CN104725517B - 一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法。该方法包括：1)将由a凝集素的Aga2亚基的编码基因与目的蛋白的编码基因融合而成的融合基因导入能表达a凝集素的Aga1亚基的受体酵母细胞，得到重组酵母细胞；所述目的蛋白以融合蛋白的形式被展示于所述重组酵母细胞表面；2)将外源表达的由a凝集素的Aga2亚基和所述目的蛋白融合而成的融合蛋白人工锚定到已经天然展示了所述目的蛋白的所述重组酵母细胞表面。实验证明，此种方法能够明显增加酵母细胞表面的目的蛋白展示量。这一结果解决了其在口服免疫过程中抗原提呈量不足的问题，为新型口服疫苗的研制提供重要的理论基础与方法指导。

Description

一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法。

背景技术

酵母表面展示(Yeast surface display)是继噬菌体展示技术发明之后，近些年发展起来的一种新的蛋白表面展示技术。酵母细胞作为真核生物表达体系可以对真核蛋白进行糖基化和二硫键异构化等修饰，并将其暴露展示在酵母细胞表面，因此酵母展示技术被越来越多地应用在蛋白质/肽文库的构建与筛选、蛋白质相互作用、生物催化、抗体药物筛选及口服疫苗的研制等诸多方面。

酵母展示技术是一种新型的口服疫苗研制技术，和传统的疫苗相比利用酵母展示技术制备的疫苗有以下优点：第一，酵母细胞表达的抗原能够更加有效的被生物体识别；第二，酵母细胞本身颗粒度大，在进行口服免疫的过程中能够起到免疫佐剂的作用；第三，酵母细胞作为真核表达系统，易于蛋白质的表达，可用于多种疾病的疫苗研究；第四，酵母细胞培养容易，可实现高密度发酵生产疫苗的需求。虽然酵母表面展示技术在新型疫苗的研制上有众多的优点，但是展示于酵母细胞表面的目的蛋白的展示量却不高，存在口服免疫过程中抗原提呈量不足的问题，在一定程度上限制了其在疫苗研制方面的应用，因此如何提高酵母细胞表面目的蛋白的展示量成为了急需解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法。

本发明所提供的在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法，具体可包括：

(1)将a凝集素的Aga2亚基的编码基因与目的蛋白的编码基因融合，得到融合基因，记为融合基因1；在所述融合基因1中，所述a凝集素的Aga2亚基的编码基因位于5’端，所述目的蛋白的编码基因位于3’端；

(2)将所述融合基因1导入受体酵母细胞，所述受体酵母细胞能表达a凝集素的Aga1亚基，得到表达融合蛋白1的重组酵母细胞，所述融合蛋白1为由所述融合基因1编码得到的蛋白质；所述融合蛋白1展示于所述重组酵母细胞表面；

在所述重组酵母细胞中，既表达了所述a凝集素的Aga1亚基，也表达了所述融合蛋白1；所述融合蛋白1通过所述a凝集素的Aga1亚基展示于所述重组酵母细胞表面(所述融合蛋白1中的所述a凝集素的Aga2亚基通过二硫键与所述a凝集素的Aga1亚基连接，所述a凝集素的Aga1亚基锚定于所述重组酵母细胞的细胞壁)；

(3)制备外源表达的融合蛋白2；所述融合蛋白2由a凝集素的Aga2亚基和所述目的蛋白融合而成；在所述融合蛋白2中，所述a凝集素的Aga2亚基位于N端，所述目的蛋白位于C端；

(4)将所述融合蛋白2与所述重组酵母细胞反应，使所述融合蛋白2锚定于所述重组酵母细胞表面，从而实现在所述重组酵母细胞表面既展示所述融合蛋白1，又展示所述融合蛋白2。

在步骤(4)中，所述融合蛋白2之所以能够被锚定于所述重组酵母细胞表面是因为：通常情况下经过步骤(1)和(2)，所述重组酵母细胞表达的所述融合蛋白1的量较低，使得所述重组酵母细胞表面展示的所述融合蛋白1的展示量低，导致所述重组酵母细胞表面的一些所述a凝集素的Aga1亚基的位点是空的，没有被所述融合蛋白1占据。

在所述方法中，所述融合基因1既可以仅由所述a凝集素的Aga2亚基的编码基因和所述目的蛋白的编码基因首尾直接相连而成，也可以由所述a凝集素的Aga2亚基的编码基因和所述目的蛋白的编码基因通过linker连接起来，当然与此同时还可以有标签序列(如6×组氨酸的编码基因序列)等。所述融合蛋白2既可以仅由所述a凝集素的Aga2亚基和所述目的蛋白首尾直接相连而成，也可以由所述a凝集素的Aga2亚基和所述目的蛋白通过连接肽连接起来。

在所述方法中，所述融合蛋白2既可为原核表达产物，也可为真核表达产物。

在本发明的一个实施例中，所述融合蛋白2为原核表达产物，具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将所述融合蛋白2的编码基因导入受体大肠杆菌，得到表达所述融合蛋白2的重组大肠杆菌；裂解所述重组大肠杆菌，得到所述融合蛋白2。

当所述融合蛋白2为原核表达产物时，还可包括对原核表达所得蛋白进行复性的步骤。

其中，将所述融合蛋白2的编码基因导入所述受体大肠杆菌中后，还包括采用IPTG进行诱导的步骤。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Rosetta。所述融合蛋白2的编码基因是通过重组表达载体的形式导入所述受体大肠杆菌的；所述重组表达载体具体为在pET-27b载体的酶切位点Nco I和BamH I之间插入所述融合蛋白2的编码基因后得到的重组质粒。

在所述方法的步骤(2)中，所述融合基因1是通过重组表达载体的形式导入所述受体酵母细胞中的；

所述重组表达载体中表达所述融合基因1的表达盒由T7启动子、所述融合基因1和MATα终止子组成。

具体的，所述重组表达载体为将所述目的蛋白的编码基因(去除了起始密码子和终止密码子对应的脱氧核糖核苷酸)正向插入到酵母展示载体pYD1的多克隆位点(如Kpn I和EcoR I)处后得到的重组质粒。

在本发明中，所述受体酵母细胞具体为酿酒酵母EBY100。

在所述方法的步骤(4)中，所述反应的条件具体为20-25℃搅拌反应4-5h。

其中，所述“搅拌”时的转速为200rpm(所采用的转子长度为2cm)。

在所述方法的步骤(4)中，所述反应的体系具体由所述重组酵母细胞悬液与所述融合蛋白2混合而成；所述重组酵母细胞悬液的OD₆₀₀为1.0～2.0，所述融合蛋白2在所述体系中的浓度为0.2～0.3mg/ml(如0.2mg/mL)。所述重组酵母细胞悬液为将所述重组酵母细胞用含有1mmol/L GSH、0.2mmol/L GSSG、10％(体积分数)DMSO的PBS(pH 8.0)重悬至OD₆₀₀为1.0～2.0所得。

在本发明中，所述目的蛋白具体为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。相应的，所述重组表达载体具体为将序列表中序列2的第335-1050位所示的增强型绿色荧光蛋白的编码基因(去除了起始密码子和终止密码子对应的脱氧核糖核苷酸)正向插入到酵母展示载体pYD1的多克隆位点(如Kpn I和EcoR I)处后得到的重组质粒。所述融合蛋白2的氨基酸序列具体为序列表中序列1，其编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2。

其中，序列1共由350个氨基酸组成，第1-70位为所述a凝集素的Aga2亚基的氨基酸序列(由序列2的第1-210位编码得到)；第103-110位为Xpress epitope的氨基酸序列(由序列2的第307-330位编码得到)，第113-350位为增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列(由序列2的第337-1050位编码得到)。

本发明所提供的在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法在制备口服疫苗中的应用也属于本发明的保护范围；所述口服疫苗的有效成分为利用所述在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法制备获得的展示有所述目的蛋白的重组酵母细胞。

活性成分为利用所述在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法制备获得的展示有所述目的蛋白的重组酵母细胞的口服疫苗也属于本发明的保护范围。

本发明以酿酒酵母EBY100为展示菌株，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为表面展示蛋白，对酵母表面展示蛋白量进行检测。其中酿酒酵母作为面包业及酿酒业使用的发酵菌种已经有数千年的历史，并且被美国FDA认定为安全性生物，不会对生物体产生毒副作用，因此可以用于口服疫苗的研发中。并且为了弥补酵母细胞表面展示目的蛋白表达量不高的问题，对EGFP蛋白与Aga2进行原核细胞融合表达，并将纯化后的蛋白人工锚定到已经展示EGFP蛋白的酵母细胞表面，以期达到提高酵母表面展示的EGFP蛋白的展示量。结果表明，此种方法能够明显增加酵母细胞表面的目的蛋白展示量。这一结果解决了其在口服免疫过程中抗原提呈量不足的问题，为新型口服疫苗的研制提供重要的理论基础与方法指导。

附图说明

图1为酵母展示载体pYD1的质粒图谱。

图2为利用引物pA、pB对EGFP基因序列进行PCR扩增的结果。1：DL2000DNA marker；2：以水替代模板的阴性对照；3：EGFP基因扩增产物。

图3为Kpn I和EcoR I双酶切鉴定pYD1-EGFP质粒。1：Kpn I和EcoR I双酶切pYD1-EGFP；2：未经酶切的pYD1-EGFP；3：DL2000DNA marker；4：DL15000DNA marker。

图4为利用pC和pD为上下游引物PCR扩增Aga2-EGFP基因序列。1：DL2000DNAmarker；2：以水替代模板的阴性对照；3：Aga2-EGFP基因扩增产物。

图5为Nco I和BamH I双酶切鉴定pET-27b-Aga2-EGFP质粒。1：未经酶切的pET-27b-Aga2-EGFP；2：Nco I和BamH I双酶切pET-27b-Aga2-EGFP；3：DL2000DNA marker。

图6为EGFP蛋白在酵母表面的表达与鉴定。A：表面展示EGFP蛋白的SDS-PAGE分析。其中，M：蛋白分子量标准；1：诱导后的EBY100/pYD1作为阴性对照；2：诱导后的EBY100/pYD1-EGFP。B：表面展示EGFP蛋白的点杂交分析。其中，1：诱导后的EBY100/pYD1作为阴性对照；2：EGFP标准蛋白；3：诱导后的EBY100/pYD1-EGFP。

图7为目的蛋白的原核表达分析。1：蛋白分子量标准；2：未诱导菌体总蛋白；3：未诱导菌体破碎后上清；4：未诱导菌体破碎后沉淀；5：诱导后破碎菌体总蛋白；6：诱导后破碎菌体上清；7：诱导后破碎菌体沉淀。

图8为纯化的Aga2-EGFP融合蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析结果。1：蛋白分子量标准；2：SDS-PAGE分析结果；3：Western blot分析结果。

图9为原核表达的Aga2-EGFP蛋白的人工锚定方式示意图。

图10为人工锚定Aga2-EGFP后重组酵母细胞的Western blot分析结果。1：EBY100/pYD1诱导菌株；2：未加人工锚定Aga2-EGFP蛋白的EBY100/pYD1-EGFP诱导菌株；3：人工锚定Aga2-EGFP蛋白后的EBY100/pYD1-EGFP菌株。

图11为人工锚定Aga2-EGFP后重组酵母细胞的流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、质粒和菌种

酿酒酵母EBY100：记载于“李新新,刘庆慧,张秀丽等.对虾白斑综合征病毒VP28酵母表面展示渔业科学进展，2012年第33卷第1期”一文，公众可从中国水产科学研究院黑龙江水产研究所获得。

酵母展示载体pYD1：记载于“李新新,刘庆慧,张秀丽等.对虾白斑综合征病毒VP28酵母表面展示.渔业科学进展,2012年第33卷第1期”一文，公众可从中国水产科学研究院黑龙江水产研究所获得。

大肠杆菌(E.coli)DH5α：天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号CB101。

大肠杆菌(E.coli)Rosetta：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号CW0811A。

原核表达载体pET-27b：Novagen公司，产品目录号69863。

2、酶及主要试剂

限制性内切酶Kpn I、EcoR I、Nco I、BamH I、T4连接酶、Taq DNA聚合酶及克隆载体pMD18-T simple购自TaKaRa公司；质粒DNA提取试剂盒、酵母质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自OMEGA公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购自Abcam公司；其他化学试剂为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

3、主要仪器

流式细胞仪(BD FACS Aria^TM Cell Sorter 334078)；PCR仪(ABI公司7500型)。

实施例1、提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法的建立

本实施例将以酿酒酵母EBY100为展示菌株，以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为表面展示蛋白，利用a凝集素酵母表面展示系统说明本发明是如何提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的。

一、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表面展示载体pYD1-EGFP的构建

参考酵母展示载体pYD1(图1)的多克隆位点序列，利用Primer Premier 5.0对EGFP蛋白基因序列进行分析，并设计用于构建表面展示载体pYD1-EGFP的引物。

上游引物pA引入Kpn I酶切位点，下游引物pB引入EcoR I酶切位点(下划线标出)。

pA：5'-GGTACCAGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'；

pB：5'-GAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'。

以EGFP蛋白的编码基因序列(序列2的第337-1050位)为模板，利用引物pA、pB对EGFP基因序列进行PCR扩增(图2)，并将PCR后的产物(727bp)经1％琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收纯化目的片段。纯化后的片段连接pMD18-T simple载体并转化E.coli DH5α感受态后，提取质粒进行测序。将经测序表明将序列表中序列2的第330-1050位所示DNA片段连接到pMD18-T simple载体上后所得的重组质粒命名为pMD18-T-EGFP。

将pMD18-T-EGFP质粒及pYD1载体分别用Kpn I和EcoR I进行双酶切，胶回收纯化后于16℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后，提取质粒进行Kpn I和EcoRI双酶切鉴定(图3)，将酶切鉴定正确(得到大小约为4991bp和714bp的两个条带)的质粒送样测序。将经测序表明在pYD1载体的酶切位点Kpn I和EcoR I之间正向插入序列表中序列2的第330-1050位所示DNA片段命名为pYD1-EGFP。

二、人工锚定Aga2-EGFP蛋白表达载体的构建

a凝集素酵母表面展示系统是利用二硫键将Aga2亚基与酵母细胞壁上的Aga1相连来展示目的蛋白的，因此选择将EGFP蛋白连接到Aga2亚基的C端，利用大肠杆菌使两者融合表达，从而用于酵母细胞表面EGFP蛋白的人工锚定。

本发明结合pET-27b载体的多克隆位点序列，根据Aga2蛋白和EGFP蛋白基因序列设计引物。上游引物pC引入Nco I酶切位点，下游引物pD引入BamH I酶切位点(下划线标出)。

pC：5'-CCATGGGACAGGAACTGACAACTATATGCGAGC-3'；

pD：5'-GGATCCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'。

以质粒pYD1-EGFP为模板，利用pC和pD为上下游引物PCR扩增Aga2-EGFP基因序列(图4)，PCR产物(1064bp)经胶回收纯化后连接pMD18-T simple载体进行测序。将经测序表明将“CCATGG+序列2的第2-1050位+TGAGGATCC”所示DNA片段连接到pMD18-T simple载体上后所得的重组质粒命名为pMD18-T-Aga2-EGFP。

将pMD18-T-Aga2-EGFP质粒及pET-27b载体分别用Nco I和BamH I进行双酶切，胶回收纯化后于16℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后，提取质粒进行NcoI和BamH I双酶切鉴定(图5)，将酶切鉴定正确(得到大小约为1052bp和5392bp的两个条带)的质粒送样测序。将经测序表明在pET-27b载体的酶切位点Nco I和BamH I之间正向插入序列表中序列2所示DNA片段命名为pET-27b-Aga2-EGFP。

三、pYD1-EGFP转化酿酒酵母及EGFP蛋白的诱导表达

酿酒酵母EBY100感受态细胞的制备方法参照文献(叶玲，刘建伟，刘静.酿酒酵母感受态细胞的低温保存及酵母菌落PCR-快速筛选鉴定[J].生物化学与生物物理进展，2003,30(6):956-959.)，将pYD1空质粒及步骤一获得的pYD1-EGFP质粒分别转化EBY100感受态细胞，转化后的细胞涂布于YNB选择培养基(含亮氨酸，不含色氨酸)上，30℃静置培养2d，筛选出阳性转化子，并分别命名为EBY100/pYD1和EBY100/pYD1-EGFP。

挑取阳性转化子于YNB-CAA(含2％(2g/100ml)葡萄糖)培养基中，30℃培养至其OD₆₀₀值在2.0-5.0之间，4000rpm离心8min收集菌体，加入YNB-CAA(含2％(2g/100ml)半乳糖)培养基重悬酵母细胞，并使其OD₆₀₀值在0.5～1.0之间。重悬后的酵母细胞于20℃摇床中振荡培养，诱导EGFP蛋白的表达，并在诱导后的72h取样，进行SDS-PAGE及点杂交法鉴定目的蛋白的表达情况，其中Rabbit anti-GFP antibody(Abcam公司产品，其产品目录号为ab183734)作为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG antibody H&L(HRP))(Abcam公司产品，其产品目录号为ab6721)作为二抗。

结果显示，经2％半乳糖诱导后EBY100/pYD1-EGFP菌株在35-45kDa之间有特异性条带(图6中A)，并经点杂交显示诱导后的酵母细胞在硝酸纤维素膜上出现斑点(图6中B)，表明EGFP蛋白已经成功表达。

四、人工锚定Aga2-EGFP融合蛋白的原核表达及纯化

将重组质粒pET-27b-Aga2-EGFP转化E.coli Rosetta感受态细胞，将鉴定正确的菌落于37℃扩大培养，当培养至其OD₆₀₀值在0.3～0.4之间时，加入IPTG诱导目的蛋白的表达，IPTG的终浓度为0.25mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为5h。并在诱导后取样进行12％SDS-PAGE确定目的蛋白的表达情况。结果显示，目的蛋白以包涵体形式进行表达(图7)。

离心收集诱导表达后的菌体，PBS洗涤2次后重悬菌体，并加入溶菌酶于4℃消化细胞1h，经反复冻融后利用超声破碎仪冰浴破碎菌体细胞。离心收集沉淀后对表达的融合蛋白进行变性、复性后，PBS透析24h，中间换液1次，透析结束后12000g、4℃离心10min收集上清液，对目的蛋白进行离子交换层析纯化。

五、原核表达Aga2-EGFP蛋白的Western blot分析

将步骤四中纯化的Aga2-EGFP蛋白进行12％SDS-PAGE，电泳后转移至硝酸纤维素膜，用含1％BSA的PBS室温封闭1h，加入Rabbit anti-GFP antibody作为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG antibody H&L(HRP))作为二抗，ECL化学发光剂进行检测。

结果如图8所示，可以看出，纯化后蛋白纯度在90％以上，并且Western blot结果显示为单一特异性条带，表明纯化后的蛋白即为Aga2-EGFP融合蛋白。

六、人工锚定Aga2-EGFP蛋白

为了提高酵母表面EGFP蛋白的展示量，本发明在对含有pYD1-EGFP转化子的酵母细胞进行诱导展示EGFP蛋白后，对酵母细胞继续进行Aga2-EGFP蛋白的人工锚定，以此来增加表面展示蛋白的数量。原核表达的Aga2-EGFP蛋白的人工锚定方式如图9所示，其中白色部分为酵母细胞诱导后自身表达并展示的EGFP蛋白，黑色部分为原核表达后人工锚定的EGFP蛋白。具体操作如下：

将步骤三中诱导72h的EBY100/pYD1-EGFP菌株(经鉴定EGFP蛋白已经成功表达)离心后用PBS(pH 8.0)洗涤3遍，用PBS(含有1mmol/L的GSH、0.2mmol/L的GSSG、10％(体积分数)的DMSO，pH 8.0)重悬至OD₆₀₀为1.0～2.0，加入步骤四获得原核表达纯化后的Aga2-EGFP蛋白(经步骤五鉴定)至终浓度为0.2mg/mL，于室温(20-25℃)条件下搅拌(搅拌转速为200rpm，所采用的转子长度为2cm)反应4-5h，4000g离心10min收集酵母细胞，并用PBS洗涤3遍。

七、人工锚定Aga2-EGFP蛋白后的Western blot分析

将人工锚定Aga2-EGFP蛋白后的酵母细胞按照文献(Andreu C,Del Olmo M.Yeastarming by the Aga2p system:effect of growth conditions in galactose on theefficiency of the display and influence of expressing leucine-containingpeptides[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(20):9055-9069.)的方法对总EGFP蛋白进行提取，将提取后的蛋白上清液进行Western blot分析，一抗为Rabbit anti-GFPantibody，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG antibody H&L(HRP))。并以EBY100/pYD1和未加人工锚定蛋白的EBY100/pYD1-EGFP诱导菌株作为对照。

结果如图10所示，由结果可以看出，经过与原核表达纯化的Aga2-EGFP蛋白在氧化环境下孵育后的酵母细胞提取液中有2条特异性条带。这是由于经诱导表达于酵母细胞表面的EGFP蛋白是以Aga2-Xpress epitope-EGFP-V5epitope-6×His融合形式展示于细胞表面，而人工锚定的EGFP蛋白以Aga2-EGFP的形式展示于细胞表面，因此前者的分子量会大于后者的分子量，由此可见原核表达的EGFP蛋白已经成功锚定到了酵母细胞表面。

八、人工锚定Aga2-EGFP蛋白后的流式细胞仪检测

将人工锚定Aga2-EGFP蛋白后的酵母细胞用PBS洗涤3遍，加入PBS重悬酵母细胞使其细胞密度在2×10⁶个/mL，进行流式细胞仪检测，并以EBY100/pYD1和未加人工锚定蛋白的EBY100/pYD1-EGFP诱导菌株作为对照。

结果如图11所示，由结果可以看出，与EBY100/pYD1细胞所检测出的荧光信号强度相比，未加人工锚定蛋白的EBY100/pYD1-EGFP诱导菌株和添加人工锚定蛋白孵育后的EBY100/pYD1-EGFP菌株的荧光信号强度都得到了提高；但是与EBY100/pYD1-EGFP诱导菌株的荧光信号强度相比，人工锚定EGFP蛋白后荧光信号提高了近40％，表明利用原核表达纯化的Aga2-EGFP蛋白可以成功的增加酵母细胞表面的EGFP展示量。

Claims (8)

1.一种在酵母细胞表面展示目的蛋白的方法，包括：

(1)将a凝集素的Aga2亚基的编码基因与目的蛋白的编码基因融合，得到融合基因，记为融合基因1；在所述融合基因1中，所述a凝集素的Aga2亚基的编码基因位于5’端，所述目的蛋白的编码基因位于3’端；

(2)将所述融合基因1导入受体酵母细胞，所述受体酵母细胞能表达a凝集素的Aga1亚基，得到表达融合蛋白1的重组酵母细胞，所述融合蛋白1为由所述融合基因1编码得到的蛋白质；所述融合蛋白1展示于所述重组酵母细胞表面；

(3)制备外源表达的融合蛋白2；所述融合蛋白2由a凝集素的Aga2亚基和步骤(1)中所述的目的蛋白融合而成；在所述融合蛋白2中，所述a凝集素的Aga2亚基位于N端，所述目的蛋白位于C端；

(4)将所述融合蛋白2与所述重组酵母细胞反应，使所述融合蛋白2中的所述a凝集素的Aga2亚基通过二硫键与所述a凝集素的Aga1亚基连接，所述a凝集素的Aga1亚基锚定于所述重组酵母细胞的细胞壁，从而实现在所述重组酵母细胞表面既展示所述融合蛋白1，又展示所述融合蛋白2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述融合蛋白2为原核表达产物或真核表达产物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白2是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将所述融合蛋白2的编码基因导入受体大肠杆菌，得到表达所述融合蛋白2的重组大肠杆菌；裂解所述重组大肠杆菌，得到所述融合蛋白2。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述融合基因1是通过重组表达载体的形式导入所述受体酵母细胞中的；

所述重组表达载体中表达所述融合基因1的表达盒由T7启动子、所述融合基因1和MATα终止子组成。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述目的蛋白的编码基因插入到酵母展示载体pYD1的多克隆位点处后得到的重组质粒。

6.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述受体酵母细胞为酿酒酵母EBY100。

7.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述反应的条件为20-25℃搅拌反应4-5h。

8.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述反应的体系由所述重组酵母细胞悬液与所述融合蛋白2混合而成；所述重组酵母细胞悬液的OD₆₀₀为1. 0～2. 0，所述融合蛋白2在所述体系中的浓度为0. 2～0. 3mg/mL。