CN114875052B - 一种能够检测透明质酸的融合蛋白及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种能够检测透明质酸的融合蛋白及检测方法，主要涉及内容为一种融合蛋白TMZSa‑4D0Q编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，一种融合蛋白4D0Q‑TMZSb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述融合蛋白TMZSa‑4D0Q和融合蛋白4D0Q‑TMZSb在检测透明质酸中的应用，本发明提供的融合蛋白TMZSa‑4D0Q和4D0Q‑TMZSb能够与透明质酸特异性结合，并产生荧光，能够用于透明质素的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种能够检测透明质酸的融合蛋白及检测方法。
背景技术
透明质酸，又称玻尿酸，分子式是(C14H21NO11)n，是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖。透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。具有较高临床价值的生化药物,广泛应用于各类眼科手术,如晶体植入、角膜移植和抗青光眼手术等。还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。将其用于化妆品中,能起到独特的保护皮肤作用，可保持皮肤滋润光滑、细腻柔嫩、富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。
随着蛋白质组学、合成生物学和计算机模拟技术的快速发展，研究人员可以借助使用CBM融合来达到筛选的作用。此外，目前多数研究针对多样CBM融合碳水化合物酶，以此提高酶分子的催化活性、稳定性以及酶分子与底物的结合特异性，但是利用CBM与荧光蛋白融合作为探针检测底物的方法仍较少。
中国专利文献CN114106193A(202010985303.X)公开了一种透明质酸结合蛋白聚糖及其在检测透明质酸中的应用，所述二聚体蛋白包括二个单体，其中每个单体包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区通过所述第二蛋白功能区形成二聚体形式，本发明的VG1二聚体蛋白的亲和力高于VG1单体及现有的TSG-6-Fc，可应用于透明质酸的检测。该方法所使用的蛋白以及检测方法与本发明提供的技术方案明显不同。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种能够检测透明质酸的融合蛋白及检测方法。
发明人将基因4D0Q的N端通过Linker(连接肽)添加TMZS基因的a段构建融合蛋白TMZSa-4D0Q，基因4D0Q的C端通过Linker(连接肽)添加TMZS基因的b段，构建融合蛋白4D0Q-TMZSb。本发明发现两个融合蛋白TMZSa-4D0Q、4D0Q-TMZSb与底物透明质酸的相邻位点同时发生结合时，能够产生强烈荧光，而融合蛋白TMZSa-4D0Q、4D0Q-TMZSb不与底物透明质酸结合时不产生明显荧光，因此可以利用融合蛋白TMZSa-4D0Q、4D0Q-TMZSb快速检测透明质酸。
本发明技术方案如下：
一种融合蛋白TMZSa-4D0Q编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种融合蛋白4D0Q-TMZSb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组载体，包含上述TMZSa-4D0Q编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
一种重组载体，包含上述4D0Q-TMZSb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
一种重组菌，包含上述TMZSa-4D0Q编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
一种重组菌，包含上述4D0Q-TMZSb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
一种含融合蛋白TMZSa-4D0Q基因的兽疫链球菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成TMZSa-4D0Q融合基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将步骤(1)中制得的TMZSa-4D0Q融合基因片段插入pLH200载体，得到重组质粒pLH200-TMZSa-4D0Q；
(3)制备兽疫链球菌感受态细胞，将步骤(2)制得的重组质粒pLH200-TMZSa-4D0Q经酶切后转化兽疫链球菌感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白TMZSa-4D0Q基因的兽疫链球菌工程菌。
一种含融合蛋白4D0Q-TMZSb基因的兽疫链球菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
①合成4D0Q-TMZSb融合基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
②将步骤①中制得的4D0Q-TMZSb融合基因片段插入pLH200载体，得到重组质粒pLH200-4D0Q-TMZSb；
③制备兽疫链球菌感受态细胞，将步骤②制得的重组质粒pLH200-4D0Q-TMZSb经酶切后转化兽疫链球菌感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白4D0Q-TMZSb基因的兽疫链球菌工程菌。
根据本发明优选的，上述步骤(3)或步骤③中筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有100μg/mL氯霉素的THY固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有100μg/mL氯霉素的THY液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。
上述方法构建的含融合蛋白TMZSa-4D0Q基因的兽疫链球菌在生产融合蛋白TMZSa-4D0Q中的应用。
上述方法构建的含融合蛋白4D0Q-TMZSb基因的兽疫链球菌在生产融合蛋白4D0Q-TMZSb中的应用。
由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白TMZSa-4D0Q和由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白4D0Q-TMZSb在检测透明质酸中的应用。
根据本发明优选的，上述融合蛋白TMZSa-4D0Q和融合蛋白4D0Q-TMZSb在筛选产透明质酸的微生物中的应用。
进一步优选的，上述融合蛋白TMZSa-4D0Q和融合蛋白4D0Q-TMZSb在筛选产透明质酸的兽疫链球菌中的应用。
一种检测透明质酸的试剂盒，含有融合蛋白TMZSa-4D0Q和融合蛋白4D0Q-TMZSb。
一种检测透明质酸的方法，包括如下步骤：
将由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白TMZSa-4D0Q、由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白4D0Q-TMZSb和待测样品混合反应，利用酶标仪检测；
荧光强度增强，则确定待测样品中含有透明质酸；荧光强度没有增强，则确定待测样品中不含透明质酸。
有益效果
1、本发明提供的融合蛋白TMZSa-4D0Q和4D0Q-TMZSb能够与透明质酸特异性结合，并产生荧光，能够用于透明质素的检测。
2、本发明提供的融合蛋白用于检测透明质酸，反应体系小、检测时间短，底物特异性高以及操作简单，可以实时监测，无需清洗或猝灭荧光探针，拓宽了透明质酸检测的方法途径，也能够在快速检测酶活的领域得到应用。
附图说明
图1为融合蛋白TMZSa-4D0Q和融合蛋白4D0Q-TMZSb检测透明质酸结果图。
图2为融合蛋白TMZSa-4D0Q蛋白电泳图；
TMZSa-4D0Q为37.6kDa，目的蛋白条带已红色色圈出。
图3为融合蛋白4D0Q-TMZSb蛋白电泳图；
图中，4D0Q-TMZSb为29.6kDa，目的蛋白条带已红色色圈出。
图4为实施例6中不同底物检测结果图；
图中：图4为实施例6中不同底物检测结果图,图中：A1-6、B1-6、C1-6为空白对照，使用配制底物缓冲液做空白；A7-9为0.1％木聚糖；B7-9为0.1％纤维素；C7-9为0.1％透明质酸。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
实施例1
融合蛋白TMZSa-4D0Q的基因构建
在TMZS基因的N端通过连接肽(Linker)连接黄色荧光蛋白基因的a片段，得到融合蛋白TMZSa-4D0Q基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将TMZSa-4D0Q基因片段插入到载体pLH200上，构建pLH200-TMZSa-4D0Q质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。
融合蛋白4D0Q-TMZSb的基因构建
在TMZS基因的C端通过连接肽(Linker)连接黄色荧光蛋白基因的b片段，得到融合蛋白4D0Q-TMZSb基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将4D0Q-TMZSb插入到载体pLH200上，构建pLH200-4D0Q-TMZSb质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。
实施例2
制备兽疫链球菌感受态
(i)将兽疫链球菌ATCC 39920单菌落接入5mL THY液体培养基(3％Todd-Hewitt，0.2％Yeast extract，121℃灭菌30min)中，200r/min、37℃下培养10-14h。
(ii)按体积分数1％的接种量接入新鲜的40mL的THY液体培养基中，37℃下培养至OD530为0.4左右时加入无菌的LHAase溶液10mL(酶活5×105U/mL)，继续培养约30min后将其冰浴10min。
(iii)6 000r/min、4℃离心10min，收集菌体，加入提前冰浴的0.5mol/L的蔗糖溶液20mL重悬菌体。
(iv)重悬菌体和离心重复操作2次，加入500μL体积分数为15％甘油的0.5mol/L的蔗糖溶液，重悬菌体后进行分装。
(v)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。
实施例3
TMZSa-4D0Q、4D0Q-TMZSb基因转化兽疫链球菌
将实施例1构建的pLH200-TMZSa-4D0Q质粒、pLH200-4D0Q-TMZSb质粒，分别加入到实施例2制备的感受态细胞中，混匀，冰浴10min后加入预冷的电转杯里进行电激，电压为2500V(2mm电转杯)。电激后将900μL冷THY培养液加入电转杯中，混匀后吸出置于离心管中，冰浴30min。37℃静置培养1.5-2.5h后涂布于带有100μg/mL氯霉素抗性的THY板。37℃培养24-48h，挑选转化子提取质粒，进行PCR验证及测序鉴定，筛选具有氯霉素抗性的转化子。液体复苏培养基，每升组分如下：
牛肉浸粉10.0g，胰蛋白胨20.0g，葡萄糖2.0g，碳酸氢钠2.0g，氯化钠2.0g，磷酸氢二钠0.4g，酵母粉2.0g，pH 7.2，余量水。
实施例4
阳性重组菌的培养及鉴定
挑取上述阳性重组菌落(即具有氯霉素抗性的转化子)，接种到含100μg/mL氯霉素抗性的液体THY培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，TMZSa-4D0Q条带大小约为1000bp，与理论值1017bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到兽疫链球菌细胞内上，制得含有融合蛋白TMZSa-4D0Q基因的兽疫链球菌工程菌。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，4D0Q-TMZSb条带大小约为800bp，与理论值804bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到兽疫链球菌细胞内上，制得含有融合蛋白4D0Q-TMZSb基因的兽疫链球菌工程菌。
实施例5
融合蛋白TMZSa-4D0Q、4D0Q-TMZSb发酵测试和蛋白纯化。
将实施例4制备的含有融合蛋白TMZSa-4D0Q、4D0Q-TMZSb基因的兽疫链球菌工程菌，分别接种至含100μg/mL氯霉素抗性的液体THY培养基中，200rpm 37℃下培养至发酵液OD530在0.6-0.8之间，再加入IPTG诱导12h，取样。菌液离心后得到菌体，使用0.01M PBS(pH7.4)重悬菌体，超声破碎后，12000rpm离心20min收集上清，即为蛋白上清液；融合蛋白电泳图，见图2、图3。
实施例6
融合蛋白TMZSa-4D0Q、4D0Q-TMZSb与底物的反应，使用实施例5制备的蛋白上清液。
(一)融合蛋白TMZSa-4D0Q、融合蛋白4D0Q-TMZSb在有透明质酸为底物的体系中能够使用酶标仪(501nm激发光，527nm发射光)检测到荧光信号。
反应体系如下：
使用80μL TMZSa-4D0Q蛋白上清、80μL 4D0Q-TMZSb蛋白上清以及40μL质量分数为0.1％透明质酸溶液构建200μL的反应体系。
实验结果：反应后有明显的荧光强度的增加，反应在0-6h时间内荧光强度明显增加，反应2h以后荧光强度趋于平稳，见图1。
(二)使用不同的反应底物代替上述0.1％透明质酸，具体为以质量分数计：0.1％木聚糖、0.1％纤维素，其他均相同。
实验结果，见图4：以木聚糖、纤维素为反应底物，反应体系中没有荧光增强。只有以透明质酸作为底物时，反应体系才有荧光强度的增加，说明融合蛋白TMZSa-4D0Q、融合蛋白4D0Q-TMZSb与透明质酸反应具有良好的底物特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种能够检测透明质酸的融合蛋白及检测方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catatgagca aaggcgaaga actgttcacc ggcgttgttc cgatcctggt tgaactggat 60
ggtgatgtta acggccacaa attcagcgtt tctggtgaag gcgaaggcga tgcgacctac 120
ggtaaactga ccctgaaatt catctgcacc accggcaaac tgccggtgcc gtggccgacc 180
ctggttacca ccttcggtta cggtctgcag tgcttcgcgc gttacccgga tcacatgaaa 240
ctgcacgatt tcttcaaaag cgcgatgccg gaaggttacg ttcaggaacg taccatcttc 300
ttcaaagatg acggtaacta taaaacccgc gcagaagtta aattcgaagg cgatactctg 360
gttaaccgta tcgaactgaa aggcatcgat ttcaaagaag atggcaacat cctgggtcac 420
aaactggaat acaactacaa cagccacaac gtgtatatca tggcggattc cggtggcggc 480
tctggtggcg gcagcggcgg cagcatgcag aacctggttg aaaacggcga cttcggccag 540
accgaagatg gcagcagccc gtggaccggt tccaaagcgc agggctggag cgcgtgggtt 600
gatcagaaaa actccgcgga tgctagcacc cgtgttatcg aagcgaaaga tggcgcgatc 660
accatctcta gccacgaaaa actgcgtgca gcgctgcacc gcatggtgcc gatcgaagcg 720
aaaaagaaat acaaactgcg tttcaaaatc aaaaccgata acaaaatcgg tatcgcgaaa 780
gtgcgtatca tcgaagaatc tggtaaagat aaacgtctgt ggaactccgc gaccaccagc 840
ggtaccaaag attggcagac catcgaagcg gattactctc cgaccctgga tgttgataaa 900
atcaaactgg aactgttcta cgaaaccggt accggcaccg ttagcttcaa agatatcgaa 960
ctggttgaag ttgcggatca gctgagcctg gaacaccacc accaccatca cctcgag 1017
<210> 2
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catatgatgc agaacctggt tgaaaacggt gatttcggcc agaccgaaga tggcagcagc 60
ccgtggaccg gttctaaagc gcagggttgg agcgcgtggg ttgatcagaa aaactctgcg 120
gatgcgagca cccgtgttat cgaagcgaaa gatggcgcta tcaccatctc ttctcacgaa 180
aaactgcgcg cggcgctgca ccgtatggtt ccgatcgaag cgaaaaagaa atacaaactg 240
cgtttcaaaa tcaaaaccga taacaaaatc ggtatcgcga aagttcgtat catcgaagaa 300
agcggtaaag ataaacgtct gtggaactct gcgaccacct ctggcaccaa agattggcag 360
accatcgaag cggattactc tccgaccctg gatgttgata aaatcaaact ggaactgttc 420
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gttctgctgc cggataacca ctacctgtct taccagagcg cgctgtctaa agatccgaac 720
gaaaaacgtg atcacatggt tctgctggaa ttcgttaccg cggcgggcat caccctgggt 780
atggatgaac tgtacaaact cgag 804
Claims (5)
1.由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白TMZSa-4D0Q和由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白4D0Q-TMZSb在检测透明质酸中的应用。
2.由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白TMZSa-4D0Q和由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白4D0Q-TMZSb在筛选产透明质酸的微生物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白TMZSa-4D0Q和融合蛋白4D0Q-TMZSb在筛选产透明质酸的兽疫链球菌中的应用。
4.一种检测透明质酸的试剂盒，含有由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白TMZSa-4D0Q和由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白4D0Q-TMZSb。
5.一种检测透明质酸的方法，包括如下步骤：
将由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白TMZSa-4D0Q、由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白4D0Q-TMZSb和待测样品混合反应，利用酶标仪检测；
荧光强度增强，则确定待测样品中含有透明质酸；荧光强度没有增强，则确定待测样品中不含透明质酸。
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