JPH05176789A - Ｎ−末端にメチオニンを含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非含有γ− インターフェロンの製造方法 - Google Patents
Ｎ−末端にメチオニンを含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非含有γ− インターフェロンの製造方法Info
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- JPH05176789A JPH05176789A JP707491A JP707491A JPH05176789A JP H05176789 A JPH05176789 A JP H05176789A JP 707491 A JP707491 A JP 707491A JP 707491 A JP707491 A JP 707491A JP H05176789 A JPH05176789 A JP H05176789A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ヒト・システイン非含有γ- インタ−フェロン
の合成遺伝子を有するプラスミド pＩＢＭを、Nr 845の
下に産業用微生物および培養細胞の寄託のための国立寄
託機関に登録された大腸菌ＬＥ 392株において発現さ
せ、次にそれを、発酵器内において通気条件下で36ない
し38℃の温度で培養し、その後、付随する溶媒および混
入物を除去して得られた産生物を精製し、変性し、およ
び溶出する。 【効果】この方法によると、免疫原性の要因となり得る
メチオニンをN-末端に含有しない、遺伝子組換えによる
ヒト・システイン非含有γ- インタ−フェロンが、高い
収量および高い純度で製造される。また製造されたγ-
インタ−フェロンは、変性およびカオトロピック物質を
含有しない生物学的に適合し得る水溶液に完全に溶解す
る。
の合成遺伝子を有するプラスミド pＩＢＭを、Nr 845の
下に産業用微生物および培養細胞の寄託のための国立寄
託機関に登録された大腸菌ＬＥ 392株において発現さ
せ、次にそれを、発酵器内において通気条件下で36ない
し38℃の温度で培養し、その後、付随する溶媒および混
入物を除去して得られた産生物を精製し、変性し、およ
び溶出する。 【効果】この方法によると、免疫原性の要因となり得る
メチオニンをN-末端に含有しない、遺伝子組換えによる
ヒト・システイン非含有γ- インタ−フェロンが、高い
収量および高い純度で製造される。また製造されたγ-
インタ−フェロンは、変性およびカオトロピック物質を
含有しない生物学的に適合し得る水溶液に完全に溶解す
る。
Description
【０００１】この発明は、医用実務に用いられる、N-末
端にメチオニンを含有しない、遺伝子組換えによるヒト
・システイン非含有γ- インタ−フェロンの製造方法に
関する。
端にメチオニンを含有しない、遺伝子組換えによるヒト
・システイン非含有γ- インタ−フェロンの製造方法に
関する。
【０００２】細菌細胞の発現による、遺伝子組換えによ
るヒト・システイン含有γ- インタ−フェロン（米国特
許 4,686,284号、11／1987、Nara等、 424／85；WO、85
／05637 （BIOGEN）、17ないし18頁および特許請求の範
囲；日本国特許281376／84、サントリ−株式会社）およ
びシステイン非含有γ- インタ−フェロン（日本国特許
281376／84、サントリ−株式会社；米国特許 4,714,611
号、12／1987、Yasaburgo 等、 424／85；T.Arakawa 、
N.K.Alton 、Y.R.Tsu （1985）、J.Biol.Chem.260、144
35 ）を製造するための方法が知られている。これらの
方法においては、遺伝子組換えによるインタ−フェロン
は、細菌合成における開始アミノ酸として残っている余
分なメチオニンをN-末端に有している。
るヒト・システイン含有γ- インタ−フェロン（米国特
許 4,686,284号、11／1987、Nara等、 424／85；WO、85
／05637 （BIOGEN）、17ないし18頁および特許請求の範
囲；日本国特許281376／84、サントリ−株式会社）およ
びシステイン非含有γ- インタ−フェロン（日本国特許
281376／84、サントリ−株式会社；米国特許 4,714,611
号、12／1987、Yasaburgo 等、 424／85；T.Arakawa 、
N.K.Alton 、Y.R.Tsu （1985）、J.Biol.Chem.260、144
35 ）を製造するための方法が知られている。これらの
方法においては、遺伝子組換えによるインタ−フェロン
は、細菌合成における開始アミノ酸として残っている余
分なメチオニンをN-末端に有している。
【０００３】細菌細胞の分泌型表現、およびα- アミラ
−ゼプロモ−タ−および分泌のシグナル配列の使用に基
づく、N-末端にメチオニンを含有しないシステイン非含
有γ- インタ−フェロンの製造方法（欧州特許公開0 19
0 686 A2 号、日本国特許 18991／85、緑十字社）も公
知である。これらの、遺伝子組換えによるヒト・システ
イン含有またはシステイン非含有γ- インタ−フェロン
の製造方法の不利な点は、それらが、N-末端に余分のメ
チオニンを有するタンパクを得る結果に帰着することに
ある。この余分のメチオニンの存在は、産生物を免疫原
性を有するものとし、治療薬としてのその長期の投与が
特異性抗体の形成に帰着する可能性があるため、望まし
くない。
−ゼプロモ−タ−および分泌のシグナル配列の使用に基
づく、N-末端にメチオニンを含有しないシステイン非含
有γ- インタ−フェロンの製造方法（欧州特許公開0 19
0 686 A2 号、日本国特許 18991／85、緑十字社）も公
知である。これらの、遺伝子組換えによるヒト・システ
イン含有またはシステイン非含有γ- インタ−フェロン
の製造方法の不利な点は、それらが、N-末端に余分のメ
チオニンを有するタンパクを得る結果に帰着することに
ある。この余分のメチオニンの存在は、産生物を免疫原
性を有するものとし、治療薬としてのその長期の投与が
特異性抗体の形成に帰着する可能性があるため、望まし
くない。
【０００４】欧州特許公開 0 190 686 A2 号および日本
国特許 18991／85（緑十字社）に記載の、N-末端にメチ
オニンを含有しない、遺伝子組換えによるシステイン非
含有γ- インタ−フェロンの製造方法の欠点は、メチオ
ニンの除去が、細菌のペリプラスム間隙における分泌に
よってなされることである。その輸送の間に、調製薬の
免疫原性の生成に帰着する可能性がある立体配座変性を
起こす危険性がある。他の欠点は、インタ−フェロンの
収量が排他的に低い（培養物 1リットル当り3000 000
Ｕ）ことである。
国特許 18991／85（緑十字社）に記載の、N-末端にメチ
オニンを含有しない、遺伝子組換えによるシステイン非
含有γ- インタ−フェロンの製造方法の欠点は、メチオ
ニンの除去が、細菌のペリプラスム間隙における分泌に
よってなされることである。その輸送の間に、調製薬の
免疫原性の生成に帰着する可能性がある立体配座変性を
起こす危険性がある。他の欠点は、インタ−フェロンの
収量が排他的に低い（培養物 1リットル当り3000 000
Ｕ）ことである。
【０００５】精製方法に関しては、公知の方法はγ- イ
ンタ−フェロンの免疫吸着（Y.Ishimori、T.kurokawa、
S.Honda 、N.Suzuki、M.Wakimasu、K.Tsukatomo（198
5）、J.Immunol.Methods 80、55）または他のクロマト
グラフィ−用吸着剤の使用（WO、85／05637 （BIOGE
N）、17ないし18頁および特許請求の範囲）に基づいて
いる。
ンタ−フェロンの免疫吸着（Y.Ishimori、T.kurokawa、
S.Honda 、N.Suzuki、M.Wakimasu、K.Tsukatomo（198
5）、J.Immunol.Methods 80、55）または他のクロマト
グラフィ−用吸着剤の使用（WO、85／05637 （BIOGE
N）、17ないし18頁および特許請求の範囲）に基づいて
いる。
【０００６】γ- インタ−フェロンの精製方法としての
免疫吸着の不利な点は、高価であり、かつ高い特異性を
有するモノクロ−ナル抗体を使用することにある。この
モノクロ−ナル抗体の調製には分離技術が必要であり、
融合細胞系から生じる形質転換因子および細菌による最
終生成物の汚染の危険性がある。その結果、生物学的活
性を減少させる、γ- インタ−フェロンの立体配座変性
（変質）が進行する可能性がある。
免疫吸着の不利な点は、高価であり、かつ高い特異性を
有するモノクロ−ナル抗体を使用することにある。この
モノクロ−ナル抗体の調製には分離技術が必要であり、
融合細胞系から生じる形質転換因子および細菌による最
終生成物の汚染の危険性がある。その結果、生物学的活
性を減少させる、γ- インタ−フェロンの立体配座変性
（変質）が進行する可能性がある。
【０００７】モノクロ−ナル抗体を用いることのないク
ロマトグラフィ−法（WO、85／05637 （BIOGEN）、17な
いし18頁および特許請求の範囲）の欠点は、この方法が
チオ−ル -セファロ−スに対するクロマトグラフィ−に
基づいており、システインを含有するγ- インタ−フェ
ロンにのみ適用可能であることである。
ロマトグラフィ−法（WO、85／05637 （BIOGEN）、17な
いし18頁および特許請求の範囲）の欠点は、この方法が
チオ−ル -セファロ−スに対するクロマトグラフィ−に
基づいており、システインを含有するγ- インタ−フェ
ロンにのみ適用可能であることである。
【０００８】他の多くの遺伝子組換えによるタンパクと
同様に、γ- インタ−フェロンは、変性剤もしくはカオ
トロピック剤を含有しない溶液中に於いて、容易に凝集
し得る。公知の方法（限外ろ過、ゲルろ過、透析）に従
って塩化グアニジンを除去すると、γ- インタ−フェロ
ンは凝集する。その結果、可溶性の生物学的に活性なγ
- インタ−フェロンの収量は、温度、タンパクの初期濃
度、溶媒の交換率、一価および二価イオンの存在、およ
び恐らく当分未知の他の因子の関数として変化し得る。
この全ては技術の標準化を妨げ、収量を減少させて、最
終生成物をより高価なものにする。
同様に、γ- インタ−フェロンは、変性剤もしくはカオ
トロピック剤を含有しない溶液中に於いて、容易に凝集
し得る。公知の方法（限外ろ過、ゲルろ過、透析）に従
って塩化グアニジンを除去すると、γ- インタ−フェロ
ンは凝集する。その結果、可溶性の生物学的に活性なγ
- インタ−フェロンの収量は、温度、タンパクの初期濃
度、溶媒の交換率、一価および二価イオンの存在、およ
び恐らく当分未知の他の因子の関数として変化し得る。
この全ては技術の標準化を妨げ、収量を減少させて、最
終生成物をより高価なものにする。
【０００９】この発明の目的は、N-末端にメチオニンを
含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非含
有γ- インタ−フェロンの製造方法を提供することにあ
る。この方法は、変性およびカオトロピック物質を含有
しない生物学的に適合し得る水溶液への産生物の完全な
溶解の他に、産生物の高い収量および高度の精製を保証
する。
含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非含
有γ- インタ−フェロンの製造方法を提供することにあ
る。この方法は、変性およびカオトロピック物質を含有
しない生物学的に適合し得る水溶液への産生物の完全な
溶解の他に、産生物の高い収量および高度の精製を保証
する。
【００１０】この目的は、大腸菌属微生物、特に、得ら
れた大腸菌株であってNr 845の下に産業用微生物および
培養細胞の寄託のための国立寄託機関（the National B
ankfor deposition of industrial microorganisms and
cell cultures ）に記録された大腸菌株においてγ-
インタ−フェロンの合成遺伝子を発現させること、およ
びそれにより得られた発現プラスミド pＩＢＭを含有す
る組換え株を、L-トリプトファンおよびL-メチオニンに
富み、窒素源としての細かく粉砕したペプトンおよび酵
母抽出物を含有する栄養培地中でテトラサイクリンの存
在下において培養することによる、N-末端にメチオニン
を含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非
含有γ- インタ−フェロンの製造方法によって達成され
る。発酵のパラメ−タ−は、それらが、グルコ−ス添加
処理の進行中において制御された指数増殖期の急速な出
現を保証するように選択される。処理の最後における通
気の中止は、細菌の細胞内空間に高濃度のインタ−フェ
ロンを有する封入体を形成する他に、N-末端のメチオニ
ンの除去を支持するものである。抽出の後、遺伝子組換
えによるヒト・システイン非含有γ- インタ−フェロン
を、溶媒および復元を除くために、さらにカルボキシメ
チルセファロ−スのカラムに対してクロマトグラフィ−
処理する。
れた大腸菌株であってNr 845の下に産業用微生物および
培養細胞の寄託のための国立寄託機関（the National B
ankfor deposition of industrial microorganisms and
cell cultures ）に記録された大腸菌株においてγ-
インタ−フェロンの合成遺伝子を発現させること、およ
びそれにより得られた発現プラスミド pＩＢＭを含有す
る組換え株を、L-トリプトファンおよびL-メチオニンに
富み、窒素源としての細かく粉砕したペプトンおよび酵
母抽出物を含有する栄養培地中でテトラサイクリンの存
在下において培養することによる、N-末端にメチオニン
を含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非
含有γ- インタ−フェロンの製造方法によって達成され
る。発酵のパラメ−タ−は、それらが、グルコ−ス添加
処理の進行中において制御された指数増殖期の急速な出
現を保証するように選択される。処理の最後における通
気の中止は、細菌の細胞内空間に高濃度のインタ−フェ
ロンを有する封入体を形成する他に、N-末端のメチオニ
ンの除去を支持するものである。抽出の後、遺伝子組換
えによるヒト・システイン非含有γ- インタ−フェロン
を、溶媒および復元を除くために、さらにカルボキシメ
チルセファロ−スのカラムに対してクロマトグラフィ−
処理する。
【００１１】塩化グアニジン中でインタ−フェロンを産
生した後には、γ- インタ−フェロンをイオン交換装置
に吸着させて保持する目的から塩化グアニジンの濃度は
0.35Ｍ未満であって 0.1Ｍ以上である必要がある。低濃
度の塩化グアニジンでは、インタ−フェロンは急速に凝
集する。良好な結果を得るために、γ- インタ−フェロ
ンを含有する抽出物を、塩化グアニジン濃度が 0.7ない
し 1.0Ｍに達するまで、pH 5.0ないし 8.5およびモル濃
度 0.005ないし 0.1Ｍの氷冷緩衝液で希釈する。カラム
にカルボキシメチルセファロ−スを充填する直前に、カ
ラムを通過させようとする塩化グアニジンの最終濃度
0.35 Ｍが得られるように、γ- インタ−フェロンと氷
冷緩衝液とを混合する。この塩化グアニジンは、カラム
をそれぞれの緩衝液で長時間洗浄することにより除去す
る。γ- インタ−フェロンは、それぞれの緩衝液におけ
る 0.1ないし 0.6Ｍの塩化ナトリウムの勾配によって溶
出する。
生した後には、γ- インタ−フェロンをイオン交換装置
に吸着させて保持する目的から塩化グアニジンの濃度は
0.35Ｍ未満であって 0.1Ｍ以上である必要がある。低濃
度の塩化グアニジンでは、インタ−フェロンは急速に凝
集する。良好な結果を得るために、γ- インタ−フェロ
ンを含有する抽出物を、塩化グアニジン濃度が 0.7ない
し 1.0Ｍに達するまで、pH 5.0ないし 8.5およびモル濃
度 0.005ないし 0.1Ｍの氷冷緩衝液で希釈する。カラム
にカルボキシメチルセファロ−スを充填する直前に、カ
ラムを通過させようとする塩化グアニジンの最終濃度
0.35 Ｍが得られるように、γ- インタ−フェロンと氷
冷緩衝液とを混合する。この塩化グアニジンは、カラム
をそれぞれの緩衝液で長時間洗浄することにより除去す
る。γ- インタ−フェロンは、それぞれの緩衝液におけ
る 0.1ないし 0.6Ｍの塩化ナトリウムの勾配によって溶
出する。
【００１２】産生物は、発熱因子を含有しない水で生理
学的塩化ナトリウム濃度に希釈し、安定化剤として用い
られるデキストラン（日本国特許281376／84、サントリ
−株式会社）の10％溶液と最終濃度 2％まで混合する。
学的塩化ナトリウム濃度に希釈し、安定化剤として用い
られるデキストラン（日本国特許281376／84、サントリ
−株式会社）の10％溶液と最終濃度 2％まで混合する。
【００１３】この発明による方法の利点は、N-末端のメ
チオニンが除去されているγ- インタ−フェロンを細胞
内に分泌によらずに産生すること、γ- インタ−フェロ
ンの収量が非常に高く培養物 1リットル当り1 000 000
000 Ｕをこえること、および調製された遺伝子組換えに
よるヒト・システインγ- インタ−フェロンの純度が9
9.6％をこえ、適切な安定化剤の存在下で凍結乾燥の後
もその生物学的活性を保持し、および変性剤もしくはカ
オトロピック剤を含有しない溶液に可溶であることであ
る。この技術は、遺伝子組換えによるタンパクの精製へ
のモノクロ−ナル抗体の適用を回避する。モノクロ−ナ
ル抗体は、調剤実務において広く適用されている安価な
クロマトグラフィ−技法用装置を使用することにより生
成物を汚染することがある。さらに、この技術は、再生
し、殺菌して複数回産業に利用することができるイオン
交換装置を使用する、自動化された大規模生産の可能性
を提供する。
チオニンが除去されているγ- インタ−フェロンを細胞
内に分泌によらずに産生すること、γ- インタ−フェロ
ンの収量が非常に高く培養物 1リットル当り1 000 000
000 Ｕをこえること、および調製された遺伝子組換えに
よるヒト・システインγ- インタ−フェロンの純度が9
9.6％をこえ、適切な安定化剤の存在下で凍結乾燥の後
もその生物学的活性を保持し、および変性剤もしくはカ
オトロピック剤を含有しない溶液に可溶であることであ
る。この技術は、遺伝子組換えによるタンパクの精製へ
のモノクロ−ナル抗体の適用を回避する。モノクロ−ナ
ル抗体は、調剤実務において広く適用されている安価な
クロマトグラフィ−技法用装置を使用することにより生
成物を汚染することがある。さらに、この技術は、再生
し、殺菌して複数回産業に利用することができるイオン
交換装置を使用する、自動化された大規模生産の可能性
を提供する。
【００１４】この発明は下記の典型的な態様によって説
明される。
明される。
【００１５】組換えプラスミド pＩＢＭの担体である産
生菌株（strain producer ）E.coliＬＥ 392を15％グリ
セリン培養体の形態で -70℃で保存した。純度および活
性を制御した後、種物質を、37℃で 7時間、振とうする
ことにより栄養培地中で培養した。この栄養培地は、発
酵培地と同じものであり、発酵器の作業容積の10％の容
量である。発酵は、撹拌装置を具備し、 4リットルの作
働容積を有する標準型細菌発酵器で、１リットル当り下
記組成を有する栄養培地において行なった。
生菌株（strain producer ）E.coliＬＥ 392を15％グリ
セリン培養体の形態で -70℃で保存した。純度および活
性を制御した後、種物質を、37℃で 7時間、振とうする
ことにより栄養培地中で培養した。この栄養培地は、発
酵培地と同じものであり、発酵器の作業容積の10％の容
量である。発酵は、撹拌装置を具備し、 4リットルの作
働容積を有する標準型細菌発酵器で、１リットル当り下
記組成を有する栄養培地において行なった。
【００１６】 ペプトン（細かく粉砕） ２５ｇ 酵母抽出物 ５ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ６ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ３ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ３ｇ ＭｇＳＯ4 （1 Ｍ） ２ｍｌ ＣａＣｌ2 （100 mM） １００ｍｌ 20％グルコ−ス ５０ｍｌ Ｌ- トリプトファン（20 mKg／ml） ５ｍｌ Ｌ- メチオニン （20 mKg／ml） ５ｍｌ テトラサイクリン （10 mKg／ml） １．２ｍｌ 発酵は、初期 pH 7.1 ないし 7.2、および通気の初期容
積 0.5ｌ／1 ｌ体積／分、温度 37.2 ℃および撹拌装置
の 400回転／分で開始した。
積 0.5ｌ／1 ｌ体積／分、温度 37.2 ℃および撹拌装置
の 400回転／分で開始した。
【００１７】培養物が指数増殖期に達したときに、通気
容積を1 ｌ／1ｌ容積／分まで増加した。発酵開始から
6時間後、培養物に20％グルコ−ス 40 mlを添加し、指
数増殖期が終了した後、通気を止め、培養物を 400回転
／分でさらに一時間撹拌した。
容積を1 ｌ／1ｌ容積／分まで増加した。発酵開始から
6時間後、培養物に20％グルコ−ス 40 mlを添加し、指
数増殖期が終了した後、通気を止め、培養物を 400回転
／分でさらに一時間撹拌した。
【００１８】この培養リカ−を冷却し、バイオマスを集
めた。収量は培養物 1リットル当り約20ｇ細胞マスであ
った。このバイオマスを破壊してタンパク粒子からγ-
インタ−フェロンを抽出し、分画沈殿によって部分的に
精製した（WO、85／05637（BIOGEN）、17ないし18頁お
よび特許請求の範囲）。
めた。収量は培養物 1リットル当り約20ｇ細胞マスであ
った。このバイオマスを破壊してタンパク粒子からγ-
インタ−フェロンを抽出し、分画沈殿によって部分的に
精製した（WO、85／05637（BIOGEN）、17ないし18頁お
よび特許請求の範囲）。
【００１９】得られたγ- インタ−フェロンの溶液を、
撹拌しながら氷冷0.05Ｍ酢酸ナトリウム（pH 6.0）で希
釈して塩化グアニジン濃度を 0.7Ｍとした。このように
して調製された溶液を、カルボキシメチルセファロ−ス
を充填したカラム（Farmazia、 2.6×10cm、pH 6.0の0.
05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化）にロ−ドし、吸着
の直前に、ポンプおよびミキサ−を用いて、γ- インタ
−フェロンの溶液を氷冷緩衝液で希釈して塩化グアニジ
ン濃度を0.35Ｍとした。ロ−ドは、1100ml／時間の速度
で行なった。カラムを、3ないし 4倍容積の緩衝液で洗
浄し、0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中に 0.1
ないし 0.6Ｍ塩化ナトリウムを溶解した勾配 2×60mlを
用いて溶出速度 2ml／分で20分間溶出した。γ- インタ
−フェロンは、0.40ないし0.44Ｍの塩化ナトリウム濃度
で溶出された。純粋なγ- インタ−フェロンの収量は、
細菌マス 1ｇ当りほぼ 1mgの純粋タンパクであった。
撹拌しながら氷冷0.05Ｍ酢酸ナトリウム（pH 6.0）で希
釈して塩化グアニジン濃度を 0.7Ｍとした。このように
して調製された溶液を、カルボキシメチルセファロ−ス
を充填したカラム（Farmazia、 2.6×10cm、pH 6.0の0.
05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化）にロ−ドし、吸着
の直前に、ポンプおよびミキサ−を用いて、γ- インタ
−フェロンの溶液を氷冷緩衝液で希釈して塩化グアニジ
ン濃度を0.35Ｍとした。ロ−ドは、1100ml／時間の速度
で行なった。カラムを、3ないし 4倍容積の緩衝液で洗
浄し、0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）中に 0.1
ないし 0.6Ｍ塩化ナトリウムを溶解した勾配 2×60mlを
用いて溶出速度 2ml／分で20分間溶出した。γ- インタ
−フェロンは、0.40ないし0.44Ｍの塩化ナトリウム濃度
で溶出された。純粋なγ- インタ−フェロンの収量は、
細菌マス 1ｇ当りほぼ 1mgの純粋タンパクであった。
【００２０】得られたγ- インタ−フェロンの純度の決
定は、下記の２つの独立した方法で行なった。すなわ
ち、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下における電気泳動
およびそれに続くストリップの濃度計測による方法、お
よびカラムPro-RPC（Farmazia、スウェ−デン、 5×20m
m）における高圧クロマトグラフィ−による方法であ
る。溶出速度は 0.6ml／分である。勾配- 20分、0.01％
トリフルオロ酢酸- 0.01％トリフルオロ酢酸中に溶解し
た 100％アセトニトリル、および 280nmの吸収という条
件で、産生物の純度は、電気泳動を用いた場合 99.9 ％
であり、分析用クロマトグラフィ−を適用した場合 99.
9 ％をこえた。
定は、下記の２つの独立した方法で行なった。すなわ
ち、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下における電気泳動
およびそれに続くストリップの濃度計測による方法、お
よびカラムPro-RPC（Farmazia、スウェ−デン、 5×20m
m）における高圧クロマトグラフィ−による方法であ
る。溶出速度は 0.6ml／分である。勾配- 20分、0.01％
トリフルオロ酢酸- 0.01％トリフルオロ酢酸中に溶解し
た 100％アセトニトリル、および 280nmの吸収という条
件で、産生物の純度は、電気泳動を用いた場合 99.9 ％
であり、分析用クロマトグラフィ−を適用した場合 99.
9 ％をこえた。
【００２１】得られた遺伝子組換えによるシステイン非
含有γ- インタ−フェロンのN-末端のアミノ酸の決定
は、N-末端のアミノ酸をダンシルクロライドを用いて蛍
光標識することにより行なった。このようにして調製さ
れた遺伝子組換えによるヒト・システイン非含有γ- イ
ンタ−フェロンのN-末端のアミノ酸は、グルタミンであ
った。メチオニンもしくは他のアミノ酸の存在は確認さ
れていない。
含有γ- インタ−フェロンのN-末端のアミノ酸の決定
は、N-末端のアミノ酸をダンシルクロライドを用いて蛍
光標識することにより行なった。このようにして調製さ
れた遺伝子組換えによるヒト・システイン非含有γ- イ
ンタ−フェロンのN-末端のアミノ酸は、グルタミンであ
った。メチオニンもしくは他のアミノ酸の存在は確認さ
れていない。
【００２２】可溶／凝集インタ−フェロンの比率の決定
は、インタ−フェロン溶液を25 000回転／分で遠心する
ことにより行なった。沈殿物（不溶性インタ−フェロ
ン）を残した。上清に溶解しているインタ−フェロン
は、20％トリクロロ酢酸を用いて沈殿させた。10 000回
転／分で30分間遠心した後、得られた沈殿を電気泳動用
の緩衝液に溶解し、不溶性インタ−フェロンの沈殿と平
行して、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリ
ルアミドゲルについて分析した。ゲルの着色の後、濃度
計測によりストリップのタンパク量を測定した。濃度計
測による決定は、全ての（ 100％）タンパク質が可溶性
であることを示した。
は、インタ−フェロン溶液を25 000回転／分で遠心する
ことにより行なった。沈殿物（不溶性インタ−フェロ
ン）を残した。上清に溶解しているインタ−フェロン
は、20％トリクロロ酢酸を用いて沈殿させた。10 000回
転／分で30分間遠心した後、得られた沈殿を電気泳動用
の緩衝液に溶解し、不溶性インタ−フェロンの沈殿と平
行して、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリ
ルアミドゲルについて分析した。ゲルの着色の後、濃度
計測によりストリップのタンパク量を測定した。濃度計
測による決定は、全ての（ 100％）タンパク質が可溶性
であることを示した。
【００２３】溶液中のγ- インタ−フェロンの濃度は、
モル吸光係数ε280 ＝ 11 700 （T.Arakawa 、N.K.Alto
n 、Y.R.Tsu （1985）、J.Biol.Chem. 260、14435 ）を
用いてそれぞれ独立に決定した。生物学的活性の決定
は、ヒト細胞株ＷＩＳＨに対する水泡性口内炎ウイルス
の細胞変性作用に関するインタ−フェロンの保護作用に
基づいて行なった。この分析は、滴定プレ−トにおい
て、インタ−フェロンの濃度を下げて行なった。活性の
単位として、細胞の50％保護が観察されたインタ−フェ
ロン濃度を採用した。インタ−フェロン-dの国際標準に
従って計算された研究所の標準を適用した。
モル吸光係数ε280 ＝ 11 700 （T.Arakawa 、N.K.Alto
n 、Y.R.Tsu （1985）、J.Biol.Chem. 260、14435 ）を
用いてそれぞれ独立に決定した。生物学的活性の決定
は、ヒト細胞株ＷＩＳＨに対する水泡性口内炎ウイルス
の細胞変性作用に関するインタ−フェロンの保護作用に
基づいて行なった。この分析は、滴定プレ−トにおい
て、インタ−フェロンの濃度を下げて行なった。活性の
単位として、細胞の50％保護が観察されたインタ−フェ
ロン濃度を採用した。インタ−フェロン-dの国際標準に
従って計算された研究所の標準を適用した。
【００２４】凍結乾燥品の活性を研究する場合は、凍結
乾燥後の異なる期間（7日ないし 3か月）で、発熱因子
を含有しない水 1mlを用いて試料を戻した。研究したイ
ンタ−フェロン調製品は、約 5×107 Ｕ／mgの特異活性
を示した。
乾燥後の異なる期間（7日ないし 3か月）で、発熱因子
を含有しない水 1mlを用いて試料を戻した。研究したイ
ンタ−フェロン調製品は、約 5×107 Ｕ／mgの特異活性
を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ベセリン・ペンコフ・イワノフ ブルガリア国、ソフィア、コンプレック ス・バニショラ、ブロック 21 (72)発明者 アドリアナ・アブラム・サラフォバ ブルガリア国、ソフィア、コンプレック ス・ムラドスト − １、ブロック 82 − ２ (72)発明者 ルメン・ゲオルギエフ・ザネフ ブルガリア国、ソフィア、オボリシュテ − ストリート 92 (72)発明者 イワン・ゲオルギエフ・イワノフ ブルガリア国、ソフィア、パステイルナ − ストリート ６ (72)発明者 ベセラ・ステファノバ・イワノバ ブルガリア国、ソフィア、コンプレック ス・ムラドスト − ４、ブロック 440 − ３
Claims (8)
- 【請求項１】 N-末端に大腸菌属の微生物が関与するメ
チオニンを含有しない、遺伝子組換えによるヒト・シス
テイン非含有γ- インタ−フェロンの製造方法であっ
て、Nr 845の下に産業用微生物および培養細胞の寄託の
ための国立寄託機関に登録され、通気条件下において36
ないし38℃の温度で発酵器内で培養された宿主大腸菌株
において、遺伝子組換えによるヒト・システイン非含有
γ- インタ−フェロンの合成遺伝子の担体であるプラス
ミド pＩＢＭを発現させ、得られた産生物を固相支持体
上で精製および変性し、それにより付随する溶媒および
混入物を除去することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 培養物が指数増殖期にある発酵期間中は
通気を増大させ、定常期に達したときは、バイオマスの
回収前の少なくとも１時間通気を停止することを特徴と
する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 インタ−フェロンを吸着する固相支持体
が陽イオン交換樹脂であることを特徴とする請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】 固相支持体がカルボキシメチルセファロ
−スであることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 固相支持体へのγ- インタ−フェロンの
吸着を、0.10ないし0.35Ｍの濃度の塩化グアニジン溶液
中で行なうことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 溶媒を除去するための洗浄を、濃度0.00
5 ないし 0.050Ｍの生物学的に適合し得る緩衝化合物で
緩衝した、発熱物質を含有しない水で行なうことを特徴
とする請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 細胞タンパク質および他の混入物の痕跡
を、濃度0.10ないし0.35Ｍの生物学的に適合し得る塩の
溶液を用いて除去することを特徴とする請求項１記載の
方法。 - 【請求項８】 インタ−フェロンの溶出を、濃度 0.4な
いし0.55Ｍの生物学的に適合し得る塩の溶液を用いて行
なうことを特徴とする請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BG91006 | 1990-01-24 | ||
| BG9100690A BG52073B2 (en) | 1990-01-24 | 1990-01-24 | Method for the preparation of recombinant human noncystein -interferon, free of n-end methionine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176789A true JPH05176789A (ja) | 1993-07-20 |
Family
ID=3922678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP707491A Pending JPH05176789A (ja) | 1990-01-24 | 1991-01-24 | Ｎ−末端にメチオニンを含有しない、遺伝子組換えによるヒト・システイン非含有γ− インターフェロンの製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0446582B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05176789A (ja) |
| BG (1) | BG52073B2 (ja) |
| DE (1) | DE69106407T2 (ja) |
| ES (1) | ES2066237T3 (ja) |
| RU (1) | RU2054044C1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SK8292002A3 (en) | 1999-11-12 | 2002-12-03 | Maxygen Holdings Ltd | A conjugate exhibiting interferon gamma activity, nucleotide sequence encoding for a polypeptide fraction of conjugate, an expression vector and a host cell containing nucleotide sequence, pharmaceutical composition comprising the same and use thereof |
| CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
| AU2002227499A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-13 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Process for producing recombined protein |
| CN1257186C (zh) * | 2001-04-06 | 2006-05-24 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ多肽变体 |
| US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
| US7038015B2 (en) | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
| EP1539814A2 (en) | 2002-07-03 | 2005-06-15 | Maxygen Holdings Ltd. c/o Close Brothers (Cayman) Limited | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
| BG66458B1 (bg) | 2005-03-21 | 2014-10-31 | Иван Иванов | Средство за конкурентно инхибиране на ендогенен гама интерферон |
| BG66517B1 (bg) | 2008-04-08 | 2016-02-29 | Tigo Gmbh | Супресор на ендогенния човешки гама - интерферон |
| US9359421B2 (en) | 2008-04-08 | 2016-06-07 | Tigo Gmbh | Suppressor of the endogenous interferon-gamma |
| FR3052462A1 (fr) | 2016-06-14 | 2017-12-15 | Dna Script | Variants d'une adn polymerase de la famille polx |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| EP0168008A3 (en) * | 1984-07-10 | 1986-12-30 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of gamma-interferon |
| JPS63501471A (ja) * | 1984-12-27 | 1988-06-09 | サントリー株式会社 | インタ−フェロンの精製方法 |
| JPS61177996A (ja) * | 1985-02-02 | 1986-08-09 | Green Cross Corp:The | インタ−フエロン−γの製造法 |
| EP0315950A3 (en) * | 1987-11-09 | 1990-05-23 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of incubating cells expressing a recombinant protein |
-
1990
- 1990-01-24 BG BG9100690A patent/BG52073B2/xx unknown
-
1991
- 1991-01-22 EP EP19910100777 patent/EP0446582B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-22 DE DE1991606407 patent/DE69106407T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-22 ES ES91100777T patent/ES2066237T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-24 RU SU4894482 patent/RU2054044C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1991-01-24 JP JP707491A patent/JPH05176789A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG52073B2 (en) | 1996-04-30 |
| DE69106407D1 (de) | 1995-02-16 |
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| EP0446582A1 (en) | 1991-09-18 |
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| RU2054044C1 (ru) | 1996-02-10 |
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