TWI282370B - Improved method for the recombinant production of polypeptides - Google Patents

Description

1282370 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種改良方法’其係將宿主細胞於局溫下 進行後段培養，以經由包涵體來重組製造原核生物中之多 肽。 在原核生物體中，蛋白質合成（亦稱爲轉譯）發生在細胞質 中的核糖體上。原核宿主有機體（諸如，例如大腸桿菌）表現 重組DNA時，通常需要將所得重組基因産物/蛋白質應以不 溶的”包涵體”形式沈澱於細胞質中。發酵作用完成及細胞-溶解後，分蠢該等包涵體，視情況純化之，並藉由加入諸 如尿素或鹽酸胍之變性劑來溶解其中所含有的重組蛋白 質，及藉由降低變性條件恢復該蛋白質之特性。該等方法 已爲人所熟知，且亦長期成功地應用於重組蛋白質之工業 製造（例如參照，Lee，S.Y.，Trends Biotechnol· 14 (1996)98-105; Panda，Α·Κ·等人，J· Biotechnol. 75(1999)161-172; Mattes, R·， Semin. Thromb. Hemost. 27 (2001)325-336; Clark, E.D·， Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001)202-207; Misawa, S.? and Kumagai，I·，Biopolymers 51(1999)297-307;及 Lilie，H·， Current Opinion Biotechnol· 9 (1998) 497-501) o 【先前技術】 以不溶的蛋白質凝集體（包涵體）或以可溶的活性或非活 性形式所獲得之蛋白質於細胞質中表現至何種程度主要取 決於蛋白質的一級結構（胺基酸序列）。蛋白質的一級結構決 定了該蛋白質之固有生物物理/生物化學特性，該特性因此 93018.doc 1282370 ^疋该蛋白h否可於微生物有機體細胞f環境中進行摺 豐，以形成可溶的生物活性或非活性蛋白質，或者是否形 $較佳為高分子量之蛋自該集體4酵作用及表現條件 、選擇會影響該糟疊平衡（可溶的結構蛋白質之形成盘不 溶的蛋白質凝集體有關）。舉例而言，原核細胞生長於較低 培養溫度及/或非最佳誘導條件（有限的誘導物濃幻下，會 使重組質體所編碼的蛋白質生物合成率下降，藉此阻止或 降低該蛋白質積聚所形成之不溶的蛋白質凝集體（例如參

Kopetzki, E.f Λ, Mo, Gen. Gene, 216(1989)149-155; 及EP 0 3()(^25)'然而’在其他實例中，卻需要以包涵體 之途徑來製備重組蛋白冑’據此，該等方法之目的係為獲 得於包涵體中較高産量之重組蛋白質。然❼，就此而論， 須謹記的是，其他參數在原核生物之重組基因表現中亦相 當重要’該等參數能⑽如）盡可能完成重組基因表現，並阻 止不必要之後轉譯修飾作用。 【發明内容】 本發明之目的係增加重組表現後呈包涵體形式之不溶多 肽之産量。 培養於非生理性高溫下之 之重、纟且多肽之産量頗為增 已驚奇地發現··發酵作用後， 額外步驟可使所欲不溶且變性 加0 口 ^ I明之目的係一種用於重組製造所要多肽之方 法，該方法係藉由在微生物宿主細胞（較佳爲原核生物宿主 細胞）中表現編碼該多肽之核酸、在該宿主細胞之細胞質中 93018.doc 1282370 形成含有該多肽之包涵體、分離該等包涵體、將該多狀溶 解並恢復特性，該枝之特徵在於經發料，宿主細胞或 宿主細胞内容物培養⑽。C或更高溫度（較佳爲45t或更高） 下至少10分鐘（較佳爲1()至⑽分鐘），且隨後自宿主細胞中 分離出不溶的多肽。 根據本發明方法係於液態培養基進行，且通常在仙至 6(TC(較佳爲45。〇之間的溫度下進行，更高的溫度只會造成 根據本發明極小的絲，I可能導致該多肽產生不可逆之 變性作用。 不溶的包㉟體係在微生物宿主細胞進行多肽重組表現期 間形成的。包涵體係具蛋白質酶抗性的褶疊異常之所要蛋 白質之折射凝集體，其係由於編碼基因過度表現而發生 (MiSawa，S.，及Kumagai，！，Bi〇p〇lymers 5ι(ΐ999)297 3〇7)。 令人驚奇地，將含有所要重組多肽之宿主細胞培養在非 生理性之高溫下’則所要多肽會如不溶的包涵體一般積聚 在一起，因此，該發酵批量之不溶部分中的所要多肽産量 會有所增加。培養持續時間及培養溫度本身並非具有決定 性。伴隨培養時間之增加及更高之培養溫度，首先會形成 大量的包涵體。然而，特長之培養持續時間及特高之培養 溫度則會導致多肽產生不可逆變化（例如，熱所導致的不可 逆變性作用）。熟悉此項技術者現在藉由簡單實驗就可容易 地找出重組製造所關注多肽之最佳條件。在該等實驗中， 咸已發現後段培養（例如）於4 5 °C下1小時可使含重組多肽之 包涵體之産量頗為增加。 93018.doc 1282370 適合用於重組基因表現之原核宿主細胞為：例如，革蘭 氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如，大腸桿菌（E c〇li)及枯 草桿菌（Bacillus subtilis)。合適的大腸桿菌菌株：例如，大 腸桿菌 K12 菌株（諸如 UT5600、HB101、XL1、ΧΠ76 及 W3 110)然而，其他知内囷科（enter〇bacter^aceae)以及諸如 克雷伯氏菌（Klebsiella)、沙門氏菌（Salm〇nella)或枯草桿菌 (Bacillus subtilis)、假單胞菌（pseud〇m〇nas)或鏈黴菌 (Streptomyces)之微生物亦適用作爲宿主細胞。亦適合用作 爲宿主細胞的還有諸如酵母菌株（例如，植酵母 (Saccharomyces)、畢赤酵母（pichia)、漢森酵母 (Hansemila)刻魯維拉菌（KiUyVer〇myCes)及裂殖酵母 (Schizosaccharomyces))。 編碼該多肽之核酸通常插入在表現載體中。適當的載體 已爲熟悉此項技術者所熟知，例如質體或噬菌體。 宿主細胞之發酵作用亦可根據熟悉此項技術者所知之方 法完成之。通常，細胞首先於發酵溫度或高達37°C下培養， 細胞達到預定數目後（藉由發酵培養液/細胞懸浮液之光密 度來量測），誘導該重組多肽之表現並進行培養，直至生長 停滞期（就批量培養而言）。、細月包生長完成I，根據已知^ 法’採集該等細胞，分離包涵體，並將其以溶解及恢復特 11處理。根據本發明之額外培養步驟係適當地插入該步驟 匕Μ扣例如，發酵完成後，僅升高該發酵批量的溫 度亚隨後採集該等細胞。同樣地，細胞當然亦可根據本發 明在/谷解刖或溶解後採集並培養於懸浮液中。因此，發酵 93018.doc 1282370 成則自發酵盗中採集並移除細胞懸浮液，否則細胞. 生長s又到抑制，或者細胞懸浮液之溫度升高至根據本發 明40 C及更向’其亦會進一步抑制宿主細胞之生長。 在微生物宿主細胞中重組製造多肽之發酵溫度爲通常範 圍内之溫度。發酵溫度較佳爲30。〇或更低，特別當需要進 行N-末端處理時（例如，所要多肽之甲硫胺酸的N_末端切 除）。該N-末端處理係在發酵期間，藉由宿主細胞内源性酶 催化進行。溫度範圍尤佳爲18至28。〇之間，且最佳爲22至 26°C之間。 提供以下實例、參考文獻、序列列表及圖式以有助於本 發明之理解，在附加專利申請範圍中闡述了本發明之實際 範疇。咸欲瞭解的是在不脫離本發明之精神下可將所揭示 步驟修飾。 【實施方式】 起始物質 用於表現根據本發明之基因/多肽的大腸桿菌宿主/載體 系統（大腸桿菌株及基本載體）揭示於美國專利案第 6,291，245號中。 一般方法 重組DNA技術 用以複製DNA之標準方法描述於Sambrook，J.等人， Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中。根據薇家說明書使用分子生物試劑。 93018.doc -10- 1282370 多肽測定 藉由測定280奈米處之光密度，使用以胺基酸序列為基礎 之莫耳消光係數[T-重復：e = 148680平方公分/莫耳； IFN-ce-2a: ¢ = 18020平方公分/莫耳]來估算多體性T-重復融 合多肽及干擾素-a-2a之多肽濃度。 實例1 T-重復融合基因之合成 1 · 1 T-重復融合基因之基因設計 人造T-重復融合基因係編碼分子量爲27,242道耳頓並含· 217個胺基蜂的融合多肽。該融合多肽包含人類干擾素 -ce-2a N_ 末端的 13 個胺基酸（MCDLPQTHSLGSR(SEQ ID ΝΟ:1)；載體肽）及5個具有抑制性HIV肽T-1357 (WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID ΝΟ:2)，靶肽）之複製序列，其係以可被胰蛋白酶 切除之肽連接子（GR)連接之。 爲將Τ-重復結構基因插入至大腸桿菌表現質體 pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel(製造及描述參見實例2)中， 在5’端上游插入一合成核糖體RBSII結合位點及單一 EcoRI 裂解位點，並在Y端上游插入一單一 Celll限制性核酸内切 酶裂解位點。 1.2 T-重復融合基因之基因合成 藉由化學合成自寡核苷酸來製備長約690鹼基對且單一 EcoRI及Celll限制核酸内切酶裂解位點位於兩側之RBSII T-重復基因。藉由寡核苷酸鏈合及接合作用組合成雙股 93018.doc -11 - 1282370 RBSII T重復基因，且隨後將長691鹼基對的EcoRI/Celll片 斷選殖至大腸桿菌質體中。所要質體命名爲pT-重復。以 DNA定序分析確認該經選殖RBSII Τ-重復基因的預定DNA 序列。 實例2 大腸桿菌表現質體之建構 2.1 起始質體 pBRori-URA3_LacI-RFN-Edel 之建構 質體pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel係在大腸桿菌中表現干 擾素_o:-2a(IFN-a-2a)之載體，其係以IFN-a-2b表現質體_ OripBR-URA^EK-IFN(美國專利案第 6,291，245 號）為基 礎。pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel與 OripBR-URA3-EK-IFN 不同在於額外存在的lacl阻遏基因及取代IFN-a-2b基因之 IFN-a-2a基因。IFN-〇!-2a與IFN-a-2b僅在21位置上的一個胺

基酸有差別（Lys21 Arg交換）。該lacl阻遏基因來自質體 pUHAl(Stuber，D”等人，System for high-level production in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping， preparation of antibodies, and structure-function analysis; In: Immunological Methods IV(1990)121-152)，其可根據Mullis， K.B·，and Faloona，F.A·，In: Methods Enzymol. 155 (1987)335-3 50中所述之方法，使用引子N1(SEQ ID NO:3) 及 N2(SEQ ID NO:4)

Not I N1 ： 5f-AAAAAAGCGGCCGCGACAATTCGCGCGCGAAGGCG-3 93018.doc •12- 1282370

Not I N2 ： 5f-AAAAAAGCGGCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG-3f 藉由聚合酶鏈式反應（PCR)擴增之，及隨後將長約1210 鹼基對之Notl片斷接合至0ripBR_URA3-EK-IFN單一 Notl 裂解位點上。 2.2表現載體pBRori-URA3_LacI-T-重復之構建 從質體pT-重復（參見實例1.2)中分離出長約690鹼基對之 EcoRI/Celll片斷之Τ-重復棊因，且隨後接合至經EcoRI及 Celll切割之長約3·1仟鹼基對之pBRori_URA3-LacI-RFN載 體片斷。以$制酶圖譜鑑別所要質體pBRori-URAS-LacI-T-重復，並再以DNA定序分析確認次選殖之T-重復基因。 實例3 3·1 T-重復基因於大腸桿菌中之表現 為表現根據本發明之融合基因，係使用藉由互補大腸桿 菌營養缺陷體（PyrF)(美國專利案第6,291，245號）進行不含 抗生素質體篩選之大腸桿菌宿主/載體系統。 3·2藉由在選擇性培養基中互補PyrF營養缺陷艎之轉化作 用及細胞製作 爲製造用於表現T-重復基因之細胞，以實例2 · 2所述 pBRori-URA3_LacI-T-重復之表現質體轉化大腸桿菌K12菌 株[命名爲 UT5600(APyrF)]。經轉化後的 UT5600(APyrF)/ pBRori-URA3-LacI-T-重復細胞首先在瓊脂平板上生長，且 隨後在含有0.5%酪蛋白胺基酸（Difco)的M9基本培養基中 震盪培養直至550奈米處光密度（OD55〇)爲0.6-0.9，隨後用 93018.doc -13- 1282370 IPTG(l-5毫莫耳/公升之終濃度）誘導。在22至37°C下經4至 16小時誘導期後，細胞以離心法採集，用50毫莫耳/公升磷 酸鉀緩衝液（pH 6.5)洗滌，並保存於-20°C下直至進一步處 理。 實例4 用於表現IFN-a-2a之轉化作用及細胞製作 為表現IFN-a-2a基因，係使用藉由互補大腸桿菌營養缺 陷體（PyrF)(美國專利案第6,291，245號）進行不含抗生素質 體篩選之大腸桿菌宿主/載體系統。 爲製造用於表現IFN-a-2a之細胞，以實例2.1所述 pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel之表現質體轉化大腸桿菌K12 菌株 UT5600(APyrF)。經轉化後的 UT5600(APyrF)/pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel細胞首先在瓊脂平板上生長，且隨後 在含有0.5%酪蛋白胺基酸（Difco)的M9基本培養基中震盪 培養直至550奈米處光密度（OD550)爲0.6-0.9，隨後用 IPTG(l-5毫莫耳/公升之終濃度）誘導。在22至37°C下經4至 16小時誘導期後，細胞以離心法採集，用10毫莫耳/公升磷 酸钟緩衝液（pH 6.8)洗條。 實例5 表現分析 以SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE)(用庫馬斯亮藍 R(Coomassie Brilliant Blue R)染料染色）及光密度分析法分 析經完成細胞生長、發酵及後段發酵之後，於細胞溶解産 物中所存在之可溶及不溶的IFN-ce-2a及T-重復融合多肽部 93018.doc -14- 1282370 分。以離心方法將細胞溶解産物分離成可溶部分（上清液） 及不可溶部分（IB’s及不溶的細胞成分）。 因此，將每一 3個OD550單位（1 OD550即爲OD550爲1的1毫 升細胞懸浮液）經離心培養基之細胞沉澱物再次懸浮於0.25 毫升之10毫莫耳/公升磷酸鉀缓衝液（pH 6.8)中，且該等細 胞以超音波處理加以溶解（在50%強度時每30秒2個脈衝）。 該不溶的細胞成分進行沈降（14,000 rpm，5分鐘）且用1/5體 積（vol)之5xSDS樣本緩衝液（IxSDS樣本緩衝液：50毫莫耳/ 公升 Tris-HCl，pH 6.8，1% SDS，50毫莫耳/公升 DTT，10°/〇 甘油，0.001 %溴酚藍）與上清液摻合。將不溶的細胞碎片部 分（沉澱物）再次懸浮於0.3毫升之IxSDS樣本緩衝液中，且 將樣本在95°C下培養5分鐘並再離心。隨後，以SDS聚丙烯 醯胺凝膠電泳（PAGE)(Laemmli， U.K·， Nature 227(1970)680-685)分離多肽，用庫馬斯亮藍R染料染色，並 隨後對相關凝膠紋進行光密度分析。 實例6 6.1用於重組製造T-重復之大腸桿菌之10公升高細胞密度 發酵 預先培養物 爲了製備預先培養物，將1毫升大腸桿菌UT5600 △pyrF/pBRod-URA3-lacI-T-重復之甘油儲液接種至1000毫 升錐形瓶中之300毫升M9補充培養基（M9培養基添加了 0.5%酷蛋白胺基酸及0.9公克/公升之Trp、Pro及Leu各一 種）。將該培養物在37°C下於轉速爲150 rpm的外心震盪器中 93018.doc -15- 1282370 培養約6小時直至OD578nm達到3.〇。 10公升分批進料主要發酵作用 在發酵開始時，將預先培養物移至一 10公升發酵器中。 主培養物於25°c下在所定義的M9鹽培養基（其含有1.4%甘 油來替代葡萄糖，2%酪蛋白胺基酸及〇1%胺基酸Trp、Leu 及ΡΓ〇各一種）中生長直至〇D578nm值爲20。隨後，開始將甘 油酵母配料（d〇sage)(儲液：3〇%酵母萃取物及33%甘油）加 入培養物中，其流動率視培養物pH值之發展在0·8至3_5毫 升/分鐘間變化，藉此避免另外添加校正助劑（Η3ρ〇4，- Κ0Η)。ΡΗ值舞持在7.0，藉由控制rpm轉速將ρ〇2值保持在 50% 〇 〇〇57811111爲70時，加入1.5毫莫耳/公升ΙΡΤ(}，並誘導基因/ 多肽表現。（^爪㈣爲160-180時終止發酵。 6.2用於重組製造干擾素之大腸桿菌之1〇公升高細胞 密度發酵 預先培養物 爲了製備預先培養物，將約1·5毫升大腸桿菌 UT5600ApyrF/pBRori_URA3_lacI_RFN之甘油儲液接種至一 2公升錐形瓶中之500毫升之M9培養基（其中添加了 〇5%酪 蛋白胺基酸及〇·9公克/公升Trp、Pro及Leu各一種）。將該培 養物在37°C且振蕩器轉速爲130rpm下培養約1〇小時，直至 〇D546nm達到2以上。 發酵 為進行發酵，係採用以酵母-甘油為基礎之複合培養基， 93018.doc -16- 1282370 在5 C且pH值爲7.0時進行該培養。當〇1)45_達到1〇時，開 始甘^酵母配料（其額外含有胺基酸蛋胺酸）。在的 爲50日守進仃〇·5 mM2IpTG之誘導。然後發酵溫度由乃。c增 加至45 C歷時2小時。由於高㉟，迄今幾乎全部以可溶形式 存在的表現産物均轉換爲包涵體。隨後，採集生物質量並 分離多肽。 實例7 發酵後的細胞培養 鲞酵元成後，在以離心法採集細胞前，將細胞在發酵器· 中於45°C下培養1小時，同時攪動。 根據實例5中所述，分析細胞有關之所表現的多肽（可溶 f分對比不部分）。_ 多肽 25°C下之標準發酵 45°C下培養1小時 上清液 (可溶的） 沉澱物 (不溶的） 上清液 (可溶的） 沉澱物 (不溶的） IFN - a-2a >95% <5% <2% >98% T-重復 40% 60% <2% >98% 在後培養條件42°C/1_5小時、50°C/1小時或50°C/45分鐘下 可獲得類似結果。 參考文獻目錄

Clark, E.D.? Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 202-207 EP 0 300 425 EP-A 0 368 342

Kopetzki，E·，等人，Mol. Gen· Genet· 216 (1989) 149-155 93018.doc -17- 1282370

Laemmli, U.K.5 Nature 227(1970)680-685

Lee，S.Y·，Trends Biotechnol· 14(1996)98-105

Lilie, H.5 Current Opinion Biotechnol. 9(1998)497-501

Mattes, R.5 Semin. Thromb. Hemost. 27(2001)325-336

Misawa，S_，and Kumagai，I·，Biopolymers 51(1999)297-307

Mullis， Κ·Β·， and Faloona， F.A.， Methods Enzymol. 155(1987)335-350

Panda，Α·Κ·，等人，J. Biotechnol· 75(1999)161-172 Sambrook，J·，等人，Molecular cloning: A laboratory manual;· Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，1989

Sttiber，D·，等人，System for high-level production in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping， preparation of antibodies, and structure-function analysis; In: Immunological Methods IV(1990)121-152 美國專利案第6,291，245號 93018.doc -18- 1282370 序列表

<110>F. Hoffmann-La Roche AG <120〉重組製造蛋白質之改良方法

<130>21736 EP <140〉093115974 <141>2004-06-03 <150>EP03012295.6 <151>2003-06-12 <160>4 <170>PatentIn Ver. 2.1 <210>1 ： <211>13 <212>PRT <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列之描述：載體肽 <400>1

Met Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg 1 5 10 <210>2 <211>39 <212>PRT <213>人造序列 <220> <223>人造序列之描述：靶肽 <400>2

Trp Gin Glu Trp Glu Gin Lys lie Thr Ala Leu Leu Glu Gin Ala Gin 1 5 10 15

He Gin Gin Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gin Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30 93018.doc 1282370

Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35 <210>3 <211>35 <212>DNA <213〉人造序列 <220> <223〉人造序列之描述：引子N1 <400〉3 aaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg 35 <210>4 <211>36 <212>DNA , <2Π〉人造序列 <220> <223〉人造序列之描述：引子N2 <400>4 aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg 36 93018.doc

Claims (1)

12怿菩本 十、申請專利範圍： 1. -種方法，其係藉由下列步驟重組製造所要多肽：在微 生物宿主細胞中表現編碼該多肽之核酸、在該宿主細胞 之細胞質中形成含有該多肽之包涵體，及將該多肽分 離、溶解及恢復特性；其特徵在於：在發酵後，將該宿 主細胞或該宿主細胞内容物培養於4(rc或更高溫度下至 少10分鐘，及隨後自該宿主細胞中分離出不溶的多肽。 2·如睛求項1之方法，其特徵在於該發酵係在3〇它或更低溫 度下進行。 3·如請求項1。或2之方法，其特徵在於該培養進行10至180分 鐘。 4·如請求項1或2之方法，其特徵在於該培養係在40°C至60°C 之溫度下進行。 93018.doc