CN117756925A - 一种重组弹性蛋白Pro.ELP及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组弹性蛋白Pro.ELP,其特征在于其氨基酸序列为MGRS[(VPGVP)6S]n,其中n为8~32之间的自然数。还公开了其编码基因、Pro.ELP‑Ⅲ型胶原融合蛋白、表达载体及其制备方法和应用。本发明的重组弹性蛋白Pro.ELP能在大肠杆菌中高效可溶表达,能有效促进人成纤维细胞增殖与迁移。本发明还构建了Pro.ELP‑Ⅲ型胶原融合蛋白的表达载体,表达产物促进人成纤维细胞增殖与迁移能力更强。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组弹性蛋白Pro.ELP及其制备方法和应用,属于蛋白表达技术领域。
背景技术
弹性蛋白(Elastin)在结缔组织的胞外基质中广泛存在,与微纤维共同组成弹性纤维,广泛存在于韧带和脉管壁。组织之所以具有弹性和抗张能力,主要是由于弹性纤维与胶原纤维的共同作用。
重组弹性蛋白ELP是参照天然弹性蛋白中高度重复序列,通过基因工程技术构建的由五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n串联重复而成的多肽,其中Xaa称为客座残基,是除了Pro以外的任意一种氨基酸,Xaa和重复次数n不同,则ELPs不同。另外,在人的原弹性蛋白中含有一个特殊的高度亲水域,称为外显子26A,富含丝氨酸,在原弹性蛋白的这个亲水域,14个氨基酸中就有8个是丝氨酸。
ELP与天然弹性蛋白相似,具有良好的细胞相容性,在体内可降解为天然氨基酸,免疫排斥反应低,当外界温度低于相变温度时,ELPs处于溶解状态,当外界温度高于相变温度时,ELPs自动聚集,从溶液中析出形成沉淀,该特性被称为相转变特性,已被广泛用于组织工程材料,药物靶向递送和蛋白纯化研究。
随着ELP广泛的使用价值的日益显现,弹性蛋白在异源体内的高通量表达成为应用的瓶颈问题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组弹性蛋白Pro.ELP。
本发明采用的技术方案:
一种重组弹性蛋白Pro.ELP,其特征在于其氨基酸序列为MGRS[(VPGVP)6S]n,其中n为8~32之间的自然数。
优选的,所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1-4中任一项所示。
前述的重组弹性蛋白Pro.ELP的编码基因。
优选的,其碱基序列如SEQ ID No.5-8中任一项所示。
本发明还公开了一种Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白,由Pro.ELP与Ⅲ型胶原通过接头连接,其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
前述的Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白的编码基因,其碱基序列如SEQ ID No.10所示。
表达载体,表达前述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白。
前述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白的制备方法,其步骤包括:
构建前述的表达载体,将其转化到表达宿主菌中;
培养表达宿主菌,诱导重组蛋白表达;
纯化表达产物,得到前述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白。
前述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者前述的Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白在提高人成纤维细胞增殖与迁移的能力的应用。
本发明的有益效果:
本发明为提高弹性蛋白在异源体内的高效可溶性表达,依据天然弹性蛋白中高度重复序列五肽VPGVG以及高度分散在26A外显子亲水域中的丝氨酸,构建合成具有精确序列和分子量的重组弹性蛋白Pro.ELP表达基因,其最终表达序列为MGRS[(VPGVG)6S]n。
本发明的重组弹性蛋白Pro.ELP能在大肠杆菌中高效可溶表达,能有效促进人成纤维细胞增殖与迁移。
本发明还构建了Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白的表达载体,由前述的Pro.ELP与Ⅲ型胶原串联融合表达,两个蛋白之间包含一段柔性接头区,该表达载体可高效表达Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白,表达产物促进人成纤维细胞增殖与迁移能力更强。
附图说明
图1本发明的表达载体pET30a-Pro.ELP①的质粒图谱。
图2本发明的表达载体pET30a-Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白的质粒图谱。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是,应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制本发明,与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
本重组弹性蛋白Pro.ELP①-④的表达载体的构建方法,包括以下步骤:
1.密码子优化后的重组弹性蛋白Pro.ELP①的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.5所示,但不限于此序列,以翻译后的蛋白质氨基酸序列同源性等于或大于85%为限。并委托北京六合华大基因科技有限公司合成含SEQ ID NO.5所示Pro.ELP①DNA片段的pMV-Pro.ELP质粒。
2.将合成得到的Pro.ELP①编码序列,通过SnapGene软件设计引物,以PCR技术扩增出Pro.ELP①基因片段后回收PCR产物,并利用同源臂引物,采用Gibson连接技术将Pro.ELP①基因连接到载体pET30a上,构建成表达载体pET30a-Pro.ELP①。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,以卡那霉素抗性筛选阳性转化子,挑选转化子进行琼脂糖凝胶电泳验证,选择阳性转化子进行测序验证及质粒抽提。
表1PCR扩增体系
体系成分 | 成分体积 |
引物F | 2.5μL |
引物R | 2.5μL |
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | 2μL |
含Pro ELP DNA片段的pMV-Pro.ELP质粒 | 25μL |
ddH2O | To 50μL |
2.1配制完PCR体系后,混匀并离心,PCR扩增条件为:第一阶段98℃预变性30s;第二阶段98℃变性10s,50-72℃退火30s,72℃延伸30s/kb,32个循环次数;第三阶段72℃终延伸2min。使用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因片段,按照产品说明书的操作步骤进行。
表2Gibson连接体系
体系成分 | 成分体积 |
Gibson Assembly Master Mix(2X) | 5μL |
连接片段 | 0.2–1pmols*XμL |
dd H2O | (5-X)μL |
总体系 | 10μL |
将以上成分在冰上混匀之后置于37℃热浴60min,获得的连接产物储存在冰上或者-20℃,以便后续的感受态转化。
2.2转化大肠杆菌DH5α感受态细胞:在冰上缓慢融解感受态细菌(对于新鲜制备的感受态可以直接使用),加入3-5ul连接产物,轻轻用手指弹动离心管,以混匀细菌和质粒连接产物,冰浴放置30min,结束后42℃水浴热激2min,加入500ul LB,于37℃、220rpm恒温摇床培养1小时,培养后2000-3000g离心1min使菌体沉淀,留下约50-100ul上清重悬沉淀,然后全部涂布到含有氨苄素抗性的LB平板上,37℃倒置培养过夜。
3.步骤2得到的pET30a-Pro.ELP①质粒分别用BgIII/XhoI和BamHI/XhoI限制性内切酶进行双酶切反应,反应产物利用T4连接酶进行连接,构建成表达载体pET30a-Pro.ELP②。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,以卡那霉素抗性筛选阳性转化子,挑选转化子进行琼脂糖凝胶电泳验证,选择阳性转化子进行测序验证及质粒抽提。
表3双酶切体系
体系成分 | 成分体积 |
10X FD green buffer | 2μL |
BgIII/BamHI限制性内切酶 | 2μL |
XhoI限制性内切酶 | 2μL |
pET30a-Pro.ELP①质粒 | 7μL |
ddH2O | To 20μL |
表4T4连接体系
体系成分 | 成分体积 |
10X T4 buffer | 2μL |
BgIII/XhoI酶切产物 | 8μL |
BamHI/XhoI酶切产物 | 8μL |
T4连接酶 | 2μL |
4.重复步骤3依次得到pET30a-Pro.ELP③与pET30a-Pro.ELP④。其中Pro.ELP②、Pro.ELP③、Pro.ELP④的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2-4所示,编码DNA序列分别如SEQID No.6-8所示。
实施例2
采用与实施例1基本相同的方法,构建pET30a-Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白表达载体。Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.9所示,优化后的编码DNA序列如SEQ ID No.10所示,构建的表达载体命名为pET30a-Pro.ELP-Linker1-Pro.Type IIIcollagen。
实施例3蛋白表达测试
将实施例1和2得到的pET30a-Pro.ELP①、pET30a-Pro.ELP②、pET30a-Pro.ELP③、pET30a-Pro.ELP④、pET30a-Pro.ELP①-Linker1-Pro.Type III collagen载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以卡那霉素抗性筛选阳性转化子。
挑取单菌落,LB培养基培养,IPTG诱导20小时,离心收集菌体,1XPBS洗涤2次,重新悬浮于1XPBS,超声破碎菌体,离心取上清。
取20uL上清与上样缓冲液混合,95℃加热10分钟,离心瞬离至管底,置于冰上。
取10uL上样15%聚丙烯酰胺电泳,考马斯亮蓝染色,脱色,观察蛋白质条带和Pro.ELP①及Pro.ELP①-Ⅲ型胶原融合蛋白的表达情况。
Pro.ELP①,共252aa,分子量20.8KDa,占菌体总蛋白的26%,可溶性表达;
Pro.ELP②,共500aa,分子量41.2KDa,占菌体总蛋白的20%,可溶性表达;
Pro.ELP③,共996aa,分子量81.9KDa,占菌体总蛋白的14%,可溶性表达;
Pro.ELP④,共1988aa,分子量163.3KDa,占菌体总蛋白的9%,可溶性表达;
Pro.ELP①-Ⅲ型胶原融合蛋白,共392aa,分子量33.2KDa,占菌体总蛋白21%,可溶性表达。具体数据如表3所示。
表3蛋白表达测试结果
实施例4人成纤维细胞增殖与迁移能力测定
4.1将蛋白浓度为4μg/mL实施例3表达得到的Pro.ELP①与Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白溶液(溶液指实施例3诱导表达后的上清,用Elisa测定稀释成对应的浓度),以同体积超纯水作为阴性对照,同等浓度体积Ⅲ型胶原蛋白液(广州肽源生物科技有限公司Rechprotein COL-3(重组Ⅲ型人源化胶原蛋白))作为阳性对照,0h人成纤维细胞OD值定义为1,分别在培养基中加入超纯水、Pro.ELP①、Pro.ELP①-Ⅲ型胶原融合蛋白、Ⅲ型胶原蛋白液进行细胞培养,测定0h、12h、24h、36h、48h、72h的OD值,以测定Pro.ELP①与Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白溶液促进人成纤维细胞增殖能力。
表4细胞增殖实验结果
4.2将蛋白浓度为4μg/mL的实施例3表达得到的Pro.ELP①与Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白溶液(溶液指实施例3诱导表达后的上清,用Elisa测定稀释成对应的浓度),以同体积超纯水作为阴性对照,同等浓度体积Ⅲ型胶原蛋白液作为阳性对照,分别在培养基中加入超纯水、Pro.ELP①、Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白、Ⅲ型胶原蛋白液进行细胞培养,利用倒置显微镜在0h、12h、24h、36h、48h、72h时,对6孔板中的细胞进行拍照采样,利用ImageJ对细胞迁移距离进行统计,以测定Pro.ELP①与Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白溶液促进人成纤维细胞迁移能力。
表5细胞迁移实验结果
。
Claims (10)
1.一种重组弹性蛋白Pro.ELP,其特征在于其氨基酸序列为MGRS[(VPGVP)6S]n,其中n为8~32之间的自然数。
2.根据权利要求1所述的重组弹性蛋白Pro.ELP,其特征在于所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1-4中任一项所示。
3.权利要求1或2所述的重组弹性蛋白Pro.ELP的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因,其特征在于其碱基序列如SEQ ID No.5-8中任一项所示。
5.一种Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白,其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
6.权利要求5所述的Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白的编码基因,其特征在于其碱基序列如SEQ ID No.10所示。
7.表达载体,表达权利要求1或2所述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者表达权利要求5所述的Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白。
8.权利要求1或2所述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者权利要求5所述的Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白的制备方法,其特征在于其步骤包括:
(1)构建权利要求7所述的表达载体,将其转化到表达宿主菌中;
(2)培养表达宿主菌,诱导重组蛋白表达;
(3)纯化表达产物,得到权利要求1或2所述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者权利要求5所述的Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白。
9.权利要求1或2所述的重组弹性蛋白Pro.ELP,或者权利要求5所述的Pro.ELP-Ⅲ型胶原融合蛋白在提高细胞增殖与迁移的能力的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于所述细胞为人成纤维细胞。
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