CN114958884B - 一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法，主要涉及内容为一种融合蛋白PULLa‑CBM1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，一种融合蛋白CBM1‑PULLb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述融合蛋白PULLa‑CBM1和融合蛋白CBM1‑PULLb在检测普鲁兰多糖中的应用，本发明提供的融合蛋白PULLa‑CBM1和CBM1‑PULLb能够与普鲁兰多糖特异性结合，并产生荧光，能够用于普鲁兰多糖的检测。

Description

一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法。
背景技术
普鲁兰糖，又称普鲁兰多糖，1938年最早由Bauer教授发现，通过出芽短梗霉在合适的发酵条件下在体内生物合成，是一种天然胞外多糖。该多糖安全性很高，低热值，稳定性很好，还具有良好的成膜性、阻氧性以及水溶性，在自然状态下不吸湿、无毒、无致癌性、可食用。因普鲁兰糖能形成透明、隔油、隔氧的薄膜，所以可用于空心胶囊壳、食品保鲜、糖果等领域。
普鲁兰糖的检测方法有苯酚-硫酸法、醇沉法、高效液相色谱法等，在普鲁兰糖的发酵生产中，当前广泛使用的检测方法为醇沉干燥法和高效液相色谱法。硫酸蒽酮法测量结果误差较大，重现性不高；每次都要制备标准曲线，操作繁琐；要用到浓硫酸，有一定危险性，对操作人员和设备有较高要求。醇沉干燥法是使用高浓度酒精将发酵液中的普鲁兰糖沉淀出来，然后再高温烘干并称重，由于干燥过程较慢，一般需要8～12h才能完成测定。高效液相色谱法设备要求高，耗材成本高，而且30min之内只能检测一个样品，不适合实验室多水平平行优化实验中普鲁兰糖实时监测。
中国专利文献CN102621269A(申请号：201210098720.7)公开了一种普鲁兰多糖的检测方法，该专利文献公开的定性检测方法是通过薄层层析图谱显色检测普鲁兰多糖，与本申请提供的检测方法明显不同。
目前多数研究针对多样CBM融合碳水化合物酶，以此提高酶分子的催化活性、稳定性以及酶分子与底物的结合特异性，但是利用CBM与荧光蛋白融合作为探针检测底物的方法仍较少。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法。
发明人将基因CBM1的N端通过Linker(连接肽)添加PULL基因的a段构建融合蛋白PULLa-CBM1，基因CBM1的C端通过Linker(连接肽)添加PULL基因的b段，构建融合蛋白CBM1-PULLb。本发明发现两个融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb与底物普鲁兰多糖的相邻位点同时发生结合时，能够产生强烈荧光，而融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb不与底物普鲁兰多糖结合时，不产生明显荧光，因此可以利用融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb快速检测普鲁兰多糖。
本专利中构建的CBM1是能够特异性结合普鲁兰多糖的结合结构域。
本发明技术方案如下：
一种融合蛋白PULLa-CBM1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种融合蛋白CBM1-PULLb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组载体，包含上述PULLa-CBM1编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
一种重组载体，包含上述CBM1-PULLb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
一种重组菌，包含上述PULLa-CBM1编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
一种重组菌，包含上述CBM1-PULLb编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
一种含融合蛋白PULLa-CBM1基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成PULLa-CBM1基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将步骤(1)中制得的PULLa-CBM1基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-PULLa-CBM1；
(3)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(2)制得的重组质粒pET-20b(+)-PULLa-CBM1经酶切后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白PULLa-CBM1的大肠杆菌工程菌。
一种含融合蛋白CBM1-PULLb基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
①合成CBM1-PULLb基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
②将步骤①中制得的CBM1-PULLb基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-CBM1-PULLb；
③制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤②制得的重组质粒pET-20b(+)-CBM1-PULLb经酶切后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白CBM1-PULLb的大肠杆菌工程菌。
根据本发明优选的，上述步骤(3)或步骤③中筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。
上述方法构建的含融合蛋白PULLa-CBM1基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白PULLa-CBM1中的应用。
上述方法构建的含融合蛋白CBM1-PULLb基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白CBM1-PULLb中的应用。
由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白PULLa-CBM1和由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白CBM1-PULLb在检测普鲁兰多糖中的应用。
一种检测普鲁兰多糖的方法，包括如下步骤：
将由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白PULLa-CBM1、由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白CBM1-PULLb和待测样品混合反应，利用酶标仪检测；荧光强度增强，则确定待测样品中含有普鲁兰多糖；荧光强度没有增强，则确定待测样品中不含普鲁兰多糖。
有益效果
1、本发明提供的融合蛋白PULLa-CBM1和CBM1-PULLb能够与普鲁兰多糖特异性结合，并产生荧光。
2、本发明提供的融合蛋白PULLa-CBM1和CBM1-PULLb只有在共同结合
在同一普鲁兰多糖链相邻的位点才能激发荧光，单独结合普鲁兰多糖或不结合普鲁兰多糖均不发出明显荧光。因此该方法与传统荧光探针相比，具有反应体系小、检测时间短、底物特异性高以及操作简便，可实时监测，无需清洗或淬灭荧光探针的优点，拓宽了普鲁兰多糖检测的方法途径，也能够在快速检测酶活的领域得到应用。
附图说明
图1为实施例5融合蛋白PULLa-CBM1的蛋白电泳图；
图中，PULLa-CBM1 30.598kDa，目的蛋白条带已用黑色圈出。
图2为实施例5融合蛋白CBM1-PULLb的蛋白电泳图；
图中，CBM1-PULLb 22.592kDa，目的蛋白条带已用黑色圈出。
图3为融合蛋白PULLa-CBM1和融合蛋白CBM1-PULLb检测普鲁兰多糖的结果图。
图4为实施例6中不同底物检测结果图；
图中：D7-9、E7-9、F7-9为空白对照，使用配制底物缓冲液做空白；
D1-3为0.2％葡聚糖；E1-3为0.2％木质素；F1-3为0.2％微晶纤维素；D4-6为0.2％木聚糖；E4-6为0.2％普鲁兰糖；F4-6为0.2％透明质酸。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
实施例1
融合蛋白PULLa-CBM1的基因构建
在CBM1基因的N端通过连接肽(Linker)连接黄色荧光蛋白基因的a片段，得到融合蛋白PULLa-CBM1基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将PULLa-CBM1插入到载体pET20b(+)上，构建pET-20b(+)-PULLa-CBM1质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。
融合蛋白CBM1-PULLb的基因构建
在CBM1基因的C端通过连接肽(Linker)连接黄色荧光蛋白基因的b片段，得到融合蛋白CBM1-PULLb基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，选择NdeI和XhoI为限制性酶切位点将CBM1-PULLb插入到载体pET20b(+)上，构建pET-20b(+)-CBM1-PULLb质粒。构建好的质粒由上海生工生物工程公司合成。
实施例2
制备大肠杆菌感受态
(i)挑取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)单菌落接种至LB培养基中，220r/min、37℃培养过夜；
(ii)吸取0.1mL菌液至10mL的LB培养基中，300r/min、37℃培养至OD600达0.6～0.8；
(iii)吸取1mLOD600达0.6～0.8的菌液至1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；
(iv)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。
(v)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。
实施例3
PULLa-CBM1、CBM1-PULLb基因转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)
将实施例1构建的质粒pET-20b(+)-PULLa-CBM1、pET-20b(+)-CBM1-PULLb分别添加ddH2O使质粒浓度达到100ng/mL浓度后，与实施例2制备的感受态细胞进行化学转化，得到的细胞使用900μLLB培养基37℃复苏培养1h后，离心弃900μL上清，使用剩余的培养基重悬细胞，涂布在含100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，筛选具有氨苄霉素抗性的转化子。液体复苏培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，余量水。
实施例4
阳性重组菌的培养及鉴定
挑取上述阳性重组菌落(即具有氨苄霉素抗性的转化子)，接种到含100μg/mL氨苄霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，PULLa-CBM1条带大小约为800bp，与理论值807bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得含有融合蛋白PULLa-CBM1基因的大肠杆菌工程菌。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，CBM1-PULLb条带大小约为600bp，与理论值594bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得含有融合蛋白CBM1-PULLb基因的大肠杆菌工程菌。
实施例5
融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb发酵测试和蛋白纯化。
将实施例4制备的含有融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb基因的大肠杆菌工程菌分别接种至100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，余量水)中200rpm37℃下培养至发酵液OD600在0.6-0.8之间，再加入IPTG诱导12h，取样。菌液离心后得到菌体，使用0.01M PBS(pH7.4)重悬菌体，超声破碎后10000r/min离心收集上清，即为蛋白上清液，蛋白电泳图见图1、图2。
实施例6
融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb的反应，使用实施例5制备的蛋白上清液。
(一)融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb在有普鲁兰多糖为底物的体系中能够使用酶标仪(501nm激发光，527nm发射光)检测到荧光信号
反应体系如下：
使用40μL PULLa-CBM1蛋白上清、40μL CBM1-PULLb蛋白上清以及120μL浓度为0.2％普鲁兰多糖构建200μL的反应体系。实验结果：将测试样减去对照样(对照样不含普鲁兰多糖，其他均相同)的荧光数值进行作图及分析，见图3，可以看出，反应后有明显的荧光强度的增加，且荧光强度随着反应时间的增加不断变强。
(二)使用不同的反应底物代替上述普鲁兰多糖，具体为以质量分数计：0.2％葡聚糖、0.2％木质素、0.2％微晶纤维素、0.2％透明质酸、0.2％木聚糖，其他均相同。
实验结果，见图4：以葡聚糖、木质素、微晶纤维素、透明质酸、木聚糖为反应底物，反应体系中没有荧光增强现象。只有底物为0.2％普鲁兰多糖时，反应体系才有荧光强度的明显增加，说明融合蛋白PULLa-CBM1、CBM1-PULLb与普鲁兰多糖具有良好的底物特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccacct tcggctacgg cctgcaatgc ttcgcccgct accccgacca catgaagctg 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacagcgg tggcggtagc 480
ggcggtggca gcggtggcag cacagaaacc accatcgtag tccactatca cagatacgat 540
ggaaaatacg atggatggaa tctctggata tggcccgtgg agcctgtgtc tcaggaaggg 600
aaagcttatc agttcacagg tgaggatgat tttggtaaag tagcagtagt gaaattacca 660
atggatctta caaaggtggg gatcatagtg aggctgaacg agtggcaggc aaaagacgtg 720
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gtggaagaga ttttctacga aaaacca 807
<210> 2
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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aatctctgga tatggcccgt ggagcctgtg tctcaggaag ggaaagctta tcagttcaca 120
ggtgaggatg attttggtaa agtagcagta gtgaaattac caatggatct tacaaaggtg 180
gggatcatag tgaggctgaa cgagtggcag gcaaaagacg tggcaaaaga caggttcata 240
gagataaaag acggaaaggc tgaagtgtgg atactccagg gagtggaaga gattttctac 300
gaaaaaccaa gcggtggcgg tagcggcggt ggcagcggtg gcagcaagca gaagaacggc 360
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ctgagctacc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 540
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 594

Claims (8)

1.一种基因组合物，其特征在于，包括融合蛋白PULLa-CBM1编码基因和融合蛋白CBM1- PULLb编码基因；融合蛋白PULLa-CBM1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，融合蛋白CBM1-PULLb编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组载体组合物，其特征在于，包括含有权利要求1所述融合蛋白PULLa-CBM1编码基因的重组载体和含有权利要求1所述融合蛋白CBM1-PULLb编码基因的重组载体。
3.一种重组菌组合物，其特征在于，包括含有权利要求1所述融合蛋白PULLa-CBM1编码基因的重组菌和含有权利要求1所述融合蛋白CBM1-PULLb编码基因的重组菌。
4.如权利要求3所述的重组菌组合物，其特征在于，包括含有融合蛋白PULLa-CBM1基因的大肠杆菌工程菌和含有融合蛋白CBM1-PULLb编码基因的大肠杆菌工程菌；
含融合蛋白PULLa-CBM1基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
（1）合成PULLa-CBM1基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
（2）将步骤（1）中制得的PULLa-CBM1基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-PULLa-CBM1；
（3）制备大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，将步骤（2）制得的重组质粒pET-20b(+)-PULLa-CBM1经酶切后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白PULLa-CBM1的大肠杆菌工程菌；
含融合蛋白CBM1-PULLb基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
① 合成CBM1-PULLb基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
② 将步骤①中制得的CBM1-PULLb基因片段插入pET-20b(+)载体，得到重组质粒pET-20b(+)-CBM1-PULLb；
③ 制备大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，将步骤②制得的重组质粒pET-20b(+)-CBM1-PULLb经酶切后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含融合蛋白CBM1- PULLb的大肠杆菌工程菌。
5.如权利要求4所述的重组菌组合物，其特征在于，步骤（3）或步骤 ③ 中筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。
6.权例要求4中所述方法构建的含融合蛋白PULLa-CBM1基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白PULLa-CBM1中的应用；
所述方法构建的含融合蛋白CBM1-PULLb基因的大肠杆菌工程菌在生产融合蛋白CBM1- PULLb中的应用。
7.由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白PULLa-CBM1和由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白CBM1-PULLb在检测普鲁兰多糖中的应用。
8.一种检测普鲁兰多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的融合蛋白PULLa-CBM1、由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的融合蛋白CBM1-PULLb和待测样品混合反应，利用酶标仪检测；荧光强度增强，则确定待测样品中含有普鲁兰多糖；荧光强度没有增强，则确定待测样品中不含普鲁兰多糖。
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