CN105018401B - 一种靶向治疗用人工趋磁细菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向治疗用人工趋磁细菌及其构建方法和应用，所述人工趋磁细菌内包含能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，所述细菌表面表达有所述定位蛋白，所述定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连。本发明的人工趋磁细菌能够在外加磁场的作用下富集到生物体内的靶向部位，当细菌的密度在靶向部位富集到密度感应元件感知的临界密度时，密度感应元件控制治疗基因表达，因此具有较好的靶向治疗作用。本发明的人工趋磁细菌可用于制备靶向治疗的药物中，提高治疗的靶向性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向治疗用人工细菌，特别是一种靶向治疗用人工趋磁细菌及其构建方法和应用。
背景技术
自然界中存在大量能够适应并利用不同环境条件的微生物，可供我们开发利用。其中一个特殊例子就是趋磁细菌。这类原核生物群体能够借助地球磁场的作用，使自己迁移至低氧海水环境中。虽然这类微生物在生理、形态与系统发生上呈现多样化的特性，但它们依然表现出一些共同特性。趋磁细菌一般出现在海洋有氧层与无氧层的交界面附近，它们几乎都是厌氧或微耗氧细菌，或者两种特性兼而有之。这一类群细菌的最显著特征在于它们能够向着地球磁极运动。依靠自身鞭毛的作用，北半球的趋磁细菌向着北磁极运动，而南半球的情况则相反。趋磁性与各种趋化性相配合，可以使趋磁细菌更好地适应化学性质存在差异的不同水体底部的微氧环境。
这种趋磁性由细菌内部一个特殊结构——磁小体介导。它由磷脂双分子层包裹着的磁铁纳米晶体组成，包含四氧化三铁、四硫化三铁、硫化亚铁和八硫化七铁等物质。一般情况下，磁小体的形态、晶体成分、尺寸和排列方式都有其种属特异性。磁小体大小一般在35到120纳米之间，亦有报道指出在一些无法培养的菌株中存在250纳米的磁小体。其形状包含矩形、长棱镜状和八面立方体等多种类型。各磁小体在细胞内依次排列成一条或多条长链，组成一个“磁场感应器”，使趋磁细菌能够顺着外部磁场的方向游动。磁小体的形成机制尚不明确，一般认为其形成应当包括以下几个环节：磁小体囊泡形成，摄入环境中的铁，向囊泡转运铁和晶体生物矿化。
由于磁小体有包膜结构、纳米级大小、尺寸分布窄和具有铁磁性等特点，自40年前被发现以来，人们就对趋磁细菌及其磁小体进行了多方面的研究与开发利用。曾有学者利用趋磁细菌在陨石和岩石中寻找磁铁矿。趋磁细菌也被用于清除污水中的放射性核素和重金属。虽然对趋磁细菌的研究不断深入，但其苛刻的生长方式与复杂的营养要求，使得对它的分离培养变得非常困难。因此仅有一小部分趋磁细菌能够被培养与研究。由于对它们缺乏了解，尚无一种能够产生硫复铁矿的趋磁细菌被纯培养。这也阻碍了我们对天然趋磁细菌应用价值的开发。
由于认识水平与研究手段的原因，趋磁细菌的磁性内含物反而得到了更广泛的研究利用，特别是在医疗与诊断领域，如磁共振成像、热疗、标记细胞分离和药物输送等。利用一些多功能分子对磁颗粒表面进行修饰，可以将它的应用范围扩展至生物技术领域。如利用多基团连接物的一端与磁颗粒外膜上的氨基酸等分子结合，另一端再与需要携带的药物分子结合，就可以将药物固定在磁颗粒上。这一工程磁颗粒可以被施加的磁场捕获，并将药物运输到特定部位。在DNA分离技术中，经含氨基末端的有机物修饰的磁颗粒可以显著增加DNA回收效率。这种工程磁颗粒有望用于肿瘤治疗中的药物运输。肿瘤化疗的一个主要不足就是，毒性药物经过静脉注射，随着循环系统分布全身，无法被特异集聚在病灶部位。由此带来的副作用就是药物攻击肿瘤时，也会损伤正常的组织器官。而通过开发利用药物磁运输技术，可以明显降低抗肿瘤药物在血液循环系统中的分布。同时由于药物被靶向运输至肿瘤部位，其治疗效果可以得到明显提高。这一结果在脑瘤和骨髓瘤等的动物模型中得到很好的验证。
在这类研究中，药物通常被连接到磁颗粒上，形成药物载体复合物后经静脉注射到动物体内。然后一个外加磁场被用于将药物聚集在病灶部位。不过这些已有的靶向运输都需要将一个永磁铁尽可能地靠近目标区域以提供靶向的外加磁场，直到释放出磁颗粒。这对于靠近身体表面的肿瘤具有良好的靶向效果，但对深部肿瘤其效果会明显降低。同时复杂的毛细血管网络也会降低那些单纯依靠体液运输的药物的靶向运输效果。这种靶向性的降低也会带来一定的治疗副作用。并且通过化学修饰将药物结合在磁颗粒的方法，对药物的种类和活性存在着明显的限制作用，特别是一些生物活性药物在修饰过程中容易被破坏。实际上这类药物一进入人体就开始在各个部位发挥药效，只是其药效低于富集部位而已。这类方案在时间和空间上，不易控制药物活性的发挥。
发明内容
本发明提供一种能够通过鞭毛自主运动并利用磁场将治疗基因携带到靶向部位，并在该部位进行特异表达治疗基因，以提高靶向治疗效果的人工趋磁细菌及其构建方法。鉴于靶向治疗与基因运输在生物医药领域的重要作用，以及磁靶向运输技术在一些稳定性或水溶性较差药物应用方面的优势，本发明将对药物与基因的靶向运输的研究与应用具有重要的补充和促进作用。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种靶向治疗用人工细菌，该细菌内包含能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，上述定位蛋白能够通过生物亲和作用与磁颗粒相连。
作为本发明的优选方案，上述细菌选自能够与生物体相容的非致病性细菌，优选大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸菌或枯草芽孢杆菌，更优选大肠杆菌。
作为本发明的优选方案，上述定位蛋白选自增强绿色荧光蛋白(eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)，或者其它便于检测的蛋白，优选增强绿色荧光蛋白(eGFP)。
作为本发明的优选方案，上述生物亲和作用为生物素-亲和素系统，具体是通过生物素化的定位蛋白抗体介导上述定位蛋白与亲和素标记的纳米磁颗粒相连。
作为本发明的优选方案，上述治疗基因选自侵袭因子、细胞溶解素、干扰素、细胞因子或重组疫苗的基因。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种靶向治疗用人工趋磁细菌，该细菌内包含能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，上述细菌表面表达有上述定位蛋白，上述定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连，形成上述人工趋磁细菌。当上述细菌与上述磁颗粒相连后，上述细菌能够在外加磁场的作用下富集到生物体内的靶向部位，当细菌的密度在上述靶向部位富集到上述密度感应元件感知的临界密度时，上述密度感应元件控制上述治疗基因表达。
本发明还提供一种人工趋磁细菌，该细菌内包含能够在大肠杆菌表面表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列，上述细菌表面表达有上述增强绿色荧光蛋白，上述增强绿色荧光蛋白通过生物素化的增强绿色荧光蛋白的抗体与亲和素标记的纳米磁颗粒相连，形成上述人工趋磁细菌。当上述细菌与上述纳米磁颗粒相连后，上述细菌能够在外加磁场的作用下富集到生物体内的靶向部位，当上述细菌的密度在上述靶向部位富集到上述密度感应元件感知的临界密度时，上述密度感应元件控制上述黄色荧光蛋白报告基因表达。
作为本发明的优选方案，上述能够在大肠杆菌表面表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23a sp-eGFP-aida质粒；上述密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列是如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
根据本发明的第三方面，本发明提供一种构建靶向治疗用人工细菌的方法，该方法包括：将能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列导入细菌内；其中上述定位蛋白能够通过生物亲和作用与磁颗粒相连。
根据本发明的第四方面，本发明提供一种构建靶向治疗用人工趋磁细菌的方法，该方法包括：将能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列导入细菌内；诱导上述定位蛋白表达，并将上述定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连，形成上述人工趋磁细菌。当上述细菌与上述磁颗粒相连后，上述细菌能够在外加磁场的作用下富集到生物体内的靶向部位，当上述细菌的密度在上述靶向部位富集到上述密度感应元件感知的临界密度时，上述密度感应元件控制上述治疗基因表达。
本发明还提供一种构建人工趋磁细菌的方法，该方法包括：将能够在大肠杆菌表面表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列导入细菌内；诱导上述增强绿色荧光蛋白表达，并将上述增强绿色荧光蛋白通过生物素化的增强绿色荧光蛋白的抗体与亲和素标记的纳米磁颗粒相连，形成上述人工趋磁细菌。当上述细菌与上述纳米磁颗粒相连后，上述细菌能够在外加磁场的作用下富集到生物体内的靶向部位，当上述细菌的密度在上述靶向部位富集到上述密度感应元件感知的临界密度时，上述密度感应元件控制上述黄色荧光蛋白报告基因表达。
作为本发明的优选方案，上述能够在大肠杆菌表面表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23a sp-eGFP-aida质粒；上述密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列是如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
根据本发明的第五方面，本发明提供一种第一方面的人工细菌或第二方面的人工趋磁细菌在制备靶向治疗的药物中的用途。
本发明通过向细菌内导入能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，得到一种人工细菌，通过诱导定位蛋白表达，并将定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连，得到一种人工趋磁细菌。该人工趋磁细菌能够在外加磁场的作用下富集到生物体内的靶向部位，当细菌的密度在靶向部位富集到密度感应元件感知的临界密度时，密度感应元件控制治疗基因表达，因此具有较好的靶向治疗作用。本发明的人工趋磁细菌可用于制备靶向治疗的药物中，提高治疗的靶向性和特异性。
附图说明
图1是本发明一个实施例中的人工趋磁细菌及趋磁性示意图；
图2是本发明一个实施例中的eGFP细菌顶端定位表达所需的基因结构，即Pet23asp-eGFP-aida质粒的结构示意图；
图3是本发明一个实施例中的eGFP在细菌中的分布情况；
图4是本发明一个实施例中的eGFP在细菌表面的定位表达效果；
图5是本发明一个实施例中的纳米磁颗粒在人工趋磁细菌上的标记效果；
图6是本发明一个实施例中的纳米磁颗粒在人工趋磁细菌上的标记效果统计结果；
图7是本发明一个实施例中的纳米磁颗粒标记的细菌的靶向效果；
图8是本发明一个实施例中的报告基因YFP在密度感应元件控制下的基因结构，即JRI2YFP质粒图谱；
图9是本发明一个实施例中的YFP和plux的PCR扩增结果，其中泳道1是YFP片段PCR产物，泳道2是plux片段PCR产物，泳道3是阴性PCR，泳道4是DNA marker；
图10是本发明一个实施例中的pluxYFP的质粒图谱；
图11是本发明一个实施例中的pluxYFP的酶切鉴定结果，其中泳道1是pluxYFP的NdeI/BamHI双酶切得到的2200bps和750bps的两条特异条带，泳道2是DNA marker；
图12是本发明一个实施例中的L-pluxYFP酶切结果，其中泳道1是PCR产物L-pluxYFP经XhoI/ApaLI双酶切的结果，泳道2是DNA marker；
图13是本发明一个实施例中的pluxRI2酶切结果，其中泳道1是pluxRI2经XhoI/ApaLI双酶切得到的2000bps的RI2片段和约1700bps的质粒骨架片段，泳道2是DNA marker；
图14是本发明一个实施例中的pluxYFPRI2的质粒图谱；
图15是本发明一个实施例中的pluxYFPRI2的酶切鉴定结果，其中泳道1是pluxYFPRI2经XhoI/ApaLI双酶切得到的2000bps和2900bps的特异片段，泳道2是DNAmarker；
图16是本发明一个实施例中的pluxYFPRI2的酶切鉴定结果，其中泳道1是pluxYFPRI2经XhoI/AatII双酶切得到的约3800bps的RI2片段和约1100bps的片段，泳道2是DNA marker；
图17是本发明一个实施例中的PCR产物p-YFP的酶切鉴定结果，其中泳道1是p-YFP经XhoI/AatII双酶切得到的结果，泳道2是DNAmarker；
图18是本发明一个实施例中的JRI2YFP的酶切鉴定结果，其中泳道1是JRI2YFP经BamHI酶切得到的3000bps和1800bps的特异片段，泳道2是DNA marker；
图19是本发明一个实施例中的JRI2YFP的YFP荧光的密度感应效果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
鉴于天然趋磁细菌来源受限，培养困难。本发明提供一种能够通过鞭毛自主运动并利用磁场将治疗基因携带到靶向部位，并在该部位进行特异表达治疗基因，以提高靶向治疗效果的人工趋磁细菌及其构建方法。鉴于靶向治疗与基因运输在生物医药领域的重要作用，以及磁靶向运输技术在一些稳定性或水溶性较差药物应用方面的优势，本发明将对药物与基因的靶向运输的研究与应用具有重要的补充和促进作用。
本发明区分了靶向治疗用的“人工细菌”和“人工趋磁细菌”两个概念，前者是指，细菌内包含能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，上述定位蛋白能够通过生物亲和作用与磁颗粒相连。也就是说，“人工细菌”具有表达定位蛋白的潜能，或者在诱导条件下表达有定位蛋白，但是定位蛋白并没有与磁颗粒相连，在这种情况下，细菌还没有获得在外加磁场的作用下向生物体内的靶向部位富集的能力。后者是指，不但细菌内包含能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，而且定位蛋白已经表达，并且定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连，在这种情况下，细菌已经获得在外加磁场的作用下向生物体内的靶向部位富集的能力。本发明中，“人工趋磁细菌”可以看作是“人工细菌”与磁颗粒相连的结果，其中磁颗粒可以看作已经成为细菌的一部分结构。
需要说明的是，只需要向普通细菌中导入能够在细菌表面表达出定位蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，即可获得本发明的人工细菌。而向普通细菌中导入基因或表达序列的方法是本领域公知的技术，并且确定能够获得携带相应基因或表达序列的重组细菌。因此，本发明的“人工细菌”具有可重复性的特征，本领域的技术人员只要按照本发明提供的方法即可得到本发明的人工细菌。据此，本领域的技术人员应当理解，本发明无需提供菌种保藏也能满足充分公开条件。
本发明的一个实施方案中，磁颗粒选用纳米级的磁颗粒，即纳米磁颗粒，这种磁颗粒比细菌的尺寸小，不会影响细菌的运动性。
本发明的某些实施方案中，细菌可以选自能够与生物体相容的非致病性细菌，优选大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸菌或枯草芽孢杆菌，更优选大肠杆菌。
本发明的某些实施方案中，定位蛋白可以选自增强绿色荧光蛋白(eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)，或者其它便于检测的蛋白，优选增强绿色荧光蛋白(eGFP)。这些蛋白具有便于检测的优势，能够精确、容易地定位其在细菌表面上的位置，利于分析其与纳米磁颗粒的共定位情况。
本发明的一个实施方案中，生物亲和作用为生物素-亲和素系统，具体是通过生物素化的定位蛋白抗体介导上述定位蛋白与亲和素标记的纳米磁颗粒相连。需要说明的是，本发明中定位蛋白与纳米磁颗粒的连接并不限于上述生物素-亲和素系统，鉴于抗原抗体反应是生物学中常见且成熟的反应模式，可以采用例如将定位蛋白的抗体直接包被在纳米磁颗粒上，再与细菌表面的定位蛋白结合的方式实现定位蛋白与纳米磁颗粒的连接；也可以先用定位蛋白的抗体结合细菌表面的定位蛋白，然后用连接有该抗体的抗体(即二抗)的纳米磁颗粒与细菌接触，实现定位蛋白与纳米磁颗粒的连接；等等。
本发明的某些实施方案中，治疗基因可以选自侵袭因子(Invasin)、细胞溶解素、干扰素、细胞因子或重组疫苗的基因。需要说明的是，任何治疗基因都可以通过本发明的人工趋磁细菌富集到生物体的靶向部位，并在靶向部位经密度感应元件的调控实现治疗基因的特异性表达，从而实现治疗目的。因此，本发明的人工细菌或人工趋磁细菌具有广泛的靶向治疗作用，只要改变治疗基因，即可实现治疗作用的改变。也就是说，本发明具有普适性的特点，因此本发明并不意图限制治疗基因的种类。
需要说明的是，本发明虽然没有特别针对某个治疗基因进行具体的实验研究，但是本发明采用黄色荧光蛋白(YFP)作为报告基因成功验证了本发明的可行性。本领域的技术人员公知，这样的研究能够可预期性地推广到治疗基因上，并且其效果也是可以预料到的。
以下通过实施例说明本发明的可行性，需要说明的是，以下实施例仅是示例性的，并且其目的仅在于说明本发明的可行性，并不意在限制本发明的保护范围。
实施例1磁颗粒标记细菌及趋磁性
如图1a所示，首先在大肠杆菌外表面顶端表达一个eGFP蛋白，然后将一个带cy3红色荧光的亲和素标记纳米磁颗粒通过生物素标记eGFP抗体连接在细菌上。由此得到一个带有磁性的人工趋磁细菌。如图1b该细菌在自然状态下成游离分布，当遇到外加磁场时就会在磁场周围集聚。
实施例2eGFP细菌顶端定位表达所需的基因结构
如图2所示，eGFP表达质粒Pet23a sp-eGFP-aida(由香港大学黄建东实验室提供，参照Sumita Jain,2006年文章改造)。将eGFP定位表达于大肠杆菌顶端外表面，需要利用粘附素介导的弥散性粘附转位因子aida。通过EcoRI与SacI酶切位点，将eGFP基因插入到pET23a sp-aida质粒的SP信号肽与aida之间，即可使eGFP通过aida定位于细菌顶端外表面。Pet23a sp-eGFP-aida质粒的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。本领域技术人员也可以参考SEQ ID NO：1所示的序列通过人工合成的方式得到Pet23a sp-eGFP-aida质粒。
实施例3eGFP在大肠杆菌中分布
3.1eGFP诱导表达
eGFP的表达使用购自Tiangen公司的BL21(DE3)(GenBank:AM946981.2)。BL21(DE3)基因型为F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)。该菌株用做以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。其T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。将实施案例2中的质粒Pet23a sp-eGFP-aida转化携带T7聚合酶的细菌BL21。对得到的细菌在LB培养基中进行37℃,220rpm培养。至OD0.6时加入终浓度0.5mM IPTG进行诱导表达2h。
3.2不同细菌组分分离与eGFP western鉴定
1)35000g,10min离心收集10ml 3.1中菌体，0.5ml PBS重悬菌体后进行超声破碎，得到细菌总蛋白抽提物TE。
2)100000g,1h离心抽提物TE收集沉淀，以0.5ml含0.05mM氯化镁,2％TritonX-100的PBS重悬沉淀，得到细菌膜总蛋白抽提物TM。
3)100000g,1h离心抽提物TM收集沉淀，0.5ml PBS重悬沉淀，得到外膜蛋白抽提物OM。
4)以未诱导的细菌总蛋白抽提物CN做对照，对上述各抽提物进行WesternBloting鉴定。如图3所示，经过eGFP抗体的特异性检测，未诱导的对照组中不存在eGFP特异性条带。而在诱导组中细菌总蛋白(TE)、细菌总膜蛋白(TM)和细菌外膜蛋白(OM)中eGFP含量相当。
实施例4eGFP在大肠杆菌顶端外表面定位表达
对实施例3.1中细菌，用DAPI进行核区染色后，将菌体涂抹于载玻片上，进行荧光显微观察。用350～370nm激发光、450～480nm发射光检测DAPI紫色荧光；470～490nm激发光、520～560nm发射光检测eGFP绿色荧光。如图4所示，携带Pet23a sp-eGFP-aida质粒的细菌中，eGFP特异性地出现在其菌体顶端，而在菌体其它部位则没有eGFP的分布。
实施例5人工趋磁细菌组装
纳米磁颗粒通过生物素亲和素反应和抗原抗体反应标记在细菌上，得到人工趋磁细菌。
5.1eGFP抗体标记细菌
1)10000g，10min离心收集20ml实施例3.1中eGFP定位表达的细菌。
2)1ml PBS重悬步骤1菌体，再以10000g，10min离心收集菌体。
3)重复步骤2。
4)PBS重悬菌体，调整至108～109CFU/ml。向200微升重悬菌体中加入生物素化的eGFP抗体，调节终浓度至抗体1ug/ml,菌体108CFU/ml。
5)抗体与细菌混合物在22℃，孵育30min。
6)10000g，10min离心孵育产物，收集菌体。
7)用1ml PBS重悬菌体,再10000g，10min离心收集菌体。
8)重复步骤7。用1ml PBS重悬最终产物，得到eGFP抗体标记的菌体。
9)得到的菌体保存于4℃，时间不超过2h。
5.2纳米磁颗粒准备
纳米磁颗粒由Chemicell公司提供，已被事先标记cy3和链亲和素。
1)10000g，10min离心收集1ml 109颗/ml浓度的磁颗粒。
2)1ml PBS重悬磁颗粒，再以10000g，10min离心收集磁颗粒。
3)重复步骤2，1mlPBS重悬磁颗粒，即可去除叠氮化钠。
5.3纳米磁颗粒标记细菌
1)10000g，10min，离心收集1ml实施例5.1中菌体。
2)以1ml实施例5.2制备的磁颗粒悬液重悬步骤1)中收集的菌体，此时磁颗粒与细菌数目比例约为10:1。
3)样品在混匀器上，室温混匀15min。
4)3000g缓慢离心5min，去除上清，收集菌体。此时被磁颗粒标记的菌体会被沉淀下来，而游离磁颗粒依然处于上清中。
5)1ml PBS重悬菌体，重复步骤4)。
6)1mlPBS重悬磁颗粒标记的菌体，调整菌体浓度至105CFU/ml。所得菌体保存于4℃，时间不超过1周。
实施例6人工趋磁细菌组装效果检测
6.1将实施例5.3中最终产物涂布在载玻片上进行激光共聚焦荧光显微观察。以470–490nm激发光，520–560nm发射光检测eGFP；530-560nm激发光，73–648nm发射光检测Cy3。如图5所示，在人工组装的趋磁细菌中，除去少量非特异荧光外，纳米磁颗粒所携带的cy3红色荧光(箭头a指示)总是特异性地和细菌顶端的eGFP绿色荧光(箭头b指示)一同出现。这显示了人工趋磁细菌良好的组装效率与组装特异性。
6.2在实施例5.3中改用1ml稀释至4×108颗/ml浓度的磁颗粒标记细菌，磁颗粒与细菌比例为4:1。按6.1进行荧光观察，分别统计磁颗粒与细菌比例在10:1和4:1条件下的红绿荧光数目，分析人工趋磁细菌组装效率和特异性。如图6所示，在磁颗粒与细菌比例为4:1时，与绿色荧光共定位的红色荧光比例更高，表示具有较高的人工趋磁细菌组装效率。此时非特异结合在菌体上的红色荧光比例最低，表示良好的组装特异性。
实施例7人工趋磁细菌磁靶向性分析
将1ml施例5.3组装的人工趋磁细菌加入到培养至80％的hela细胞中，轻轻混匀。对照组加入1ml PBS。分别在两组细胞的平板上选择一个部位，放置一块小磁铁，30、120秒后进行显微观察。如图7所示，在实验组中放置了磁铁的靶向部位富集了大量细菌，而在其他部位则没有观察到明显的细菌残留，显人工趋磁细菌良好的磁靶向性。
实施例8人工趋磁细菌密度感应所需基因元件构建
为了构建图8所示密度感应元件JRI2YFP，本实施例先构建了pluxYFP和pluYFPRI2，再将pluxYFPRI2改造成JRI2YFP。
本实施例中使用的引物序列如表1所示。
表1
| 引物名称 | 引物序列 | 序列编号 |
| YFP-NdeI f | catcatatggtgagcaagggcgaggag | SEQ ID NO：3 |
| YFP-BamHI r | atcaggatccttacttgtacagctcgtc | SEQ ID NO：4 |
| plux f | gtcgacaagcttggatccctgcag | SEQ ID NO：5 |
| plux r | catcatatgaacctcccttgcg | SEQ ID NO：6 |
| L-pluxYFP f | atggtgcacaagatacttaacagggaag | SEQ ID NO：7 |
| L-pluxYFP r | agactcgaggaggaagcggaatatatc | SEQ ID NO：8 |
| YFP–AatII f | gttagacgtcgactgggcctttcgttttat | SEQ ID NO：9 |
| YFP–XhoII r | atgcctcgaggtcctttgattctaataaattg | SEQ ID NO：10 |
8.1构建pluxYFP
1)利用引物YFP-NdeI f和YFP-BamHI r从模板chez-YFP(序列如SEQ ID NO：11)中扩增约750bps的YFP序列(chez-YFP由香港大学黄建东实验室提供)。利用引物plux f和plux r从模板pluxcheZ(序列如SEQ ID NO：12，参考Chenli liu,2011)中扩增约2200bps的plux片段。PCR结果如图9所示。
2)利用限制性内切酶NdeI和BamHI分别酶切步骤“1)”中的PCR产物YFP和plux。利用T4连接酶对两个酶切产物进行连接，再转化DH5a感受态细胞就可以得到如图10所示pluxYFP克隆。
3)抽提pluxYFP质粒，并对pluxYFP进行NdeI和BamHI酶切鉴定，可重新看到一条750bps的条带和一条2200bps的条带，结果如图11所示。
8.2构建pluxYFPRI2
1)利用引物L-pluxYFP f和L-pluxYFP r对质粒pluxYFP进行扩增，得到线性化片段2900bps的L-pluxYFP。回收PCR产物后，进行XhoI和ApaLI双酶切处理。PCR和酶切结果如图12。
2)利用XhoI和ApaLI对质粒pluxRI2(序列如SEQ ID NO：13，参考Chenli liu,2011)进行双酶切处理，得到约2000bps的RI片段。酶切结果如图13所示。
3)利用T4连接酶连接酶切处理的L-pluxYFP片段和RI片段。再转化DH5a感受态细胞可以得到如图14所示pluxYFPRI2克隆(序列如SEQ ID NO：14)。
4)抽提pluxYFPRI2质粒，并进行XhoI和ApaLI双酶切鉴定，可以看到2900bps和2000bps的条带，结果如图15所示。
8.3构建JRI2YFP
构建JRI2YFP的主要目的在于更改pluxYFPRI2中YFP的转录方向，避免YFP的转录表达干扰LuxR基因的表达。
1)对pluxYFPRI2进行AatII和XhoI双酶切，去除YFP基因，得到3000bps的JRI2片段。酶切结果如图16所示。
2)利用引物YFP–XhoI f和YFP–AatII r对模板pluxYFPRI2进行扩增，得到约1000bps的p-YFP片段，5’端与3’端分别带有XhoI与AatII酶切位点(在pluxYFPRI2中刚好相反，这两个酶切位点在YFP片段3’端与5’端)。对p-YFP片段进行XhoI与AatII双酶切处理，PCR产物酶切结果如图17所示。
3)利用T4连接酶连接酶切处理的JRI2片段和p-YFP片段，再转化DH5a感受态细胞可以得到如图8所示的JRI2YFP克隆。
4)抽提JRI2YFP质粒，并进行BamHI酶切鉴定，可以看到1800bps和3000bps的特异条带。而BamHI酶切pluxYFPRI2得到的是1000和3800的条带。酶切结果如图18所示。
携带JRI2YFP的细菌含有密度感应所需的基因原件luxR-luxI和被密度感应原件控制的报告基因YFP，因此能对细菌自身的密度变化作出响应。当细菌密度达到阈值时，细菌作出响应，报告基因YFP迅速表达。
实施例9细菌密度感应效果监测
将携带JRI2YFP的目的细菌(大肠杆菌)进行30℃培养，利用多功能酶标仪检测细菌不同生长阶段的YFP黄色荧光水平，分析报告基因的密度感应效果。如图19所示，在低密度时YFP报告基因不表达，基本没有可检测荧光信号，当细菌密度达到1.8附近，时YFP基因感应到密度变化。报告基因迅速表达，此时开始检测到强荧光信号，显示较好的密度感应效果(图19中相对荧光指检测到的荧光强度水平与OD600的比值)。
用相应的治疗基因(如侵袭因子Invasin、细胞溶解素、干扰素、细胞因子和重组疫苗等能够在原核细菌中活性表达的基因)代替YFP报告基因，这一密度感应原件系统即可以导入到前面组装的人工趋磁细菌中，得到具有靶向治疗效果的人工趋磁细菌。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种靶向治疗用人工细菌，其特征在于，所述细菌内包含能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，所述定位蛋白能够通过生物亲和作用与磁颗粒相连；
所述能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23asp-eGFP-aida质粒；所述密度感应元件控制的治疗基因表达序列包括如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
2.根据权利要求1所述的人工细菌，其特征在于，所述细菌选自能够与生物体相容的非致病性细菌，所述非致病性细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸菌或枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的人工细菌，其特征在于，所述非致病性细菌为大肠杆菌。
4.据权利要求1所述的人工细菌，其特征在于，所述生物亲和作用为生物素-亲和素作用，具体是通过生物素化的定位蛋白抗体介导所述定位蛋白与亲和素标记的纳米磁颗粒相连。
5.据权利要求1所述的人工细菌，其特征在于，所述治疗基因选自侵袭因子、细胞溶解素、干扰素、细胞因子或重组疫苗的基因。
6.一种靶向治疗用人工趋磁细菌，其特征在于，所述细菌内包含能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列，所述细菌表面顶端表达有所述定位蛋白，所述定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连，形成所述人工趋磁细菌；
所述能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23asp-eGFP-aida质粒；所述密度感应元件控制的治疗基因表达序列包括如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
7.一种人工趋磁细菌，其特征在于，所述细菌内包含能够在大肠杆菌表面顶端表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构，以及密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列，所述细菌表面顶端表达有所述增强绿色荧光蛋白，所述增强绿色荧光蛋白通过生物素化的增强绿色荧光蛋白的抗体与亲和素标记的纳米磁颗粒相连，形成所述人工趋磁细菌；
所述能够在大肠杆菌表面顶端表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23a sp-eGFP-aida质粒；所述密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列是如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
8.一种构建靶向治疗用人工细菌的方法，其特征在于，所述方法包括：将能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列导入细菌内；其中所述定位蛋白能够通过生物亲和作用与磁颗粒相连；
所述能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23asp-eGFP-aida质粒；所述密度感应元件控制的治疗基因表达序列包括如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
9.一种构建靶向治疗用人工趋磁细菌的方法，其特征在于，所述方法包括：将能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的治疗基因表达序列导入细菌内；诱导所述定位蛋白表达，并将所述定位蛋白通过生物亲和作用与磁颗粒相连，形成所述人工趋磁细菌；
所述能够在细菌表面顶端表达出定位蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23asp-eGFP-aida质粒；所述密度感应元件控制的治疗基因表达序列包括如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
10.一种构建人工趋磁细菌的方法，其特征在于，所述方法包括：将能够在大肠杆菌表面顶端表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构以及密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列导入细菌内；诱导所述增强绿色荧光蛋白表达，并将所述增强绿色荧光蛋白通过生物素化的增强绿色荧光蛋白的抗体与亲和素标记的纳米磁颗粒相连，形成所述人工趋磁细菌；
所述能够在大肠杆菌表面顶端表达出增强绿色荧光蛋白的基因结构是如SEQ ID NO：1所示的Pet23a sp-eGFP-aida质粒；所述密度感应元件控制的黄色荧光蛋白报告基因表达序列是如SEQ ID NO：2所示的JRI2YFP质粒。
11.一种权利要求1-5任一项所述的人工细菌或权利要求6所述的人工趋磁细菌在制备靶向治疗的药物中的用途。
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| "New paradigm for tumor theranostic methodology using bacteria-based microrobot";Sung Jun Park 等;《SCIENTIFIC REPORTS》;20131231;第3卷(第3394期);摘要，第6页"方法" * |
| "一个新型原核诱导表达系统的建立";刘征 等;《生物技术通报》;20130815(第8期);第145页左栏第1段-146页左栏第1段，第148页左栏最后一段 * |
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