は、実施例１と同しである。

インターロイキン２の場合もＢＣ叶と同様に、大腸菌体
内にインターロイキン２の封入体が形成されていた。生
産量、Ｎ末端アミノ酸配列を実施例１と同様に検定した
結果、下記の第２表に示したようにインターロイキン２
の場合も、Ｍ９−カザミノ酸培地を用いた培養に比べ、
Ｍ９−総合アミノ酸培地による培養により、ヒトインタ
ーロイキン２の生産量は約１．５倍となり、Ｎ末端メチ
オニン除去率も５７％から９２％に向上した。このよう
に、アミノ末端メチオニンが効率よく除去できたヒトイ
ンターロイキン２を大量に取得することができた。尚、
第２表のヒトＩＬ−２はヒトインターロイキン２の略称
である。

第２表 第２図

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＢＣＤＦの生産プラスミドであるｐＢＳＦ
ニーＳＤ７の構造を示す。 第２図は総合アミノ酸培地を用いた時とカザミノ酸培地
の時の、ヒ）　ＢＣＤＦ生産菌の培養経過を示す。 培養時間（時間）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）有用蛋白質をコードするＤＮＡが組み込まれた発
   現プラスミドにより形質転換された大腸菌を培養して有
   用蛋白質を生産するに際し、大豆加水分解物を添加した
   培地で培養することを特徴とする組換え蛋白質の生産方
   法。
2. （２）大豆加水分解物が、培地あたり１％から１０（重
   量）％の濃度範囲で添加されることを特徴とする請求項
   （１）記載の生産方法。
3. （３）有用蛋白質がヒトＢ細胞分化因子である請求項（
   １）記載の生産方法。
4. （４）有用蛋白質がヒトインターロイキン２である請求
   項（１）記載の生産方法。