CN108387729A - 一种功能性生物纳米磁珠荧光编码方法及其流式应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种功能性生物纳米磁珠荧光编码方法及其流式应用，通过本方法获得的生物纳米磁珠，可以在表面均匀表达展示荧光蛋白，可直接作为荧光标记的生物纳米磁珠使用；同时，生物纳米磁珠表面还可以同时表达展示重组蛋白等具有其他生物活性的蛋白分子，以满足流式检测的需求。使用本方法提供的培养基对三级重组菌株进行深层培养，可以有效提高细菌的活性和抗逆性，并能增强细菌对荧光蛋白融合表达质粒的承载能力，促进细菌的增殖以及荧光蛋白和重组蛋白的同时表达，保证功能性生物纳米磁珠合成的质量与产量，从而便于后续的荧光编码流式分析应用。

Description

一种功能性生物纳米磁珠荧光编码方法及其流式应用
技术领域
本发明属于生物纳米磁珠应用和医学检验技术领域，特别涉及一种功能性生物纳米磁珠荧光编码方法及其流式应用。
背景技术
生物纳米磁珠是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，也称为细菌磁颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的生物纳米磁珠，它们的粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，细菌磁颗粒是生物制备来源，因此具有较好的生物相容性。生物纳米磁珠表面膜上带有大量的氨基基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在表面膜上表达特殊的蛋白质及多肽分子，成为具有特殊生物活性的功能性生物纳米磁珠。
荧光编码技术是2000年以来新出现的一种纳米新技术，通过将不同数量、不同荧光特征的纳米量子点组合掺杂在一起制备荧光微球，微球上具有独特的荧光编码特征，可被光学分析设备所识别、区分，在流式细胞分析中具有很强的应用前景。理论上，只需要5-6种荧光颜色以及每种5-6个荧光强度的量子点，就能组合得到超过30000种不同组合的荧光编码微球。在应用方面，荧光编码微球的基本设计是在微球表面连接不同的生物分子，而在微球内部设计对应不同的荧光编码信号，最终实现对液相中超过30000种靶标物质进行同时定量检测分析。尽管目前实际应用的荧光编码微球最多只能同时检测几十到上百种靶标，仍远远没有达到理论值，但已经极大提高了液相生物分子检测的效率。
荧光蛋白是从生物体中分离得到的一种具有荧光特性的蛋白物质，最早是1962年从水母中发现的绿色荧光蛋白，此后在生命科学领域被广泛用于荧光标记工具，极大推动了生物技术的发展，也间接推动了荧光纳米材料的发展。2008年诺贝尔化学奖授予了在荧光蛋白发现和研究方面有突出贡献的三位科学家。通过运用生物信息学、基因突变、DNA-shuffling工程等一系列理论和技术，荧光蛋白家族成员不断扩大，出现很多新的荧光蛋白突变体，它们具有不同的光谱特性。具有代表性的荧光蛋白呈现绿色、青色、蓝色、黄色、红色等5种颜色，这些不同的荧光蛋白突变体进一步拓展了荧光标记的应用范围。
近年来，出现了将纳米材料和荧光物质进行组装，形成新的功能性纳米材料，在生物医学领域具有很强的潜力，这里的荧光物质大都是无机荧光材料或者有机小分子荧光染料，其合成方式大多也是化学偶联的方法。本发明主要是从生物合成的方法以及荧光蛋白的角度出发，提供一种功能性生物纳米磁珠，其表面展示有荧光蛋白，通过选择不同的荧光蛋白组合实现荧光编码磁性纳米颗粒的生产制备。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种功能性生物纳米磁珠荧光编码方法及其流式应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种功能性生物纳米磁珠，所述功能性生物纳米磁珠的膜蛋白同时融合表达荧光蛋白和功能蛋白。
本发明提供的功能性生物纳米磁珠可直接作为荧光标记的生物纳米磁珠使用，便于通过流式细胞仪对其表达的功能蛋白进行检测。
进一步地，所述荧光蛋白为EGFP、EBFP、ECFP、EYFP、ERFP、mOrange、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mPlum以及mKate中的任一种，所述EGFP基因序列如SEQ.ID.No.1所示，所述EBFP基因序列如SEQ.ID.No.2所示，所述ECFP基因序列如SEQ.ID.No.3所示，所述EYFP基因序列如SEQ.ID.No.4所示，所述ERFP基因序列如SEQ.ID.No.5所示，所述mOrange基因序列如SEQ.ID.No.6所示，所述mCherry基因序列如SEQ.ID.No.7所示，所述mStrawberry基因序列如SEQ.ID.No.8所示，所述mRaspberry基因序列如SEQ.ID.No.9所示，所述mPlum基因序列如SEQ.ID.No.10所示，所述mKate基因序列如SEQ.ID.No.11所示。
上述荧光蛋白均为改进的增强型荧光蛋白，流式检测的敏感性更高、准确性更好。
进一步地，所述功能蛋白为重组蛋白G、重组蛋白A或重组链霉亲和素蛋白SA，所述重组蛋白G的基因序列如SEQ.ID.No.12所示，所述重组蛋白A的基因序列如SEQ.ID.No.13所示，所述重组链霉亲和素蛋白A的基因序列如SEQ.ID.No.14所示。
本发明另一方面提供了一种对上述的功能性生物纳米磁珠进行荧光编码的方法，包括如下步骤：
S1：利用趋磁细菌MSR-I构建细菌磁颗粒膜蛋白基因的缺失突变体菌株，作为一级重组菌株，缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为MamC、MamD以及MamF中的任两种蛋白的基因；
S2：利用任一种缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因融合功能蛋白，并导入所述一级重组菌株中，构建二级重组菌株；
S3：利用与步骤S2中不同的任一种缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因融合荧光蛋白基因，构建基因融合表达载体；将所述基因融合表达载体导入所述二级重组菌株中，并进行筛选，得到具有荧光编码特性的三级重组菌株；
S4：对所述三级重组菌株进行培养，得到能同时表达荧光蛋白和功能蛋白的功能性生物纳米磁珠。
通过本方法获得的生物纳米磁珠，可以在表面均匀表达展示荧光蛋白，可直接作为荧光标记的生物纳米磁珠使用；同时，生物纳米磁珠表面还可以同时表达展示重组蛋白等具有其他生物活性的蛋白多肽，以满足流式检测的需求。
进一步地，所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：分别对缺失的两个所述膜蛋白基因两侧500bp的同源DNA片段进行扩增，通过分子克隆构建两条微载体；
S1.2：将两条所述微载体通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
S1.3：对电转化后的菌株进行筛选和鉴定，获得缺失两种的重组菌株，即为一级重组菌株。
本发明中有提到使用噬菌体AAV-del微载体，传统质粒的区别在于，质粒可以在染色体之外单独存在，能自我复制，可在细胞中长期存在、不易丢失；微载体则不能在染色体之外单独自我复制，只有整合到染色体中才能长期存在、较易丢失，因此用来进行基因敲除，遗传背景比较干净，没有太多外来基因的干扰和污染。
进一步地，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：将所述功能蛋白的基因序列与一种缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因序列进行融合，得到新的融合基因片段；
S2.2：将所述融合基因片段克隆到表达载体pBRC1上，得到功能蛋白表达质粒；
S2.3：通过三亲本接合或电转化的方式将所述功能蛋白表达质粒转入所述一级重组菌株中，验证后得到表达所述功能蛋白的重组菌株，即为二级重组菌株。
进一步地，所述步骤S3的方法如下：
S3.1：对所述荧光蛋白基因序列进行PCR扩增；
S3.2：用EcoRI/SmaI对扩增产物和表达载体pBRC2分别进行双酶切；
S3.3：将经过双酶切的所述扩增产物与不同于步骤S2的缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因融合，并连接到同样经过双酶切的所述表达载体pBRC2上，得到荧光蛋白表达质粒；
S3.4：通过电转化的方式将11个所述荧光蛋白融合表达质粒分别转化到所述二级重组菌株中，经过筛选验证得到能表达荧光蛋白的所述三级重组菌株；
S3.5：通过流式细胞仪对所述三级重组菌株表达的不同荧光蛋白进行分析和鉴定，不同荧光蛋白的发射光谱峰如下：EGFP：503～506nm；EBFP：446～450nm；EYFP：523～526nm；ECFP：475～477nm；ERFP：607～609nm；mOrange：557～561nm；mCherry：615nm；mStrawberry：574～577nm；mRaspberry：621～625nm；mPlum：646～649nm；mKate：633～636nm。
进一步地，所述步骤S4包括如下步骤：
S4.1：首先使用200～500mL培养基进行预培养，培养条件为氧气含量5～10％、N2含量90～95％，培养时间16小时，培养温度37℃；
S4.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中进行深层培养，培养条件为氧气含量5％、氢气含量1％、N2含量94％，培养时间3～4天，培养温度37℃；
S4.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；
S4.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能化细菌磁颗粒。
MSR–Ⅰ菌株是微需氧细菌，在微需氧环境下较容易吸收外界铁离子合成纳米磁珠，而在高氧或氧气充足的条件下纳米磁珠的合成会大大降低，因此在发酵培养过程中应精确控制氧气含量，以便提高纳米磁珠的产量。同时在本研究中发现，适当增加氢气的含量也有利于提高纳米磁珠的产量。
进一步地，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3100～3200V条件下，进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲。
细菌间一般是通过接合的方式进行基因转移，这容易造成转移基因的损失。电穿孔转化的方式，是通过瞬时电流在细胞上形成孔洞，使得溶液中的DNA基因片段能够通过孔洞进入细胞内，从而完成转化。电转化的电流过小时不能形成孔洞或形成孔洞时间短，不利于基因转移；电流过大、时间过长则容易对细胞造成不可逆的损伤，甚至导致细胞死亡。上述电转化条件可以有效地将微载体或表达质粒转入受体细胞中，不会造成基因片段的损失，也不会对细胞活性造成不可逆的伤害。
进一步地，所述预培养中使用的培养基包括如下成分：
10～12份牛肉膏、1～2份壳聚糖、1～2份半乳糖、0.5～1份磷酸二氢钠、0.2～0.5份磷酯酰丝氨酸、0.05～0.1份柠檬酸钠以及0.5～1份海藻酸钾；
所述深层培养中使用的培养基包括如下成分：
6～8份女贞子多糖、8～12份蛋白胨、1～2份蜗牛多糖、1～2份卵磷脂、0.1～0.2份槲皮素、0.5～1份酒石酸钾钠以及0.05～0.1份柠檬酸钠。
使用上述培养基对三级重组菌株进行预培养，可以有效提高细菌的活性，从而提高后续培养中的增殖能力和存活能力；使用上述培养基对预培养后的三级重组菌株进行深层培养，可以有效提高细菌的抗逆性和对荧光蛋白融合表达质粒的承载能力，促进细菌的增殖以及荧光蛋白和重组蛋白的同时表达，从而便于后续的流式分析。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种功能性生物纳米磁珠荧光编码方法及其流式应用，通过本方法获得的生物纳米磁珠，可以在表面均匀表达展示荧光蛋白，可直接作为荧光标记的生物纳米磁珠使用；同时，生物纳米磁珠表面还可以同时表达展示重组蛋白等具有其他生物活性的蛋白分子，以满足流式检测的需求。使用本方法提供的培养基对三级重组菌株进行深层培养，可以有效提高细菌的活性和抗逆性，并能增强细菌对荧光蛋白融合表达质粒的承载能力，促进细菌的增殖以及荧光蛋白和重组蛋白的同时表达，保证功能性生物纳米磁珠合成的质量和产量，从而便于后续的荧光编码流式分析应用。
附图说明
图1为实验例1中空白对照的流式图；
图2为实验例1中阴性对照的流式图；
图3为实验例1中实验组1的流式图；
图4为实验例1中实验组2的流式图；
图5为实验例1中实验组3的流式图；
图6为实验例1中实验组4的流式图；
图7为实验例7中各组生物纳米磁珠的荧光强度衰减曲线。
具体实施方式
实施例1
一种表达EGFP荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠，在MamF膜蛋白上融合表达重组蛋白G，同时在MamC膜蛋白上融合表达荧光蛋白EGFP。
实施例2
一种表达EBFP荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠，在MamF膜蛋白上融合表达重组蛋白A，同时在MamC膜蛋白上融合表达荧光蛋白EBFP。
实施例3
一种表达ECFP荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠，在MamF膜蛋白上融合表达重组链亲和蛋白SA，同时在MamC膜蛋白上融合表达荧光蛋白ECFP。
实施例4
一种表达EYFP荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠，在MamF膜蛋白上融合表达重组蛋白G，同时在MamC膜蛋白上融合表达荧光蛋白EYFP。
实施例5
一种表达ERFP荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，包括如下步骤：
S1：利用趋磁细菌MSR-I构建细菌磁颗粒膜蛋白基因MamC和MamF的缺失突变体菌株，作为一级重组菌株；
S2：利用MamF基因融合重组蛋白G，并导入一级重组菌株中、构建二级重组菌株；
S3：利用MamC基因融合ERFP荧光蛋白基因，构建表达载体，将表达载体导入所述二级重组菌株中，并进行筛选，得到具有荧光编码特性的三级重组菌株；
S4：对三级重组菌株进行培养，得到能同时表达荧光蛋白ERFP和重组蛋白G的功能性生物纳米磁珠。
实施例6
一种表达mOrange荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，包括如下步骤：
S1：利用趋磁细菌MSR-I构建细菌磁颗粒膜蛋白基因MamC和MamF的缺失突变体菌株，作为一级重组菌株；
S1.1：对MamC基因和MamF基因两侧500bp的同源DNA片段进行扩增，通过分子克隆构建两条微载体AAV-del-MamC和AAV-del-MamF；
S1.2：将AAV-del-MamC和AAV-del-MamF按照2:1的摩尔比混合，使终浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
S1.3：将电转化后的菌株通过蔗糖和抗生素梯度浓度压力筛选双突变菌株，电转化的方法为采用方波电脉冲、在3100～3200V条件下进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲；经过菌种鉴定后，获得MamC和MamF双缺失的重组菌株，即为一级重组菌株MSRI-dCF；
S2：利用MamF基因融合重组蛋白A，并导入一级重组菌株中、构建二级重组菌株；
S3：利用MamC基因融合mOrange荧光蛋白基因，构建表达载体，将所述表达载体导入所述二级重组菌株中，并进行筛选，得到具有荧光编码特性的三级重组菌株；
S4：对所述三级重组菌株进行培养，得到能同时表达荧光蛋白mOrange和重组蛋白A的功能性生物纳米磁珠。
实施例7
一种表达mStrawberry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，包括如下步骤：
S1：利用趋磁细菌MSR-I构建细菌磁颗粒膜蛋白基因MamC和MamF的缺失突变体菌株，作为一级重组菌株；
S2：利用MamF基因融合重组链亲和蛋白SA，并导入一级重组菌株中、构建二级重组菌株；
S2.1：将重组链亲和蛋白SA的基因序列与MamF基因序列进行融合，得到新的融合基因片段pMamF-SA；
S2.2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC1上，得到表达质粒pBRC1-pMamF-SA；
S2.3：通过电转化的方式将表达质粒转入一级重组菌株中，电转化的方法为采用方波电脉冲、在3100～3200V条件下进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲；验证后得到表达重组链亲和蛋白SA的二级重组菌株MSRI-dCF/SA；
S3：利用MamC基因融合mStrawberry荧光蛋白基因，构建表达载体，将表达载体导入所述二级重组菌株中，并进行筛选，得到具有荧光编码特性的三级重组菌株；
S4：对三级重组菌株进行培养，得到能同时表达荧光蛋白mStrawberry和重组链亲和蛋白SA的功能性生物纳米磁珠。
实施例8
一种表达mCherry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，包括如下步骤：
S1：利用趋磁细菌MSR-I构建细菌磁颗粒膜蛋白基因MamC和MamF的缺失突变体菌株，作为一级重组菌株；
S2：利用MamF基因融合重组蛋白G，并导入一级重组菌株中、构建二级重组菌株；
S3：利用MamC基因融合mCherry荧光蛋白基因，构建表达载体；
S3.1：对mCherry基因进行PCR扩增；
S3.2：用EcoRI/SmaI对扩增产物和表达载体pBRC2分别进行双酶切；
S3.3：将经过双酶切的所述扩增产物与MamC基因融合，并连接到同样经过双酶切的所述表达载体pBRC2上，得到融合MamC的荧光蛋白表达质粒pBRC-mCherry；
S3.4：通过电转化的方式将荧光蛋白融合表达质粒pBRC-mCherry转化到所述二级重组菌株中，电转化的方法为采用方波电脉冲、在3100～3200V条件下进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲；经过筛选验证得到能表达mCherry的所述三级重组菌株；
S3.5：通过流式细胞仪在523-526nm波长下对三级重组菌株表达的mCherry进行分析和鉴定；
S4：对三级重组菌株进行培养，得到能同时表达荧光蛋白mCherry和重组蛋白G的功能性生物纳米磁珠。
实施例9
一种表达mRaspberry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，包括如下步骤：
S1：利用趋磁细菌MSR-I构建细菌磁颗粒膜蛋白基因MamC和MamF的缺失突变体菌株，作为一级重组菌株；
S2：利用MamF基因融合重组蛋白A，并导入一级重组菌株中、构建二级重组菌株；
S3：利用MamC基因融合mRaspberry荧光蛋白基因，构建表达载体；将所述表达载体导入所述二级重组菌株中，并进行筛选，得到具有荧光编码特性的三级重组菌株；
S4：对三级重组菌株进行培养，得到能同时表达荧光蛋白mRaspberry和重组蛋白A的功能性生物纳米磁珠；
S4.1：首先使用200～500mL培养基进行预培养，培养条件为微需氧(O2含量5～10％、N2含量90～95％)，培养时间16小时，培养温度37℃；
S4.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中进行深层培养，培养条件为微需氧加氢气(O2含量5％、H2含量1％、N2含量94％)，培养时间3～4天，培养温度37℃；
S4.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置吸附细菌磁颗粒，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；
S4.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能化细菌磁颗粒。
实施例10
一种表达mPlum荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例9步骤相同，其中步骤S4中预培养的培养基包括如下成分：
12份牛肉膏、1份壳聚糖、2份半乳糖、0.5份磷酸二氢钠、0.5份磷酯酰丝氨酸、0.1份柠檬酸钠以及0.5份海藻酸钾；
深层培养的培养基包括如下成分：
8份女贞子多糖、8份蛋白胨、1份蜗牛多糖、2份卵磷脂、0.2份槲皮素、0.5份酒石酸钾钠以及0.1份柠檬酸钠。
对照例1
一种表达mOrange荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例6步骤相同，其中一级重组菌株缺失的细菌磁颗粒膜蛋白基因为MamC和MamD。
对照例2
一种表达mOrange荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例6步骤相同，其中一级重组菌株缺失的细菌磁颗粒膜蛋白基因为MamD和MamF。
对照例3
一种表达mOrange荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例6步骤相同，其中一级重组菌株缺失的细菌磁颗粒膜蛋白基因为MamA和MamC。
对照例4
一种表达mOrange荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例6步骤相同，其中两条微载体AAV-del-MamC和AAV-del-MamF的摩尔比为1:1。
对照例5
一种表达mcherry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例8步骤相同，其中电转化的方法为采用方波电脉冲、在2700～2800V条件下进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲。
对照例6
一种表达mcherry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例8步骤相同，其中电转化的方法为采用方波电脉冲、在3100～3200V条件下进行1～2次时长为2.8～3.0ms电脉冲。
对照例7
一种表达mcherry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例8步骤相同，其中电转化的方法为采用方波电脉冲、在3300～3400V条件下进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲。
对照例8
一种表达mcherry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例8步骤相同，其中电转化的方法为采用方波电脉冲、在3100～3200V条件下进行1～2次时长为3.4～3.6ms电脉冲。
对照例9
一种表达mRasperry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例9步骤相同，其中预培养的条件为O2含量15％、N2含量85％。
对照例10
一种表达mRasperry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例9步骤相同，其中深层培养的条件为O2含量5％、N2含量95％。
对照例11
一种表达mRasperry荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例9步骤相同，其中深层培养的条件为O2含量10％、H2含量1％、N2含量89％。
对照例12
一种表达mPlum荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例10步骤相同，其中步骤S4中预培养和深层培养的培养基均采用LB培养基。
对照例13
一种表达mPlum荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例10步骤相同，其中步骤S4中预培养的培养基采用实施例6提供的培养基，深层培养的培养基采用麦芽汁培养基。
对照例14
一种表达mPlum荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，与实施例10步骤相同，其中步骤S4中预培养的培养基采用LB培养基，深层培养的培养基采用实施例6提供的培养基。
对照例15
一种表达EGFP荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠，在MamC膜蛋白上融合表达荧光蛋白EGFP。
对照例16
一种表达EYFP荧光蛋白的功能性生物纳米磁珠，在MamC膜蛋白上融合表达荧光蛋白EYFP。
实验例1
荧光编码生物纳米磁珠流式分析实验
以培养的CHO细胞作为检测对象，以实施例1～4提供的生物纳米磁珠作为实验组1～4，以不带荧光编码的重组蛋白G生物纳米磁珠作为阴性对照，以未经处理的CHO细胞作为空白对照。
将上述五种生物纳米磁珠分别与抗-CHO抗体结合，并在室温下孵育15min，使相关IgG抗体通过重组蛋白G结合，偶联标记到生物纳米磁珠上；取五支流式分析管，每管加入约105个CHO细胞，重悬均匀，分别加入50μL的经过-CHO抗体标记的五种生物纳米磁珠，室温孵育15min，期间混匀2～3次，通过磁装置对细胞洗涤2次，去除杂质及未结合的细胞；使用流式细胞仪对上述细胞样品进行检测。
实验结果如图1～6所示，阴性对照不产生荧光激发，与空白对照结果一致；而实验组各组光谱均发生了变化，并且出峰时间各不相同，表明4中荧光编码生物纳米磁珠结合CHO细胞后均产生了相应的荧光激发。由此说明，本发明提供的生物纳米磁珠可以同时表达荧光蛋白和重组蛋白，从而便于后续的流式分析。
实验例2
膜蛋白基因缺失比较实验
以实施例5～6提供的方法作为实验组1～2，以对照例1～4提供的方法作为对照组1～4，分别采用上述方法对趋磁细菌MSR-Ⅰ进行培养，以野生型菌株作为阳性对照，对各组细菌的磁珠产量进行测定和比较。实验结果如表1所示。
表1各组培养物每升培养基中纳米磁珠的产量
由表1可知，实验组各组的磁珠产量均能达到野生型的85％以上，降低幅度不明显；而对照组各组的磁珠产量较野生型菌株均出现显著降低，其中以对照组3、4的磁珠产量最低。表明在构建膜蛋白双基因缺失的趋磁细菌时，MamC+MamF是最优的选择；而在选择了相同的缺失膜蛋白时，用于结合表达荧光蛋白与用于结合表达功能蛋白的两条微载体的摩尔比为2:1时的效果好于1:1时的效果。
实验例3
电转化条件比较实验
以实施例8提供的方法作为实验组1，以对照例5～8提供的方法作为对照组1～4，分别采用上述方法对趋磁细菌MSR-Ⅰ进行培养，每组的细菌数目为107个、转化DNA的两位1μg(大小约5kbp)，对电转化后的细菌成活率和基因转化表达的成功率进行测定并比较。实验结果如表2所示。
表2各组细菌电转化后的成活率和转化成功率
组别 细菌成活率(％) 转化成功率(％)
实验组1 72.8 38.3
对照组1 71.4 17.2
对照组2 68.7 19.5
对照组3 51.1 22.3
对照组4 48.6 20.9
由表2可知，实验组的细菌成活率和基因转化成功率均显著高于对照组各组，其中对照组1、2的成活率较高、但转化成功率较低，二对照组3、4的成活率和转化成功率均较低。说明电流过低或时间过短均会降低转化的成功率，电流过大或时间过长则或造成细菌死亡率升高，同样会影响转化的成功率；由此表明本发明提供的电转化条件可以在保证细菌存活率的前提下提高转化的成功率。
实验例4
发酵培养条件比较实验
以实施例9提供的方法作为实验组1，以对照例9～11提供的方法作为对照组1～3，分别采用上述方法对趋磁细菌MSR-Ⅰ进行培养，以野生型菌株作为阳性对照，对各组细菌的磁珠产量进行测定和比较。实验结果如表3所示。
表3各组培养物每升培养基中纳米磁珠的产量
组别 纳米磁珠含量(mg) 对照组减产比例(％)
实验组1 232.5 —
对照组1 177.2 23.8
对照组2 192.7 17.1
对照组3 171.6 26.2
由表3可知，实验组的磁珠产量显著高于对照组各组，并且对照组1、3磁珠产量显著低于对照组2。表明本发明提供的微需氧+少量氢气的培养条件可以显著提高趋磁细菌MSR-Ⅰ的磁珠产量。
实验例5
培养基性能比较试验
在接种量相同的条件下，以实施例10提供的方法作为实验例1，以对照例12～14提供的方法作为对照例1～3，分别对趋磁细菌MSR-1进行培养，对培养后的细菌活力和数量进行测定，并进行比较。实验结果如表4所示。
表4各组细菌的活力和数量
组别 细菌活力 细菌数量
实验组1 0.842 6.1×109
对照组1 0.585 3.7×108
对照组2 0.663 7.5×108
对照组3 0.628 6.6×108
由表4可知，实验组细菌活力和细菌数量均显著高于对照组各组，说明本发明提供的培养方法可以有效提高趋磁细菌的活力和增殖能力；同时由于对照组2和3的细菌活力和细菌数量均显著高于对照组1，说明本培养方法中使用的预培养培养基和深层培养培养基均可以有效提高细菌的活力和增殖能力。
实验例6
生物纳米磁珠抗体载量比较试验
以实施例1和4提供的生物纳米磁珠作为实验组1～2，以对照例15～16提供的生物纳米磁珠作为对照组1～2，对各组纳米磁珠进行吸附、吸去多余水分后称重，加入适量保存液对纳米磁珠进行重悬，使磁珠的浓度达到1mg/mL。将FITC荧光标记的lgG抗体调节浓度至1mg/mL，依次按照1/10浓度进行梯度稀释，通过荧光分析仪计算每个梯度的荧光强度，制作标准曲线；另取适量稀释的FITC标记抗体，加入100μL纳米磁珠，混匀、37℃下温育15min，其间混匀3～5次；对纳米磁珠进行吸附、吸取上清，检测上清的FITC荧光强度，同时对磁珠进行洗涤、去掉结合不牢固的抗体，重悬磁珠后检测溶液中的荧光强度，根据标准曲线计算各组纳米磁珠的抗体载量。实验结果如表5所示。
表5各组纳米磁珠的lgG抗体载量
由表5可知，实验组各组纳米磁珠的抗体载量显著高于对照组各组。表明本发明通过在生物纳米磁珠膜蛋白上重组表达重组蛋白，可以有效提高抗体载量、提高实验分析结果的可靠性。
实验例7
高温加速实验
以实施例1～4提供的生物纳米磁珠作为实验组1～4，每组样品做12组平行实验，根据实验例6的方法将FITC标记的lgG抗体与生物纳米磁珠结合，将结合后的生物纳米磁珠置于37℃条件下，每组样品分别于第1～12天取出1份，用PBS缓冲液洗涤、磁力吸附后重悬，对FITC荧光强度进行检测，得到纳米磁珠试剂荧光强度的衰减曲线，并与4℃正常保存的试剂进行比较。
如图7所示，实验组各组到的生物纳米磁珠在10天后仍能保持原有活性的70％以上。通常认为37℃下放置1天大约相当于4℃下放置40天，并且生物纳米磁珠荧光强度衰减35％以下均认为符合性能标准。由此可以认为，本发明提供的生物纳米磁珠在4℃下放置一年仍能满足性能标准，说明其具有良好的稳定性、可以满足使用需求。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京国科融智生物技术有限公司
<120> 一种功能性生物纳米磁珠荧光编码方法及其流式应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggtaagca agggagagga actgttcaca ggcgtggtgc cgattctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggacacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgcgacgtat 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggtgtgcaa tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctagagt tcgtgacagc agccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaa 717
<210> 2
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggtcagca agggcgagga gctgttcact ggtgtggtgc ccatcctggt cgagctggat 60
ggagacgtaa acggccacaa gttcagcgtg agaggcgaag gcgaaggtga tgccaccaac 120
ggcaagctga cgctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgccagtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgagcca tggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaccta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcgtcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaacttcaa cagccacaac atctatatca tggccgtcaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacgtggagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacagccac 600
tacctgagca cccagtccgt gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
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<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
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ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
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ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
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ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
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<210> 4
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
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<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
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cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180
ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240
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gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
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aacatggcca tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc gcatggaggg ctccgtgaac 120
ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg ctttcagacc 180
gttaagctga aggtgaccaa gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat cttgtcccct 240
cagttcacct acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacctc 300
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gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc 360
tacaaggtga aggtgcgcgg caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag 420
accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc 480
gagatgaaga tgaggctgag gctgaaggac ggcggccact acgacgccga ggtcaagacc 540
acctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acaagaccga catcaagctg 600
gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg cgccgagggc 660
cgccactcca ccggcgcc 678
<210> 11
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
atgtctaaag gtgaagaatt attcactggt gttgtcccaa ttttggttga attagatggt 60
gatgttaatg gtcacaaatt ttctgtctcc ggtgaaggtg aaggtgatgc tacttacggt 120
aaattgacct taaaatttat ttgtactact ggtaaattgc cagttccatg gccaacctta 180
gtcactactt tttcttatgg tgttatggtt tttgctagat acccagatca tatgaaacaa 240
catgactttt tcaagtctgc catgccagaa ggttatgttc aagaaagaac tatttttttc 300
aaagatgacg gtaactacaa gaccagagct gaagtcaagt ttgaaggtga taccttagtt 360
aatagaatcg aattaaaagg tattgatttt aaagaagatg gtaacatttt aggtcacaaa 420
ttggaataca actttaactc tcacaatgtt tacatcatgg ctgacaaaca aaagaatggt 480
atcaaagcta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gtggtgttca attagctgac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggtgat ggtccagtct tgttaccaga caaccattac 600
ttatccattc aatctgcctt atccaaagat ccaaacgaaa agagagacca catggtcttg 660
ttagaatttg ttactgctgc tggtattacc catggtattg atgaattgta caaa 714
<210> 12
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
acttacaaac ttgtcattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagtc 60
gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgtcgatggt 120
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ggcggcggaa gcggaggctc aggtagcggc acttacaaac ttgtcattaa tggtaaaaca 240
ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagtc gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa 300
caatacgcta acgacaacgg tgtcgatggt gtgtggactt atgatgatgc gactaagacc 360
tttacggtca ctgaa 375
<210> 13
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gccgacaata aattcaacaa agaacaacaa aatgcgttct atgaaatttt acatttacct 60
aatttaactg aagaacaacg taatggcttc atccaaagcc ttaaagacga tccttcagtg 120
agcaaagaaa ttttagccga agcgaaaaag ctaaacgatg cccaagcacc aaaaggttca 180
ggcggaagcg gcggcggaag cggaggctca ggtagcgccg acaataaatt caacaaagaa 240
caacaaaatg ctttctatga aattttacat ttacctaatt taactgaaga acaacgtaat 300
ggcttcatcc aaagccttaa agacgatcct tcagtgagca aagaaatttt agccgaagcc 360
aaaaagctaa atgatgcgca agcgccaaaa 390
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gcagaagcag gcatcactgg cacgtggtat aaccagctgg gttccacgtt cattgtaact 60
gccggcgcag acggtgcact gactggtacg tacgagtccg cggtgggcaa cgcagagagc 120
cgttatgttc tgacgggccg ctacgactct gcaccagcta cggatggttc cggtactgct 180
ctgggttgga cggtggcatg gaagaacaac taccgtaacg cacattctgc gacgacttgg 240
tctggccagt acgtaggtgg tgcagaggca cgtatcaaca cgcagtggct gctgacgtcc 300
ggcacgacgg aggcgaacgc atggaaatct acgctggtgg gtcacgacac gttcactaag 360
gtgaagccat ctgcc 375

Claims (10)

1.一种功能性生物纳米磁珠，其特征在于，所述功能性生物纳米磁珠的膜蛋白同时融合表达荧光蛋白和功能蛋白。
2.如权利要求1所述的功能性生物纳米磁珠，其特征在于，所述荧光蛋白为EGFP、EBFP、ECFP、EYFP、ERFP、mOrange、mCherry、mStrawberry、mRaspberry、mPlum以及mKate中的任一种，所述EGFP基因序列如SEQ.ID.No.1所示，所述EBFP基因序列如SEQ.ID.No.2所示，所述ECFP基因序列如SEQ.ID.No.3所示，所述EYFP基因序列如SEQ.ID.No.4所示，所述ERFP基因序列如SEQ.ID.No.5所示，所述mOrange基因序列如SEQ.ID.No.6所示，所述mCherry基因序列如SEQ.ID.No.7所示，所述mStrawberry基因序列如SEQ.ID.No.8所示，所述mRaspberry基因序列如SEQ.ID.No.9所示，所述mPlum基因序列如SEQ.ID.No.10所示，所述mKate基因序列如SEQ.ID.No.11所示。
3.如权利要求1所述的功能性生物纳米磁珠，其特征在于，所述功能蛋白为重组蛋白G、重组蛋白A或重组链霉亲和素蛋白SA，所述重组蛋白G的基因序列如SEQ.ID.No.12所示，所述重组蛋白A的基因序列如SEQ.ID.No.13所示，所述重组链霉亲和素蛋白A的基因序列如SEQ.ID.No.14所示。
4.一种对权利要求1～3中任一项所述的功能性生物纳米磁珠进行荧光编码的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：利用趋磁细菌MSR-I构建细菌磁颗粒膜蛋白基因的缺失突变体菌株，作为一级重组菌株，缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因为MamC、MamD以及MamF中的任两种蛋白的基因；
S2：利用任一种缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因融合功能蛋白，并导入所述一级重组菌株中，构建二级重组菌株；
S3：利用与步骤S2中不同的任一种缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因融合荧光蛋白基因，构建基因融合表达载体；将所述基因融合表达载体导入所述二级重组菌株中，并进行筛选，得到具有荧光编码特性的三级重组菌株；
S4：对所述三级重组菌株进行培养，得到能同时表达荧光蛋白和功能蛋白的功能性生物纳米磁珠。
5.如权利要求4所述的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：
S1.1：分别对缺失的两个所述膜蛋白基因两侧500bp的同源DNA片段进行扩增，通过分子克隆构建两条微载体；
S1.2：将两条所述微载体通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
S1.3：对电转化后的菌株进行筛选和鉴定，获得缺失两种的重组菌株，即为一级重组菌株。
6.如权利要求4所述的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：
S2.1：将所述功能蛋白的基因序列与一种缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因序列进行融合，得到新的融合基因片段；
S2.2：将所述融合基因片段克隆到表达载体pBRC1上，得到功能蛋白表达质粒；
S2.3：通过三亲本接合或电转化的方式将所述功能蛋白表达质粒转入所述一级重组菌株中，验证后得到表达所述功能蛋白的重组菌株，即为二级重组菌株。
7.如权利要求4所述的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，其特征在于，所述步骤S3的方法如下：
S3.1：对所述荧光蛋白基因序列进行PCR扩增；
S3.2：用EcoRI/SmaI对扩增产物和表达载体pBRC2分别进行双酶切；
S3.3：将经过双酶切的所述扩增产物与不同于步骤S2的缺失的所述细菌磁颗粒膜蛋白基因融合，并连接到同样经过双酶切的所述表达载体pBRC2上，得到荧光蛋白表达质粒；
S3.4：通过电转化的方式将所述荧光蛋白融合表达质粒分别转化到所述二级重组菌株中，经过筛选验证得到能表达荧光蛋白的所述三级重组菌株；
S3.5：通过流式细胞仪对所述三级重组菌株表达的不同荧光蛋白进行分析和鉴定。
8.如权利要求4所述的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：
S4.1：首先使用200～500mL培养基进行预培养，培养条件为氧气含量5～10％、N2含量90～95％，培养时间16小时，培养温度37℃；
S4.2：将经过预培养的菌株转接到发酵罐中进行深层培养，培养条件为氧气含量5％、氢气含量1％、N2含量94％，培养时间3～4天，培养温度37℃；
S4.3：通过均质设备对深层培养物进行处理、将菌体粉碎，通过磁装置进行吸附，并用磷酸缓冲液洗涤2～3次；
S4.4：用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到纯化后的功能性生物纳米磁珠。
9.如权利要求5～7中任一项所述的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，其特征在于，所述电转化的具体方法如下：
采用方波电脉冲，在3100～3200V条件下，进行1～2次时长为3.1～3.3ms电脉冲。
10.如权利要求8所述的功能性生物纳米磁珠荧光编码方法，其特征在于，所述预培养中使用的培养基包括如下成分：
10～12份牛肉膏、1～2份壳聚糖、1～2份半乳糖、0.5～1份磷酸二氢钠、0.2～0.5份磷酯酰丝氨酸、0.05～0.1份柠檬酸钠以及0.5～1份海藻酸钾；所述深层培养中使用的培养基包括如下成分：
6～8份女贞子多糖、8～12份蛋白胨、1～2份蜗牛多糖、1～2份卵磷脂、0.1～0.2份槲皮素、0.5～1份酒石酸钾钠以及0.05～0.1份柠檬酸钠。
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