ES2253604T3 - Metodo para la produccion recombinante de polipeptidos. - Google Patents
Metodo para la produccion recombinante de polipeptidos.Info
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Abstract
Método para la producción recombinante de un poli- péptido deseado mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido en una célula microbiana hos- pedadora, formando en el citoplasma de dicha célula hospeda- dora cuerpos de inclusión que contienen dicho polipéptido, y aislando, solubilizando y naturalizando dicho polipéptido, caracterizado dicho método porque después de la fermentación la célula hospedadora o el contenido de la célula hospedadora se incuba a una temperatura de 40ºC ó superior durante por lo menos 10 minutos y a continuación se aisla el polipéptido in- soluble de la célula hospedadora.
Description
Método para la producción recombinante de
polipéptidos
La invención se refiere a un método perfeccionado
para la producción recombinante de polipéptidos en procariotas, por
medio de cuerpos de inclusión mediante la post incubación de las
células hospedadoras a temperatura elevada.
En los organismos procarióticos, la síntesis de
proteínas, llamada también traducción, tiene lugar en los ribosomas
del citoplama. Al expresar el ADN recombinante en los organismos
hospedadores procarióticos, como p. ej., E. coli, a menudo
es deseable que el producto/proteína génico recombinante resultante
sea precipitado en el citoplasma en forma de "cuerpos de
inclusión" insolubles. Después de completar la fermentación y
lisis de las células, los cuerpos de inclusión son aislados y
opcionalmente se purifican y la proteína recombinante contenida en
los mismos se solubiliza añadiendo desnaturalizadores tales como la
urea o el clorhidrato de guanidina y la naturalización de dicha
proteína se efectúa mediante la reducción de las condiciones
desnaturalizantes. Tales métodos son ya bien conocidos y se han
empleado desde hace tiempo con éxito también para la fabricación
industrial de proteínas recombinantes (ver p. ej., Lee, S.Y., Trends
Biotechnol. 14 (1996) 98-105; Panda, A.K., et
al., J. Biotechnol. 75 (1999) 161-172; Mattes,
R., Semin. Thromb. Hemost. 27 (2001) 325-336; Clark,
E.D., Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 202-207;
Misawa, S., y Kumagai, I., Biopolymers 51 (1999)
297-307; y Lilie, H., Current Opinión Biotechnol. 9
(1998) 497-501).
La extensión con la cual se obtienen las
proteínas expresadas en el citoplasma como agregados insolubles de
proteína (cuerpos de inclusión) o en forma soluble activa o
inactiva, se determina esencialmente mediante la estructura
primaria (secuencia de aminoácidos) de la proteína. La estructura
primaria de la proteína determina las propiedades intrínsecas
biofísicas/bioquímicas de la proteína, determinando estas
propiedades si la proteína se plegará en el ambiente citoplasmático
de un microorganismo para formar una proteína soluble biológicamente
activa o inactiva, o si de preferencia se formarán agregados de
proteína de alto peso molecular. El equilibrio de plegado
(formación de la proteína estructurada soluble en relación con los
agregados de proteína insoluble) puede influenciarse mediante la
selección de la fermentación y las condiciones de la expresión. Por
ejemplo, haciendo crecer las células procarióticas en un cultivo a
temperatura reducida y/o en condiciones de inducción no óptimas
(concentración limitada del inductor), puede reducirse la velocidad
de la biosíntesis de la proteína recombinante codificada con un
plásmido, mediante lo cual previniendo o reduciendo una acumulación
de proteína para formar agregados insolubles de proteína (ver p.
ej., Kopetzki, E., et al., Mol. Gen. Genet. 216 (1989)
149-155); y EP 0 300 425). Un método para la
obtención de anticuerpos en forma soluble, correctamente plegados
mediante temperatura elevada, es ya conocido a partir de la patente
WO 9402608. En otras instancias, si se desea sin embargo, se
prepara la proteína recombinante por medio de la ruta de los cuerpos
de inclusión. En consecuencia, un objetivo de dichos métodos es el
de obtener un alto rendimiento de la proteína recombinante en los
cuerpos de inclusión. En esta conexión, debería tenerse en cuenta,
sin embargo, que otros parámetros, también, son de alta importancia
en la expresión génica recombinante en procariotas, siendo estos
otros parámetros por ejemplo, el lograr una expresión génica
recombinante tan alta como sea posible y prevenir la modificación
post translacional no deseada.
El objetivo de la invención es el de aumentar el
rendimiento de los polipéptidos insolubles en forma de cuerpos de
inclusión después de la expresión recombinante.
Sorprendentemente se ha descubierto que el
rendimiento de un polipéptido recombinante deseado desnaturalizado
insoluble, puede aumentarse considerablemente mediante el paso
adicional de una incubación a una temperatura elevada no
fisiológicamente, después de la fermentación.
El objeto de la invención es por lo tanto, un
método para la producción recombinante de un polipéptido deseado,
mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica dicho
polipéptido en una célula hospedadora microbiana, de preferencia
una célula hospedadora procariótica, formando en el citoplasma de
dicha célula hospedadora, cuerpos de inclusión que contienen dicho
polipéptido, aislando los cuerpos de inclusión, solubilizando y
naturalizando el polipéptido, estando dicho método caracterizado
porque después de la fermentación, la célula hospedadora o el
contenido de la célula hospedadora se incuba a una temperatura de
40ºC ó mayor, de preferencia, 45ºC ó mayor, durante por lo menos 10
minutos, de preferencia durante 10 a 180 minutos, y subsiguiente
aislamiento del polipéptido insoluble a partir de la célula
hospedadora.
El método de acuerdo con la invención se efectúa
en un medio acuoso y habitualmente se efectúa a temperaturas entre
40 y 60ºC, de preferencia, a 45ºC. Temperaturas más altas
contribuyen solamente muy poco a aumentar el efecto de la invención
y pueden tener como consecuencia una irreversible desnaturalización
del polipéptido.
Los cuerpos de inclusión insolubles se forman
durante la expresión recombinante de los polipéptidos en células de
hospedadores microbianos. Los cuerpos de inclusión son agregados
refráctiles de la proteína deseada
proteasa-resistente mal plegados, que se forman
después de la sobreexpresión del gen codificador (Misawa, S., y
Kumagai, I., Biopolymers 51 (1999) 297-307).
Sorprendentemente, mediante la incubación de las
células hospedadoras que contienen el polipéptido recombinante
deseado, a tales temperatura elevadas no fisiológicamente, el
polipéptido deseado se acumula en forma de cuerpos de inclusión
insolubles. Por lo tanto, el rendimiento del polipéptido deseado en
la porción insoluble de la masa de fermentación puede ser
potenciado. La duración de la incubación y la temperatura de
incubación no son críticas per se. Con un tiempo de
incubación creciente y a temperaturas de incubación más altas, se
forma en primer lugar una cantidad mayor de cuerpos de inclusión.
Una duración muy larga de incubación y temperaturas de incubación
muy altas, dan como resultado sin embargo que el polipéptido cambia
irreversiblemente, por ejemplo, mediante una irreversible
desnaturalización por el calor. La persona experta en la técnica
puede ahora averiguar fácilmente las condiciones óptimas para la
producción recombinante del polipéptido de interés para llevar a
cabo simples experimentos. En tales experimentos, se ha descubierto
que puede lograrse un considerable aumento del rendimiento del
polipéptido recombinante -conteniendo cuerpos de inclusión- por
ejemplo, mediante la post incubación a 45ºC durante una hora.
Células hospedadoras procarióticas adecuadas para
la expresión génica recombinante, son por ejemplo, organismos gram
negativos o gram positivos, tales como p. ej., E. coli y
Bacillus subtilis. Cepas de E. coli adecuadas son,
por ejemplo, cepas de E. coli tales como UT5600, AB101, XL1,
K12, X1776 y W3110. Sin embargo, otras enterobacteriáceas así como
también microorganismos tales como Klebsiella, Salmonella o
Bacillus subtilis, Pseudomonas o Streptomyces son
también adecuadas como células hospedadoras. También son adecuadas
como células hospedadoras cepas de levaduras, tales como p. ej.,
Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces y
Schizosaccharomyces.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido
está normalmente insertado en un vector de expresión. Vectores
adecuados son ya bien conocidos para los expertos en la técnica, y
son por ejemplo, plásmidos o fagos.
La fermentación de las células hospedadoras se
efectúa también de acuerdo con métodos ya conocidos para un experto
en la técnica. Normalmente, las células se incuban en primer lugar a
la temperatura de fermentación o hasta 37ºC. Después de alcanzar un
predeterminado número de células (medido mediante la densidad óptica
del caldo de fermentación/suspensión de células), se induce la
expresión del polipéptido recombinante, y se efectúa el cultivo
hasta que se alcanza la fase estacionaria (en el caso de cultivos
por partidas). Una vez terminado el crecimiento de las células,
éstas se recogen, se aislan los cuerpos de inclusión y se procesan
mediante solubilización y naturalización de acuerdo con métodos ya
conocidos. El paso de incubación adicional de acuerdo con la
invención está apropiadamente insertado en este procedimiento. Esto
implica que, por ejemplo, una vez terminada la fermentación, se
aumenta simplemente la temperatura de la partida de fermentación y
a continuación se recogen las células. De manera similar, las
células pueden por supuesto también ser recogidas e incubadas de
acuerdo con la invención, en suspensión antes o después de la lisis.
Por lo tanto, la fermentación es completa si la suspensión de
células se recoge y se retira del fermentador, si de otra manera se
inhibe el crecimiento celular, o si la temperatura de la suspensión
celular se aumenta de acuerdo con la invención a 40ºC y más, lo
cual inhibe también el posterior crecimiento de la célula
hospedadora.
La temperatura de fermentación puede estar en el
margen normal para la producción recombinante de polipéptidos en
células microbianas hospedadoras. La temperatura de fermentación es
de preferencia 30ºC ó inferior, especialmente si se desea procesar
un terminal N (p. ej., escisión del terminal N de la metionina del
polipéptido deseado). Este procesado del terminal N se efectúa
enzimaticamente mediante enzimas endógenas de la célula hospedadora
durante la fermentación. Con particular preferencia, el margen de
temperatura se escoge entre 18 y 28ºC, y con más preferencia, entre
22 y 26ºC.
Los siguientes ejemplos, referencias, listados de
secuencias y figuras, se proporcionan para ayudar a la comprensión
de la presente invención, el verdadero fin de la cual está
compendiado en las reivindicaciones anexas.
El sistema E. coli hospedador/vector (cepa
de E. coli hospedadora y vector básico) empleado para la
expresión de los genes/polipéptidos de acuerdo con la invención,
está descrito en la patente nº 6.291.245.
Se emplearon métodos estándar para manipular el
ADN, como describe Sambrook, J. et al. en Molecular cloning:
A laboratory manual ("Clonación molecular: un manual de
laboratorio"); Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se
emplearon de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La concentración del polipéptido para el
polipéptido multimérico de fusión T repeat, y el
interferón-\alpha-2a se estimó
determinando la densidad óptica (OD) a 280 nm, empleando el
coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la
secuencia de aminoácidos [T-repeat: \varepsilon =
148680 cm^{2}/mol;
IFN-\alpha-2a:\varepsilon =
18020 cm^{2}/moles].
El gen artificial de fusión
T-repeat codifica un polipéptido de fusión de 217
aminoácidos con un peso molecular de 27,242 D. El polipéptido de
fusión se compone de un N-terminal, 13 aminoácidos
del interferón-\alpha-2a humano
(MCDLPQTHSLGSR (SEQ ID NO:1); péptido portador) y 5 copias del
péptido T-1357 inhibidor del HIV
(WQE
WEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:2), péptido diana), las cuales están conectadas por medio de empalmes de péptido escindibles con tripsina (GR).
WEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:2), péptido diana), las cuales están conectadas por medio de empalmes de péptido escindibles con tripsina (GR).
Con el fin de insertar el gen estructural
T-repeat en el plásmido de expresión de E.
coli,
pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel
(producción y descripción: ver ejemplo 2), fueron insertados un
sitio de unión sintético ribosómico RBSII y un sitio singular de
escisión EcoRI corriente arriba en el extremo 5', y un sitio
singular de escisión con la endonucleasa de restricción CeIII,
corriente arriba en el extremo 3'.
El gen T-repeat del RBSIIm que
tiene aproximadamente 690 bp de longitud y está flanqueado por un
sitio singular de escisión de las endonucleasas de restricción
EcoRI y CelII, se preparó a partir de oligonucleótidos mediante
síntesis química. El gen T-repeat de RBSII de doble
cadena, se montó por reasociación y ligación de los oligonucleótidos
y subsecuentemente clonado como un fragmento EcoRI/CelII de una
longitud de 691 bp en un plásmido de E. coli. El plásmido
deseado recibió el nombre de pT-repeat. La secuencia
predeterminada de ADN del gen T-repeat de RBSII se
confirmó mediante el secuenciado del ADN.
El plásmido
pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel
es un vector para la expresión del
interferón-\alpha-2a
(IFN-\alpha-2a) en E.
coli. Se basa sobre el plásmido de expresión de
IFN-\alpha-2b,
OripBR-URA3-EK-IFN
(patente U.S. nº 6.291.245). El
pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel
difiere del
OripBR-URA3-EK-IFN
por un adicionalmente presente gen represor lacI y un gen
IFN-\alpha-2a en lugar de un gen
IFN-\alpha-2b. El
IFN-\alpha-2a y el
IFN-\alpha-2b difieren solamente
por un aminoácido en la posición 21 (intercambio Lys21Arg). El gen
represor lacI viene del plásmido pUHA1 (Stüber, D., et al.,
System for high level production in Escherichia coli and
rapid application to epitope mapping, preparation of
anti-bodies an structure-function
analysis ("Sistema para la producción a alto nivel en
Escherichia coli y rápida aplicación en el mapeado de
epitopes, preparación de anticuerpos y análisis de la
estructura-función"). En: Immunological Methods
("Métodos inmunológicos") IV (1990) 121-152).
Se amplificó mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) de
acuerdo con el método descrito por Mullis, K.B., y Faloona, F.A., en
Methods Enzymol. 155 (1987) 335-350, empleando los
cebadores NI (SEQ ID NO:3) y N2 (SEQ ID NO:4).
y a continuación ligado como un
fragmento NotI de una longitud de aproximadamente 1210 bp en el
sitio singular de escisión NotI de
OripBR-URA3-EK-IFN.
El gen T-repeat se aisló como un
fragmento EcoRI/CelII de una longitud de aproximadamente 690 bp del
plásmido pT-repeat (ver ejemplo 1.2) y a
continuación se ligó en el fragmento vector
pBRori-URA3-LacI-RFN
de aproximadamente 3,1 kbp de longitud, digerido con EcoRI y CelII.
El plásmido deseado
pBRori-URA3-LacI-T-repeat
se identificó mediante el mapeado de restricción y el gen
T-repeat subclonado se verificó de nuevo mediante
secuenciado del ADN.
Para la expresión del gen de fusión de acuerdo
con la invención se empleó un sistema hospedador/vector de E.
coli que permite una selección del plásmido libre de antibiótico
mediante complementación de una auxotrofía de E. coli (PyrF)
(patente US nº 6.291.245).
Con el fin de producir células útiles para la
expresión del gen T-repeat, se transformó una cepa
K12 de E. coli (designada como UT5600 (\DeltapyrF) con el
plásmido de expresión
pBRori-URA3-LacI-T-repeat
descrito en el ejemplo 2.2. Las células transformadas
UT5600(\DeltapyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-repeat,
se hicieron crecer en primer lugar sobre placas de agar y a
continuación en un cultivo en agitación en medio M9 mínimo
conteniendo 0,5% de ácidos casamino (Difco) hasta una densidad
óptica a 550 nm (OD_{550}) de 0,6-0,9 y a
continuación inducidas con IPTG (1-5 mmoles/litro
concentración final). Después de una fase de inducción de
4-16 horas a 22-37ºC, las células
fueron recogidas por centrifugación, se lavaron con 50 mmoles/litro
de tampón de fosfato de potasio, de pH 6,5, y se almacenaron a
-20ºC hasta un procesado posterior.
Para la expresión del gen
IFN-\alpha-2a, se empleó un
sistema hospedador E. coli/vector, que permite una selección
de plásmido libre de antibiótico mediante complementación de una
auxotrofía de E. coli (PyrF) (patente US nº 6.291.245).
Para la producción de células para la expresión
de IFN-\alpha-2a, se transformó la
cepa UT5600 de E. coli K12 (\DeltapyrF) con el plásmido de
expresión
pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel
descrito en el ejemplo 2.1. Las células transformadas
UT5600(\DeltapyrF)/
pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel,
se hicieron crecer en primer lugar sobre placas de agar y a
continuación en un cultivo con agitación en medio mínimo M9
conteniendo 0,5% de ácidos casamino (Difco) a
22-37ºC hasta una densidad óptica a 550 nm
(OD_{550}) de 0,6-0,9 y a continuación inducida
con IPTG (1-5 mmoles/ litro, concentración final).
Después de una fase de inducción de 4-16 horas a
22-37ºC, las células se recogieron por
centrifugación y se lavaron con 10 mmoles/tampón de fosfato de
potasio, pH 6,8.
Se analizó la porción soluble e insoluble de
IFN-\alpha-2a, y el polipéptido de
fusión T-repeat, presente después de finalizar el
crecimiento de células, la fermentación y la post fermentación, en
lisados de células mediante electroforesis sobre gel de
poliacrilamida SDS (PAGE), se coloreó con colorante azul R brillante
Coomassie, y análisis densitométrico. La separación de los lisados
celulares en una fracción soluble (sobrenadante) y una fracción
insoluble (de IB y componentes insolubles celulares) se logró por
medio de una centrifugación.
Para esta finalidad, sedimentos celulares de 3
unidades OD_{550} cada una (1 OD_{550} = 1 ml de suspensión
celular con un OD_{550} de 1), de medio de cultivo celular, se
resuspendieron en 0,25 ml 10 mmoles/litro de tampón de fosfato de
potasio, de pH 6,8, y las cálulas se lisaron mediante tratamiento
ultrasónico (2 pulsos de 30 segundos con el 50% de intensidad). Los
componentes insolubles de la célula se sedimentaron (14.000 rpm, 5
minutos) y el sobrenadante se mezcló con 1/5 volúmenes (vol) de
5xSDS tampón de muestras (1 x SDS tampón de muestras: 50
mmoles/litro de Tris-HCl, pH 6,8, 1% de SDS, 50
mmoles/litro de DTT, 10% de glicerina, 0,001% de azul de bromo
fenol). La fracción de restos celulares insolubles (sedimento) se
resuspendió en 0,3 ml de 1xSDS de tampón de muestras y las muestras
se incubaron durante 5 minutos a 95ºC y se centrifugaron de nuevo.
A continuación, se separaron los polipéptidos mediante
electroforesis SDS en gel de poliacril-amida (PAGE)
(Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685), se
coloreó con colorante azul R brillante Coomassie, y a continuación
se analizaron densitométricamente las bandas de gel principales.
Con el fin de preparar el precultivo, se
inocularon 300 ml de medio M9plus (medio M9 suplementado con 0,5% de
ácidos casamino y 0,9 g/litro de Trp, Pro y Leu cada uno), con 1 ml
de stock en glicerina de E. coli
UT5600\DeltapyrF/pBRori-URA3-LacI-T-repeat
en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml. El cultivo se incubó durante
aproximadamente 6 horas a 37ºC en un agitador excéntrico con 150 rpm
hasta alcanzar una OD_{578 \ nm} de 3,0.
Al principio de la fermentación, el precultivo se
transfirió a un fermentador de 10 litros. El cultivo principal se
hizo crecer en el medio de sal M9 definido conteniendo 1,4% de
glicerina en lugar de glucosa, 2% de ácidos casamino y 0,1% de los
aminoácidos Trp, Leu y Pro cada uno, a 25ºC hasta una OD_{578 \
nm} de 20. A continuación, empezó la alimentación del cultivo con
una dosificación de levadura en glicerina (solución de stock: 30% de
extracto de levadura y 33% de glicerina), y la velocidad del flujo
la cual se varió entre 0,8 y 3,5 ml/minuto en función del desarrollo
del valor del pH del cultivo, evitando con ello cualquier adición
posterior de auxiliares de corrección (H_{3}PO_{4}, KOH). El pH
se mantuvo a pH 7,0, el valor pO_{2} se mantuvo a 50% controlando
las rpm.
A una OD_{578 \ nm} de 70, se añadieron 1,5
mmoles/litro de IPTG y se indujo la expresión gen/polipéptido. La
fermentación finalizó a una OD_{578 \ nm} de
160-180.
Con el fin de preparar el precultivo, 500 ml de
medio M9 se inoculó con aproximadamente 1,5 ml de stock en glicerina
de E. coli
UT5600\DeltapyrF/pBRori-URA3-LacI-RFN
en un matraz Erlenmeyer de 2 litros. El cultivo se incubó durante
aproximadamente 10 horas a 37ºC y 130 rpm (agitador) hasta alcanzar
una OD_{578 \ nm} > 2.
Para la fermentación se empleó un medio complejo
sobre una base de levadura-glicerina. El cultivo se
efectuó a 25ºC y a un valor de pH de 7,0. Cuando se alcanzó una
OD_{456 \ nm} de 10, dio comienzo una dosificación de levadura en
glicerina, la cual adicionalmente contiene el aminoácido
L-metionina. La inducción con 0,5 mM de IPTG tuvo
lugar a una OD_{456 \ nm} de 50. A continuación se incrementó la
temperatura de fermentación de 25ºC a 45ºC durante un período de dos
horas. Como resultado de la alta temperatura, el producto de
expresión que hasta ahora ha estado presente casi enteramente en
forma soluble se convierte en cuerpos de inclusión. A continuación,
se recoge la biomasa y se aisla el polipéptido.
Una vez terminada la fermentación, las células se
incubaron a 45ºC durante 1 hora en el fermentador, mientras se
agitaba, antes de ser recogidas por centrifugación.
Se analizaron las células en relación a los
polipéptidos expresados (porción soluble frente a porción insoluble)
como se ha descrito en el ejemplo 5.
| Polipéptido | Fermentación estándar a 25ºC | Incubación a 45ºC/litro hora | ||
| Sobrenadante | Sedimento | Sobrenadante | Sedimento | |
| (soluble) | (insoluble) | (soluble) | (insoluble) | |
| IFN-\alpha-2a | > 95% | < 5% | < 2% | > 98% |
| T-repeat | 40% | 60% | < 2% | > 98% |
Análogos resultados se obtuvieron con las
condiciones de post-incubación 42ºC/1,5 horas,
50ºC/1 litro hora ó 50ºC/45 minutos.
Clark, E.D., Curr. Opin.
Biotechnol. 12 (2001) 202-207
EP 0 300 425
EP-A 0 368 342
Kopetzki, E., Mol.Gen. Genet. 216
(1989) 149-155
Laemmli, U.K., Nature 227
(1970) 680-685
Lee, S.Y., Trends Biotechnol. 14
(1996) 98-105
Lilie, H., Current Opinion
Biotechnol. 9 (1998) 497-501
Mattes, R., Semin. Thromb. Hemost.
27 (2001) 325-336
Misawa, S., and Kamagai, l.,
Biopolymers 51 (1999) 297-307
Mullis, K.B., and Faloona, F.A.
Methods Enzymol. 155 (1987)
335-350
Panda, A.K. et al., J. Biotechnol.
75 (1999) 161-172
(1) Sambrook, J. et al., Clonación
molecular: Un manual de Laboratorio; Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989
(2) Stüber, D., et al., Sistema
para la producción a alto nivel en Escherichia coli y rápida
aplicación al mapeado de epítopes, preparación de anticuerpos y
análisis de la estructura-función; en Métodos
Inmunológicos IV (1990) 121-152
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método perfeccionado para la
producción recombinante de proteínas
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<130> 21736 EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido soporte
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<400> 1
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\sa{Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly
Ser Arg}
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<210> 2
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<211> 39
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido diana
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<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador N1
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg
\hfill35
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<210> 4
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<211> 36
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador N2
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg
\hfill36
Claims (4)
1. Método para la producción recombinante de un
poli-péptido deseado mediante la expresión de un
ácido nucleico que codifica dicho polipéptido en una célula
microbiana hospedadora, formando en el citoplasma de dicha célula
hospedadora cuerpos de inclusión que contienen dicho polipéptido, y
aislando, solubilizando y naturalizando dicho polipéptido,
caracterizado dicho método porque después de la fermentación
la célula hospedadora o el contenido de la célula hospedadora se
incuba a una temperatura de 40ºC ó superior durante por lo menos 10
minutos y a continuación se aisla el polipéptido insoluble de la
célula hospedadora.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la fermentación se realiza a una
temperatura de 30ºC ó inferior.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la incubación se realiza durante 10 a
180 minutos.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 1 a 3,
caracterizado porque la incubación se realiza a una
temperatura de 40ºC a 60ºC.
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