MX2013001536A - Construccion de expresion procariotica. - Google Patents
Construccion de expresion procariotica.Info
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Abstract
En la presente se reporta un pro-polipéptido el cual es útil para la expresión de un polipéptido de interés en una célula procariótica. Por lo tanto el pro-polipéptido se fusiona a la parte N-terminal del polipéptido de interés. El pro-polipéptido como se reporta en la presente proporciona rendimientos de expresión mejorados y mejora el manejo del polipéptido de fusión (procesamiento Dirección 3', purificación). Por ejemplo, una separación eficiente de endotóxina se lleva a cabo mientras la proteína de interés que comprende al pro-polipéptido se une, por ejemplo, a un material de cromatografía definida. Posteriormente el pro- polipéptido puede ser separado eficientemente del polipéptido de interés por el sitio de separación de proteasa incorporado con la proteasa a fin.
Description
CONSTRUCCION DE EXPRESION PROCARIOTICA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
En la presente se reporta una construcción de expresión para la producción de un polipéptido en una célula procariótica. La construcción de expresión comprende un propopiléptido que comprende, en una dirección N- a C-terminal, el dipéptido GS, una etiqueta de aminoácido, el dipéptido GS y un sitio de separación de proteasa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes son bien conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, por Marino, M.H. Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V. , et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F. , y Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159.
Los polipéptidos tales como los anticuerpos o fusiones de anticuerpo para uso en aplicaciones farmacéuticas generalmente se producen en células de mamífero tales como células CHO, células NSO, células SP2/0, células COS, células
HEK, células BHK o células PER.C6MR o similares. Los elementos de un plásmido de expresión eucariótico generalmente son una unidad de propagación plasmídica procariótica, por ejemplo para E. coli que comprende un origen de replicación procariótico y un marcador de selección procariótico, un
Ref.: 237694 marcador de selección eucariótico y uno o más casetes de expresión para la expresión de uno o varios genes estructurales de interés, cada uno comprende un promotor, un gen estructural y terminador de transcripción que incluye una señal de poliadenilación. Para expresión transitoria en células de mamífero se puede incluir un origen de replicación de mamífero tal como SV40 Ori u OriP. Como un promotor se puede seleccionar un promotor constitutivo o inducible. Para transcripción optimizada se puede incluir una secuencia Kozak en la región 5' no traducida. Para procesamiento de AR m, en particular, empalme de ARNm y terminación de transcripción se pueden incluir señales de empalme de ARNm, dependiendo de la organización del gen estructural (organización exón-intrón) así como una señal de poliadenilación.
Otros polipéptidos para uso en aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo insulina, interferón alfa-2, somatotropina, interleucina-2 , GM-CSF y reteplase se pueden producir en células procarióticas, levadura y principalmente E. coli. Los elementos de un plásmido de expresión de E. coli generalmente son un origen de replicación, un marcador de selección y uno o más casetes de expresión para la expresión de uno o varios genes estructurales de interés. Un c sete de expresión generalmente comprende un promotor, un gen estructural y un terminador de transcripción. Como promotor se puede utilizar un promotor constitutivo o inducible.
Para transcripción optimizada se puede incluir en la región 5' no traducida una secuencia de Shine-Dalgarno o una variante de la misma que precede al codón de inicio de ARNm.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En la presente se reporta un propopiléptido el cual es útil para la expresión de un polipéptido de interés en una célula procariótica . Por lo tanto, el propolipéptido se fusiona a la parte N-terminal del polipéptido de interés. El propolipéptido, como se reporta en la presente proporciona rendimientos de expresión mejorados y mejora el manejo del polipéptido de fusión (procesamiento posterior, purificación) . Por ejemplo, se lleva a cabo una eliminación eficiente de endotoxina mientras la proteína de interés que comprende el propolipéptido está unida, por ejemplo, a un material de cromatografía de afinidad. Posteriormente, el propolipéptido puede ser separado eficientemente del polipéptido de interés por el sitio de separación de proteasa incorporado con la proteasa afín.
En la presente se reporta como un aspecto un propolipéptido que comprende, en una dirección N a C-terminal :
un primer dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS,
una etiqueta de secuencia de aminoácidos, - un segundo dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS inmediatamente adyacente a
un sitio de separación enzimático.
En una modalidad, el propolipéptido comprende una secuencia de aminoácidos delantera N-terminal al primer dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS . En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos delantera tiene una longitud de por lo menos dos residuos aminoácidos y como máximo 20 residuos aminoácidos. En una modalidad adicional, la secuencia de aminoácidos delantera tiene una longitud de por lo menos dos residuos aminoácidos y como máximo diez residuos aminoácidos. También en una modalidad, la secuencia de aminoácidos delantera es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 1-8. En una modalidad adicional, la secuencia de aminoácidos delantera es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 1-6.
En una modalidad, el propolipéptido consiste, en una dirección N a C-terminal, de
una secuencia delantera de aminoácidos,
- un primer dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS,
una etiqueta de secuencia de aminoácidos, un segundo dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS inmediatamente adyacente a
- un sitio de separación enzimático.
Un aspecto adicional como aquí se reporta es un polipéptido de fusión que comprende, en una dirección N a C-terminal ,
opcionalmente una secuencia de aminoácidos delantera,
un primer dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS,
una etiqueta de secuencia de aminoácidos, un segundo dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS inmediatamente adyacente a
un sitio de separación enzimático, y
una proteína de interés.
En una modalidad de todos los aspectos como se reportan en lo anterior, la etiqueta de secuencia de aminoácidos tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 9 a SEC ID NO: 27. En una modalidad, la etiqueta de secuencia de aminoácidos tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 15. En otra modalidad, el sitio de separación enzimático tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 28 a 42. En una modalidad adicional el polipéptido de interés se selecciona de una cadena pesada o ligera de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, apolipoproteína, variante de apolipoproteína, fusión de apolipoproteína, interferón, interleucina, insulina, variante de activador de plasminógeno de tipo tisular, factor estimulante de colonias, hormona del crecimiento, proteína morfogenética ósea. En una modalidad, el polipéptido de interés tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 43 o la SEC ID NO: 44 o la SEC ID NO: 45. En una modalidad, el polipéptido de interés es un polipéptido diferente del propolipéptido como se reporta en la presente, es decir, el polipéptido de interés no comprende una secuencia de aminoácidos que corresponda a un dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS fusionado directamente a una etiqueta de secuencia de aminoácidos. En una modalidad, el aminoácido en la parte N-terminal del polipéptido de interés tiene un grupo alfa-amino libre después del procesamiento posterior. En una modalidad, el propolipéptido y/o el polipéptido de interés no está glucosilado.
En la presente se reporta como otro aspecto un método para producir un polipéptido de interés que comprende las siguientes etapas:
a) proporcionar una célula que comprenda un ácido nucleico que codifique para un polipéptido de fusión que comprende, en una dirección N a C-terminal:
opcionalmente una secuencia de aminoácidos delantera,
un primer dipéptido GS,
- una etiqueta de secuencia de aminoácidos, un segundo dipéptido GS inmediatamente adyacente a
un sitio de separación enzimático, y
un polipéptido de interés,
b) cultivar la célula,
c) recuperar el polipéptido de fusión de la célula o el medio de cultivo, .
d) purificar el polipéptido de fusión, e) separar enzimáticamente el polipéptido de fusión y de esta manera producir el polipéptido de interés.
En una modalidad la célula es una célula procariótica . En otra modalidad la célula es una célula E. coli o una célula de Bacillus subtilis . En una modalidad, la etiqueta de secuencia de aminoácidos tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 9 a la SEC ID NO: 27. En una modalidad, la etiqueta de secuencia de aminoácidos tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 15. En otra modalidad, el sitio de separación enzimático tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 28 a 42. También una modalidad del polipéptido adicional se selecciona de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticuerpo de cadena simple, apolipoproteína, variante de apolipoproteína, fusión de apolipoproteína, interferón, interleucina, insulina, variante de activador de plasminógeno de tipo tisular, factor estimulante de colonias, hormona del crecimiento, proteína morfogenética ósea. En una modalidad, el polipéptido de interés tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 43 o SEC ID NO: 44 o SEC ID NO: 45. En una modalidad, el polipéptido de interés es un polipéptido diferente del propolipéptido como se reporta en la presente, es decir, el polipéptido adicional no comprende el dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS fusionada directamente a la etiqueta de secuencia de aminoácidos.
En la presente se reporta como un aspecto adicional un kit de partes que comprenden un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3':
un ácido nucleico que codifica para el dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS,
- un ácido nucleico que codifica para una etiqueta de secuencia de aminoácidos,
un ácido nucleico que codifica para el dipéptido con la secuencia de aminoácidos GS inmediatamente adyacente a
un ácido nucleico que codifica para un sitio de separación enzimático.
Un aspecto, como se reporta en la presente, es un método para el cultivo de células procarióticas , definido porque :
- las células se cultivan en un medio que comprende glucosa, extracto de levadura, L-leucina, L-prolina, L-metionina, clorhidrato de tiamina y agente antiespumante ,
las células son alimentadas con una primera solución de alimentación que comprende extracto de levadura, glicerol, L-metionina, L-leucina y L-prolina,
las células son alimentadas con una segunda solución de alimentación que comprende L-prolina,
una solución de hidróxido de potasio y una solución de glucosa se utilizan para control de pH.
Un aspecto como se reporta en la presente es un método para la producción de un polipéptido, caracterizado porque :
las células que comprenden un ácido nucleico que codifican para el polipéptido se cultivan en un medio que comprende glucosa, extracto de levadura, L-leucina, L-prolina, L-metionina, clorhidrato de tiamina y agente antiespumante ,
las células son alimentadas primero con una solución de alimentación que comprende extracto de levadura, glicerol, L-metionina, L-leucina y L-prolina,
las células son alimentadas en segundo lugar con una solución de alimentación que comprende L-prolina,
una solución de hidróxido de potasio y una solución de glucosa se utilizan para control de pH,
en donde el polipéptido se recupera de las células o del medio de cultivo y de esta manera se produce el polipéptido .
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan la adición de la primera alimentación se inicia a una densidad óptica de aproximadamente 15 determinada a 578 nm, la adición de la segunda alimentación se inicia a una densidad óptica de aproximadamente 50 determinada a 578 nm, y la expresión del polipéptido se induce con IPTG a una densidad óptica de aproximadamente 90 determinada a 578 nm.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan, el medio comprende aproximadamente 8.85 g/1 de glucosa, aproximadamente 63.5 g/1 de extracto de levadura, aproximadamente 2.2 g/1 de NH4C1, aproximadamente 1.95 g/1 de L-leucina, aproximadamente 2.9 g/1 de L-prolina, aproximadamente 0.75 g/1 de L-metionina, aproximadamente 17.3 g/1 de KH2P04*3 H20, aproximadamente 2 g/1 de MgS04*7 H20, aproximadamente 25.8 mg/1 de clorhidrato de tiamina, aproximadamente 1.0 ml/1 de agente antiespumante 10%.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan la primera solución de alimentación comprende aproximadamente 333 g/1 de extracto de levadura, aproximadamente 333 g/1 de glicerol 85% y aproximadamente 1.7 g/1 de L-metionina y aproximadamente 5 g/1 de L-leucina y L-prolina cada uno.
En una modalidad de los métodos como se reportan aquí, la segunda solución de alimentación comprende aproximadamente 600 g/1 de L-prolina.
En una modalidad de los métodos como se reportan aquí, la base para la regulación de pH es una solución de KOH 10% (p/v) y el ácido es una solución de glucosa 75%.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan el cultivo es aproximadamente 25 °C.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan el cultivo es un pH de entre aproximadamente pH 6.5 y aproximadamente 6.9.
En una modalidad el cultivo es en un volumen de aproximadamente 10 1.
En una modalidad de los métodos como aquí se reporta la primera alimentación se inicia a una tasa de 70 g/h.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan en la segunda alimentación se inicia a una tasa de 10 ml/h.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan el valor de oxígeno disuelto se mantiene por encima de 50%. En una modalidad específica el valor de oxígeno disuelto se mantiene por encima de 50% al incrementar la velocidad de agitación, la tasa de aireación y la presión de aire en paralelo.
En una modalidad de los métodos como aqui se reportan la velocidad del agitador es de aproximadamente 500 rpm a aproximadamente 1500 rpm.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan la tasa de aireación es de aproximadamente 10 1/min a aproximadamente 20 1/min.
En una modalidad, de los métodos como aguí se reportan la presión de aire es de aproximadamente 300 mbar a aproximadamente 500 mbares.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan la célula procariótica es una célula de E. coli.
En una modalidad de los métodos como aquí se reportan el polipéptido es apolipoproteína Al. En una modalidad específica, la apolipoproteína Al es proteína precursora de tetranectina-apolipoproteína Al.
Un aspecto como se reporta en la presente, es un medio de cultivo para células procarióticas que comprende aproximadamente 8.85 g/1 de glucosa y aproximadamente 63.5 g/1 de extracto de levadura, aproximadamente 2.2 g/1 de NH4C1, aproximadamente 1.95 g/1 de L-leucina, aproximadamente 2.9 g/1 de L-prolina, aproximadamente 0.75 g/1 de L-metionina, aproximadamente 17.3 g/1 de KH2P04*3 H20, aproximadamente 2 g/1 de MgS04*7 H20, aproximadamente 25.8 mg/1 de clorhidrato de tiamina, aproximadamente 1.0 ml/1 de agente antiespumante 10%.
En una modalidad el medio comprende además una primera alimentación que comprende aproximadamente 333 g/1 de extracto de levadura, aproximadamente 333 g/1 de glicerol 85%, aproximadamente 1.7 g/1 de L-metionina y aproximadamente 5 g/1 de L-leucina y L-prolina cada uno.
En una modalidad, el medio comprende además una segunda solución de alimentación que comprende aproximadamente 600 g/1 de L-prolina.
BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1 a 8 secuencias de aminoácidos
SEC ID NO: 9 a 27 etiquetas de aminoácidos
SEC ID NO: 28 a 42 sitios de separación de proteasa
SEC ID NO: 43 a 76 secuencias de aminoácidos de apolipoproteína
SEC ID NO: 77 a 78 secuencias de aminoácidos de fusión de
apolipoproteína variante SEC ID NO: 79 a 84 secuencia de aminoácidos de propolipéptido
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El propolipéptido que aquí se reporta es útil para la expresión de un polipéptido de interés en una célula procariótica . Proporciona rendimientos de expresión mejorados y mejora el manejo, por ejemplo, durante el procesamiento y - Im ¬
purificación Dirección 3'. Por ejemplo, la separación eficiente de endótoxina se lleva a cabo mientras la proteína de interés que comprende el propolipéptido se une, por ejemplo, a un material de cromatografía de afinidad. Posteriormente, el propolipéptido puede ser separado eficientemente del polipéptido de interés por el sitio de separación de proteasa incorporado con la proteasa afin.
En la presente se reporta un propolipéptido que comprende, en una dirección N a C-terminal:
opcionalmente una secuencia de aminoácidos delantera,
un primer dipéptido GS,
una etiqueta de secuencia de aminoácidos, un segundo dipéptido GS inmediatamente adyacente a
un sitio de separación enzimático.
El término "aminoácido" o "residuo aminoácido", como se utiliza dentro de esta solicitud indica el grupo de a-aminoácidos carboxi los cuales directamente o en forma de un precursor pueden ser codificados por un ácido nucleico. Los aminoácidos individuales son codificados por ácidos nucleicos que consisten de tres nucleótidos, los denominados codones o tripletes de base. Cada aminoácido es codificado por al menos un codón. Esto se conoce como "degeneración del código genético" . El término "aminoácido" como se utiliza en esta solicitud indica los a-aminoácidos carboxi que se encuentran de manera natural que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R) , asparagina (asn, N) , ácido aspártico (asp, D) , cisteína (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I) , leucina (leu, L) , lisina (lys, K) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S) , treonina (thr, T) , triptofano (trp, W) , tirosina (tyr, Y) y valina (val, V) .
El término "polipéptido" indica un polímero que consiste de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos ya sea producidos de manera natural o sintética. Los polipéptidos de menos de 20 residuos aminoácidos se pueden denominar como "péptidos", mientras que las moléculas que consisten de dos o más polipéptidos o que comprenden un polipéptido de más de 100 residuos aminoácidos se pueden denominar como "proteínas". El término "dipéptido" indica un péptido que consiste de dos residuos aminoácidos conectados entre sí con un enlace peptídico. Un polipéptido también puede comprender componentes diferentes de aminoácidos tales como grupos carbohidrato, iones metálicos o ásteres de ácido carboxílico. Los componentes diferentes de aminoácidos se pueden agregar por la célula en los cuales se expresa el polipéptido y pueden variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en la presente en términos de su estructura principal de aminoácidos o el ácido nucleico que codifica para los mismos. Las adiciones tales como grupos carbohidrato generalmente no se especifican pero pueden estar, no obstante, presentes. En una modalidad, el polipéptido de interés es una apolipoproteína o una variante/fusión de apolipoproteína . En otra modalidad, la apolipoproteína es una apolipoproteína Al o una variante/fusión de apolipoproteína Al. En una modalidad adicional, la apolipoproteína Al está fusionada en la parte N-terminal con un dominio de trimerización de tetranectina que resulta en un polipéptido de fusión tetranectina-apolipoproteína Al artificial. En una modalidad, el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 43 a SEC ID NO: 76. En otra modalidad, el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 43, o SEC ID NO : 44, o SEC ID NO: 45.
El término "secuencia de aminoácidos delantera" indica una secuencia de aminoácidos o residuos aminoácidos conectados entre sí vía enlaces peptídicos. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos delanteros consiste de uno a veinte residuos aminoácidos. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos delanteros consiste de 2 a 15 residuos aminoácidos. En una modalidad adicional, la secuencia de aminoácidos delanteros consiste de 4 a 10 residuos aminoácidos. En también una modalidad, la secuencia de aminoácidos delantera tiene la secuencia de aminoácidos de MR o la SEC ID NO: 1 (KAKRFKKH) , o la SEC ID NO: 2 (AHFWQQA) , o SEC ID NO: 3 (CDLPQTHSL) , O SEC ID NO: 4 (IEPD), O SEC ID NO: 5 (IEPDSPGT), O SEC ID NO : 6 (MCDLPQTHSL) , o SEC ID NO : 7
(AEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTG YESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTA LGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANA KSTLVGHDTFTKV KPSAAS) O SEC ID NO: 8
(TDPEFQQQQQLDWKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH TTVP VNDSLAPD DNMTWQE EKQVRYLEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS DIRS
W) . En una modalidad adicional, la secuencia de aminoácidos delantera tiene la secuencia de aminoácidos que se selecciona de MR o la SEC ID NO: 1 (KAKRFKKH), o la SEC ID NO : 2
(AHFWQQA) , o la SEC ID NO: 3 (CDLPQTHSL), o la SEC ID NO: 4 (IEPD) , o SEC ID NO: 5 (IEPDSPGT) o SEC ID NO: 6
(MCDLPQTHSL) .
El término "etiqueta de secuencia de aminoácidos" indica una secuencia de residuos aminoácidos conectados entre sí vía enlaces peptídicos que tienen propiedades de unión específicas. En una modalidad, la etiqueta de secuencia de aminoácidos es una etiqueta de afinidad o purificación. En una modalidad la etiqueta de secuencia de aminoácidos se selecciona de Arg-etiqueta, His-etiqueta, Flag-etiqueta, 3xFlag-etiqueta, Strep-etiqueta, Nano-etiqueta, SBP-etiqueta, c-my-etiqueta, S-tag, calmodulina-péptido de unión, celulosa-dominio de unión, quitina-dominio de unión, GST-etiqueta o MBP-etiqueta. En una modalidad adicional, la etiqueta de secuencia de aminoácidos se selecciona de la SEC ID NO: 9 (RRRRR) , o SEC ID NO: 10 (RRRRRR) , SEC ID NO: 11 (HHHHHH) , o SEC ID NO: 12 (KDHLIHNVH EFHAHAHNK) o SEC ID NO: 13 (DYKDDDDK) O SEC ID NO: 14 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK) o SEC ID NO: 15 (AWRHPQFGG) o SEC ID NO: 16 (WSHPQFEK) o SEC ID NO: 17 (MDVEAWLGAR) o SEC ID NO: 18 (MDVEAWLGARVPLVET) O SEC ID NO: 19 (MDEKTTGWRGGHWEGLAGELEQLRARLEHHPGQREP) o SEC ID NO: 20 (EQKLISEEDL) o SEC ID NO: 21 (KETAAAKFERQHMDS) O SEC ID NO: 22 (KRR KKNFIAVSAANRFKKISSSGAL) o SEC ID NO: 23 (dominio de unión de celulosa) o SEC ID NO: 24 (dominio de unión de celulosa) o SEC ID NO: 25
(TNPGVSA QVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAG EP SNVPALWQLQ) O SEC ID NO: 26 (GST-etiqueta) o la SEC ID NO: 27 (MBP-etiqueta) .
El término "sitio de separación enzimática" indica una secuencia de residuos aminoácidos conectados entre sí vía enlaces peptídicos que pueden ser separados específicamente por una proteasa. En una modalidad, la proteasa es IgA-proteasa, Granzyme B, proteasa Tev, proteasa Prescission, trombina, factor Xa o enterocinasa .
El término " IgA-proteasa" indica una proteasa derivada de Neisseria gonorrhoeae con un sitio de reconocimiento que comprende una de las siguientes secuencias en la presente "^" indica la posición del enlace separado:
Pro-Ala-Pro i Ser-Pro (SEC ID NO: 28)
Pro -Pro i Ser-Pro (SEC ID NO: 29)
Pro -Pro 1 Ala-Pro (SEC ID NO: 30)
Pro - Pro 1 Thr-Pro (SEC ID NO: 31)
Pro -Pro i Gly-Pro (SEC ID NO: 32)
Pro -Arg-Pro-Pro i Thr-¦Pro (SEC ID NO: 33)
Val -Val-Ala-Pro-Pro Ala-Pro (SEC ID NO: 34)
Val -Val-Ala-Pro-Pro · Ser-Pro (SEC ID NO: 35)
Val -Val-Ala-Pro-Pro - Thr-Pro (SEC ID NO: 36)
Val -Val-Ala-Pro-Pro ^ Gly-Pro (SEC ID NO: 37)
Ala -Pro-Pro-Ala - Ala-¦Pro (SEC ID NO: 39)
Pro -Arg-Pro-Pro ? Ala-•Pro (SEC ID NO: 40)
Pro -Arg-Pro-Pro -l Ser-•Pro (SEC ID NO: 41)
Pro -Arg-Pro-Pro ' Gly-•Pro (SEC ID NO: 42)
El término "unido operablemente " indica UI yuxtaposición de dos o más componentes, en donde los componentes descritos de esta manera están en una relación que les permite funcionar de la manera destinada. Por ejemplo, la unión de dos regiones polipeptídicas codificantes tales como un líder secretor y un polipéptido.
El enlace del ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos se lleva a cabo por métodos recombinantes conocidos en el ámbito, por ejemplo, utilizando metodología de PCR y/o por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen sitios de restricción convenientes entonces los adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o enlazantes se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
Para la producción recorabinante de un polipéptido de interés en una célula procariótica entre otras cosas se considera el rendimiento de expresión elevada y practicable en procesamiento posterior.
Un propolipéptido que comprende, en la dirección N a C-terminal:
- un primer dipéptido GS,
una etiqueta de secuencia de aminoácidos, un segundo dipéptido GS, y
un sitio de separación enzimática como se reporta en la presente es útil para la expresión de un polipéptido de interés unido operablemente. Las propiedades ventajosas se pueden ejercer cuando los dos polipéptidos como se reportan en la presente se fusionan en la parte N-terminal de un polipéptido de interés, el cual está destinado a ser expresado por medios recombinantes en una célula procariótica. De esta manera, el propolipéptido como se reporta en la presente puede ser utilizado para mejorar el rendimiento de expresión y el procesamiento posterior. El polipéptido de interés se expresa por la célula procariótica como polipéptido de fusión que comprende el propolipéptido como se reporta en la presente y el polipéptido de interés. Es decir, el polipéptido de fusión comprende, en la dirección N a C-terminal, los propolipéptidos como se reportan en la presente y el polipéptido de interés.
TABLA 1 :
Rendimiento de expresión de diferentes polipéptidos de fusión. El primer valor de rendimiento proporcionado en cada celda se obtiene con un método de fermentación de acuerdo con el Ejemplo 3b , el segundo valor de rendimiento en cada celda se obtiene con un método de fermentación de acuerdo con el
Ejemplo 3a .
n.p. = no presente
A partir de la Tabla 1 se puede observar que los polipép idos de fusión que comprenden el propolipéptido como se reporta en la presente en la parte N-terminal en la cual entre el segundo dipéptido GS y el sitio de separación enzimática no se inserta secuencia de aminoácidos adicional proporcionan el rendimiento de expresión más alto en comparación con aquellos que comprenden una secuencia de aminoácidos intermedia. Una secuencia de aminoácidos delantera de dos o más residuos aminoácidos pueden estar presentes N-terminal respecto al primer dipéptido GS .
En su parte C-terminal, el propolipéptido como se reporta en la presente contiene un sitio de separación enzimático. El sitio de separación enzimático es una secuencia de aminoácidos que contiene un motivo de reconocimiento para una proteasa. Este sitio de reconocimiento puede ser para cualquier proteasa en la medida en que la proteasa separe específicamente en el sitio de reconocimiento, es decir, esta secuencia se presenta únicamente una vez en la totalidad de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión.
Especialmente ventajosa es la posibilidad de separación de endotoxina mientras el polipéptido de fusión se une a un material de cromatografía de afinidad, es decir, a un material de afinidad que no ha sido diseñado específicamente para el polipéptido de interés sino para la etiqueta de secuencia de aminoácidos. Con estas propiedades de unión cualquier combinación correspondiente de etiqueta de secuencia de aminoácidos y el material de afinidad correspondiente se pueden utilizar. Después de la separación de endotoxina el polipéptido de interés puede ser recuperado eficientemente del polipéptido de fusión mediante la utilización de un sitio de separación de proteasa.
Los siguientes ejemplos y listado de secuencias se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, el verdadero alcance de la misma se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos que se establecen sin apartarse del espíritu de la invención.
EJEMPLOS MATERIALES Y METODOS
Técnicas de ADN recombinante
Se utilizan métodos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook, J., et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edición, New York (Diciembre de 1989) . Los reactivos biológicos moleculares se utilizan de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Síntesis de genes
Se preparan segmentos de genes deseados a partir de oligonucleótidos elaborados por síntesis química. Los segmentos de gen, los cuales están flanqueados por sitios de separación por endonucleasa de restricción singular se ensamblan por reasociación y ligación de los oligonucleótidos que incluyen amplificación por PCR y subsecuentemente se clonan en el vector de clonación pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., EUA) vía partes sobresalientes A. La secuencia de ADN de los fragmentos de gen subclonados se confirman por secuenciado de ADN.
EJEMPLO 1
ELABORACION Y DESCRIPCION DE LOS PLASMIDOS DE EXPRESION DE
E. coli
El polipéptido de fusión de tetranectina-apolipoproteína Al se prepara por medios recombinantes . La secuencia de aminoácidos de tres polipéptidos de fusión tetranectina-apolipoproteína Al diferentes se proporcionan más adelante (negrillas, dominio de trimerización de tetranectina, variante A y B) . La variante A difiere de la variante B por la adición de dos residuos aminoácidos en la parte N-terminal del dominio de tetranectina. La variante C difiere de la variante A por la adición de cinco residuos aminoácidos en el extremo C-terminal del dominio de tetranectina.
Secuencia de aminoácidos de la variante A (SEC ID NO: 44) :
1 IVNAKKDWN TKMFEELKSR LDTLAQEVAL LKEQQALQTV DEPPQSPWDR
51 VKDLATVYVD VLKDSGRDYV SQFEGSALGK QLNLKLLDNW DSVTSTFSKL 101 REQLGPVTQE FWDNLEKETE GLRQEMSKDL EEVKAKVQPY LDDFQKKWQE 151 EMELYRQKVE PLRAELQEGA RQKLHELQEK LSPLGEEMRD RARAHVDALR 201 THLAPYSDEL RQRLAARLEA LKENGGARLA EYHAKATEHL STLSEKAKPA 251 LEDLRQGLLP VLESFKVSFL SALEEYTKKL NTQ
Secuencia de aminoácidos de la variante B (SEC ID
NO: 77) :
1 KKIVNAKKD WNTKMFEEL KSRLDTLAQE VALLKEQQAL QTVDEPPQSP 51 WDRVKDLATV YVDVLKDSGR DYVSQFEGSA LGKQLNLKLL DNWDSVTSTF 101 SKLREQLGPV TQEFWDNLEK ETEGLRQEMS KDLEEVKAKV QPYLDDFQKK 151 WQEEMELYRQ KVEPLRAELQ EGARQKLHEL QEKLSPLGEE MRDRARAHVD 201 ALRTHLAPYS DELRQRLAAR LEALKENGGA RLAEYHAKAT EHLSTLSEKA 251 KPALEDLRQG LLPVLESFKV SFLSALEEYT KKLNTQ
Secuencia de aminoácidos de la variante C (SEC ID
NO: 78) :
1 IVNAKKDWN TKMFEELKSR LDTLAQEVAL LKEQQALQTV SLKGTDEPPQ 51 SPWDRVKDLA TVYVDVLKDS GRDYVSQFEG SALGKQLNLK LLDNWDSTVS 101 TFSKLREQLG PVTQEFWDNL EKETEGLRQE MSKDLEEVKA KVQPYLDDFQ 151 KKWQEEMELY RQKVEPLRAE LQEGARQKLH ELQEKLSPLG EEMRDRARAH 201 VDALRTHLAP YSEDLRQRLA ARLEALKENG GARLAEYHAK ATEHLSTLSE
251 KAKPALEDLR QGLLPVLESF KVSFLSALEE YTKKLNTQ
Los polipéptidos de fusión de tetranectina-apolipoproteína Al se expresan como polipéptidos precursores (polipéptidos de fusión más grandes) en E. coli. Se probaron los siguientes propolipéptidos N-terminales para rendimiento de expresión mejorada y procesamiento posterior:
1) Secuencia de aminoácidos de propolipéptido combinado con la variante B (plásmido 5803) :
MRGSHHHHHH GSPRPPTP (SEC ID NO : 79)
El propolipéptido 5803 es un polipéptido artificial que comprende, en la dirección N a C-terminal:
una secuencia de aminoácidos delantera que tiene la secuencia de aminoácidos MR,
un primer dipéptido GS,
una etiqueta hexahistidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEC ID NO: 11) ,
un segundo dipéptido GS, y
un sitio de separación de proteasa IgA que tiene la secuencia de aminoácidos de PRPPTP (SEC ID NO: 33) .
2) Secuencia de aminoácidos de propolipéptido combinado con la variante A (plásmido 5816) :
MCDLPQTHSL GSHHHHHHGS WAPPAP (SEC ID NO : 80)
El propolipéptido 5816 es un polipéptido artificial que comprende, en una dirección N a C-terminal:
una secuencia de aminoácidos delantera que codifica para una metionina conjugada a un fragmento de una secuencia de interferón con la secuencia de aminoácidos de MCDLPQTHSL (SEC ID NO : 3),
un primer dipéptido GS,
una etiqueta hexa-histidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEC ID NO: 11) ,
un segundo dipéptido GS, y
un sitio de separación de IgA proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de WAPPAP (SEC ID NO: 32)
3) Secuencia de aminoácidos de propolipéptido combinado con la variante A (plásmido 5820) :
1 MRGSHHHHHH GSAEAGITGT WYNQLGSTFI VTAGADGALT GTYESAVGNA 51 ESRYVLTGRY DSAPATDGSG TALGWTVAWK NNYRNAHSAT TWSGQYVGGA 101 EARINTQWLL TSGTTEANAW KSTLVGHDTF TKVKPSAASV VAPPAP
(SEC ID NO: 81)
El propolipéptido 5820 es un polipéptido artificial que comprende, en una dirección N a C-terminal:
- una secuencia de aminoácidos delantera que tiene la secuencia de aminoácidos de MR,
un primer dipéptido GS,
una etiqueta hexa-histidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEC ID NO: 11),
- un segundo dipéptido GS,
una secuencia de aminoácidos intermedia derivada de estreptavidina, y
un sitio de separación de IgA proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de WAPPAP (SEC ID NO: 34)
4) Secuencia de aminoácidos de propolipéptido combinado con la variante A (plásmido 5805) :
MRGSHHHHHH AHFWQQAPRP PTP (SEC ID NO: 82)
El propolipéptido 5805 es un polipéptido artificial que comprende, en una dirección N a C-terminal:
- una secuencia de aminoácidos delantera que tiene la secuencia de aminoácidos MR,
un primer dipéptido GS,
una etiqueta hexa-histidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEC ID NO: 11) ,
- una secuencia de aminoácidos intermedia que tiene la secuencia de aminoácidos AHF QQA (SEC ID NO: 02) , y un sitio de separación de IgA proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de PRPPTP (SEC ID NO: 38)
5) Secuencia de aminoácidos de propolipéptido combinado con la variante C (plásmido 5819) :
1 MRGSHHHHHH TDPEFQQQQQ LLDWKRQQE LLRLTVWGTK NLQARVTAIE 51 KYLQDQARLN SWGCAFRQVC HTTVPWVNDS LAPDWDNMTW QEWEKQVRYL 101 EANISKSLEQ AQIQQEKNMY ELQKLNSWDI RSWAPPAP
(SEC ID NO: 83) El propolipéptido 5819 es un polipéptido artificial que comprende, en una dirección N a C-terminal:
una secuencia de aminoácidos delantera que tiene la secuencia de aminoácidos de MR,
un primer dipéptido GS,
- una etiqueta hexa-histidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEC ID NO: 11) ,
una secuencia de aminoácidos intermedia derivada de la protelna gp32 de HIV2 humano, y
un sitio de separación de IgA proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de WAPPAP (SEC ID NO: 34)
6) Secuencia de aminoácidos de propolipéptido combinado con la variante B (plásmido 5806) :
MHHHHHHKAK RFKKHPRPPAP (SEC ID NO: 84)
El propolipéptido 5806 es un polipéptido artificial que comprende, en una dirección N a C-terminal:
una secuencia de aminoácidos delantera 1(M, codón de inicio) ,
una etiqueta hexa-histidina que tiene la secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEC ID NO: 11) ,
una secuencia de aminoácidos intermedia que tiene la secuencia de aminoácidos de KAKRFKKH (SEC ID NO: 01) , y
un sitio de separación de IgA proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos de WAPPAP (SEC ID NO: 40)
Los polipéptidos de la variante de tetranectina-apolipoproteína Al se recuperan de la proteína precursora de fusión por separación enzimática in vitro utilizando IgA proteasa.
Los diferentes genes de fusión que codifican para el pro-polipéptido de tetranectina-apolipoproteína AI, designados 5803, 5816, 5820, 5805, 5819 y 5806, se ensamblaron con métodos recombinantes y técnicas conocidas mediante conexión de segmentos apropiados de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico se elaboraron por síntesis química y se verificaron por secuenciado de ADN.
ELABORACION Y DESCRIPCION DEL PLASMIDO DE EXPRESION 4980 DE
E.coli BASICO/INICIAL
El plásmido 4980 (4980-pBRori-URA3-LACI-SAC) es un plásmido de expresión para la expresión de núcleo-estreptavidina en E. coli. Se genera por ligación de un fragmento EcoRl/CelII de 3142 pares de bases derivado del plásmido 1966 (1966-pBRori-URA3-LACI-T-repetido; reportado en EP-B l 422 237) con un fragmento EcoRl/CelII que codifica para el núcleo-estreptavidina de 435 pares de bases de largo.
El plásmido de expresión de E. coli núcleo-estreptavidina comprende los siguientes elementos:
el origen de replicación del vector pBR322 para replicación en E. coli (que corresponde la posición de pares de bases 2517-3160 de acuerdo con Sutcliffe, J. G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90),
el gen URA3 de Saccharo yces cerevisiae que codifica para orotidina 5 ' -fosfatodescarboxilasa (Rose, M. , et al., Gene 29 (1984) 113-124) el cual permite la selección de plásmido por complementacion de cepas mutantes pyrF de E. coli (auxotrofia a uracilo) ,
la construcción del cásete de expresión de núcleo-estreptavidina de
el promotor híbrido T5 (promotor híbrido T5-PN25/03/04 de acuerdo con Bujard, H. , et al., Methods . Enzymol. 155 (1987) 416-433 y Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152) que incluye el sitio de unión ribosómico sintético de acuerdo con Stüber, D. , et al., (véase antes) ,
el gen para núcleo-estreptavidina, y
- dos terminadores de transcripción derivados de bacteriófago, el terminador ?-?? (Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) y el terminador fd (Beck, E . , and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58), y
el gen represor lacl de E. coli (Farabaugh, P. J.; Nature 274 (1978) 765-769).
ELABORACION DE LOS PLASMIDOS DE EXPRESION FINALES QUE COMPRENDEN PRO-POL PEPTIDOS (PLASMIDOS 5803, 5816, 5820,
5805, 5819 y 5806)
El plásmido 5803 (5803-His6-IgA-TP7-tripB-ApoAI) es el plásmido para la expresión de la proteína precursora de tetranectina-apolipoproteína AI que contiene pro-polipéptido 5803. Se ha preparado al cortar el gen estructural de núcleo-estreptavidina del vector 4980 utilizando el sitio de separación de endonucleasa de restricción EcoRI y CelII flanqueante singular y la inserción del gen que codifica para la proteína precursora de pro-polipéptido de tetranectina-apolipoproteína AI 5803 EcoRIl/CelII de 958 pares de bases de largo dentro del fragmento del vector EcoRI/CelII-980 de 3142 pares de bases .
Plásmidos:
5816 (5816-IFN-His6-IgA-API10-TripB-ApoAI) ,
5820 (5820-His6-coreSA-IgA-API10-TripB-ApoAI) ,
5805 (5805-His6-IgA-Pro-TPI10-TripB-ApoAI) ,
5819 (5819-gp32-His6-IgA-API10-TripB-SLKGT-ApoAI) , y
5806 (5806-His6-IgA-Opt-AP7-TripB-ApoAI)
se generaron como se describe en lo anterior para el plásmido 5803.
EJEMPLO 2
EXPRESIÓN DE LA PROTEINA PRECURSORA DE TETRANECTINA- APOLIPOPROTEINA AI DE LOS PLASMIDOS 5803, 5816, 5820, 5805,
5819 y 5806) EN E.colí
Para la expresión de las proteínas precursoras de tetranectina-apolipoproteína AI 5803, 5816, 5820, 5805, 5819 y 5806 se utilizó un sistema hospedador/vector de E. coli que habilita una selección de plásmido libre de antibiótico por complemento de auxotrofia de E. coli (PyrF) (véanse, por ejemplo, EP-B 0 972 838 y el documento de E.U.A. 6, 291, 245) .
Las proteínas precursoras de tetranectina-apolipoproteína AI se expresan en E. coli cepa CSPZ-2 (leuB, proC, trpE, thi-1, ApyrF) .
Transformación y Cultivo Celular Mediante Complementado de una Auxotrofia pyrF en Medio Selectivo
Se transforma E. coli K12 cepa CSPZ-2 (leuB, proC, trpE, thi-1, ApyrF) dentro de los plásmidos de expresión (5803, 5816, 5820, 5805, 5819 y 5806, respectivamente) obtenidos en la etapa previa. Las células CSPZ-2 transformadas primero se hacen crecer a 37°C en placas de agar y posteriormente en un medio de agitación en medio mínimo M9 que contiene casaminoácidos 0.5% (Difco) hasta una densidad óptica de 550 nm (DO550) de 0.6-0.9 y posteriormente se induce con IPTG (concentración final de 1-5 mmol/1) .
Después de una fase de inducción de 4 a 16 horas a 37°C las proteínas citoplasmícas y el precursor de tetranectina-apolipoproteína AI expresado de manera soluble se transfieren a agregados de proteínas insolubles, los denominados cuerpos de inclusión con una etapa de calentamiento en donde la totalidad de los caldos de cultivo en matraces Erlenmeyer se calientan a 50°C durante 1 ó 2 horas antes de recolección {véase, por ejemplo, el documento EP-B 1 486 571) . Posteriormente las células se cosechan por centrifugación, se lavan con amortiguador de fosfato de potasio 50mmol/l, pH 6.5 y se almacenan a -20 °C hasta su procesamiento adicional.
Análisis de Expresión
Para el análisis de expresión se resuspendieron gránulos de células de 3 unidades de DOSS0 nm (1 DO550 nm = 1 mi de suspensión celular con un DO a 550 nm de 1) en 0.25 mi de amortiguador de fosfato de potasio 10 mmol/1, pH 6.5 y las células se lisaron por tratamiento ultrasónico (dos pulsos de 30 segundos a 50% de intensidad) . Los componentes de células insolubles se sedimentaron (centrifugación, 14,000 rpm, 5 min.) y el sobrenadante se mezcla con 1/5 de su volumen de amortiguador de muestra 5xSDS (amortiguador de muestra lxSDS : 50 mmoles/1 de Tris-HCl, pH 6.8, SDS 1%, 50 mmoles/1 de DTT, glicerol 10%, azul de bromofenol 0.001%). La fracción de residuos celulares insolubles (sedimento) se resuspende en 0.3 mi de amortiguador de muestra lxSDS y se incuba durante 5 minutos a 95°C y se centrifuga nuevamente. Subsecuentemente las proteínas se separan por SDS y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (Laemmli, Reino Unido, Nature 227 (1970) 680-685) y se tiñen con colorante azul brillante de Coomasie R.
Las proteínas precursoras de tetranectina-apolipoproteína AI sintetizadas son homogéneas y se encuentran en la fracción de residuo celular insoluble en forma de agregados de proteína insolubles (IB, por sus siglas en inglés) . El rendimiento de expresión es comparable dentro del alcance de la presión de medición en todos los clones y se encontraba entre 30-60% en relación a la proteína total de E. coli.
EJEMPLO 3
FERMENTACION DE DENSIDAD CELULAR ALTA DE 10 1 DE E. coli PARA LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE LAS PROTEINAS PRECURSORAS DE TETRANECTINA-APOLIPOPROTEINA AI
Ejemplo 3a
Precultivo
Para la pre- fermentación se ha utilizado un medio M9 de acuerdo con Sambrook, J. , et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press; segunda edición, New York, (diciembre de 1989) ) suplementado con aproximadamente 1 g/1 de L-leucina, aproximadamente 1 g/1 de L-prolina y aproximadamente 1 mg/1 de clorhidrato de tiamina.
Para la pre- fermentación 300 mi de medio M9 en un matraz Erlenmeyer de 1000 mi con deflectores se inocula con 2 mi de una ampolleta de banco de siembra primario. El cultivo se realiza en un agitador giratorio durante 13 horas a 37°C hasta que se obtiene una densidad óptica (578 nm) de 1-3.
Fermentación Principal de Alimentación por Lotes de
10 1
Para la fermentación se utilizó un medio por lotes de acuerdo con Riesenberg et al., (Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27): 27.6 g/1 de glucosa*H20, 13.3 g/1 de KH2P04, 4.0 g/1 de (NH4)2HP04, 1.7 g/1 de citrato, 1.2 g/1 de MgS04*7 H20, 60 mg/1 de citrato de hierro (III), 2.5 mg/1 de CoCl2*6H20, 15 mg/1 de MnCl2*4 H20, 1.5 mg/1 de CuCl2*2 H20, 3 mg/1 de H3B03, 2.5 mg/1 de Na2Mo04*2 H20, 8 mg/1 de Zn(CH3COO) 2*2 H20, 8.4 mg/1 de Titriplex III, 1.3 ml/1 de Synperonic 10% como agente antiespumante . El medio de lote se suplementa con 5.4 mg/1 de clorhidrato de tiamina y 1.2 g/1 de L-leucina y L-prolina, respectivamente. La solución de alimentación 1 contiene 700 g/1 de glucosa suplementado con 19.7 g/1 de MgS04*7 H20. la solución alcalina para regulación de pH es una solución acuosa de NH3 12.5% (p/v) suplementada con 50 g/1 de L-leucina y 50 g/1 de L-prolina, respectivamente. Todos los componentes se disuelven en agua desionizada.
La fermentación se lleva a cabo en un termentador Biostat C DCU3 10 1 (Sartorius, Melsungen, Alemania) . Partiendo con un medio de lote de fermentación estéril de 6.4 1 más 300 mi de inoculo a partir de la prefermentación la fermentación del lote se realiza a 37°C, pH 6.9 ± 0.2, 500 mbares y una tasa de aeración de 10 1/min. Después de que la glucosa suplementada inicialmente se suprime la temperatura se desplaza a 28°C y la fermentación entra al modo de alimentación por lote. Aquí, el valor relativo del oxigeno disuelto (p02) se mantiene en 50% (DO-stat, véase, por ejemplo Shay, L. . , et al . , J. Indus. Microbiol. (1987) 79-85) al agregar la alimentación 1 en combinación con un incremento constante en la velocidad de agitación (550 rpm a 1000 rpm dentro de 10 horas y de 1000 rpm a 1400 rpm dentro de 16 horas) y una tasa de aeración (de 10 1/min a 16 1/min en 10 horas y de 16 1/min a 20 1/min en 5 horas) . El suministro con aminoácidos adicionales resulta en la adición de la solución alcalina cuando el pH alcanza el límite de regulación inferior (6.70) después de aproximadamente 8 horas de cultivo. La expresión de proteína terapéutica recombinante se induce por la adición de IPTG 1 mM a una densidad óptica de 70.
Cosechado de la Biomasa
Al final de la fermentación la tetranectina-apolipoproteína Al citoplasmática y expresada de manera soluble se transfiere a agregados de proteína insoluble, los denominados cuerpos de inclusión, con una etapa de calentamiento en donde la totalidad del caldo de cultivo en el termentador se calienta a 50°C durante 1 a 2 horas antes de la cosecha (véase, por ejemplo, el documento EP-B 1 486 571) . Posteriormente, el contenido del fermentador se centrifuga con una centrifuga de flujo pasante (13,000 rpm, 13 1/h) y la biomasa casechada se almacena a -20°C hasta procesamiento adicional. Las proteínas precursoras de tetranectina-apolipoproteína Al sintetizadas se encuentran exclusivamente en la fracción de residuo celular insoluble en forma de agregados de proteína insoluble, los denominados cuerpos de inclusión (IB, por sus siglas en inglés) .
Cuantificación de Producto
Las muestras extraídas del fermentador, una antes de la inducción y las otras en los puntos de tiempo dedicados después de la inducción de la expresión de proteínas se analizan por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida . De cada muestra la misma cantidad de células (D0Objetivo = 5) se resuspenden en 5 mi de amortiguador PBS y se rompen por sonicación sobre hielo. Después 100 µ? de cada suspensión se centrifugan (15,000 rpm, 5 minutos) y cada sobrenadante se extrae y se transfiere a un frasco separado. Esto es para diferenciar entre la proteína objetivo soluble e insoluble expresada. A cada fracción de sobrenadante (= soluble) 300 µ? y a cada fracción de sedimento (= insoluble) 400 µ? de amortiguador de muestra SDS (Laemmli, U. K., Nature 227 (1970) 580-685) se agregan. Las muestras se calientan durante 15 minutos a 95°C bajo agitación para solubilizar y reducir todas las proteínas en las muestras. Después de enfriar a temperatura ambiente 5 µ? de cada muestra se transfieren a un equipo de gel de poliacrilamida 4-20% TGX Criterion Stain Free (Bio-Rad) . Adicionalmente 5 µ? de estándar de peso molecular (Precisión Plus Protein Standard, Bio-Rad) y 3 cantidades (0.3 µ?, 0.6 µ? y 0.9 µ?) de estándar de cuantificación con concentración de proteína de producto conocida (0.1 µg/ml) se colocan en el gel.
La electroforesis se lleva a cabo durante 60 minutos a 200 V y posteriormente el gel se transfiere a GelDOC EZ Imager (Bio-Rad) y se procesa durante 5 minutos con radiación UV. Las imágenes del gel se analizan utilizando el programa de análisis Image Lab (Bio-Rad) . Con los tres estándares se calcula una curva de regresión lineal con un coeficiente de > 0.99 y del mismo se calculan las concentraciones de la proteína objetivo en la muestra original .
Ejemplo 3b
Precultivo
Para la pre-fermentación se ha utilizado un medio M9 de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press; segunda edición, (diciembre de 1989) ) suplementado con aproximadamente 1 g/1 de L-leucina, aproximadamente 1 g/1 de L-prolina y aproximadamente 1 mg/1 de clorhidrato de tiamina.
Para la pre- fermentación 300 mi de medio M9 modificado en matraces Erlenmeyer de 1000 mi con deflectores se inocula a partir de la placa de agar o con 1-2 mi de una ampolleta de banco de siembra primario. El cultivo se realiza en un agitador giratorio durante 13 horas a 37°C hasta que se obtiene una densidad óptica (578 nm) de 1-3.
Fermentación Principal de Alimentación por Lotes de
10 1
Para fermentación y expresión de alto rendimiento de tetranectina-apolipoproteína Al se utilizaron los siguientes medios de lotes y alimentaciones:
8.85 g/1 de glucosa, 63.5 g/1 de extracto de levadura, 2.2 g/1 de NH4C1, 1.94 g/1 de L-leucina, 2.91 g/1 de L-prolina, 0.74 g/1 de L-metionina, 17.3 g/1 de KH2P04*H20, 2.02 g/1 de MgS04*7 H20, 25.8 mg/1 de clorhidrato de tiamina, 1.0 ml/1 de Synperonic, 10% de agente antiespumante .
La solución de alimentación 1 contiene 333 g/1 de extracto de levadura y 333 g/1 de glicerol 85% suplementado con 1.67 g/1 de L-metionina y 5 g/1 de L-leucina y L-prolina cada uno. La alimentación 2 es una solución de 600 g/1 de L-prolina. La solución alcalina para regulación de pH es una solución de KOH 10% (p/v) y como ácido se utiliza una solución de glucosa 75%. Todos los componentes se disuelven en agua desionizada.
La fermentación se lleva a cabo en un termentador Biostat C DCU3 de 10 1 (Sartorius, Melsungen, Alemania) . Partiendo de un medio de lote de fermentación estéril de 5.15 1 más 300 mi de inoculo a partir de la prefermentación, la fermentación de alimentación por lotes se realiza a 25°C, pH 6.7 ± 0.2, 300 mbares y una tasa de aeración de 10 1/min. Antes de que la glucosa suplementada inicialmente se agote el cultivo alcanza una densidad óptica de 15 (578 nm) y la fermentación entra al modo de alimentación por lotes cuando se inicia la alimentación 1 con 70 g/h. El monitoreo de la concentración de glucosa en el cultivo de la alimentación l se incrementa a un máximo de 150 g/h mientras se evita la acumulación de glucosa y se mantiene el pH cerca del límite de regulación superior de 6.9. A una densidad óptica de 50 (578 nm) se inicia la alimentación 2 con una tasa de alimentación constante de 10 ml/h. El valor relativo del oxígeno disuelto (p02) se mantiene por encima de 50% incrementado la velocidad del agitador (500 rpm a 1500 rpm) , la tasa de aeración (de 10 1/rain a 20 1/min) y la presión (de 300 mbares a 500 mbares) en paralelo. La expresión de la proteína terapéutica recombinante se induce por la adición de IPTG 1 mM a una densidad óptica de 90.
Cuantificación de Producto
Siete muestras extraídas del fermentador, una antes de la inducción y las otras en los puntos de tiempo dedicados después de la inducción de la expresión de proteínas se analizan por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida . De cada muestra se resuspendieron las mismas cantidades de células (DOobjetivo = 5) en 5 mi de amortiguador PBS y se rompieron por medio de sonicado sobre hielo. Después 100 µ? de cada suspensión se centrifugaron (15,000 rpm, 5 minutos) y cada sobrenadante se extrae y se transfiere a un frasco separado. Esto es para diferenciar entre la proteína objetivo expresada soluble e insoluble . A cada fracción de sobrenadante (= soluble) 300 µ? y a cada fracción de sedimento (= insoluble) 200 µ? de amortiguador de muestra SDS (Laemmli, Reino Unido, Nature 227 (1970) 680-685) se agregan. Las muestras se calientan durante 15 minutos a 95°C bajo agitación para solubilizar y reducir todas las proteínas en las muestras. Después de enfriar a temperatura ambiente 5 µ? de cada muestra se transfieren a un gel de poliacrilamida Bis-tris 10% (Novagen) . Adicionalmente se colocan sobre el gel 5 µ? de estándar de peso molecular (Precisión Plus Protein Standard, Bio-Rad) y 3 cantidades (0.3 µ?, 0.6 µ? y 0.9 µ?) de estándar de cuantificación con concentración de proteína de producto conocida (0.1 µ /?t?1) .
La electroforesis se lleva a cabo durante 35 minutos a 200 V y después el gel se tiñe con colorante azul brillante de Coomasie R, se destiñe con agua calentada y se transfiere a un densitómetro óptico para digitalización (GS710, Bio-Rad) . Las imágenes de gel se analizan utilizando el programa de análisis Quantity One 1-D (Bio-Rad) . Con los tres estándares de curva de regresión lineal se calcula con un coeficiente de > 0.98 y con la misma se calculan las concentraciones de la proteína objetivo en la muestra original .
Cosecha de la biomasa
Al final de la fermentación la tetranectina-apolipoproteína Al citoplasmática y expresada de manera soluble se transfiere a agregado de proteína insoluble, los denominados cuerpos de inclusión (IB, por sus siglas en inglés) con una etapa de calentamiento en donde la totalidad del caldo de cultivo en el termentador se calienta a 50°C durante 1 ó 2 horas antes de la recolección (véase, por ejemplo, EP-B 1 486 571) . Después de la etapa de calentamiento el precursor de tetranectina-apolipoproteína Al sintetizado se encuentra exclusivamente en la fracción de residuo celulares insolubles en forma de los IB.
El contenido del termentador se enfría a 4-8°C, se centrifuga con una centrifuga de flujo pasante (13,000 rpm, 13 1/h) y la biomasa cosechada se almacena a -20 °C hasta procesamiento adicional. El rendimiento de biomasa recolectada total varía entre 39 g/1 y 90 g/1 de materia seca dependiendo de la construcción expresada.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (40)
1. Un pro-polipéptido caracterizado porque comprende, en la dirección N a C- terminal: un primer dipéptido GS, una etiqueta de secuencia de aminoácidos, - un segundo dipéptido GS inmediatamente adyacente a un sitio de separación enzimático.
2. El pro-polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos delantera' de una longitud de por lo menos dos residuos aminoácidos N- terminal al primer dipéptido GS.
3. Un polipéptido de fusión caracterizado porque comprende, en una dirección N a C- terminal: - un pro-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y, un polipéptido de interés.
4. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el aminoácido en la parte N-terminal del pro-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 3 tiene un grupo alfa-amino libre.
5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etiqueta de secuencia de aminoácidos tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 15.
6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el sitio de separación enzimática tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 33 o la SEC ID NO: 34.
7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos delantera N-terminal al primer dipéptido GS tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 01 a 08.
8. El polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque el polipéptido de interés se selecciona de la cadena pesada o ligera de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, apolipoproteína, variante de apolipoproteína, fusión de apolipoproteína, interferón, interleucina, insulina, variante de activador de plasminógeno de tipo tisular, factor estimulante de colonias, hormona del crecimiento o proteína morfogenética ósea.
9. El polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizado porque el polipéptido de interés tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 43, o SEC ID NO: 44 o SEC ID NO: 45.
10. Un método para producir un polipéptido de interés caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de fusión que comprende, en la dirección N a C-terminal: un primer dipéptido GS, una etiqueta de secuencia de aminoácidos, un segundo dipéptido GS inmediatamente adyacente a un sitio de separación enzimática, y el polipéptido de interés, b) cultivar la célula, c) recuperar el polipéptido de fusión de la célula o el medio de cultivo, d) purificar el polipéptido de fusión, e) separar enzimáticamente el polipéptido de fusión y de esta manera producir el polipéptido de interés.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos delantera de una longitud de por lo menos dos residuos aminoácidos N-terminal al primer dipéptido GS .
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos delantera N-terminal al primer dipéptido GS tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEC ID NO: 01 a 08.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque la célula es una célula procariótica .
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque la etiqueta de secuencia de aminoácidos tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 11 o la SEC ID NO: 15.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque el sitio de separación enzimática tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 33 O la SEC ID NO: 34.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque el polipéptido de interés se selecciona de una cadena pesada o ligera de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, apolipoproteína, variante de apolipoprotelna, fusión de apolipoproteína, interferón, interleucina, insulina, variante de activador de plasminógeno de tipo tisular, factor estimulante de colonias, hormona del crecimiento o proteína morfogenética ósea.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 43 o la SEC ID NO: 44 o la SEC ID NO: 45.
18. Un kit caracterizado porque comprende un ácido nucleico que comprende, en una dirección 5' a 3' : un ácido nucleico que codifica para el dipéptido GS, - un ácido nucleico que codifica para una etiqueta de secuencia de aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para el dipéptido GS inmediatamente adyacente a un ácido nucleico que codifica para un sitio de separación enzimática.
19. Un método para el cultivo de células procarióticas, caracterizado porque: las células se cultivan en un medio que comprende glucosa, extracto de levadura, L-leucina, L-prolina, L-metionina, clorhidrato de tiamina y agente antiespumante , las células se alimentan con una primera solución de alimentación que comprende extracto de levadura, glicerol, L-metionina, L-leucina y L-prolina, - las células son alimentadas con una segunda solución de alimentación que comprende L-prolina, una solución de hidróxido de potasio y una solución de glucosa se utilizan para control de pH.
20. Un método para la producción de un polipéptido, caracterizado porque: las células que comprenden un ácido nucleico que codifica para el polipéptido se cultivan en un medio que comprende glucosa, extracto de levadura, L-leucina, L-prolina, L-metionina, clorhidrato de tiamina y agente antiespumante, las células son alimentadas primero con una solución de alimentación que comprende extracto de levadura, glicerol, L-metionina, L-leucina y L-prolina, las células son alimentadas en segundo lugar con una solución de alimentación que comprende L-prolina, una solución de hidróxido de potasio y una solución de glucosa se utilizan para control de pH, en donde el polipéptido se recupera de las células o del medio de cultivo y de esta manera se produce el polipéptido.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, caracterizado porque la adición de la primera alimentación se inicia en una densidad óptica de aproximadamente 15 determinada a 578 nm, la adición de la segunda alimentación se inicia a una densidad óptica de aproximadamente 50 determinada a 578 nm y la expresión del polipéptido se induce con IPTG a una densidad óptica de aproximadamente 90 determinada a 578 nm.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque el medio comprende aproximadamente 8.85 g/1 de glucosa, aproximadamente 63.5 g/1 de extracto de levadura, aproximadamente 2.2 g/1 de NH4C1, aproximadamente 1.95 g/1 de L-leucina, aproximadamente 2.9 g/1 de L-prolina, aproximadamente 0.75 g/1 de L-metionina, aproximadamente 17.3 g/1 de KH2P04*3 H20, aproximadamente 2 g/1 de MgS04*7 H20, aproximadamente 25.8 mg/1 de clorhidrato de tiamina, aproximadamente 1.0 ml/1 de agente antiespumante 10%.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque la primera solución de alimentación comprende aproximadamente 333 g/1 de extracto de levadura, aproximadamente 333 g/1 de glicerol 85%, aproximadamente 1.7 g/1 de L-metionina y aproximadamente 5 g/1 de L-leucina y L-prolina cada uno.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado porque la segunda solución de alimentación comprende aproximadamente 600 g/1 de L-prolina.
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque la base para regulación de pH es una solución de KOH 10% (p/v) y el ácido es una solución de glucosa 75%.
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, caracterizado porque el cultivo es aproximadamente 25 °C.
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizado porque el cultivo es a un pH de entre aproximadamente pH 6.5 y aproximadamente pH 6.9.
28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizado porque la primera alimentación se inicia a una tasa de 70 g/h.
29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, caracterizado porque la segunda alimentación se inicia a una tasa de 10 ml/h.
30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 29, caracterizado porque el valor de oxígeno disuelto se mantiene por encima de 50%.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el valor de oxígeno disuelto se mantiene por encima de 50% al incrementar la velocidad de agitación, la tasa de aeración y la presión de aire en paralelo.
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, caracterizado porque la velocidad del agitador es de aproximadamente 500 rpm a aproximadamente 1500 rpm.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, caracterizado porque la tasa de aeración es de aproximadamente 10 1/min a aproximadamente 20 1/min.
34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 33, caracterizado porque la presión de aire es de aproximadamente 300 mbares a aproximadamente 500 mbares.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 34, caracterizado porque la célula procariótica es una célula de E. coli.
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 35, caracterizado porque el polipéptido es apolipoproteína Al.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la apolipoproteína Al es una proteína precursora de tetranectina-apolipoproteína Al.
38. Un medio de cultivo para células procarióticas caracterizado porque comprende aproximadamente 8.85 g/1 de glucosa, aproximadamente 63.5 g/1 de extracto de levadura, aproximadamente 2.2 g/1 de NH4C1, aproximadamente 1.95 g/1 de L-leucina, aproximadamente 2.9 g/1 de L-prolina, aproximadamente 0.75 g/l de L-metionina, aproximadamente 17.3 g/l de KH2P04*3 H20, aproximadamente 2 g/l de MgS0*7 H20, aproximadamente 25.8 mg/1 de clorhidrato de tiamina, aproximadamente 1.0 ml/1 de agente antiespumante 10%.
39. El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el medio comprende además una primera alimentación que comprende aproximadamente 333 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 333 g/l de glicerol 85%, aproximadamente 1.7 g/l de L-metionina y aproximadamente 5 g/l de L-leucina y L-prolina cada uno.
40. El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el medio de cultivo comprende además una segunda solución de alimentación que comprende aproximadamente 600 g/l de L-prolina.
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