CN105200070A - 普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种能够提高普鲁兰酶比酶活和热稳定性的普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体、及该载体在普鲁兰酶制备中的应用。该基因与保藏编号CGMCC？NO.10357的变栖克雷伯氏菌HN7的野生型普鲁兰酶基因相比，其去除信号肽后N端缺少31个氨基酸对应的碱基序列，具体序列如序列表所示。本发明同时利用基因工程手段提供了一种含有该基因的载体，将该载体用于普鲁兰酶制备后，与原始出发菌株变栖克雷伯氏菌HN7（<i>Klebsiella</i><i>？variicola</i>？？HN7）相比，所制得的普鲁兰酶的比酶活、热稳定性以及对普鲁兰糖的底物亲和能力和催化效率都有了极大提高，显现出较好的应用前景。

Description

普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种能够提高普鲁兰酶比酶活和热稳定性的普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体、及该载体在普鲁兰酶制备中的应用。

背景技术

淀粉是地球上比较丰富的生物质资源，它的主要组成单位是葡萄糖。淀粉除了直接作为食品原料外，还可通过化学或生物的方法生成其他有价值的物质，包括：氨基酸、葡萄糖浆、有机酸、酒精等。淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的混合物，其中直链淀粉是由葡萄糖单体通过α-1,4糖苷键形成的，支链淀粉的主链是由直链淀粉组成，其分支处则由α-1,6糖苷键形成。

工业应用淀粉中支链淀粉含量高达70%～95%，其中α-1,6键的含量是4%～5%，然而大多数的淀粉酶对α-1,6糖苷键均不起作用，α-淀粉酶和糖化酶联合使用时也不能达到对淀粉的完全分解，因此α-1,6糖苷键的水解效率直接影响到工业淀粉的利用率。

普鲁兰酶是一种脱支酶，能催化普鲁兰糖中α-1,6糖苷键的水解。普鲁兰酶可以专一性切下支链淀粉的整个支链，从而形成直链淀粉，因此普鲁兰酶在淀粉工业中具有十分重要的作用。

根据普鲁兰酶作用的底物特异性，可将普鲁兰酶分为两类：I型普鲁兰酶（EC.3.2.1.41），可以专一性水解寡糖分支处和普鲁兰糖中的α-1,6糖苷键，形成直链多糖、麦芽三糖；Ⅱ型普鲁兰酶（EC.3.2.1.1/41），又称淀粉普鲁兰酶，不仅可以水解寡糖分支处、普鲁兰糖中的α-1,6糖苷键，同时也可水解淀粉中的α-1,4糖苷键。

普鲁兰酶在工业上的应用非常广泛，但是大部分普鲁兰酶的酶活不高，或者不能适应酸性高温的作用环境，这些因素严重的制约了普鲁兰酶的工业应用。

我国对普鲁兰酶的研究始于20世纪70年代，起步相对较晚。目前国内市场对普鲁兰酶的需求量很大，主要依赖进口，价格昂贵，因此，国内掀起了一股研究普鲁兰酶的热潮。由于从自然界筛选普鲁兰酶产生菌具有很大的盲目性，因此越来越多的科研工作者把重点放在了酶的固定化、基因工程、蛋白质工程上面，并取得了一定的成果。

发明内容

本发明目的是提供一种普鲁兰酶产酶基因，同时本发明提供了一种含有该基因的载体，将该载体用于制备普鲁兰酶后，所制备的普鲁兰酶具有较好地热稳定性和比酶活，显现出了较好地潜在应用价值。

本发明的技术方案详细介绍如下。

一种普鲁兰酶产酶基因，该基因含有3156个碱基，与保藏编号CGMCCNO.10357的变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）的野生型普鲁兰酶基因相比，其信号肽N端缺少31个氨基酸对应的碱基序列，具体序列如序列表SEQIDNO.1所示。

上述普鲁兰酶产酶基因所编码的普鲁兰酶pulA-N31，含有1052个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

含有普鲁兰酶产酶基因的载体，通过下述步骤制备而成：

（1）提取基因组DNA，提取变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）的基因组DNA；

（2）PCR扩增，具体为，以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，设计如下引物序列，PCR扩增变栖克雷伯氏菌HN7的普鲁兰酶（pulA）基因，扩增产物切胶纯化后4℃保存备用；

引物序列设计如下：

上游引物F：5′-TATGATCATATGCTCAGATATACCTGTCATGCCCTATT-3′，

下游引物R：5′-AACTCTGCGGCCGCTTTACTGCTCACCGGCAGG-3′；

需要说明的是，上游引物F中的CATATG部分序列为NdeⅠ酶切位点，NdeⅠ识别位点中的ATG为起始翻译密码子，下游引物R中的GCGGCCGC部分序列为NotⅠ酶切位点；

（3）构建pMD19-pulA质粒，具体为，将步骤（2）中PCR扩增产物与pMD19-T质粒16℃下连接16h，然后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，培养12~16h；提取pMD19-pulA质粒，测序验证；

（4）构建pET21a–pulA表达载体，具体为，

将（4）中测序正确的pMD19-pulA质粒和pET21a在37℃进行NdeⅠ、NotⅠ双酶切16h，胶回收目的条带；

将上述胶回收产物16℃条件下，T4DNA连接酶连接16h；

连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，提取质粒进行测序验证；

（5）反向PCR，以（4）中测序正确的表达载体pET21a-pulA为模板，设计引物，反向PCR扩增获得去信号肽N端减少31个氨基酸基因序列的线性序列产物，线性序列产物切胶纯化后4℃保存备用；

引物序列设计如下：

上游引物F-N31：5′-CATGCTCTAGATGTGATAACAGCTCTTCCTCTTCACC-3′，

下游引物R-N31：5′-GATGTGGTCGTCCGCTTACCG-3′；

（6）酶连获得pET21a-pulA-N31表达载体，具体为，将步骤（5）中所获得线性序列产物用T4DNA连接酶进行连接构建pET21a-pulA-N31表达载体，然后用DpnⅠ酶对酶连体系进行酶切处理，以去除体系内不必要物质。

所述含有普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用，具体步骤如下：

（1）热激转化构建普鲁兰酶截短突变体工程菌，具体为，将所构建的pET21a-pulA-N31表达载体（或连接产物）用热激法转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，复苏后将感受态细胞涂布在含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，培养12~16h；

培养结束后，挑取LB平板上的阳性单克隆菌落，用菌落PCR筛选阳性克隆。同时接种到Amp终浓度为0.1mg/mL的液体LB培养基中，37℃、220r/min培养12~16h；用solarbio质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切验证。

（2）诱导表达，对步骤（1）中鉴定正确的阳性克隆接种到Amp和IPTG的终浓度分别是0.1mg/mL和0.6mmol/L的LB培养基中，进行诱导表达；

（3）获得酶pulA-N31，具体为，

取步骤（2）中菌液，4℃、6000r/min、离心10min，收集菌体，加入1×E/W（pH7.0）使菌体充分混匀，放置冰上进行超声波破碎（3s×4s×99次），4℃、6000r/min，离心30min，将上清4℃保存；

将上述上清分装到1.5mL的离心管中，4℃、12000r/min离心30min，弃沉淀，上清液即为粗酶液；

Co²⁺螯合琼脂糖凝胶即可纯化该粗酶液。

上述含有普鲁兰酶产酶基因的载体、及含有普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用的过程，也即普鲁兰酶pulA-N31的制备过程。

由于从自然界筛选普鲁兰酶产生菌具有很大的盲目性，而且筛到的普鲁兰酶的酶活普遍较低，温度和pH的作用范围也不能满足工业生产的需要。发明提供了一种普鲁兰酶产酶基因，同时利用基因工程操作手段提供了一种含有该基因的载体，将该载体用于普鲁兰酶制备后，与原始出发菌株变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）相比，所制得的普鲁兰酶的比酶活、热稳定性以及对普鲁兰糖的底物亲和能力和催化效率都有了极大提高，显现出较好地应用前景。

附图说明

图1为普鲁兰酶基因pulA的PCR扩增图，其中M是λHindⅢmarker，1是pulA基因的PCR产物；2-7是基因组DNA；

图2为重组质粒pMD19-pulA，其中M是λHindⅢmarker，1是pMD19-pulA，2是pMD19-TVector；

图3为重组质粒pMD19-pulA的NdeⅠ、NotⅠ双酶切图，其中M是λHindⅢmarker，1是pMD19-pulANdeⅠ、NotⅠ的双酶切；

图4为重组质粒pET21a-pulA图，其中M是λHindⅢmarker，1是pET-21a，2-4是pET21a-pulA；

图5为pET21a-puA-N31的PCR产物电泳检测图，其中M是λHindⅢmarker，1是线性pET21a-pulA，2线性是pET21a-puA-N31；

图6为SDS-PAGE检测pulA和pulA-N31胞内可溶性粗酶，其中M是proteinmarker，1是pulA，2是pulA-N31；

图7为SDS-PAGE检测pulA和pulA-N31胞内可溶性纯酶，其中M是proteinmarker，1是pulA，2是pulA-N31；

图8为pulA和pulA-N31的最适pH；

图9为pulA和pulA-N31的最适温度；

图10为pulA和pulA-N31半衰期；

图11为pulA和pulA-N31的Hanes-Woolf曲线（普鲁兰糖作为底物）。

具体实施方式

在介绍具体实施例前，首先对实施例中所用到的部分原料和试剂简要介绍说明如下，未说明内容以现有技术中常用原料和试剂为准。

实验菌株：本申请中所用变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）目前保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCCNO.10357；由于该菌株是申请人自行筛选获得，因而申请人留有相关菌株的备份。

微生物培养所用培养基

斜面保藏培养基（w/v）：糯米粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，KH₂PO₄0.05%，MgSO₄·7H₂O0.01%，琼脂2.0%，pH6.0；

种子培养基（w/v）：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，NaCl0.5%，pH6.0；

产酶培养基（w/v）：糯米粉0.5%，蛋白胨0.5%，KH₂PO₄0.05%，MgSO₄·7H₂O0.01%，pH自然；

LB培养基（w/v）：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl1%，（固体培养基含1.5%琼脂粉）；

以上培养基均需要121℃、高压蒸汽灭菌30min。

部分试剂与酶

普鲁兰糖为东京化成工业株式会社产品；

支链淀粉为Sigma公司产品；

玉米淀粉是阿拉丁公司产品；

琼脂糖胶DNA产物回收试剂盒、牛血清蛋白(BSA)、甘氨酸、EDTA、氨苄青霉素Amp、Tris、SDS、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、可溶性淀粉、酵母提取物（YeastExtract）、胰蛋白胨（Trytone）、琼脂糖（Agarose）均购自上海生工生物工程有限公司；

基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购买于Solarbio；

DNA分子量Marker(λHindⅢ)、高分子量蛋白质Marker、NdeⅠ、NotⅠ、T4DNALigase（连接酶）、pMD19-T载体和Co²⁺树脂都购买于TaKaRa公司；

pET21a载体购买于优宝生物；

丙三醇、冰乙酸、氯化钙、考马斯亮蓝、甲醇、无水乙醇、柠檬酸、氯化钠、磷酸氢二钠等为分析纯，购买于河南金图化学试剂有限公司；

Q5超保真DNA聚合酶，限制性内切酶DpnⅠ从NEB购买；

相关引物由北京华大基因公司合成提供；

相关基因测序由金唯智生物技术公司完成。

实施例1

本发明所提供的普鲁兰酶产酶基因，与保藏编号CGMCCNO.10357的变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）的野生型普鲁兰酶基因相比，其去信号肽N端缺少31个氨基酸对应的基因序列，具体序列如序列表所示。

由于本发明的普鲁兰酶产酶基因与变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）的野生型普鲁兰酶基因较为接近，因而申请人以变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）野生型为基础，同时构建了含有普鲁兰酶产酶基因的载体，具体构建过程介绍如下。

（1）提取基因组DNA，具体为，将试管中斜面保藏培养的变栖克雷伯氏菌HN7（KlebsiellavariicolaHN7）接种到种子培养基中，收集菌体，按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，然后进行琼脂糖凝胶验证，电泳结果如图1所示。

（2）PCR扩增，具体为，

首先设计引物序列设计如下：

上游引物F：5′-TATGATCATATGCTCAGATATACCTGTCATGCCCTATT-3′，

下游引物R：5′-AACTCTGCGGCCGCTTTACTGCTCACCGGCAGG-3′；

需要说明的是，上游引物F中的CATATG部分序列为NdeⅠ酶切位点，NdeⅠ识别位点中的ATG为起始翻译密码子，下游引物R中的GCGGCCGC部分序列为NotⅠ酶切位点；

以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，PCR扩增变栖克雷伯氏菌HN7的普鲁兰酶（pulA）基因，25μLPCR扩增体系设置如下：

Mix，12.5μL；

上游引物F（25μmol/L），0.5μL；

下游引物R（25μmol/L），0.5μL；

步骤（1）中所提取DNA模板，2μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸3min，共30个循环，72℃延伸10min；

扩增产物进行琼脂糖凝胶验证，结果如图1所示，切胶纯化后4℃保存备用。

（3）构建pMD19-pulA质粒，具体为，

将步骤（2）中PCR扩增产物与pMD19-T质粒16℃下连接16h，10μL连接体系设置如下：

纯化后的pulA，5.0μL；

pMD19-TVector，0.5μL；

SolutionⅠ，4.5μL；

将连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中；

转化产物接种到Amp终浓度为0.1mg/mL的液体LB中，37℃、220r/min培养12~16h；

12000r/min离心2min收集菌体，按照Solarbio质粒小提试剂盒的说明书提取质粒，进行琼脂糖胶验证，电泳结果如图2所示，然后送金唯智生物技术公司测序验证。验证结果表明所制备的pMD19-pulA质粒序列符合预期，构建正确。

（4）构建pET21a–pulA表达载体，具体为，

将步骤（3）中测序正确的pMD19-pulA质粒和pET21a在37℃进行NdeⅠ、NotⅠ双酶切16h，酶切体系设置如下：

质粒模板，14.0μL；

NdeⅠ，1.0μL；

NotⅠ，1.0μL；

BSA，2.0μL；

10×H，5.0μL；

酶切结果如图3所示，胶回收目的条带；

将上述胶回收产物16℃条件下，T4DNA连接酶连接16h，酶连体系设置如下：

10×T4DNAligasebuffer，1.0μL；

双酶切纯化的pulA，6.0μL；

双酶切纯化的pET-21a（+），2.0μL；

T4DNA连接酶，1.0μL；

连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，提取质粒进行琼脂糖胶验证，结果如图4所示，然后送金唯智生物技术公司测序验证。验证结果表明载体序列构建正确。

（5）反向PCR，具体为，首先设计引物序列设计如下：

上游引物F-N31：5′-CATGCTCTAGATGTGATAACAGCTCTTCCTCTTCACC-3′，

下游引物R-N31：5′-GATGTGGTCGTCCGCTTACCG-3′；

以（4）中测序正确的表达载体pET21a-pulA为模板，反向PCR扩增获得去信号肽N端去除31个氨基酸基因序列的线性序列产物，50μLPCR扩增体系设计如下：

Q5酶（2U/μL），0.5μL；

DNA模板（步骤4中所制备pET21a-pulA载体），1.0μL；

上游特异引物F，2.5μL；

下游特异引物Rn31，2.5μL；

5×Q5反应缓冲液，10.0μL；

2.5mMdNTPs，4.0μL；

ddH₂O，29.5μL；

PCR反应条件：98℃预变性30S；98℃变性20s、66℃退火25s、72℃延伸6min，30个循环；72℃延伸2min；

然后进行琼脂糖胶验证，结果如图5所示。按琼脂糖胶DNA产物回收试剂盒说明书将PCR扩增产物回收纯化，4℃保存备用。

（6）酶连获得pET21a-pulA-N31表达载体，具体为，

将步骤（5）中所获得线性序列产物16℃用T4DNA连接酶连接16h，构建pET21a-pulA-N31表达载体，然后65℃灭活30min，其酶连体系设置如下：

PCR纯化后基因（步骤5中回收后纯化产物），2.0μL；

T4DNAligase，1.0μL；

10XT4DNALigasebufffer，1.0μL；

ddH₂O，6.0μL；

对上述酶切体系用DpnⅠ对酶连体系酶切处理，用于消解模板；其酶切体系设置如下：

上述酶连体系，10.0μL；

10×NEB缓冲液，5.0μL；

DpnI，2.0μL；

ddH₂O，33.0μL；

反应条件：37℃酶切3h，80℃灭活20min，4℃保存备用，此时即为含有pET21a-pulA-N31表达载体的混合物。

实施例2

将实施例1所制备的含有普鲁兰酶产酶基因的载体用于普鲁兰酶制备中，具体步骤如下：

（1）热激转化构建普鲁兰酶截短突变体工程菌，具体为，

将实施例1所构建的pET21a-pulA-N31表达载体用热激法转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，复苏后将感受态细胞涂布在含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，培养；详细为：

本实施例为操作简便期间，直接将10μL连接产物加入到200μL大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，轻轻吹打均匀，冰置30min，然后42℃热激90s，再冰置90s，复苏后将感受态细胞涂布在Amp终浓度为0.1mg/mL的LB平板上，37℃培养12~16h；

培养结束后，挑取LB平板上的阳性单克隆菌落，用菌落PCR筛选阳性克隆。同时接种到Amp终浓度为0.1mg/mL的液体LB中，37℃、220r/min培养12~16h；用solarbio质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切验证。

（2）诱导表达，具体为：

对步骤（1）中鉴定正确的阳性克隆接种到Amp终浓度为0.1mg/mL的LB培养基上，37℃培养12~16h；

吸取2mL菌液接种到200mLAmp的终浓度是0.1mg/mL液体LB培养基中，37℃、220r/min培养2h～3h至OD值达到0.6左右；

加入IPTG使终浓度是0.6mmol/L，180r/min、28℃培养8h，进行诱导表达。

（3）获得酶pulA-N31，具体为，

取步骤（2）中菌液，4℃、6000r/min、离心10min，收集菌体，加入1×E/W（pH7.0）使菌体充分混匀，放置冰上进行超声波破碎（3s×4s×99次），4℃、6000r/min，离心30min，将上清4℃保存；

将上述上清分装到1.5mL的离心管中，4℃、12000r/min离心30min，弃沉淀，上清液即为粗酶液；结果如图6所示。

Co²⁺螯合琼脂糖凝胶即可得到纯化的pulA-N31，结果如图7所示。

实验检验

对于所制备提纯后的pulA-N31的酶学性质，申请人做了进一步的分析测定，并与野生型酶pulA（野生型的普鲁兰酶基因连接在PET21a上，并在大肠杆菌BL21中表达，具体步骤可参考上述实施例1、2，不再重复介绍说明）的酶学性质进行比较，简要介绍如下。

最适pH值的测定

首先配制不同pH的柠檬酸-磷酸缓冲液，pH依次为：4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8；然后在45℃条件下保温15min，测定pulA-N31的酶活，每个反应设置3个平行求其平均值，以灭活的酶液作为对照。

结果如图8所示。测定结果表明，pulA-N31的最适pH是5.6，与pulA（野生型原始普鲁兰酶）相比，pulA-N31的最适pH向酸性范围偏移了0.4个单位，说明本发明所提供的新的普鲁兰酶pulA-N31更加适用于酸性环境。

最适温度的测定

首先设置不同的温度梯度：38℃、42℃、45℃、48℃、51℃、54℃；然后在最适pH下测定其酶活，每个反应设置3个平行求其平均值，将灭活的酶液作为对照。

结果如图9所示。测定结果表明，pulA-N31的最适温度为45℃，与pulA的最适温度相同，说明本申请所提供的新的普鲁兰酶pulA-N31虽然氨基酸序列受到了截短，但是对酶的作用温度没有明显的影响。

半衰期的测定

对所制备的粗酶液直接进行半衰期的测定，具体为：每隔两分钟取出（从2min至30min)取出100μL酶液，然后在pulA-N31酶的最适温度、最适pH下测定其残余酶活，每个反应设置3个平行求其平均值，把没有保温处理的酶活设定为100%。

结果如图10所示。测定结果表明，pulA-N31的半衰期是37min，与pulA相比，pulA-N31的半衰期得到了很大的提高，是pulA的6.17倍。推测其原因是N段区域具有较大的柔性，这些结构域会对普鲁兰酶的稳定性造成负面影响。

普鲁兰酶酶活的测定

利用DNS法测定普鲁兰酶的酶活，具体为，在冰浴条件下，每100μL酶液，加入100μL1%普鲁兰糖、100μL的缓冲液，45℃保温15min，

加入600μLDNS溶液终止反应，煮沸10min显色，冷却后用蒸馏水定容至5mL，混匀，在540nm波长下测定还原糖含量（以葡萄糖计）；

以灭活后的酶加入底物的酶液作为空白对照。

酶活定义：在最适条件下，以每分钟水解普鲁兰糖产生相当于1μmol麦芽三糖的还原力所需要的酶量定义为一个酶活单位（IU）。

测定结果表明，本发明所提供的突变体酶pulA-N31的比酶活为582.204U/mg，而pulA比酶活是362.316U/mg，本发明所构建的pulA-N31的比酶活是pulA的1.6倍。

酶促动力学性质测定

利用普鲁兰糖为底物，分别配制0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1%的溶液，取100μL酶液与100μL不同浓度的底物在其最适温度和pH条件下反应8min，检测其酶活；

通过计算还原糖浓度，算出不同底物浓度下酶的不同反应速度V；

根据Hanes-Woolf双作图法以[S]/V-[S]作图，得到一条直线，横轴的截距为-Km，斜率为1/Vmax，通过计算得到Km，Vmax以及Kcat值等。

结果如图11所示。动力学分析显示，以普鲁兰糖为底物时，pulA-N31的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为0.0013μmoL/mL·S、191.80S^-1、0.30mg/mL、693.30，与pulA相比，pulA-N31的Km值减小，即与底物亲和力增加，同时催化效率是pulA的2倍。

SEQUENCELISTING

<110>河南农业大学

<120>普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体及其应用

<130>none

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>3156

<212>DNA

<213>Klebsiellavariicola

<400>1

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ccgcacgcgcagaaaaccaaagccgacctggcgaaaatgacgatccacgagtcgcatatt1200

cgcgatctctctgcctgggatcaaaccgttcccgccgaactgcgcggtaagtatctggcg1260

ctcaccgcccaggagagcaatatggtccagcatctgaaacagctgtcggcctcgggagtg1320

acccatattgagctgctgccggtcttcgatctggcgacggtcaatgagttcagcgacaaa1380

gtcgccgatattcagcagccgttcagtcgcctgtgcgagatcaacagcgcggtgaagagc1440

agcgagttcgcgggctattgcgacagcggttcgacggtcgaagaggtgctgacccagctg1500

aagcagaacgacagcaaggataacccgcaggtgcaggcgttgaatacgctggtggcgcag1560

accgactcctataactggggctacgatccgttccactacacggtgccggaaggatcctac1620

gccaccgatccggaaggcacggcgcgcattaaagagttccgcaccatgattcaggcgatc1680

aagcaggatctgggaatgaacgtcattatggacgtggtgtacaaccacaccaacgccgcc1740

ggcccgaccgaccgcacctcggtgctggataagatcgtcccctggtactatcagcgcctg1800

aatgaaaccaccggcagcgtggaatcggccacctgttgctccgactcggcgccagagcac1860

cggatgttcgccaagcttatcgccgattcactggcggtatggaccaccgattataagatc1920

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gagcgcattaaagcgctgaatccggacatttatttctttggtgaaggctgggattccaac2040

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ttctccgatcgtctgcgcgacgccgtgcgcggtggcgggccgttcgattccggcgatgca2160

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atgaccgacgatcaggcgcgccacctcgccgatctgacccgtctgggcatggccggtaac2280

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aaacacgacaaccaaacgctgtgggacatgatcagctataaagctgctcaggaggcggat2460

ctcgatacccgcgtccggatgcaggcggtgtcgctggcgacggtgatgctcggccagggg2520

atcgcctttgaccagcagggctcggagctgctgcgctctaaatcttttacccgcgattcg2580

tatgattccggtgactggtttaaccgcgtggattactccctgcaggacaacaactacaac2640

gtgggtatgccgcgcagcagcgatgatggcagcaactatgacattatcgcccgggtgaaa2700

gacgcggtggctactccgggtgaaacggagctcaagcagatgaccgcgttttatcaggag2760

ctgaccgcgctgcgtaaatcgtctccgctgtttaccctcggtgacggcgcgacggtgatg2820

aagcgcgtggacttccgcaacaccggcgccgatcagcagacgggtctgctggtgatgacc2880

atcgatgatgggatgcaggctggcgccagtctggacagccgtgtcgacggcatcgtggtg2940

gcgatcaacgccgcaccggaaagccggacgctgcaggacttcgccggcacatcgctgcag3000

ctgagcgccatccagcaggcggcaggcgaccgttcgctggcgagcggcgtgcaggttgcc3060

gctgacggctcggtcacgctgccggcctggtcggtagcggttctcgagctgcgacagggg3120

gaatcgcagggcgctggcctgccggtgagcagtaaa3156

<210>2

<211>1052

<212>PRT

<213>Klebsiellavariicola

<400>2

AspValValValArgLeuProAspValAlaValProGlyGluAlaAla

151015

GlnAlaSerAlaAsnGlnAlaValIleHisLeuValAspIleAlaGly

202530

IleThrSerSerThrProAlaAspTyrAlaThrLysAsnLeuTyrLeu

354045

TrpAsnAsnGluThrCysAspAlaLeuSerAlaProValAlaAspTrp

505560

AsnAspValSerThrThrProThrGlySerAspLysTyrGlyProTyr

65707580

TrpValIleProLeuThrLysGluSerGlyCysIleAsnValIleVal

859095

ArgAspGlyThrAsnLysLeuIleAspSerAspLeuArgValSerPhe

100105110

GlyAspPheThrAspArgThrValSerValIleAlaGlyAsnSerAla

115120125

ValTyrAspSerArgAlaAspAlaPheArgAlaAlaPheGlyValAla

130135140

LeuAlaAspAlaHisTrpValAspLysThrThrLeuLeuTrpProGly

145150155160

GlyGluAsnLysProIleValArgLeuTyrTyrSerHisSerSerLys

165170175

ValAlaAlaAspSerAsnGlyGluPheThrAspLysTyrValLysLeu

180185190

ThrProThrThrValSerGlnGlnValSerMetArgPheProHisLeu

195200205

AlaSerTyrProAlaPheLysLeuProAspAspValAsnValAspGlu

210215220

LeuLeuGlnGlyGluThrValAlaIleSerAlaGluSerAspGlyIle

225230235240

LeuSerSerAlaThrGlnValGlnThrAlaGlyValLeuAspAspThr

245250255

TyrAlaAlaAlaAlaGluAlaLeuSerTyrGlyAlaGlnLeuThrAsp

260265270

SerGlyValThrPheArgValTrpAlaProThrAlaGlnGlnValGlu

275280285

LeuValValTyrSerAlaAspLysLysValValAlaSerHisProMet

290295300

ThrArgAspSerAlaSerGlyAlaTrpSerTrpGlnGlyGlySerAsp

305310315320

LeuLysGlyAlaPheTyrArgTyrAlaMetThrValTyrHisProGln

325330335

SerArgLysValGluGlnTyrGluValThrAspProTyrAlaHisSer

340345350

LeuSerThrAsnSerGluTyrSerGlnValValAspLeuAsnAspSer

355360365

AlaLeuLysProGluGlyTrpAspGlyLeuThrMetProHisAlaGln

370375380

LysThrLysAlaAspLeuAlaLysMetThrIleHisGluSerHisIle

385390395400

ArgAspLeuSerAlaTrpAspGlnThrValProAlaGluLeuArgGly

405410415

LysTyrLeuAlaLeuThrAlaGlnGluSerAsnMetValGlnHisLeu

420425430

LysGlnLeuSerAlaSerGlyValThrHisIleGluLeuLeuProVal

435440445

PheAspLeuAlaThrValAsnGluPheSerAspLysValAlaAspIle

450455460

GlnGlnProPheSerArgLeuCysGluIleAsnSerAlaValLysSer

465470475480

SerGluPheAlaGlyTyrCysAspSerGlySerThrValGluGluVal

485490495

LeuThrGlnLeuLysGlnAsnAspSerLysAspAsnProGlnValGln

500505510

AlaLeuAsnThrLeuValAlaGlnThrAspSerTyrAsnTrpGlyTyr

515520525

AspProPheHisTyrThrValProGluGlySerTyrAlaThrAspPro

530535540

GluGlyThrAlaArgIleLysGluPheArgThrMetIleGlnAlaIle

545550555560

LysGlnAspLeuGlyMetAsnValIleMetAspValValTyrAsnHis

565570575

ThrAsnAlaAlaGlyProThrAspArgThrSerValLeuAspLysIle

580585590

ValProTrpTyrTyrGlnArgLeuAsnGluThrThrGlySerValGlu

595600605

SerAlaThrCysCysSerAspSerAlaProGluHisArgMetPheAla

610615620

LysLeuIleAlaAspSerLeuAlaValTrpThrThrAspTyrLysIle

625630635640

AspGlyPheArgPheAspLeuMetGlyTyrHisProLysAlaGlnIle

645650655

LeuSerAlaTrpGluArgIleLysAlaLeuAsnProAspIleTyrPhe

660665670

PheGlyGluGlyTrpAspSerAsnGlnSerAspArgPheGluIleAla

675680685

SerGlnIleAsnLeuLysGlyThrGlyIleGlyThrPheSerAspArg

690695700

LeuArgAspAlaValArgGlyGlyGlyProPheAspSerGlyAspAla

705710715720

LeuArgGlnAsnGlnGlyGlyGlySerGlyAlaGlyValGlnProAsn

725730735

GluLeuThrSerMetThrAspAspGlnAlaArgHisLeuAlaAspLeu

740745750

ThrArgLeuGlyMetAlaGlyAsnLeuAlaAspPheValLeuIleAsp

755760765

LysAspGlyAlaValLysLysGlySerGluIleAspTyrAsnGlyAla

770775780

ProGlyGlyTyrAlaAlaAspProThrGluValValAsnTyrValSer

785790795800

LysHisAspAsnGlnThrLeuTrpAspMetIleSerTyrLysAlaAla

805810815

GlnGluAlaAspLeuAspThrArgValArgMetGlnAlaValSerLeu

820825830

AlaThrValMetLeuGlyGlnGlyIleAlaPheAspGlnGlnGlySer

835840845

GluLeuLeuArgSerLysSerPheThrArgAspSerTyrAspSerGly

850855860

AspTrpPheAsnArgValAspTyrSerLeuGlnAspAsnAsnTyrAsn

865870875880

ValGlyMetProArgSerSerAspAspGlySerAsnTyrAspIleIle

885890895

AlaArgValLysAspAlaValAlaThrProGlyGluThrGluLeuLys

900905910

GlnMetThrAlaPheTyrGlnGluLeuThrAlaLeuArgLysSerSer

915920925

ProLeuPheThrLeuGlyAspGlyAlaThrValMetLysArgValAsp

930935940

PheArgAsnThrGlyAlaAspGlnGlnThrGlyLeuLeuValMetThr

945950955960

IleAspAspGlyMetGlnAlaGlyAlaSerLeuAspSerArgValAsp

965970975

GlyIleValValAlaIleAsnAlaAlaProGluSerArgThrLeuGln

980985990

AspPheAlaGlyThrSerLeuGlnLeuSerAlaIleGlnGlnAlaAla

99510001005

GlyAspArgSerLeuAlaSerGlyValGlnValAlaAlaAspGly

101010151020

SerValThrLeuProAlaTrpSerValAlaValLeuGluLeuArg

102510301035

GlnGlyGluSerGlnGlyAlaGlyLeuProValSerSerLys

104010451050

Claims (6)

1.一种普鲁兰酶产酶基因，其特征在于，与保藏编号CGMCCNO.10357的变栖克雷伯氏菌HN7的野生型普鲁兰酶基因相比，其信号肽N端缺少31个氨基酸对应的碱基序列，具体序列如序列表SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因所编码的普鲁兰酶pulA-N31，其特征在于，普鲁兰酶pulA-N31的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。

3.权利要求2所述普鲁兰酶pulA-N31的制备方法，其特征在于，首先构建含有权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因的载体pET21a-pulA-N31，然后将该载体用于制备普鲁兰酶pulA-N31。

4.含有权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因的载体，其特征在于，通过下述步骤制备而成：

（1）提取基因组DNA，提取变栖克雷伯氏菌HN7的基因组DNA；

（2）PCR扩增，具体为，以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，设计如下引物序列，PCR扩增变栖克雷伯氏菌HN7的普鲁兰酶pulA基因，扩增产物切胶纯化后保存备用；

引物序列设计如下：

上游引物F：5′-TATGATCATATGCTCAGATATACCTGTCATGCCCTATT-3′，

下游引物R：5′-AACTCTGCGGCCGCTTTACTGCTCACCGGCAGG-3′；

（3）构建pMD19-pulA质粒，将步骤（2）中PCR扩增产物与pMD19-T质粒连接；

（4）构建pET21a–pulA表达载体，将步骤（3）中测序正确的pMD19-pulA质粒进行NdeⅠ、NotⅠ双酶切16h，回收目的条带并连接；

（5）反向PCR，以步骤（4）中测序正确的表达载体pET21a-pulA为模板，设计引物，反向PCR扩增获得去除信号肽N端截去31个氨基酸基因序列的线性序列产物，线性序列产物切胶纯化后保存备用；

引物序列设计如下：

上游引物F-N31：5′-CATGCTCTAGATGTGATAACAGCTCTTCCTCTTCACC-3′，

下游引物R-N31：5′-GATGTGGTCGTCCGCTTACCG-3′；

（6）酶连获得pET21a-pulA-N31表达载体，将步骤（5）中所获得线性序列产物进行酶连接构建pET21a-pulA-N31表达载体，然后用DpnⅠ对酶连体系进行酶切处理。

5.权利要求4所述含有权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用，其特征在于，具体步骤如下：

（1）热激转化构建普鲁兰酶截短突变体工程菌，具体为，将所构建的pET21a-pulA-N31表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，培养，获得构建正确的普鲁兰酶截短突变体工程菌；

（2）诱导表达，将步骤（1）中鉴定正确的阳性克隆接种到LB培养基中培养，IPTG诱导表达；

（3）获得酶pulA-N31，取步骤（2）中菌液破碎、离心，搜集上清液即为粗酶液。

6.如权利要求5所述含有权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用，其特征在于，采用Co²⁺螯合琼脂糖凝胶纯化粗酶液。