CN108410843A

CN108410843A - 一种新普鲁兰酶与其编码基因和应用

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Publication number: CN108410843A
Application number: CN201810257909.3A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 王金星
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: CN108410843B

Abstract

本发明涉及一种新普鲁兰酶蛋白及其编码基因，以及该蛋白作为淀粉、普鲁兰糖水解酶在工业领域的应用。本发明以深海沉积物样品宏基因组文库为研究材料，对宏基因组文库进行测序和基因功能注释分析，根据注释信息筛选得到一条新普鲁兰酶基因，根据基因序列信息设计引物，以宏基因组为模板，进行PRC扩增，得到编码新普鲁兰酶的基因序列，其DNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。将目的基因插入pCold表达载体中，表达纯化得到该基因编码的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2序列所示。本发明的新普鲁兰酶，由于其特有的活性及酶学特性，可应用于与普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉水解相关的工业化生产中。

Description

一种新普鲁兰酶与其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种新普鲁兰酶与其编码基因及其应用。

背景技术

新普鲁兰酶是最具代表性的一类多功能淀粉酶，在淀粉生产糖的过程中，加入新普鲁兰酶作为辅助酶，可提高糖的转化率，还可以使用新普鲁兰酶来代替其他的转糖苷酶，以淀粉为原料生产低聚异麦芽糖、低聚麦芽糖等益生元。目前的淀粉酶和新普鲁兰酶产量较低，难以满足目前市场的要求，因此，开发新型的新普鲁兰酶在淀粉加工业、食品、农业与医药行业中有着重要的研究价值及应用前景。

海洋具有丰富的生物多样性，尤其是深海微生物所特有的适应各种极端环境的酶系是丰富的新酶资源。但是海洋微生物特别是深海微生物取样困难，培养条件特殊，能够分离培养的微生物更少，近年来宏基因组学技术体系的建立使从不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。

宏基因组学通过提取环境中微生物基因组DNA，构建相应的宏基因组文库，并对宏基因组进行筛选和分析，来寻找和发现新的功能基因。这种不依赖于环境中微生物的分离和培养的技术拓展了微生物学的研究思路与方法，为从不同自然环境中的为培养微生物中寻找新的基因资源和活性物质提供了有力的技术手段，也为研究和开发深海微生物资源提供新的方法和思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于深海沉积物样品的新普鲁兰酶基因、及其所编码的新普鲁兰酶在工业化生产中的应用。

其一，本发明涉及一种新普鲁兰酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明还涉及编码上述的新普鲁兰酶的基因，其核苷酸序列具体为序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步地，用于所述的核苷酸序列特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

上游引物见序列表中SEQ ID No.3；

下游引物见序列表中SEQ ID No.4。

进一步地，本发明还包括一种表达载体，所述的表达载体含有上述核苷酸片段。

进一步地，所述的表达载体，其具体为pCold-Neopullu31369。

进一步地，本发明还包括一种表达工程菌，其携带有上所述的表达载体。

进一步地，所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

本发明所述的新普鲁兰酶，为从深海沉积物样品宏基因组文库中筛选并克隆得到的，所述新普鲁兰酶基因获得方法为：通过从深海沉积物样品的宏基因组文库测序数据中获取了含新普鲁兰酶序列片段，通过对这些宏基因组序列信息设计引物，以宏基因组文库为模板进行PCR扩增，最后克隆得到新普鲁兰酶编码基因。

本发明对新普鲁兰酶Neopullu31369氨基酸序列进行生物信息学分析，该酶全长由588个氨基酸组成，其DNA和氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；序列分析显示该酶含有一个AmyAc_CMD结构域，N端含有E_set_CDase结构域，C端含有Malt_amylase_C结构域。

本发明根据新普鲁兰酶Neopullu31369基因序列，设计带酶切位点的扩增引物SEQID NO.3、SEQ ID NO.4，将扩增后得到的片段酶切后与线性化的载体 pCold连接，构建表达质粒并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建成工程菌株。通过对工程菌株培养、诱导表达、超声破碎获得重组蛋白。

本发明的新普鲁兰酶蛋白理论分子量为68.5kD，可以在构建的工程菌中以可溶的形式大量表达，纯化后可获得重组表达的新普鲁兰酶Neopullu31369。

本发明通过DNS法，测得新普鲁兰酶Neopullu31369分别以普鲁兰糖、可溶性淀粉和直链淀粉为底物时，比活力分别为0.0485、0.1089和0.0454。由此推断，普鲁兰糖、可溶性淀粉和直链淀粉均可作为该酶的底物，该酶为多功能淀粉酶，本发明的新普鲁兰酶在淀粉水解相关的工业、农业和医药等领域具有潜在的应用价值。

本发明还对所述新普鲁兰酶进行了初步的酶学性质研究：新普鲁兰酶Neopullu31369最适温度在30℃左右，为适冷新普鲁兰酶；最适pH为6.0，属偏酸性酶。另外，Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺⁺对新普鲁兰酶Neopullu31369的活性都具有抑制作用，值得注意的是，Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺对酶的活力均有不同程度的促进作用，特别是Ca²⁺对酶活力的促进作用最强。去污剂SDS和 beta-巯基乙醇对该酶的催化活性有强抑制作用，1％的tween-20和Triton-100对酶活有一定的促进作用。该酶对有机溶剂敏感，正丁醇对酶活力抑制最明显。

与现有技术相比，本发明的新普鲁兰酶Neopullu31369可适应较低的反应温度和偏酸的反应环境的，对金属离子和去污剂的敏感程度不同，在工业应用领域有很大的优势。

附图说明

图1：添加酶切位点后新普鲁兰酶Neopullu31369基因片段的PCR产物电泳结果。

1：目的片段Neopullu31369的PCR产物；M：DL2000bp的DNA分子量标准。

图2：重组表达质粒pCold-Neopullu31369的构建图。

图3：新普鲁兰酶Neopullu31369的表达和纯化电泳图。

M：蛋白分子量标准；1：诱导前总细菌蛋白；2：IPTG诱导后总细菌蛋白； 3：IPTG诱导后超声上清总细菌蛋白；4：纯化后的目的蛋白Neopullu31369。

图4：温度对新普鲁兰酶Neopullu31369酶活性的影响。

图5：pH对新普鲁兰酶Neopullu31369活性的影响。

图6：金属离子对新普鲁兰酶Neopullu31369活性的影响。

图7：去污剂对新普鲁兰酶Neopullu31369活性的影响。

图8：有机溶剂对新普鲁兰酶Neopullu31369活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例一：新普鲁兰酶Neopullu31369基因的克隆及表达载体的构建。

先将深海沉积物样品E406(水深3318，经度119°44.966’E，18°44.922’N)宏基因组文库测序结果进行注释并分析，获得新普鲁兰酶基因信息；再根据新普鲁兰酶基因序列信息，设计特异性引物，以宏基因组文库为模板，进行PCR扩增，获得Neopullu31369编码基因片段，全长1767bp，与预期大小一致(见图1)。如图2所示，将回收纯化的Neopullu31369基因PCR产物，用XhoI和XbaI酶切后，与同样用XhoI和XbaI切开的线性化载体pCold连接，构成含Neopullu31369基因片段的表达载体pCold-Neopullu31369。

对纯化后的pCold-Neopullu31369重组质粒用T7和T7t引物进行双向测序，其序列与合成的模板序列结果完全一致，并且读码框正确。

PCR扩增特异性引物如下：

E406pull31369F_Xbal_F:

5’-CCGCTCGAGCGGATGGAGCAAGCGGCTATTTTTCACC-3’(SEQ ID NO.3)

E406pull31369R_Xhol_R:

5’-TGCTCTAGAGCATTAAATAAGCTGACCGCTAAACG-3’(SEQ ID NO.4)

本发明所涉及新普鲁兰酶，其核苷酸序列(具体为序列表SEQ ID NO.2)所示如下：

MEQAAIFHRPGMNFSFLVDESTLGIRIRTKKNDVEEIVLIHGDPYIWEEGKWVVDKTNMYLSASDSIFDYWECKITPPHRRIRYGFELKNQHESYLYTEKGFFPEVLYDCDYYFCFPYVHASELFDAPTWVKDTTWYQIFPDRFNNGNPSINPSDTLVWGEAEPTPSNFFGGDFEGVLQKLDYLVDLGINGIYFTPIFKAKSNHKYDTSDYFEIDPQFGTKDDLKRLVNACHQRGIKIMLDAVFNHSGYFFKPFQDVLKNGVQSPYVDWFYPHDLPLQGGDRPNYETFAFVESMPKLNTQNSDVKKYLLDVATYWIKEFDIDGWRLDVANEVDHQFWREFRTAVRAEKSDLYILGEVWHESMSWLLGDQFDAVMNYPFTSNVQKLLASQTITSQEFMDSMTTVIQSYPERVLDTTFNLVGSHDTSRILTECQEDSKRVKLIYTLLYTFMGSPCMYYGDEIGMTGGRDPGCRKCMEWDSTKQDLDLFNHVKKLIALRSSEKLLANEGTFQFLNHSLTKLVVYRKYTSTKNVVVLINPTNESESYILPFSIDNQEVRDEWNNSTVQMPESKEITIE PYGFSVLSFSGQLI

本发明所涉及的新普鲁兰酶的基因，其核苷酸序列(具体为序列表SEQ ID NO.1)所示如下：

ATGGAGCAAGCGGCTATTTTTCACCGACCTGGAATGAATTTTTCATTTTTGGTGGATGAATCTACTTTAGGTATACGCATTCGAACAAAGAAAAATGATGTTGAAGAGATTGTTTTAATACATGGAGACCCCTATATTTGGGAGGAAGGAAAATGGGTAGTTGATAAAACAAACATGTACCTAAGTGCTAGCGATTCTATTTTTGATTATTGGGAATGCAAAATCACCCCTCCTCACCGAAGAATTCGCTATGGTTTTGAATTAAAAAACCAACATGAATCTTATCTATATACAGAAAAAGGATTCTTTCCAGAAGTGCTTTACGATTGTGACTATTATTTTTGTTTCCCATATGTCCATGCATCAGAATTATTTGATGCCCCTACTTGGGTAAAAGATACAACTTGGTATCAAATCTTTCCAGATCGGTTCAACAATGGTAACCCTTCGATAAATCCCTCAGACACTCTAGTTTGGGGTGAAGCAGAACCTACACCTTCGAACTTTTTTGGTGGAGATTTTGAAGGGGTTTTGCAAAAACTTGATTACTTAGTAGATCTAGGGATTAACGGAATTTACTTTACACCTATATTTAAAGCAAAATCGAATCATAAATATGATACAAGTGACTACTTTGAAATCGATCCGCAGTTTGGAACAAAAGATGATTTAAAGCGATTAGTAAATGCCTGTCATCAACGTGGGATTAAAATCATGTTGGACGCTGTTTTCAATCATAGCGGATATTTTTTCAAACCTTTTCAAGACGTGTTAAAGAATGGTGTACAATCACCTTATGTAGATTGGTTTTATCCACATGACCTTCCTTTACAAGGTGGAGATCGACCAAATTACGAAACATTCGCTTTTGTCGAATCTATGCCGAAGTTAAATACTCAAAATTCGGATGTCAAAAAATATTTACTTGATGTAGCTACTTATTGGATTAAAGAGTTTGACATTGATGGATGGCGTTTAGATGTCGCGAATGAAGTAGATCATCAATTTTGGAGAGAGTTCCGAACAGCAGTAAGAGCAGAAAAATCCGACCTATATATTTTAGGAGAAGTTTGGCATGAATCAATGTCTTGGTTATTAGGAGATCAGTTTGACGCTGTAATGAATTATCCCTTTACGAGCAACGTTCAAAAGCTTTTGGCTTCTCAAACCATTACATCACAAGAATTTATGGATTCAATGACTACCGTGATACAAAGTTATCCGGAGAGAGTATTAGATACAACATTTAATCTTGTAGGAAGTCATGATACATCTCGTATCTTGACTGAATGCCAAGAAGATAGCAAACGAGTTAAATTGATTTATACCCTTTTATATACGTTTATGGGTTCCCCTTGTATGTATTATGGAGATGAGATTGGAATGACCGGTGGCAGGGATCCTGGTTGTCGAAAGTGTATGGAGTGGGATTCTACTAAGCAAGATTTAGATTTGTTCAATCACGTCAAAAAATTAATTGCTTTGAGAAGTTCCGAAAAATTATTAGCAAATGAAGGAACATTCCAGTTCCTTAATCATAGTCTGACTAAATTAGTTGTTTACCGTAAATATACGTCTACTAAAAATGTTGTGGTTTTAATAAATCCAACCAACGAGTCAGAGTCGTATATTTTACCGTTCAGTATTGACAATCAAGAAGTTAGAGATGAATGGAATAATTCAACGGTACAAATGCCTGAATCTAAGGAAATAACGATTGAGCCTTACGGATTTAGTGTTCTTTCGTTTAGCGGTCAGCTTATTTAA

本发明所涉及的新普鲁兰酶的基因特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

其上游引物见序列(具体如序列表SEQ ID No.3)所示如下：

CCGCTCGAGCGGATGGAGCAAGCGGCTATTTTTCACC 26

其下游引物见序列(具体如序列表SEQ ID No.4)所示如下：

TGCTCTAGAGCATTAAATAAGCTGACCGCTAAACG 26

实施例二：新普鲁兰酶Neopullu31369的重组表达与纯化。

将测序正确的重组表达质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中构建成工程菌株。挑取单菌落接种于Amp⁺的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，作为种子菌。先用50％甘油进行保种，再取剩余菌液按1∶100体积比接种于新鲜的 Amp⁺LB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至OD600约为0.6-0.8时，加入IPTG 至终浓度为0.1mmol/L，于18℃诱导表达过夜。4℃、7500rpm离心10min，收菌，并预留1ml菌液用于SDS-PAGE分析。用预冷的TE缓冲液(pH8.0)洗涤菌体后，再用预冷的超声缓冲液重悬菌体。以25％的功率，冰浴下超声30 min～1hr使细菌细胞破碎，4℃、8000rpm离心30min后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析检测重组蛋白质的表达情况。如图3所示，新普鲁兰酶 Neopullu31369诱导表达后，电泳结果显示在分子量68kD附近有一个明显的条带，且诱导后以可溶形式大量表达。新普鲁兰酶Neopullu31369的纯化采用亲和层析方法进行。即用5倍柱床体积的去离子水清洗HisTrapFF层析柱，然后用5倍柱床体积的超声缓冲液平衡柱子，最后上样，用平衡缓冲液洗脱去未结合的杂蛋白后，用不同浓度的咪唑洗脱结合的蛋白质，收集洗脱峰进行 SDS-PAGE检测。如图3所示，通过纯化，得到了纯化的新普鲁兰蛋白。

实施例三：新普鲁兰酶Neopullu31369对不同底物酶活力的测定。

(1)DNS法

取2个试管，分别为对照管和样品管。将两试管中各加入Tris缓冲液800μl 和底物溶液100μl，37℃水浴保温5min，然后在对照管中加入灭活的纯化酶液 (沸水浴煮沸10min)100μl，样品管中加入纯化酶液100μl，立即混匀计时，在37℃水浴中准确反应30min后加入等体积的DNS终止反应，沸水浴显色5min，冷却后在540nm分光光度计测定吸光值，每个样品重复三次，取平均值。

酶活力单位(1U)定义：在pH6.5，37℃条件下，以1min内催化产生1μmol 还原糖所需的酶量。

(2)葡萄糖标准曲线的绘制

取7支试管编号，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml的葡萄糖标准液(1mg/ml)，用蒸馏水补加至2ml，再加入1.5ml DNS，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20ml，用第一支试管调零，测定在540nm处的吸光值。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

根据葡萄糖标准曲线，新普鲁兰酶Neopullu31369酶活(EA)计算公式如下：

EA＝(OD540×1.934)/M葡萄糖×稀释倍数/反应时间

比活力＝EA/纯化酶液蛋白浓度

分别采用三种底物普鲁兰糖、可溶性淀粉和支链淀粉对酶活性进行测定，结果见表1。本发明的新普鲁兰酶Neopullu31369可以普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉均作为该酶的底物，说明该酶既可以水解α-1,4-糖苷键也可以水解α-1,6-糖苷键，属于多功能酶类。且该酶对可溶性淀粉的酶活力最高。

表1新普鲁兰酶Neopullu31369对不同底物的酶活力测定

实施例四：温度对新普鲁兰酶Neopullu31369活力的影响。

为了探讨温度对重组表达的新普鲁兰酶Neopullu31369酶活性的影响，本实验测定了4℃-80℃范围内的9个不同温度下该酶的活性，分别为4℃、16℃、 25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。测定结果表明(图4)，该新普鲁兰酶的最适温度在30℃左右，20℃至30℃时有较明显的酶活力上升现象，但当温度上升到40℃以上时，酶活力均有明显的下降趋势，综上分析，该酶对高温敏感，应属于低温酶。

实施例五：pH对新普鲁兰酶Neopullu31369活力的影响。

为了研究不同pH值对酶活力的影响，选用了四种不同的缓冲液体系进行酶活性的实验，分别为NaAc-HAc、Tris-Hcl、Gly-NaOH和Na₂HPO₄-NaOH，这四种缓冲液的pH值范围分别为3.0-6.0、6.5-8.5、9.0-10.0和11.0-12.0。将酶分别置于pH值为3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的溶液中，37℃温浴30min后测定酶活力；当pH值为6时，酶活力最高，以此酶活力为100％，其余pH值对应的酶活力折合成百分比。实验结果表明(图5)，在pH为6.0时，该酶的酶活力最高，说明它属于偏酸性酶，高于或低于最适pH时，酶活都有所下降。

实施例六：金属离子对新普鲁兰酶Neopullu31369活力的影响。

将酶分别置于1mM和10mM不同的金属离子的溶液中，37℃温浴30min 后测定酶活力，以Tris-Hcl溶液为对照组，测得的酶活力设为100％。本实验研究了10种不同的离子对酶活性的影响，实验结果如图6所示，金属离子Co²⁺、 Zn²⁺、Cu²⁺对酶的活性有极强的抑制作用，只要这三种离子的浓度达到1mM便可完全抑制该酶的活性。NH⁺对酶活力有较强的抑制作用。其他六种离子对酶的活力影响皆不相同，值得注意的是，1mM的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺对酶的活力均有不同程度的促进作用，特别是Ca²⁺对酶活力的促进作用最强。推测该酶可能是Ca²⁺依赖性的，钙离子可能有利于酶分子形成适当的构象，从而维持其活性和稳定性。

实施例七：去污剂和抑制剂对新普鲁兰酶Neopullu31369活力的影响。

将酶分别置于1％，2％，3％和4％的不同的去垢剂和变性剂中，37℃温浴 30min后测定酶活力(以Tris-Hcl溶液为对照组，测得的酶活力设为100％。研究结果如图7所示，SDS和β-巯基乙醇对酶的催化活性有强烈的抑制作用，1％的SDS的加入就可以完全抑制酶的活性，1％β-巯基乙醇可以使酶活力下降至 50％左右，β-巯基乙醇增加至3％后酶活力几乎为零。而Tween-20，TritonX-100 和尿素对酶的活力影响较小，甚至在低浓度时有一定的促进作用。该酶的这些特点将为未来的应用提供参考数据。

实施例八：有机溶剂对新普鲁兰酶Neopullu31369活力的影响。

将酶置于10％，20％和30％不同的有机溶剂中，37℃温浴30min后测定酶活力(以Tris-Hcl溶液为对照组，测得的酶活力设为100％)。从实验结果图8 来看，该酶对有机溶剂敏感，其中正丁醇对酶活力抑制最明显，10％的正丁醇溶液中，酶活力就几乎为零。该酶在10％的甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯中，可以保持50％以上的酶活力。但当有机溶剂为20％及以上时，酶活力受到极大的抑制。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种新普鲁兰酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的新普鲁兰酶的基因，其核苷酸序列具体为序列表SEQ ID NO.1所示。

3.用于权利要求2所述的新普鲁兰酶的基因特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

上游引物见序列表中SEQ ID No.3；

下游引物见序列表中SEQ ID No.4。

4.一种表达载体，所述的表达载体含有权利要求3所述核苷酸片段。

5.权利要求4所述的表达载体，其具体为pCold-Neopullu31369。

6.一种表达工程菌，其携带有权利要求4或5所述的表达载体。

7.权利要求6所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。