CN113151336A - 重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法及应用 - Google Patents

重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组表达质粒构建透明质酸工程菌株及使用方法，属于生物活性物质提取技术领域，其特征在于重组表达质粒包含一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达蛋白酶基因的聚核苷酸；通过发酵制备高分子透明质酸发酵液，包括破壁工序、分离工序、提取工序和水解工序，本发明的有益效果是：几丁质酶进行破壁处理，利用产蛋白酶将糖蛋白变性水解后与透明质酸脱离；而分离后的透明质酸能够顺利通过细胞膜到细胞膜外，达到了将糖蛋白变性后与透明质酸分离的目的，规避了因内容物释放导致透明质酸酶水解效率差和杂质难以处理的问题，保证了低分子透明质酸高收率和低蛋白杂质。

Description

重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法及应用
技术领域：
本发明属于生物活性物质提取技术领域，更具体地涉及一种重组表达质粒构建透明质酸工程菌株及使用方法。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又称为玻尿酸，是一种以D-葡萄糖醛酸(Glca)和N-乙酰-葡萄糖胺(GlcNAC)为双糖单位聚合而成的酸性粘多糖。广泛存在于动物和人体的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为10 5-10 7Da。寡聚透明质酸是指分子量小于 10kDa的透明质酸。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，但是对分子的渗透性影响很大，因此小分子透明质酸在生物渗透，生物降解方面具有独特的特性，极具应用价值。
透明质酸的制备方法主要有动物组织提取法和微生物发酵法，但得到透明质酸分子量一般在0.8-1.5×106Da，要得到更小分子量的透明质酸必须经过水解，一般水解方法有三种：物理法、化学法和酶法，但这些方法水解过程都是随机性的，水解产物的分子量分布较广，直接使用就会影响产品功效，要得到分子量分布窄的低分子量透明质酸就必须再次经过分步提纯法才能获得，但这就增加了生产成本，也影响产品收率。
现在有较多的专利和文献报道透明质酸的制备方法，在制备小分子或寡聚透明质酸方面都是采用水解工序与提取工序独立分批的传统方式，难于同时兼顾到提高产量质量和降低成本，给产业化生产带来了难点。
发明内容：
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种低分子量透明质酸的提取及制备方法，能够有效的解决酸碱提取时，透明质酸容易发生分解和结构破坏的问题；
解决的第二个技术问题是：在提取过程中一些非糖物质被提出，如透明质酸外具有糖蛋白，糖蛋白在后续粗多糖的分离纯化会比较困难。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：
兽疫链球菌，该菌株于2020年11月23日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为：CGMCC NO.17774，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株命名为ps01，兽疫链球菌S.zooepidemicus；
一种重组表达质粒，其特征在于所述质粒的载体基于pCOLADuet-1，所述重组表达质粒包含：一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；
所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达蛋白酶基因的聚核苷酸；所述宿主细胞为产透明质酸的兽疫链球菌；
所述表达蛋白酶基因的聚核苷酸如SEQ NO：1所示的核苷酸序列。
所述的蛋白酶基因的聚核苷酸编码蛋白的氨基酸序列如SEQNO.2所示。
一种根据所述的重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法：其特征在于包括如下步骤：
第1步：利用引物1和引物2得到蛋白酶基因，连接到所述载体pCOLADuet-1 上，构建表达载体pCOLADuet-1-S1；
引物1:5′-ATGAAGCAGCAATGGTTGTCGGC-3′；
引物2：5′-TCAGTAGCGCAACGTCTCTACCG-3′；
第2步：将步骤1中构建的表达载体pCOLADuet-1-S1导入宿主产透明质酸的兽疫链球菌得到重组兽疫链球菌工程菌株，并利用培养基进行菌种发酵培养；
第3步：发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、 KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L；
发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟，在发酵3h时，加入10.0M 乳糖诱导蛋白酶的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量。
所述的蛋白酶基因通过PCR扩增获得。
一种低分子透明质酸的制备方法，其特征在于采用具有分子量800-1400kDa 的高分子透明质酸发酵液，包括破壁工序、分离工序、提取工序和水解工序；
所述破壁工序指在具有分子量800-1400kDa的高分子透明质酸的发酵液中加入几丁质酶进行破壁处理，获得具有透明质酸的兽疫链球菌原生质体的处理液；
所述分离工序将含有透明质酸的悬浊混合液温度提升到55-60℃，将透明质酸从破壁处理的细胞中分离出来；
所述提取工序指将混合液用0.22μm的过滤纸板过滤，去除含有透明质酸的原生质体，提取获得透明质酸；
所述水解工序是指将获得的透明质酸溶液加入透明质酸酶，酶解4h后，得到水解液，并通过超滤膜进行过滤截留，得到低分子量透明质酸滤液。
所述破壁工序反应温度为35-45℃，所述几丁质酶的添加量为处理液质量的 0.2-1.2‰。
所述水解工序中：透明质酸酶的添加量优选为高分子量透明质酸溶液体积的0.5％-10％酶解的温度优选为30-50℃；所述酶解的pH值优选为4.5-7.0。
所述含有透明质酸的悬浊混合液为透明质酸和内容物中含有蛋白的透明质酸菌体原生质体的混合物。
本发明的有益效果是：
本发明利用几丁质酶进行破壁处理，去除细胞壁的同时能够有效地保留具有生物活性的完整细胞膜即原生质体，将含有透明质酸和缠绕在透明质酸上的糖蛋白均隔离在原生质体内，
通过基因工程的手段，利用产蛋白酶的基因将糖蛋白变性水解后与透明质酸脱离；而分离后的透明质酸能够顺利通过细胞膜到细胞膜外，达到了将糖蛋白变性后与透明质酸分离的目的，
进而利用透明质酸酶水解获得纯度较高的低分子透明质酸，能够获得低分子透明质酸的同时，规避了因内容物释放导致透明质酸酶水解效率差和杂质难以处理的问题，保证了低分子透明质酸高收率和低蛋白杂质。
附图说明
附图1是本发明的载体pCOLADuet-1质粒图谱示意图。
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
一种根据所述的重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法：包括如下步骤：
第1步：利用引物1和引物2得到蛋白酶基因，连接到所述载体pCOLADuet-1 上，构建表达载体pCOLADuet-1-S1；
引物1:5′-ATGAAGCAGCAATGGTTGTCGGC-3′；
引物2：5′-TCAGTAGCGCAACGTCTCTACCG-3′；
第2步：将步骤1中构建的表达载体pCOLADuet-1-S1导入宿主产透明质酸的兽疫链球菌得到重组兽疫链球菌工程菌株，并利用培养基进行菌种发酵培养；
其中：重组表达质粒，所述质粒的载体为pCOLADuet-1，所述重组表达质粒包含：一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；
所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达蛋白酶基因的聚核苷酸；所述宿主细胞为产透明质酸的兽疫链球菌；
所述表达蛋白酶基因的聚核苷酸如SEQ NO：1所示的核苷酸序列。
所述的蛋白酶基因的聚核苷酸编码蛋白的氨基酸序列如SEQNO.2所示。
第3步：发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、 KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L；
发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟，在发酵3h时，加入10.0M 乳糖诱导蛋白酶的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量。
所述的蛋白酶基因通过PCR扩增获得。
一种低分子透明质酸的制备方法，其特征在于采用具有分子量800-1400kDa 的高分子透明质酸发酵液，包括破壁工序、分离工序、提取工序和水解工序；
所述破壁工序指在具有分子量800-1400kDa的高分子透明质酸的发酵液中加入几丁质酶进行破壁处理，获得具有透明质酸的兽疫链球菌原生质体的处理液；
所述分离工序将含有透明质酸的悬浊混合液温度提升到55-60℃，将透明质酸从破壁处理的细胞中分离出来；
所述提取工序指将混合液用0.22μm的过滤纸板过滤，去除含有透明质酸的原生质体，提取获得高分子量透明质酸；
所述水解工序是指将获得的高分子量透明质酸溶液加入透明质酸酶，酶解 4h后，得到水解液，并通过超滤膜进行过滤截留，得到低分子量透明质酸滤液。
所述破壁工序反应温度为35-45℃，所述几丁质酶的添加量为处理液质量的 0.2-1.2‰。
所述水解工序中：透明质酸酶的添加量优选为高分子量透明质酸溶液体积的0.5％-10％酶解的温度优选为30-50℃；所述酶解的pH值优选为4.5-7.0。
所述含有透明质酸的悬浊混合液为透明质酸和内容物中含有蛋白的透明质酸菌体原生质体的混合物。
为了更加直观的展现本发明的工艺优势，特以本发明破壁工序和除蛋白工序方法进行对比，
对比例一：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，兽疫链球菌没有进行编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸转基因表达；
对比例二：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，未添加几丁质酶进行破壁处理；
对比例三：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，采用破壁机进行粉碎处理进行破壁处理；
对比例四：
制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，采用常用的强碱进行破壁处理；再调4.5-7.0，进行酶解反应；
并根据，标准QB/T4416-2012《化妆品用原料透明质酸钠》，分别对透明质酸多糖分子量和蛋白杂质进行检测，试验数据如下：
表1：不同工艺对于低分子透明质酸的影响
Figure BDA0003004806860000071
由上表格数据分析可知：
1.由本发明和对比例一的数据分析可知：对比例一透明质酸的收率极低，这是由于透明质酸外侧包裹着修饰作用的糖蛋白，导致了包裹有糖蛋白的透明质酸无法通过细胞溶出，而本发明通过基因的手段，在兽疫链球菌细胞内，表达分解糖蛋白的蛋白酶，进而，能够满足在保存细胞原生质体完整的前提下，去除糖蛋白的透明质酸溶出通过细胞的可能性，最终获得了透明质酸提取获得，蛋白隔离在原生质体内的效果；
2.由本发明和对比例二的数据分析可知：对比例二透明质酸的收率极低，这是由于通过基因的手段，在兽疫链球菌细胞内，表达分解糖蛋白的蛋白酶，进而，能够满足在保存细胞原生质体完整的前提下，去除糖蛋白的透明质酸溶出通过细胞的可能性，但是由于细胞膜外侧存在完整的细胞壁，导致了去除糖蛋白的透明质酸无法溶出；
3.由本发明和对比例三的数据分析可知：由于对比例三采用了破壁机对细胞壁进行破壁，导致兽疫链球菌细胞膜的破损，导致内容物的释放，最终导致透明质酸水解效果较差，分子量较高且蛋白杂质含量较高；
4.由本发明和对比例四的数据分析可知：由于对比例三采用了强碱对细胞壁进行破壁，导致兽疫链球菌细胞膜的破损，导致内容物的释放，最终导致透明质酸水解效果较差，分子量较高且蛋白杂质含量较高；强碱导致银耳多糖中存在大量变性糖蛋白，糖蛋白在后续粗多糖的分离纯化会比较困难，而且强碱导致了银耳多糖分子量的降低；
综上所述：
本发明利用几丁质酶进行破壁处理，去除细胞壁的同时能够有效地保留具有生物活性的完整细胞膜即原生质体，将含有透明质酸和缠绕在透明质酸上的糖蛋白均隔离在原生质体内，
通过基因工程的手段，将产表达蛋白酶基因将糖蛋白变性水解后与透明质酸脱离；而分离后的透明质酸能够顺利通过细胞膜到细胞膜外，达到了将糖蛋白变性后与透明质酸分离的目的，
进而利用透明质酸酶水解获得纯度较高的低分子透明质酸，能够获得低分子透明质酸的同时，规避了因内容物释放导致透明质酸酶水解效率差和杂质难以处理的问题，保证了低分子透明质酸高收率和低蛋白杂质。
所述的蛋白酶为如SEQ NO：2所示的氨基酸序列：
Glu Val Leu Gly Gln Pro Met Val Ala Phe Asp Lys Ser Ile Arg Gly
Asn Phe Ser Pro Glu Arg Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala
Met Lys Gln Gln Trp Leu Ser Ala Ala Ile Leu Ala Ala Cys Ala Ala
Val Gly Ala His Ala Gln Ala Gln Glu Ile Pro Gln Lys Thr Ser Pro
Gln Ala Gly Ala Ser Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Ser Gly Gln Val
Thr Ile Arg Arg Asp Gly Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asn Thr
Val Tyr Gly Ile Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg
Pro Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala
Ser Glu Arg Gln Ile Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp
Ile Ala Arg Val Arg Ala Glu Pro Gly Gly Leu Met Pro Lys Glu Phe
Asn Asp Leu Arg Phe Gln Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala
Met Val Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser
Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys His Gly
Asp Glu Arg Ala Met Gln Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Met Thr Asp
Ser Arg Ala Pro Thr Thr Val Pro Glu Glu Glu Gly Val Tyr Gln Pro
Asp Ala Ala Arg Pro Ser Ala Arg Leu Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr
Glu Gly Thr Pro Pro Met Leu Glu Arg Val Ala Arg Asp Pro Gln Thr
Arg Gly Val Leu Asp Glu Ala Pro Ala Ala Val Pro Ala Arg Leu Leu
Ala Gln Phe Ala Glu Ser Gly Gln Pro Gly Ile Ala Gly Phe Pro Thr
Thr Ser Asn Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg
Ala Ile Leu Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr
Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn
Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val
Thr Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Tyr Ala
Glu Lys Leu Asp Pro Asn Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Val
Trp Lys Thr Met Glu Lys Arg Thr Glu Leu Ile Glu Val Lys Asp Ala
Gln Pro Val Val Met Asp Val Tyr Arg Thr Val His Gly Ile Val Thr
Lys Phe Asp Asp Lys Gln Arg Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp
Glu Gly Tyr Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr His Lys Ala Gln
Leu Pro Phe Leu Gln Gln Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Ala
Arg Ala Arg Leu Val Ala Gly Leu Ala Ser Trp Asp Gly Met Gly Thr
Ser Asp Lys Gln Pro Gly Tyr Tyr Asp His Thr Gly Pro Ala Val Met
Asp Ala Trp Leu Arg Ala Met Leu Lys Arg Ala Leu Ala Asp Glu Met
Pro Ala Asp Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Gln
Ala Ala Pro Ala Thr Gly Ser Val Asn Leu Thr Val Gly Val Lys Val
Leu Phe Asn Ala Leu Ala Gly Arg Asp Ala Gly Val Pro Gln Gln Tyr
Asp Phe Phe Asn Gly Gln Arg Pro Gln Asp Val Thr Leu Ala Ala Leu
Asp Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg Lys Ala Tyr Gly Glu Asp Pro Ala
Gln Trp Arg Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe
Ser Arg Asn Trp Asp Gln Trp Lys Gln Gln Ala Ala Arg His Ala Leu
Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Thr Asp Asp Lys Gly Asn Ile Gly Tyr Ala
His Thr Gly Phe Tyr Pro Lys Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu
Pro Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Asp Gly Ile Leu Pro Phe
Ser Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn
Trp Asn Asn Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Leu Phe Ala
Ile Val Trp Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu
Lys Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp
Asp Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe
Leu Gly Val Pro Gln Ala Asp Asp Lys Ala Val Leu Ser Phe Pro Ala
Thr Gln Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys
Gly Val Arg Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val
Ala Pro Asp Gly Thr Pro Ser Pro His Ala Arg Asp Gln Phe Asp Leu
Tyr Thr Ser Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Asp Ala Glu Val
Arg Ala His Ala Lys Ser Val Glu Thr Leu Arg Tyr。
序列表
<110> 山东银河生物科技有限公司
<120> 重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)
<400> 1
gccgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca 60
ggcggggcac ttaatgcgtt agctacggcg cggaaaacgt ggaatgtccc ccacacctag 120
tgcccaacgt ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccatgcttt 180
cgctcctcag cgtcagttac agcccagaga cctgccttcg ccatcggtgt tcctcctgat 240
atctgcgcat ttcaccgcta caccaggaat tccagtctcc cctactgcac tctagtctgc 300
ccgtacccac tgcagaaccg gagttgagcg ccggtctttc acagcagacg cgacaaccgc 360
ctacgagctc tttacgccca ataattccgg ataacgcttg cgccctacgt attaccgcgg 420
ctgctgcacg tagttaggcg gcgcttcttc tgcaggtacc gtcactttcg cttcttccta 480
ctgaagaggt ttacaacacg aaggcggtca tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt 540
gagccggatc atattcgacg gctcccccac aagggttagg ccaccggctt cgggtgttac 600
caactttcgt gacttgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcgt 660
tgctgatctg cgattactag cgactccgac ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc 720
gaactgagac cggctttttg ggattagctc cacctcacag tatcgcaacc ctttgtaccg 780
gccattgtag catgcgtgaa gcccaagaca taaggggcat gatgatttga cgtcgtcccc 840
accttcctcc gagttgaccc cggcagtctc ctatgagtcc ccgccataac gcgctggcaa 900
catagaacga gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 960
cgacaaccat gcaccacctg taaaccgacc gcaagcgggg cacctgtttc caggtctttc 1020
accaacagct atgccgacac gctcgacctg gtccgcctgg gcaccgaccg cgcacgcgcc 1080
gggcaggtac ggacgccggc cggctgggag acgccgctgg aaaaggtcga gacgattttg 1140
gtgaaaggcc agccggccga acgcgtgctc gtgcgcgaga ccagcctggg accgatccgc 1200
gaagccggcg gcgaactcta tgcgatccac tggatcgcgc atgcgccgca ggcggtcaac 1260
ctcgaacacc tgcgcatgga aaccgcgacc acgctggacg acgcgatggc ggtggcggcc 1320
gtcgacggta tcccggcgca gaacatcctg atcggcgacg agcgcggcaa tatcggctgg 1380
accgtcgccg gcatcctgcc gcaccgtccc gcggccggcc gcgggctggc cgtgtccttc 1440
ccgctggacg cgagcggcag cgttccggcc tgggacggcg tgctggcgcc ggccgactat 1500

Claims (8)

1.一种重组表达质粒，其特征在于所述重组表达质粒的载体为pCOLADuet-1，所述重组表达质粒包含：一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；
所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达蛋白酶基因的聚核苷酸；所述宿主细胞为产透明质酸的兽疫链球菌；
所述表达蛋白酶基因的聚核苷酸如SEQ NO：1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的稳定的重组表达质粒，其特征在于所述的蛋白酶基因的聚核苷酸编码蛋白的氨基酸序列如SEQNO.2所示。
3.一种根据权利要求1或2所述的重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法：其特征在于包括如下步骤：
第1步：利用引物1和引物2得到蛋白酶基因，连接到所述载体pCOLADuet-1上，构建表达载体pCOLADuet-1-S1；
引物1:5′-ATGAAGCAGCAATGGTTGTCGGC-3′；
引物2：5′-TCAGTAGCGCAACGTCTCTACCG-3′；
第2步：将步骤1中构建的表达载体pCOLADuet-1-S1导入宿主产透明质酸的兽疫链球菌得到重组兽疫链球菌工程菌株，并利用培养基进行菌种发酵培养；
第3步：发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 30g/L、玉米浆20g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、谷氨酰胺1.5g/L、精氨酸0.5g/L；
发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟，在发酵3h时，加入10.0M乳糖诱导蛋白酶的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量。
4.根据权利要求3所述的重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法，其特征在于所述的蛋白酶基因通过PCR扩增获得。
5.一种透明质酸的制备方法，其特征在于采用权利要求3中透明质酸的发酵液，包括破壁工序、分离工序、提取工序和水解工序；
所述破壁工序指在具有透明质酸的发酵液中加入几丁质酶进行破壁处理，获得具有透明质酸的兽疫链球菌原生质体的处理液；
所述分离工序将含有透明质酸的悬浊混合液温度提升到55-60℃，将透明质酸从破壁处理的细胞中分离出来；
所述提取工序指将混合液用0.22μm的过滤纸板过滤，去除含有透明质酸的原生质体，提取获得透明质酸；
所述水解工序是指将获得的透明质酸溶液加入透明质酸酶，酶解4h后，得到水解液，并通过超滤膜进行过滤截留，得到低分子量透明质酸滤液。
6.根据权利要求5所述的透明质酸的制备方法，其特征在于所述破壁工序反应温度为35-45℃，所述几丁质酶的添加量为处理液质量的0.2-1.2‰。
7.根据权利要求5所述的透明质酸的制备方法，其特征在于所述水解工序中：透明质酸酶的添加量优选为高分子量透明质酸溶液体积的0.5％-10％；酶解的温度优选为30-50℃；酶解的pH值优选为4.5-7.0。
8.根据权利要求5所述的透明质酸的制备方法，其特征在于含有所述透明质酸的悬浊混合液为透明质酸和内容物中含有蛋白的透明质酸菌体原生质体的混合物。
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