CN110129393B - 胶原蛋白三肽及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了胶原蛋白三肽及其制备工艺，包括以下步骤：(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵培养；(4)菌体收集；(5)提取类人胶原蛋白；(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。本发明所述胶原蛋白三肽，制备工艺简单方便，得到具有抗氧化能力和美白功效的类人胶原三肽，无毒副作用，可进一步加工成美白、减肥瘦身功能产品。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种胶原蛋白三肽及其制备工艺。
背景技术
大分子胶原蛋白，100-1000个氨基酸构成的胶原蛋白，人体的吸收利用率有限。胶原蛋白肽，由30-50个氨基酸组成，进入体内随机合成身体各部位的蛋白质或胶原蛋白，吸收率较低。胶原蛋白三肽由3个氨基酸组成，可直接点对点被人体吸收，合成人体所需的胶原蛋白。摄取量相同的前提下，比起普通的胶原蛋白肽，胶原蛋白三肽的吸收率高出6-7倍。由其是，胶原蛋白三肽中所含的GPH的吸收率更高。因为由3个氨基酸构成可直接被小肠吸收，经血液输送到肌肤，吸收的时间更快。
申请号为201310199103.0的发明专利公开了一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其制备工艺。该发明的目的是提供一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉及其该胶原蛋白粉的制备工艺，该发明以鱼皮为原料，先采用复合蛋白酶对鱼皮胶原蛋白进行提取并降解成小分子肽，再利用自主筛选的胶原蛋白酶对小分子肽进一步定向降解成胶原三肽，然后经离心、脱腥脱色、浓缩、喷雾干燥获得富含胶原三肽的胶原蛋白粉。该发明选用脂肪含量低的鱼皮为原料，在制备工艺中省去稀碱溶液浸泡脱除脂肪，减少因酸碱处理而产生的有害物质；另外，采用市售的蛋白酶、风味酶对鱼皮进行酶解后，再采用自制的胶原蛋白酶进一步将部分蛋白肽降解成胶原三肽，不仅可以提高原料中胶原蛋白的抽提率而且还显著提高胶原蛋白粉的功能性。
胶原蛋白作为天然的生物资源，已广泛的应用在生物医药、化妆品、食品等行业中。目前，市场对胶原蛋白的需求量越来越大，其主要来源是利用酸碱法从动物机体中提取获得，但这种胶原蛋白虽然产量较高，但其具有水溶性差、纯度低，在临床上易出现排斥反应且存在病毒隐患等缺点，从而抑制了胶原蛋白在各行业的应用。
随着生物技术的发展，人们利用转基因及基因重组技术表达胶原蛋白也获得了成功，如利用哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统及大肠杆菌表达系统等，哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白成分，但操作复杂，表达水平低，规模化生产成本较高，不易普遍推广使用，而大肠杆菌表达系统虽然表达量较高，但存在着易形成包涵体，产生较多杂蛋白等问题，从而导致后期的纯化困难，回收率低。
发明内容
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种胶原蛋白三肽，产率高、收率高，培养基采用无机盐，配制简单、价格低廉，具有抑制黑色素的美白皮肤效果，具有良好的亲水性及稳定性，同天然胶原蛋白相比，具有相近的结构和生物活性，无需变性和复性，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种胶原蛋白三肽的制备工艺。
本发明提供一种胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化；
(2)种子培养；
(3)发酵培养；
(4)菌体收集；
(5)提取类人胶原蛋白；
(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽。
具体地，本发明所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于32-34℃恒温培养36-48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以8-10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，接种量为，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子A；将种子A以8-10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5-8％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于30-34℃培养10-12小时；然后升温至42-43℃，培养2-3小时；随后降温至38-39℃，培养4-5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；在发酵培养过程中pH为6.5-6.8，溶解氧的浓度为20-40％；
(4)菌体收集；将发酵液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量200-500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：(6-12)(g/mL)混合，在压力600-800bar的条件下匀浆20-30分钟，得到破碎液；将破碎液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，收集上清液；向上清液中加入无机盐，收集无机盐浓度为15-65％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：(5-10)(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；
(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为2-5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5-11；添加类人胶原蛋白重量2-3％的碱性蛋白酶，混合后于40-50℃、pH9.5-11的条件下酶解3-4小时；酶解结束，加热至90-100℃，保温5-10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时。
具体地，本发明所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于32-34℃恒温培养36-48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以8-10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，接种量为，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子A；将种子A以8-10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5-8％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于30-34℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养10-12小时；然后升温至42-43℃，pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养2-3小时；随后降温至38-39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养4-5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(4)菌体收集；将发酵液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量200-500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：(6-12)(g/mL)混合，在压力600-800bar的条件下匀浆20-30分钟，得到破碎液；将破碎液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，收集上清液；向上清液中加入无机盐，收集无机盐浓度为15-65％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：(5-10)(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；
(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为2-5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5-11；添加类人胶原蛋白重量2-3％的碱性蛋白酶，混合后于40-50℃、pH9.5-11的条件下酶解3-4小时；酶解结束，加热至90-100℃，保温5-10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时。
优选地，在采用类人胶原蛋白进行酶解制备胶原三肽之前，对类人胶原蛋白进行纯化。
在本发明的一些实施例中，对类人胶原蛋白进行纯化的过程为：采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液将离子交换树脂缓冲平衡，然后将离子交换树脂置于容器中，加入离子交换树脂体积0.05-0.13倍的类人胶原蛋白截留液，以400-500转/分钟的转速搅拌60-80分钟，得到混合液；将混合液以3000-4000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；将上清液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时。
在本发明的一些实施例中，对类人胶原蛋白进行纯化的过程为：将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到粗品；将粗品以凝胶过滤层析柱体积的1％-5％的上样量加入到凝胶过滤层析柱中，采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时
在本发明的一些实施例中，对类人胶原蛋白进行纯化的过程为：(1)采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液将离子交换树脂缓冲平衡，然后将离子交换树脂置于容器中，加入离子交换树脂体积0.05-0.13倍的类人胶原蛋白截留液，以400-500转/分钟的转速搅拌60-80分钟，得到混合液；将混合液以3000-4000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；将上清液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；(2)将类人胶原蛋白粗品以凝胶过滤层析柱体积的1％-5％的上样量加入到凝胶过滤层析柱中，采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时。
在提取类人胶原蛋白过程中，所述无机盐为硫酸铵、氯化钠、氯化钾中的一种或几种的混合物。优选地，所述无机盐为硫酸铵和氯化钾的混合物，其中硫酸铵和氯化钾的质量比为2：1。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种胶原蛋白三肽。
本发明所述胶原蛋白三肽，采用上述人一种胶原蛋白三肽的制备工艺制备而成。
本发明所述胶原蛋白三肽，制备工艺简单方便，得到具有抗氧化能力和美白功效的类人胶原三肽，无毒副作用，可进一步加工成美白、减肥瘦身功能产品。
具体实施方式
实施例中各原料介绍：
菌种具体选用基因工程菌E.coli BL21，购自南昌大学中德联合研究院，于-20℃保存。
葡萄糖，购自四川省维克奇生物科技有限公司。
酵母粉，购自上海同田生物技术股份有限公司。
氯化钠，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
胰蛋白胨，购自上海彤源化工有限公司。
琼脂，购自广州卡芬生物科技有限公司。
卡那霉素硫酸盐，购自上海金穗生物科技有限公司。
细胞破碎缓冲液，具体采用含有1mmol/L乙二胺四乙酸的pH7.5、摩尔浓度为5mmol/L的磷酸盐缓冲液，配制方法为：将16mL摩尔浓度为5mmol/L的磷酸二氢钠溶液和84mL摩尔浓度为5mmol/L的磷酸氢二钠溶液混合，得到pH7.5、摩尔浓度为5mmol/L的磷酸盐缓冲液，然后按照0.292g/L磷酸盐缓冲液的比例添加乙二胺四乙酸。
乙二胺四乙酸，购自上海麦克林生化科技有限公司。
pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液，由5.3mL摩尔浓度为20mmol/L的磷酸二氢钠溶液和94.7mL摩尔浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠溶液混合得到。
碱性蛋白酶，具体采用南宁东恒华道生物科技有限责任公司提供的型号为2709的碱性蛋白酶，是由地衣芽胞杆菌经发酵提炼而成的蛋白水解酶，主要成分为地衣芽胞杆菌蛋白酶，酶活力为20U/g。
摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液，由50mL摩尔浓度为0.1mol/L的磷酸盐溶液和40.3mL 0.1mol/L的的盐酸混合，加水调节到100mL，即得。
DE52树脂，购自上海蔚霆试剂生物科技有限公司。
凝胶过滤层析柱，型号为Sephadex G-100，购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1
所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于34℃恒温培养48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子A；将种子A以10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于32℃培养12小时；然后升温至42℃，培养3小时；随后降温至39℃，培养5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；在发酵培养过程中pH为6.5，溶解氧的浓度为20％；
(4)菌体收集；将发酵液于4℃、以6000转/分钟的转速离心40分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：8(g/mL)混合，在压力600bar的条件下匀浆30分钟，得到破碎液；将破碎液于4℃、以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，收集硫酸铵浓度为35％的的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：10(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5；添加类人胶原蛋白重量3％的碱性蛋白酶，混合后于40℃、pH9.5的条件下酶解4小时，酶解结束，加热至90℃，保温10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时。
实施例2
所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于34℃恒温培养48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子A；将种子A以10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于32℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养12小时；然后升温至42℃，于pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养3小时；随后降温至39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(4)菌体收集；将发酵液于4℃、以6000转/分钟的转速离心40分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：8(g/mL)混合，在压力600bar的条件下匀浆30分钟，得到破碎液；将破碎液于4℃、以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，收集硫酸铵浓度为35％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：10(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(6)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5；添加类人胶原蛋白重量3％的碱性蛋白酶，混合后于40℃、pH9.5的条件下酶解4小时，酶解结束，加热至90℃，保温10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时。
实施例3
所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于34℃恒温培养48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子A；将种子A以10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于32℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养12小时；然后升温至42℃，于pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养3小时；随后降温至39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(4)菌体收集；将发酵液于4℃、以6000转/分钟的转速离心40分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：8(g/mL)混合，在压力600bar的条件下匀浆30分钟，得到破碎液；将破碎液于4℃、以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，收集硫酸铵浓度为35％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：10(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；
(6)采用离子交换树脂纯化类人胶原蛋白：采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液将DE52树脂缓冲平衡，然后将DE52树脂置于容器中，加入DE52树脂体积0.13倍的类人胶原蛋白截留液，以400转/分钟的转速搅拌60分钟，得到混合液；将混合液以3000转/分钟的转速离心25分钟，收集上清液；将上清液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(7)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5；添加类人胶原蛋白重量3％的碱性蛋白酶，混合后于40℃、pH9.5的条件下酶解4小时，酶解结束，加热至90℃，保温10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时。
实施例4
所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于34℃恒温培养48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子A；将种子A以10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于32℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养12小时；然后升温至42℃，于pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养3小时；随后降温至39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(4)菌体收集；将发酵液于4℃、以6000转/分钟的转速离心40分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：8(g/mL)混合，在压力600bar的条件下匀浆30分钟，得到破碎液；将破碎液于4℃、以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，收集硫酸铵浓度为35％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：10(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；
(6)采用凝胶过滤层析柱纯化类人胶原蛋白：将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到粗品；将粗品以凝胶过滤层析柱体积的3％的上样量加入到凝胶过滤层析柱中，采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(7)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5；添加类人胶原蛋白重量3％的碱性蛋白酶，混合后于40℃、pH9.5的条件下酶解4小时，酶解结束，加热至90℃，保温10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时。
实施例5
所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于34℃恒温培养48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子A；将种子A以10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于32℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养12小时；然后升温至42℃，于pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养3小时；随后降温至39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(4)菌体收集；将发酵液于4℃、以6000转/分钟的转速离心40分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：8(g/mL)混合，在压力600bar的条件下匀浆30分钟，得到破碎液；将破碎液于4℃、以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵，收集硫酸铵浓度为35％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：10(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；
(6)采用离子交换树脂纯化类人胶原蛋白：采用pH7.5的Tris-HCl缓冲液将DE52树脂缓冲平衡，然后将DE52树脂置于容器中，加入DE52树脂体积0.13倍的类人胶原蛋白截留液，以400转/分钟的转速搅拌60分钟，得到混合液；将混合液以3000转/分钟的转速离心25分钟，收集上清液；将上清液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白粗品；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(7)采用凝胶过滤层析柱纯化类人胶原蛋白：将类人胶原蛋白粗品以凝胶过滤层析柱体积的3％的上样量加入到凝胶过滤层析柱中，采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(8)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5；添加类人胶原蛋白重量3％的碱性蛋白酶，混合后于40℃、pH9.5的条件下酶解4小时，酶解结束，加热至90℃，保温10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时。
实施例6
所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于34℃恒温培养48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子A；将种子A以10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于32℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养12小时；然后升温至42℃，于pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养3小时；随后降温至39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(4)菌体收集；将发酵液于4℃、以6000转/分钟的转速离心40分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：8(g/mL)混合，在压力600bar的条件下匀浆30分钟，得到破碎液；将破碎液于4℃、以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集上清液；向上清液中加入氯化钾，收集氯化钾浓度为35％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：10(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；
(6)采用离子交换树脂纯化类人胶原蛋白：采用pH7.5的Tris-HCl缓冲液将DE52树脂缓冲平衡，然后将DE52树脂置于容器中，加入DE52树脂体积0.13倍的类人胶原蛋白截留液，以400转/分钟的转速搅拌60分钟，得到混合液；将混合液以3000转/分钟的转速离心25分钟，收集上清液；将上清液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白粗品；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(7)采用凝胶过滤层析柱纯化类人胶原蛋白：将类人胶原蛋白粗品以凝胶过滤层析柱体积的3％的上样量加入到凝胶过滤层析柱中，采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(8)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5；添加类人胶原蛋白重量3％的碱性蛋白酶，混合后于40℃、pH9.5的条件下酶解4小时，酶解结束，加热至90℃，保温10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时。
实施例7
所述胶原蛋白三肽的制备工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种在平板培养基上于34℃恒温培养48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(2)种子培养；将活化后的菌种以10％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子A；将种子A以10％(V/V)的接种量继续接种于种子培养基中，于34℃、转速260转/分钟的条件下培养12小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(3)发酵培养；将种子B以5％(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，于32℃、pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养12小时；然后升温至42℃，于pH6.8、溶解氧浓度40％的条件下培养3小时；随后降温至39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20％的条件下培养5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
(4)菌体收集；将发酵液于4℃、以6000转/分钟的转速离心40分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
(5)提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：8(g/mL)混合，在压力600bar的条件下匀浆30分钟，得到破碎液；将破碎液于4℃、以5000转/分钟的转速离心60分钟，收集上清液；向上清液中加入硫酸铵和氯化钾以质量比为2：1混合而成的无机盐，收集无机盐浓度为35％的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：10(g/mL)混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；
(6)采用离子交换树脂纯化类人胶原蛋白：采用pH7.5的Tris-HCl缓冲液将DE52树脂缓冲平衡，然后将DE52树脂置于容器中，加入DE52树脂体积0.13倍的类人胶原蛋白截留液，以400转/分钟的转速搅拌60分钟，得到混合液；将混合液以3000转/分钟的转速离心25分钟，收集上清液；将上清液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白粗品；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(7)采用凝胶过滤层析柱纯化类人胶原蛋白：将类人胶原蛋白粗品以凝胶过滤层析柱体积的3％的上样量加入到凝胶过滤层析柱中，采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时；
(8)类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5；添加类人胶原蛋白重量3％的碱性蛋白酶，混合后于40℃、pH9.5的条件下酶解4小时，酶解结束，加热至90℃，保温10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间2小时，升华温度15℃，解析温度30℃，真空度0.095MPa，真空冷冻干燥时间16小时。
测试例1
参考申请号为201310401280.2的专利对实施例1-7的胶原蛋白三肽的美白性能进行评价。
具体测试结果见表1。
表1：美白性能测试结果表
测试例2
对实施例1-7的胶原蛋白三肽的收率进行评价。
具体测试结果见表2。
表2：收率测试结果表
从上述数据可以看出，实施例2相较于实施例1，胶原三肽的收率得到提高，这可能是因为在细胞生长的不同阶段，pH和溶解氧的浓度对营养物质的选择和吸收的具有很大的影响。在前期的生长阶段，可以适当控制溶解氧浓度，避免菌体繁殖速度过快，导致含空质粒细胞比例的增加和葡萄糖等营养物质的过度消耗。在升温阶段需要进行外源蛋白的表达，此时通过调整pH和适当增加溶解氧浓度，可以在促进细胞的呼吸代谢的同时，减少代谢副产物，提高胶原蛋白的产量和质量。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (2)
1.胶原蛋白三肽的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将菌种在平板培养基上于32-34℃恒温培养36-48小时，得到活化后的菌种；其中平板培养基的组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；所述菌种为基因工程菌E.coli BL21；
（2）种子培养；将活化后的菌种以8-10%（V/V）的接种量接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子A；将种子A以8-10%（V/V）的接种量继续接种于种子培养基中，于32-34℃、转速220-260转/分钟的条件下培养10-14小时，得到种子B；其中种子培养基的组成：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
（3）发酵培养；将种子B以5-8%（V/V）的接种量接种于发酵培养基中，于30-34℃、pH6.5、溶解氧浓度20%的条件下培养10-12小时；然后升温至42-43℃，pH6.8、溶解氧浓度40%的条件下培养2-3小时；随后降温至38-39℃，于pH6.5、溶解氧浓度20%的条件下培养4-5小时；发酵结束，收集发酵液；其中发酵培养基的组成：葡萄糖40g/L，酵母粉60g/L，硫酸铵4.2g/L，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钠3.4g/L，磷酸氢二钾5.6g/L，乙二胺四乙酸0.8g/L，卡那霉素硫酸盐0.03g/L，余量为水；
（4）菌体收集；将发酵液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，弃上清液，收集底部固体；将底部固体用底部固体重量200-500倍的去离子水洗涤，得到菌体；
（5）提取类人胶原蛋白：将菌体和细胞破碎缓冲液以固液比1：（6-12）（g/mL）混合，在压力600-800bar的条件下匀浆20-30分钟，得到破碎液；将破碎液于2-4℃、以5000-6000转/分钟的转速离心40-60分钟，收集上清液；向上清液中加入质量比为2：1的硫酸铵和氯化钾的混合物，收集无机盐浓度为15-65%的蛋白沉淀；将蛋白沉淀和pH8.0、摩尔浓度为20mmol/L的磷酸盐缓冲液以固液比1：（5-10）（g/mL）混合，用截留分子量为30kD的超滤膜进行超滤，色素、无机盐以及小分子物质透过超滤膜，相对分子量较大的类人胶原蛋白被截留，收集类人胶原蛋白截留液；将类人胶原蛋白截留液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30~-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；
（6）类人胶原蛋白酶解制备胶原三肽：将类人胶原蛋白制备成为质量分数为2-5%的胶原蛋白水溶液，采用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液调节胶原蛋白水溶液的pH为9.5-11；添加类人胶原蛋白重量2-3%的碱性蛋白酶，混合后于40-50℃、pH9.5-11的条件下酶解3-4小时；酶解结束，加热至90-100℃，保温5-10分钟灭酶；收集酶解液，真空冷冻干燥，得到所述胶原蛋白三肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30~-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；
在采用类人胶原蛋白进行酶解制备胶原三肽之前，对类人胶原蛋白进行纯化；
所述对类人胶原蛋白进行纯化的过程为：（1）采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的Tris-HCl缓冲液将DE52树脂缓冲平衡，然后将DE52树脂置于容器中，加入DE52树脂体积0.13倍的类人胶原蛋白截留液，以400-500转/分钟的转速搅拌60-80分钟，得到混合液；将混合液以3000-4000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；将上清液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白粗品；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30~-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时；（2）将类人胶原蛋白粗品以凝胶过滤层析柱体积的1%-5%的上样量加入到凝胶过滤层析柱中，采用摩尔浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐-盐酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液真空冷冻干燥，得到类人胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30~-25℃，预冻时间1-2小时，升华温度15-20℃，解析温度30-35℃，真空度0.09-0.095MPa，真空冷冻干燥时间16-20小时。
2.胶原蛋白三肽，其特征在于，采用权利要求1所述的胶原蛋白三肽的制备工艺制备而成。
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