CN107119058B - 一种ms2衣壳蛋白融合表达方法及其应用 - Google Patents

一种ms2衣壳蛋白融合表达方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种MS2衣壳蛋白融合表达方法及其应用。通过运用分子生物学方法，将经改造的MS2衣壳蛋白单链二聚体与SUMO标签蛋白串联表达，得到融合蛋白，运用镍柱纯化，随后再将SUMO标签去除。本发明与传统MS2衣壳蛋白表达相比，提高了展示的外源片段的长度，简化了纯化步骤，提高了目的蛋白得率，降低了目的产物中核酸的残留。

Description

一种MS2衣壳蛋白融合表达方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种改造的MS2衣壳蛋白单链二聚体与SUMO标签融合表达的方法及其应用。
背景技术
VLPs：病毒样颗粒是不含病毒核酸的空壳结构，许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性，其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。此外，多数病毒VLPs还具有包裹核酸或其他小分子的能力。
大肠杆菌MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4中蛋白质分子。研究发现，体外将MS2噬菌体的外壳蛋白基因克隆到表达载体中，诱导表达后的蛋白可以自我组装为成熟的类病毒颗粒，且在其外壳蛋白基因的特定位点插入几个基因可以表达成展示外源氨基酸的VLPs。为此，我们将两个衣壳蛋白串联形成单链二聚体，在第二个亚基的AB环处插入外源氨基酸，开发了VLPs疫苗及检测试剂。VLPs具有强大的生物学优势，但是，随着外源肽的插入，影响了蛋白的原有结构，表现在表达过程中部分以包涵体的形式存在，同时传统的纯化工艺中会残留大量的核酸。为克服上述问题，本发明将MS2串联二聚体融合SUMO标签表达，一步纯化后再将SUMO标签切除，简化了纯化步骤，提高了目的蛋白得率，降低了目的产物中核酸的残留。
发明内容
本发明的目的是介绍一种改造的MS2衣壳蛋白单链二聚体与SUMO标签融合表达的方法及其应用，本发明提高了展示的外源片段的长度，简化了纯化步骤，提高了目的蛋白得率，降低了目的产物中核酸的残留。
为了实现以上目的，本发明的具体实施方案如下：
一种通过密码子优化的MS2-1衣壳蛋白的基因序列，所述基因序列如SeqID NO.2所示。
一种根据MS2-1衣壳蛋白的基因序列引入酶切位点的产物，所述引入酶切位点是在原有MS2-1衣壳蛋白基因序列的基础上引入酶切位点BamH I和Sal I，引入酶切位点后的产物的基因序列如SeqID NO.3所示。
一种用于普遍展示长链氨基酸的上下游连接肽，为linkerU和linkerD，所述linkerU序列如SeqID NO.4所示，所述linkerD序列如SeqID NO.5所示。
一种编码MS2-2衣壳蛋白的基因序列，所述基因序列是将连接肽整合到SeqIDNO.3的酶切位点BamHI和SalI之间，编码MS2-2衣壳蛋白的基因序列如SeqID NO.6所示。
一种MS2衣壳蛋白，为串联二聚体形式，所述编码MS2衣壳蛋白氨基酸的基因序列由MS2-1和MS2-2串联构成，基因序列如SeqID NO.7所示，所述MS2衣壳蛋白氨基酸序列如SeqID NO.1所示。
一种带有SUMO标签的dMS2衣壳蛋白，所述编码dMS2衣壳蛋白的氨基酸序列如SeqID NO.1所示，所述SUMO标签位于融合蛋白的N端，并包括六个便于纯化的融合标签。
其中，所述便于纯化的融合标签选自Gst、His、Trx中的任意一种。
一种制备纯化SUMO-dMS2重组基因表达的融合蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)SUMO标签融合表达载体构建；
(2)MS2衣壳蛋白基因与SUMO标签融合表达载体融合，得重组质粒；
(3)将步骤(2)制备的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，得到带有重组质粒的大肠杆菌菌种；
(4)在大肠杆菌表达系统中表达SUMO-dMS2融合蛋白；
(5)将表达了融合蛋白的大肠杆菌破碎，分离得到上清液；
(6)采用镍离子亲和层析，一步捕获目的蛋白；
(7)去除SUMO标签。
其中，所述步骤(7)去除SUMO标签，包括如下步骤：
(1)在权利要求8得到的目的蛋白中加入1μg/ml的蛋白酶ULP1，同时在Tris-NaCl缓冲液中透析，所述Tris-NaCl缓冲液pH为7.4，Tris浓度20mM，NaCl浓度100mM；
(2)将步骤(1)酶切后的产物用镍离子亲和层析，收集穿出；
(3)采用SDS-PAGE电泳，检测步骤(2)收集的样品。
本发明与现有技术相比具有具有以下有益效果：
与现有技术相比，本发明的创新之处是：
1、本发明提高了用于展示的外源片段的氨基酸长度，其长度可以大于100氨基酸。克服了展示的大片段在组装过程中的空间位阻问题，提高了展示大片段氨基酸的类病毒颗粒的自组装效率。建立了一套高效、适宜放大的纯化生产工艺。
2、传统表达方式中，MS2衣壳蛋白采用不加融合标签的表达形式，使表达的MS2衣壳蛋白在胞内既自组装成颗粒，这样做的问题是为后续的重组蛋白的回收提高了难度，并带来了核酸的污染，一旦核酸被包裹在VLP内部将会难以去除，这些问题都使纯化工艺难上加难。本发明突破了MS2衣壳蛋白表达重组的思维壁垒，采用先表达再在体外组装的思路，成功的解决了该问题。由于在MS2的N端融合了SUMO标签，阻碍了MS2衣壳蛋白在胞内自组装的过程，通过镍柱亲和层析纯化，有效地提高了蛋白的得率和纯度，并去除了大部分的核酸，最后再切除SUMO标签，MS2衣壳蛋白在体外重新组装成颗粒。
3、本发明提供了一种基于大肠杆菌来源的MS2单链二聚体与SUMO标签融合表达的方法，基于本发明的技术，降低了包涵体的形成，一步纯化后再将SUMO标签切除，简化了纯化步骤，提高了目的蛋白得率，降低了目的产物中核酸的残留。为进一步开发MS2类病毒颗粒的应用储备了技术基础。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
附图说明：
图1.MS2衣壳蛋白氨基酸序列比对结果。
图2.MS2展示dsRBD2蛋白SDS-PAGE电泳图
图3.MS2展示dsRBD2蛋白重组VLP透射电镜图
图4.添加SUMO标签前后蛋白表达量对比。
图5.添加linker前后蛋白可溶性对比。
序列表说明：
SeqID NO.1MS2衣壳蛋白氨基酸序列
SeqID NO.2密码子优化的MS2衣壳蛋白基因序列
SeqID NO.3插入位点优化后的MS2衣壳蛋白基因序列
SeqID NO.4用于辅助展示的连接肽序列linkerU
SeqID NO.5用于辅助展示的连接肽序列linkerD
SeqID NO.6融合了连接肽的MS2衣壳蛋白基因序列
SeqID NO.7编码MS2衣壳蛋白氨基酸的基因序列
SeqID NO.8编码dsRBD2蛋白的基因序列
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：含有突变位点的MS2-2衣壳蛋白基因序列的构建
采用苏州金唯智生物科技有限公司合成的经过大肠杆菌密码子优化的MS2-1衣壳蛋白基因，运用碱基定点突变的技术，引入酶切位点BamH I和Sal I，从而构建而成。
实施例2：具有MS2衣壳蛋白基因与SUMO标签融合表达载体的构建
采用MS2-1、MS2-2以及由本实验室保存的含有编码SUMO标签蛋白的表达载体pET-28b-SUMO。
以MS2-1为模板，上游引物为：GGAAGATCTATGGCGAGCAACTTTACCC，下游引物为：CCGGAATTCCATAAATGCCGCTGTTCGC，扩增片段的上下游分别引入酶切位点Bgl II和EcoR I，PCR条件如下：
Figure BDA0001291170260000041
将扩增得到的基因片段，用Bgl II和EcoR I酶切消化处理，连接到用BamH I和EcoR I酶处理的pET-28b原核表达载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有34μg/ml卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有34μg/ml卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET-28b-wtMS2。
以MS2-2为模板，上游引物为：GGGTTTCATATGATGTCGGACTCAGAAGTC，下游引物为：CGCGGATCCCTGTTCTCTGTGAGCCTC，扩增片段的上下游分别引入酶切位点EcoR I和Xho I，PCR条件如下：
Figure BDA0001291170260000042
Figure BDA0001291170260000051
将扩增得到的基因片段，用EcoR I和Xho I酶切消化处理，连接到用同样酶处理的pE T-28b-wtMS2原核表达载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有34μg/ml卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有34μg/ml卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET-28b-dMS2。
以pET-SUMO为模板，上游引物为：CCGGAATTCCATGGCGAGCAACTTTACCC，下游引物为：CCGCTCGAGTTAATAAATGCCGCTGTTCGC，扩增片段的上下游分别引入酶切位点BamH I和Nde I，PCR条件如下：
Figure BDA0001291170260000052
将扩增得到的基因片段，用BamH I和Nde I酶切消化处理，连接到用同样酶处理的pET-28b-dMS2原核表达载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有34μg/ml卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有34μg/ml卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET-28b-SUMO-dMS2。
将上述的pET-28b-SUMO-dMS2转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布于含有34μg/ml卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有34μg/ml卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，从中取1ml菌液加入终浓度为17％的甘油，-80℃冷冻保存，作为后续试验的种子。
实施例3：MS2衣壳蛋白的大量表达
从-80℃中取出带有重组质粒pET-28b-SUMO-dMS2的大肠杆菌菌种，接种到含有34μg/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃培养至菌体达到对数期，按照1％的比例接种到含有1L液体LB培养基的三角瓶中，37℃培养，等OD600值到0.6时，加入0.4mM的IPTG，20℃诱导表达12小时。
实施例4：MS2衣壳蛋白的纯化
将发酵液5000rpm离心10min，弃上清，按照1g菌体对应10ml缓冲液I的比例重悬菌体，采用均质机以700bar压力破碎菌体4次，24000rpm离心1小时，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达量。
将上清液用镍柱层析纯化，洗脱程序为：
(1)上清液上柱，
(2)3mM咪唑洗脱杂蛋白，
(3)250mM咪唑洗脱目的蛋白，收集洗脱液。
在上述收集的洗脱液中加入1μg/ml的蛋白酶ULP1，同时在Tris-NaCl缓冲液中透析，其中Tris-NaCl缓冲液pH为7.4，Tris浓度20mM，NaCl浓度100mM。
再次采用镍柱层析纯化，收集穿出液，采用SDS-PAGE电泳，检测纯化后的样品。
实施例5：MS2衣壳蛋白氨基酸序列的同源性比对
本发明获得的MS2衣壳蛋白氨基酸序列，经过比对，与最相近的NP_040648.1同源性为98.5％，区别在第82到第84位氨基酸，由A W R突变为了S N，与已报到的序列有明显的差异。本发明获得的MS2衣壳蛋白氨基酸序列与已报到的相近的序列比对结果如图1所示，其中MS2patent为本发明所获得原始序列。
实施例6：利用MS2展示dsRBD2蛋白
利用展示臂的上下游引物LinkerF：TTGTGCTGGTGGATAACGGCGGATCAGGTGGTGGTGGTAGTCAA和LinkerR：CGGTCACATCGCCGGTGCCATCGACACTACCGCCGCCGCCTTC，PCR扩增linker基因序列，采用同源重组的方式将PCR的扩增产物连接到pET-28b-SUMO-dMS2载体的BamH I和Sal I位点，得到含有linker的表达载体pET-28b-SUMO-dMS2-linker。具体链接过程如下：
(1)反应体系(10μl)：
2×Assembly Mix 5μl
pET-28b-SUMO-dMS2(BamH I/Sal I) 2μl
linker PCR产物 3μl
总计 10μl
(2)轻轻混匀，55℃反应15分钟。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。之后可将重组产物保存于-20℃或直接用于转化。
利用以下引物组扩增dsRBD2基因序列，dsRBD2-F：CGCGGATCCGAAGTGGATTTAAATGCTG和dsRBD2-R：ACGCGTCGACCTTTGTAAGTCCGGAGTAAG，采用常规的基因片段连接方式，将PCR扩增的dsRBD2基因片段连接到载体pET-28b-SUMO-dMS2-linker的BamH I和Sal I位点得到重组表达载体pET-28b-SUMO-dMS2-linker-dsRBD2，编码dsRBD2蛋白的基因序列如SeqID NO.8所示，并依照实施例2和实施例3的方法纯化重组蛋白。
同上，将dsRBD2基因连接到pET-28b-SUMO-dMS2，得到pET-28b-SUMO-dMS2-dsRBD2，该重组载体不含有linker序列。
结果表明，本发明的MS2衣壳蛋白对插入外源多肽的长度由先前的不大于30个氨基酸提高到了至少100个氨基酸，并成功的展示了大小为100个氨基酸的dsRBD2蛋白，表达结果SDS-PAGE如图2所示，电镜图如图3所示。
实施例7：目的蛋白的回收率
本发明通过在不添加SUMO标签的前提下，利用饱和硫酸铵沉淀的方法纯化MS2衣壳蛋白，与添加SUMO标签后，采用亲和层析的纯化方式纯化MS2衣壳蛋白，比较目的蛋白的回收率，结果如表1所示。
表1
纯化方法 是否添加SUMO标签 蛋白回收率(％)
饱和硫酸铵沉淀 不添加 60
亲和层析 添加 95
实施例8：纯化后的衣壳蛋白是否具有组装成类病毒颗粒的能力
以编码dsRBD2蛋白的碱基序列为例，纯化后衣壳蛋白重新具有了组装成类病毒颗粒的能力，如图3所示，但本发明具体包括但不局限于以上多肽。
实施例9：纯化样品中核酸残留的检测
核酸残留的检测，采用OD280/OD260比值表征核酸的相对含量，比值越大表明蛋白纯度越高，核酸残留量越低。由于MS2衣壳蛋白中含有RNA的结合位点，在组合成类病毒颗粒的过程中会随机包裹自身或者外源RNA，RNA的污染大大的降低了蛋白的纯度，并且难以去除，在公开的报道中未见有效地去除VLPs中核酸的方法。本发明曾尝试了添加核酸酶、硫酸铵沉淀等传统的去除核酸的方法，但是由于VLPs将核酸包裹在内部，并且VLPs的结构非常的稳定，所以利用传统的去除方法去除核酸残留的效果非常有限。本发明通过添加融合标签，核酸去除效果非常的明显。不同方法的核酸去除效果数据如下表2所示。
表2
Figure BDA0001291170260000081
实施例10：表达过程中包涵体的含量检测
由于融合标签的辅助作用，减少了重组蛋白的错误折叠，表达的外源蛋白中可溶性外源蛋白占总外源蛋白的比例由50％提高到了80％，如图4所示。
利用连接肽linker氨基酸序列，有效的减少了展示蛋白的空间位阻现象。没有linker的pET-28b-SUMO-dMS2-dsRBD2表达的重组蛋白不能够正确的折叠，全部以包涵体的形式存在于沉淀中，带有linker序列的pET-28b-SUMO-dMS2-linker-dsRBD2表达的重组蛋白约50％可以正确折叠，以可溶的形式存在于裂解液的上清中，如图5所示。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
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50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
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atggcgagca actttaccca gtttgtgctg gtggataacg gcggcaccgg cgatgtgacc 60
gtggcgccga gcaactttgc gaacggcgtg gcggaatgga ttagcagcaa cagccgtagc 120
caggcgtata aagtgacctg cagcgtgcgt cagagcagcg cgcagaaccg taaatatacc 180
attaaagtgg aagtgccgaa agtggcgacc cagaccgtgg gcggcgtgga actgccggtg 240
gcgagcaata gctatctgaa catggaactg accattccga tttttgcgac caacagcgat 300
tgcgaactga ttgtgaaagc gatgcagggc ctgctgaaag atggcaaccc gattccgagc 360
gcgattgcgg cgaacagcgg catttatgaa ttcatggcga gcaactttac ccagtttgtg 420
ctggtggata acggcggatc aggtggtggt ggtagtcaag gcgttagcga tctggttggt 480
ctgccgaatc aaatctgcct gcagaaaacc accagcacca ttctgaaacc gggatccgcc 540
gtcgacccgg cacaatgttc tgaaggcggc ggcggtagtg tcgatggcac cggcgatgtg 600
accgtggcgc cgagcaactt tgcgaacggc gtggcggaat ggattagcag caacagccgt 660
agccaggcgt ataaagtgac ctgcagcgtg cgtcagagca gcgcgcagaa ccgtaaatat 720
accattaaag tggaagtgcc gaaagtggcg acccagaccg tgggcggcgt ggaactgccg 780
gtggcgagca atagctatct gaacatggaa ctgaccattc cgatttttgc gaccaacagc 840
gattgcgaac tgattgtgaa agcgatgcag ggcctgctga aagatggcaa cccgattccg 900
agcgcgattg cggcgaacag cggcatttat 930
<210> 8
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gaagtggatt taaatgctgg gcttcatgga aactggacct tggaaaatgc taaagctcgt 60
ctaaaccaat attttcagaa agaaaagatc caaggagaat ataagtacac ccaagtgggt 120
cctgatcaca acaggagctt tattgcagaa atgaccattt atatcaagca gctgggcaga 180
aggatttttg cacgagaaca tggatcaaat aagaaattgg cagcacagtc ctgtgccctg 240
tcacttgtca gacaactgta ccatcttgga gtggttgaag cttactccgg acttacaaag 300

Claims (4)

1.一种制备纯化SUMO-dMS2重组基因表达的融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）SUMO标签融合表达载体构建；
（2）MS2衣壳蛋白基因与SUMO标签融合表达载体融合，得重组质粒，MS2衣壳蛋白的N端融合SUMO标签，阻碍MS2衣壳蛋白在胞内自组装的过程；
MS2衣壳蛋白为串联二聚体形式，所述编码MS2衣壳蛋白氨基酸的基因序列由MS2-1和MS2-2串联构成，基因序列如SeqID NO.7所示，所述MS2衣壳蛋白氨基酸序列如SeqID NO.1所示；
所述MS2-1衣壳蛋白的基因序列如SeqID NO.2所示，MS2-1衣壳蛋白的基因序列引入酶切位点的产物，所述引入酶切位点是在原有MS2-1衣壳蛋白基因序列的基础上引入酶切位点BamH I和Sal I，引入酶切位点后的产物的基因序列如SeqID NO.3所示；
所述编码MS2-2衣壳蛋白的基因序列是将连接肽整合到酶切位点BamH I和Sal I之间，编码MS2-2衣壳蛋白的基因序列如SeqID NO. 6所示；
（3）将步骤（2）制备的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，得到带有重组质粒的大肠杆菌菌种；
（4）在大肠杆菌表达系统中表达SUMO-dMS2融合蛋白；
（5）将表达了融合蛋白的大肠杆菌破碎，分离得到上清液；
（6）采用镍离子亲和层析，一步捕获目的蛋白；
（7）去除SUMO标签；
所述连接肽由linkerU和linkerD串联组成，所述linkerU序列如SeqID NO.4所示，所述linkerD序列如SeqID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的一种制备纯化SUMO-dMS2重组基因表达的融合蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（7）去除SUMO标签，包括如下步骤：
1）在权利要求1得到的目的蛋白中加入1μg/ml的蛋白酶ULP1，同时在Tris-NaCl缓冲液中透析，所述Tris-NaCl缓冲液pH为7.4，Tris浓度20mM，NaCl浓度100mM；
2）将步骤1）酶切后的产物用镍离子亲和层析，收集穿出；
3）采用SDS-PAGE电泳，检测步骤2）收集的样品。
3.根据权利要求1所述的一种制备纯化SUMO-dMS2重组基因表达的融合蛋白的方法，其特征在于，所述编码dMS2衣壳蛋白的氨基酸序列如SeqID NO.1所示，所述SUMO标签位于融合蛋白的N端，并包括六个便于纯化的融合标签。
4.根据权利要求3所述的一种制备纯化SUMO-dMS2重组基因表达的融合蛋白的方法，其特征在于，所述便于纯化的融合标签选自Gst、His、Trx中的任意一种。
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