CN103122342B - 一种耐热葡萄糖淀粉酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的耐热葡萄糖淀粉酶是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）具有SEQ ID NO.22所示氨基酸序列；（b）具有与SEQ ID NO.22所示氨基酸序列至少70%同源性的序列。本发明提供的编码基因是如下（1）-（3）的脱氧核糖核苷酸：（1）具有SEQ ID NO.20的所示核苷酸序列；（2）具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列；（3）具有与（1）或（2）所示核苷酸序列至少70%同源性的序列。本发明提供的重组宿主细胞包括具有上述编码基因的重组表达载体。根据本发明的葡萄糖淀粉酶最适温度高于70℃，热稳定性好，适于工业上应用的要求。本发明提供的重组宿主细胞适于上述葡萄糖淀粉酶基因的表达，通过摇瓶诱导表达，其中KM71蛋白表达量达到0.7g/L，具有产业化应用前景。

Description

一种耐热葡萄糖淀粉酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种具有较好的热稳定性的葡萄糖淀粉酶，本发明还涉及该耐热葡萄糖淀粉酶的编码基因与应用。

背景技术

葡萄糖淀粉酶(α-1,4-Glucanglucohydrolases,EC3.2.1.3)是一种具有外切活性的糖苷酶，它能以淀粉、糊精等多糖或者寡糖碳链为底物，从非还原末端逐个水解α-1,4-糖苷键，生成β-D-葡萄糖，也能缓慢水解支链淀粉α-1,6葡萄糖苷键，生成葡萄糖，是水解淀粉生成葡萄糖过程中的主要酶类之一，在食品加工、乙醇生产和酿造领域具有重要商业价值。

当前市场上应用的葡萄糖淀粉酶基本都是由黑曲霉发酵生产得到，虽然酶活力较高，但是最适温度较低，导致在淀粉加工工艺过程中，在糖化之前必须先进行降温处理，工艺繁琐且增加能耗；且黑曲霉葡萄糖淀粉酶热稳定性不好，高温下很快失活，也导致了生产成本的增加。另一方面，例如在葡萄糖的生产中糖化酶需要在酸性条件下作用，因此迫切需要寻找一种在酸性条件下具有良好热稳定性的葡萄糖淀粉酶。

国内外虽然筛选出多种新的葡萄糖淀粉酶生产菌，但普遍因为表达活力很低，而限制了在工业上的应用。因此，如何筛选到既具有优良性质，又可以获得高表达活力的葡萄糖淀粉酶生产菌成为研究热点。早在1980年，Somkuti和Steinberg曾报道微小毛霉(Rhizomucor pusillus)能产嗜热嗜酸的淀粉酶（Somkuti,G.A.and D.H.Steinberg.1980.Thermoacidophilic extracellularα-amylase for Mucor pusillus.Dev.Ind.Microbiol.21,327-337.）；1987年，Keisuke Ishimatsu和Masahiro Nakao分离到一株新的微小毛霉(Rhizomucor pusillus)，从发酵液中纯化了葡萄糖淀粉酶，具有生淀粉酶水解活力（WerasitKanilayakrit,Keisuke Ishimatsu,Masahiro Nakao,and Shinsaku Hayashida.1987.Characteriticsof Raw-Starch-Digesting Glucoamylase from Thermophilic Rhizomucor pusillus.J.Ferment.Technol.,Vol.65,No.4,379-385.）；2005年，Tony M.Silva等筛选到一株微小毛霉，测定发酵粗酶液糖化酶活力，最适作用pH5.0，最适作用温度75℃（Tony M.Silva,etc.2005.Production of Saccharogenic and Dextrinogenic Amylases by Rhizomucor pusillus A13.36.TheJournal of Microbiology.Vol.43No.6,561-568.）。但微小毛霉(Rhizomucor pusillus)葡萄糖淀粉酶基因和蛋白质氨基酸序列至今均没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热的葡萄糖淀粉酶及其编码基因。

本发明提供的耐热葡萄糖淀粉酶是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）具有SEQ ID NO.22所示氨基酸序列；（b）具有与SEQ ID NO.22所示氨基酸序列至少70%同源性的序列。上述（b）中的葡萄糖淀粉酶可通过将SEQ ID NO.22所示氨基酸序列的一个或者多个特异位点的一个或者多个特异氨基酸残基的替换、插入、缺失或者截短而获得，例如通过对其编码基因进行定点突变、或者定向进化而得到，或者通过在5’端或3’端加上或去掉具有特殊功能的多肽序列而得到。

该耐热葡萄糖淀粉酶具有与SEQ ID NO.22所示氨基酸序列至少70%同源性的序列。更优选地，该耐热葡萄糖淀粉酶具有与SEQ ID NO.22所示氨基酸序列至少80%同源性的序列。进一步优选地，该耐热葡萄糖淀粉酶具有与SEQ ID NO.22所示氨基酸序列至少90%同源性的序列。最佳地，该耐热葡萄糖淀粉酶具有与SEQ ID NO.22所示氨基酸序列至少99%同源性的序列。

本发明提供的耐热葡萄糖淀粉酶的编码基因是如下（1）-（3）的脱氧核糖核苷酸：（1）具有SEQ ID NO.20所示核苷酸序列；（2）具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列；（3）具有与所述（1）或（2）所示核苷酸序列至少70%同源性的序列。

该编码基因具有与SEQ ID NO.20所示核苷酸序列或SEQ ID NO.21所示核苷酸序列至少70%同源性的序列。更优选地，该编码基因具有与SEQ ID NO.20所示核苷酸序列或SEQID NO.21所示核苷酸序列至少80%同源性的序列。进一步优选地，该编码基因具有与SEQID NO.20所示核苷酸序列或SEQ ID NO.21所示核苷酸序列至少90%同源性的序列。最佳地，该编码基因具有与SEQ ID NO.20所示核苷酸序列或SEQ ID NO.21所示核苷酸序列至少99%同源性的序列。

本发明提供的重组表达载体包括上述编码基因。

所述重组表达载体为在毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点间插入上述编码基因而得到的重组表达载体。

本发明提供的重组宿主细胞包括根据上述重组表达载体。

所述重组宿主细胞是将上述重组表达载体转入到毕赤酵母KM71中得到的重组宿主细胞。

本发明成功地公开了微小毛霉(Rhizomucor pusillus)葡萄糖淀粉酶基因和蛋白质氨基酸序列。根据本发明的葡萄糖淀粉酶最适温度70℃，且热稳定性好，适于工业上应用的要求。本发明得到的重组宿主细胞，适于上述葡萄糖淀粉酶基因的表达，通过摇瓶诱导表达，其中KM71蛋白表达量即可达到0.9g/L，因此具有产业化应用前景。

附图说明

图1示出了微小毛霉葡萄糖淀粉酶毕赤酵母KM71重组菌诱导表达的蛋白电泳图；其中，1、2、3表示抗不同浓度的抗生素G418重组菌（1-抗1mg/ml G418；2-抗2mg/ml G418；3-抗4mg/ml G418）；

图2示出了微小毛霉葡萄糖淀粉酶最适作用温度为70℃（pH5.0的条件下测定），且在60～80℃具有较高酶活力；

图3示出了微小毛霉葡萄糖淀粉酶在50℃条件下稳定，而在60℃条件下孵育50min，仍有85%残余酶活力，其分别在50℃、60℃、70℃孵育5、10、20、30、40、50分钟迅速取出冷却后测定残余酶活力；

图4示出了微小毛霉葡萄糖淀粉酶最适作用pH为4.0，在pH3.0～5.0区间内（60℃的条件下测定）具有较高酶活力；

图5示出了微小毛霉葡萄糖淀粉酶在pH4.0～8.0的区间内50℃孵育30min后均具有较好的pH稳定性；

图6示出了微小毛霉葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉的产物薄层层析图，其中，3表示标准糖溶液；4表示水解产物；A表示葡萄糖；B表示麦芽糖；C表示麦芽三糖；D表示麦芽四糖。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明保护的范围。

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1.葡萄糖淀粉酶基因的扩增

1.1菌株及其培养

从北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心ＣＧＭＣＣ购得微小毛霉(Rhizomucor pusillus)（菌种编号3.204）。

用无菌水从培养5-6天的PDA斜面上洗下微小毛霉孢子，接种液体培养基，30℃培养2-3天收集菌丝体，用于基因组或RNA提取。

1.2基因组提取

参照Omega真菌基因组提取试剂盒说明书

1.3总RNA提取

用无菌水从培养6天的PDA斜面上的孢子洗下，接种真菌产淀粉酶液体培养基，培养2～3d，纱布过滤搜集菌丝体。按照Takara RNA提取试剂说明书进行操作。

1.4cDNA第一链合成

以抽提的总mRNA为模板，用Takara试剂盒的方法获得cDNA第一链，PCR体系及步骤如下：

65℃保温5min，冰上迅速冷却，向上述反应管中加入

42℃45min，95℃5min，冰上冷却。

1.5微小毛霉葡萄糖淀粉酶保守区域克隆

在NCBI上找到微小毛霉相近种属的菌种以及其他丝状真菌的葡萄糖淀粉酶氨基酸序列。在葡萄糖淀粉酶氨基酸保守区域WGRPQ(N)DGPA的位置设计正向兼并引物R.pGJf，在氨基酸保守区域GRYPED的位置设计反向兼并引物R.pGJr。其中：

R.pGJf的序列为SEQ ID NO.1：TGGGGHMGHCCNCARAATGAYGG

R.pGJr的序列为SEQ ID NO.2：RTCGTCAGGRTANCKRCCRATDGC

以微小毛霉基因组为模板，用兼并引物R.pGJf和R.pGJr，进行PCR扩增葡萄糖淀粉酶保守区域，PCR体系为：

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-TSimple Vector，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由华大基因完成。

基于上述得到的DNA片段设计两条特异性引物Gluf1，Glur1，其中：

Gluf1的序列为SEQ ID NO.3：CTGCGTGCATCGACCTTTATCCTTTTTGCA

Glur1的序列为SEQ ID NO.4：AATTGCGTACCCAGATGCTGAGGCTGC

以微小毛霉cDNA第一链为模板，PCR扩增葡萄糖淀粉酶保守片段的cDNA序列。PCR反应体系为：

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃(每个循环降0.5℃)退火30s，72℃延伸1min，30个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。

1.6葡萄糖淀粉酶全长DNA克隆

基于上述得到的葡萄糖淀粉酶保守片段DNA序列，分别在上游和下游设计3条特异性引物(5’端：5-1SP1、5-1SP2、5-1SP3；3’端：3-1SP1、3-1SP2、3-1SP3)。以微小毛霉基因组为模板，用特异性引物和染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit，购自大连宝生物工程有限公司)提供的四种兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应获取保守片段两侧的未知序列。其中：

5-1SP1的序列为SEQ ID NO.5：TCTTCCCTAGAATTGATGCGTGTGA

5-1SP2的序列为SEQ ID NO.6：AGTCTAAATCCTTGAATATCGCCGG

5-1SP3的序列为SEQ ID NO.7：AAGGATAAAGGTCGATGCACGCAGT

3-1SP1的序列为SEQ ID NO.8：TGGATGTTTCTATCCTATTGGCAGC

3-2SP2的序列为SEQ ID NO.9：CCACATAAATATGGATCCATTGCCG

3-3SP3的序列为SEQ ID NO.10：TTGTATCCACTCAATCGGGAGCAGC

操作流程如下：

(1)1stPCR，反应体系：

反应条件为：94℃1min，98℃1min；94℃30s，60℃1min，72℃2min，5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min；保存在4℃。

(2)2ndPCR，反应体系：

反应条件：94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min；保存在4℃。

(3)3rdPCR，反应体系：

反应条件：94℃30s，0℃1min，72℃2min，94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min；保存在4℃。

将2nd和3rd PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，回收清晰条带，连接pMD19-T SimpleVector，菌落PCR验证阳性克隆，送测序，测序由华大基因完成。

将测序结果进行拼接，然后在拼接序列的两端设计特异性引物R.pGWf1和R.pGWr1，以基因组为模板，进行全长PCR验证。其中：

R.pGWf1的序列为SEQ ID NO.11：TCTTCCAGTTGGAGCTTGCTGTCAC

R.pGWr1的序列为SEQ ID NO.12：GATGAAAGCAGCGTACGACCATGTC

根据获得的序列，在5’端再次设计3个特异性引物5-2SP1、5-2SP2、5-2SP3，进行5’端的第二次步移，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收连pMD19-T Simple Vector，验证后送测序。其中：

5-2SP1的序列为SEQ ID NO.13：ATCCTCCTCCTCCCATGAAGAAACA

5-2SP2的序列为SEQ ID NO.14：AGCAATATGTTGGTTGCGGTTGATC

5-2SP3的序列为SEQ ID NO.15：GAAAAGCATCAGCAGCACCTGAATC

测序结果与原有序列进行拼接，基于拼接序列再次设计特异性引物，进行全长PCR验证。

1.7葡萄糖淀粉酶cDNA克隆

分析2.6得到的葡萄糖淀粉酶基因DNA序列，在可能性最大的起始密码子ATG和终止密码子TAA的位置，以及中间两个保守区设计以下特异性引物：

R.pGf2的序列为SEQ ID NO.16：ATGGACACGCGATTCAGCCC

R.pGr2的序列为SEQ ID NO.17：AGCGTACGACCATGTCAGGTCG

R.pGr(TAA)的序列为SEQ ID NO.18：GGCGTTATTTATTACCCTCTTTTGACC

R.pGf(ATG)的序列为SEQ ID NO.19：ATGCGTTATGCAACCCCGC

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-T Simple，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由华大基因完成。由此获得微小毛霉完整cDNA序列，即开放阅读框。

将测序结果在GenBank上进行比对并分析表明，所获得的葡萄糖淀粉酶基因DNA由1971个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO.20所示：

ATGCGTTATGCAACCCCGCCCGAGCCGCTCTTTTTCTTCCTCCAAACATCCACGATGCACCTGTCCCCCACGATATCGTTGCTGTTTGCTTCATCGTTGCTAAAAGCTGTCCTCGTCAACTCACAGCAGTTTCTACATCCTGAACAAGGTAAAACGACACATGATAACCGAGATATTGGGAGTTCAGCTTTCATTTAAAGTCATACACAAATCTTGCAGAAGTGTTTCATGCTAAAACTGTCGACAATGACACACTGCTGATGACTACCCTCGATTACGAGGACTGGATAGCACGGCAAGAAGAGGTTGGCTGGCAAGCATTGCTAAGGAACATCAACCCGGCTGGAGCCATCAAGGGCTTCGTGGCCGCGTCGCCATCCACATCCGACCCAGACTATTTCTACAGCTGGACACGCGATTCAGCCCTCGTCATGCGGGTGGTCGCTCAAAAGTATCACGAAACTGGAGATCACGAGGATATCCTGCGAGACTATGTCGCTCAGGAAATCTACCATCAAGTCACTCGCACCCAGTGCGATTGCCTCGGCGAGCCCAAATTCAGTAAGTCTGTGTAGTTGGATTGCATCGCTTATTTATATACACAGCAGCCACGCTCACAATTGTTTACATTACATTCCTTTAGACGCGGTAAGTTATACTAAAAAATACAAGCTAGAAGGATATCTTCTCGCAGACGTATATATCATATGTCTACAGATATATTAATCAGGAACTACTGCTAACAGGACGGGTCTGGTTACGATGGTCCTTGGGGTAGTCCGCAAAATGACGGCCCAGCACTGCGTGCATCGACCTTTATCCTTTTTGCAAAGGGCTTGCGGGCACACCATCCTGGCGAGAAGGATCAAGAGCAGTACGTGACATCGGTGCTTGCTCCGGCGATATTCAAGGATTTAGACTACGTTGCAGATACATGGTCGAGTCCATGTTTTGATTTATGGTTCGTAAATATGGTGGAAACCAAGATGGAGGTTGCTAAAGTTTATTGGTTCACACGCATCAATTCTAGGGAAGAAGTATGTGGTATTCACTTTTACACGCTCACGGTCATGCGACAAGCGTTGTTGGACGGCGCTCTGTTTGCTGACGAATACTACGACCCAAACCGTGCATCCAGATATCAAATGCTGGCAGTCTCGGATTTATCCGATCGATTAGATTCCTTCTGGGTGGAGGATGGTGGATACATTGCTGTGACACAGGAGCAATGCGGCGGTGTGCACAAGCCATCGGGATTGGATGTTTCTATCCTATTGGCAGCCAACCATGCTCTGCGACGACGCGGCGACGAAACAGGTTAAGCCTATTCTTGACGTTTAGAACGTTCTCAGATACTAAAGTTTCTCCATTCCCAGGTGTCTTTACATCAGTATCAGATAAGGTAAGGATACCACATAAATATGGATCCATTGCCGAACAATGACACAAAAAAAGGTGCTGGCCACTGCAGTTGCCATTGAAGATGCGTTTGAACGCTTGTATCCACTCAATCGGGAGCAGCCTCAGCATCTGGGTACGGCAATTGGCCGATACCCTGACGACACGTACGATGGCTACCAAAGCGCGTCGCTTGGCAATCCATGGTTCTTGGCAACGTTAGCGTACGCTGAATTATACTACAATGCAATCCAAGAAAGGGACTACGTGGCTGTCAACGAGGTCAATGCGCCGTTCTTTGCACATGTTCTGAAAACGCGCCCTGAAGACCTAATGTACCAAGTGTTTTTACGCGGCGAACCAGACTTCGATGAACTTGTTAACAAGATGCTTGCACGAGCCGATGCCTTTATGAAAACGGTTCAGTACCATGCGCGATCGAATGGATCGCTTTCCGAGCAGTACGATCGGTACATTGGATTCCAGACGGGTGCACGCGACCTGACATGGTCGTACGCTGCTTTCATCACAGCTGCGAATGCCCGACGACAATTGCTGGTCAAAAGAGGGTAA

该葡萄糖淀粉酶基因cDNA的开放阅读框cDNA由1539个核苷酸组成，序列如SEQ IDNO.21所示：

ATGCGTTATGCAACCCCGCCCGAGCCGCTCTTTTTCTTCCTCCAAACATCCACGACGCACCTGTCCCCCACGATATCGTTGCTATTTGCTTCATCGTTGCTAAAAGCTGTCCTCGTCAACTCACAGCAGTTTCTACATCCTGAACAAGAAGTGTTTCATGCTAAAACTGTCGACAATGACACACTGCTGATGACTACCCTCGATTACGAGGACTGGATAGCACGGCAAGAAGAGGTTAGCTGGCAAGCATTGCTAAGGAACATCAACCCGGCTGGAGCCATCAAGGGCTTCGTGGCCGCGTCGCCATCCACATCCGACCCAGACTATTTCTACAGCTGGACACGCGATTCAGCCCTCGTCATGCGGGTGGTCGCTCAAAAGTATCACGAAACTGGAGATCACGAGGATATCCTGCGAGACTATGTCGCTCAGGAAATCTACCATCAAGTCACTCGCACCCAGTGCGATTGCCTCGGCGAGCCCAAATTCAACGCGGACGGGTCTGGTTACGATGGTCCTTGGGGAAGACCGCAAAATGATGGCCCAGCACTGCGTGCATCGATCTTTATCCTTTTTGCAAAGGGCTTGCGGGCACACCATCCTGGCGAGAAGGATCAAGAGCAGTACGTGACATCGGTGCTTGCTCCGGCGATATTCAAGGATTTAGACTACGTTGCAGATACATGGTCGAGTCCATGTTTTGATTTATGGGAAGAAGTATGTGGTATTCACTTTTACACGCCCACGGTCATGCGACAAGCGTTGTTGGACGGCGCTCTGTTTGCTGACGAGTACTACGACCCAAACCGTGCATCCAGATATCAAATGCTGGCAGTCTCGGATTTATCCGATCGATTAGATTCCTTCTGGGTGGAGGATGGTGGATACATTGCTGTGACACAGGAGCAATGCGGCGGTGTGCACAAGCCATCGGGATTGGATGTTTCTATCCTATTGGCAGCCAACCATGCTCTGCGACGACGCGGCGACGAAACAGCTGTCTTTACATCAGTATCAGATAAGGTGCTGGCCACTGCAGTTGCCATTGAAGATGCGTTTGAACGCTTGTATCCACTCAATCGGGAGCAGCCTCAGCATCTGGGTACGGCCATTGGCAGGTATCCAGAGGACACGTACGATGGCTACCAAAGCGCGTCGCTTGGCAATCCATGGTTCTTGGCAACGTTAGCGTACGCTGAATTATACTACAATGCAATCCAAGAAAAGGACTACGTGGCTGTCAACGAGGTTAATGCGCCGTTCTTTGCACATGTTCTGAAAACGCGTCCTGAAGACCTAATGTACCAAGTGTTTTTACGCGGCGAACCAGGCTTCGATGAGCTTGTTAACAAGATGCTTGCACGAGCCGATGCCTTTATGAAAACGGTTCAGTACCATGCGCGATCGAATGGATCGCTTTCCGAGCAGTACGATCGGTACATTGGATTCCAGACGGGTGCACGCGACCTGACATGGTCGTACGCTGCTTTCATCACAGCTGCGAATGCCCGACGACAATTGCTGGTCAAAAGAGGGTAA

该cDNA编码512个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.22所示：

MRYATPPEPLFFFLQTSTTHLSPTISLLFASSLLKAVLVNSQQFLHPEQEVFHAKTVDNDTLLMTTLDYEDWIARQEEVSWQALLRNINPAGAIKGFVAASPSTSDPDYFYSWTRDSALVMRVVAQKYHETGDHEDILRDYVAQEIYHQVTRTQCDCLGEPKFNADGSGYDGPWGRPQNDGPALRASIFILFAKGLRAHHPGEKDQEQYVTSVLAPAIFKDLDYVADTWSSPCFDLWEEVCGIHFYTPTVMRQALLDGALFADEYYDPNRASRYQMLAVSDLSDRLDSFWVEDGGYIAVTQEQCGGVHKPSGLDVSILLAANHALRRRGDETAVFTSVSDKVLATAVAIEDAFERLYPLNREQPQHLGTAIGRYPEDTYDGYQSASLGNPWFLATLAYAELYYNAIQEKDYVAVNEVNAPFFAHVLKTRPEDLMYQVFLRGEPGFDELVNKMLARADAFMKTVQYHARSNGSLSEQYDRYIGFQTGARDLTWSYAAFITAANARRQLLVKRG

该微小毛霉葡萄糖淀粉酶氨基酸序列与已报道的葡萄糖淀粉酶氨基酸序列最高相似性为51%。因此该基因是一个新的葡萄糖淀粉酶基因，将之命名为R.pGLA。

虽然以上提供了从野生菌株通过PCR方法获得全长葡萄糖淀粉酶基因DNA及cDNA的方法，但是，本领域的技术人员根据本发明所公开的基因序列，采用其它方法，如人工合成法，同样可以获得全长葡萄糖淀粉酶基因DNA及cDNA，这是显而易见的。

实施例2.含有葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母重组表达载体的构建及其转化

2.1引物设计

R.pGEcoRf的序列为SEQ ID NO.23：GGAATTCATGCGTTATGCAACCCCGC

R.pGNotr的序列为SEQ ID NO.24：TTGCGGCCGCTTACCCTCTTTTGACCA

2.2重组表达载体构建

以连有葡萄糖淀粉酶基因开放阅读框的pMD19-T Vector为模板，用3.1所示引物进行PCR扩增；将PCR产物EcoRI、NotI酶切，然后与同样经EcoR I、NotⅠ酶切的酵母表达载体pPIC9k连接，筛选，得到重组质粒(pPIC9KR.pGLA)。

2.3毕赤酵母感受态细胞的制备

(1)将酵母接种YPD液体培养基，30℃培养至OD1～2A(600nm)

(2)将培养液6000rpm，4℃离心3Min，收集菌体

(3)用8ml缓冲液(100mM LiAc，10mM DTT，0.6M山梨醇，10mM pH7.5Tris-HCl)重悬菌体，室温静置30Min

(4)6000rpm，4℃离心5min，收集菌体

(5)用2～3ml1M山梨醇洗涤菌体，重复两次

(6)用适量1M山梨醇重悬菌体，使细胞浓度为10^10个/ml，静置冰上，待用

2.4重组表达载体的转化

(1)将100ul重组质粒(9KAmy)用SacI线性化酶切，用Takara核酸共沉剂进行浓缩，用10ul的无菌超纯水溶解质粒

(2)将10ul的上述质粒与100ul的酵母感受态细胞混合，转入预冷的电极杯中，进行电击，迅速加入1ml预冷的1M山梨醇，转移至30℃培养箱中静置1h，涂布MD板

2.5高拷贝转化子的筛选

将MD平板长出的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布分别含有1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml G418的YPD平板，置于30℃培养箱中培养。在含有高浓度G418的YPD平板生长出的转化子即认为含有高拷贝葡萄糖淀粉酶基因。

实施例3.毕赤酵母重组菌的诱导表达

3.1在3.5所述含G418的YPD平板上挑取重组菌的单克隆，接种YPD液体培养基，30℃，200rpm培养24h。

3.2将上述种子培养液接入BMGY培养基，30℃，200rpm培养24h。

3.3培养至OD6.0，6500rpm，离心5min收集菌体，转移至BMMY培养基，225rpm,，30℃诱导表达，每24h加100%甲醇至终浓度0.5%。

3.4诱导120h，离心收集上清，测酶活，测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳。

图1显示微小毛霉葡萄糖淀粉酶毕赤酵母KM71重组菌诱导表达的蛋白电泳图。

本发明构建的毕赤酵母重组菌蛋白表达达到0.9g/L(考马斯亮蓝染色法测定)，且几乎没有其它杂蛋白，有利于后续纯化。

实施例4.葡萄糖淀粉酶酶活测定

4.1标准曲线绘制

(1)将葡萄糖先干燥至恒重，准确称取1.0000g，用去离子水定容至1000ml，配成1g/l标准液；

(2)取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml的标准葡萄糖溶液，补加纯水至1.0ml；

(3)加入1.0ml DNS显色剂，沸水浴5min，流水浴冷却，加入10ml蒸馏水，以0为参比，在540nm出测吸光值；

4.2酶活测定

(1)将1.000g可溶性淀粉溶于加热至沸腾的100ml磷酸缓冲液(100mM，pH5.0)中，冷却后定容至100ml。

(2)加0.5ml底物溶液，60℃预热10min，加入0.5ml适当稀释的酶液，反应10min；

(3)加入1.0ml DNA显色剂，沸水浴5min，流水浴冷却，用10ml蒸馏水稀释，在540nm处测定吸光值；

4.3酶活单位定义

一个葡萄糖单位定义为在给定条件下1min内水解可溶性淀粉释放1umol葡萄糖当量的还原糖所需要的酶量。

实施例5.葡萄糖淀粉酶酶学性质测定

5.1温度对R.ppGLA酶活力的影响

在pH5.0(100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)条件下，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃测定微小毛霉葡萄糖淀粉酶酶活力，以最高酶活力为100%，计算其他温度条件下的相对酶活力。

用pH5.0的缓冲液将酶液适当稀释，分别在60℃、70℃、80℃保温，5min后每隔5min取样(至50min)，冰上迅速冷却，测定残余酶活力，以没有热孵育的酶液酶活力为100%，计算相对酶活力，表示酶的热稳定性。

图2显示微小毛霉葡萄糖淀粉酶最适作用温度为70℃，且在60～80℃具有较高酶活力。

图3显示微小毛霉葡萄糖淀粉酶在50℃条件下稳定，而在60℃条件下孵育50min，仍有85%残余酶活力。

5.2pH对R.pGLA酶活力的影响

在50℃，分别在pH3.0(甘氨酸-盐酸)、4.0、5.0、6.0(柠檬酸-柠檬酸钠)、7.0(磷酸二氢钾-磷酸氢二钾)、8.0(Tris-盐酸)的条件下，测定微小毛霉葡萄糖淀粉酶酶活力，以最高酶活力为100%，计算其他温度条件下的相对酶活力。

用上述不同缓冲液将酶液适当稀释，分别在50℃条件下孵育30min，取出冰上迅速冷却，在pH5.0、60℃条件下测定残余酶活力，以没有孵育的酶液酶活力为100%，计算相对酶活力表示酶的pH耐受性。

图4显示微小毛霉葡萄糖淀粉酶最适作用pH为4.0，在pH3.0～5.0区间内具有较高酶活力。

图5显示微小毛霉葡萄糖淀粉酶在pH4.0～8.0的区间内均具有较好的pH稳定性。

5.3薄层层析分析法分析葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉的产物

用pH5.0的缓冲液配置1%(w/v)的可溶性淀粉底物溶液，在1ml底物溶液中加入0.2ml适当稀释的酶液，混匀，置于50℃水浴中反应。反应48h后，取出在沸水浴中煮沸15min，使酶失活，最大转速离心，然后用0.22um的过滤器过滤后，进行薄层层析。

用毛细管进行点样，每个样约2～3ul，点样时应使点样圈的直径尽可能小。在250ml密闭玻璃瓶中进行展层(氯仿：冰乙酸：水(30:35:5))，待溶剂线跑出硅胶板上沿后继续展层30min，取出，烘干。

将染色剂(α-萘酚-硫酸试剂：15%α-萘酚乙醇溶液21ml，加13ml浓硫酸，再加81ml乙醇，8ml水混匀，置棕色瓶中，要新鲜配制)喷洒于硅胶板上，烘干，置于100℃烘箱10min，取出观察。

图6显示微小毛霉葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉的产物薄层层析图。水解主要产物是葡萄糖和麦芽糖。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (6)

1.一种耐热葡萄糖淀粉酶，其特征在于，该耐热葡萄糖淀粉酶是蛋白质：SEQ ID NO.22所示氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的耐热葡萄糖淀粉酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因是如下（1）或（2）的核酸：

（1）SEQ ID NO.20所示核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO.21所示核苷酸序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体包括根据权利要求2所述的编码基因。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点间插入根据权利要求2所述的编码基因而得到的重组表达载体。

5.一种重组宿主细胞，其特征在于，该重组宿主细胞包括根据权利要求3所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞是将根据权利要求3所述的重组表达载体转入到毕赤酵母KM71中得到的重组宿主细胞。