CN111592600A - 一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用 - Google Patents

一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组β‑半乳糖苷酶及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中构建了一种重组β—半乳糖苷酶β‑Gal‑LEH，通过将β‑Gal和ELP(VPGVG)50连接，构建出能够自我纯化且具稳定性好，水解乳糖效率高的重组β‑半乳糖苷酶β‑Gal‑LEH。

Description

一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体包括一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用。
背景技术
乳糖是由D-葡萄糖和β-D-半乳糖单体组成的二糖，主要存在于牛奶等乳制品中，而β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，[EC 3.2.1.23]）是水解乳糖所需的主要酶，它在人类的婴儿时期表达量较高，但是随着年龄的增长而呈现下降趋势。
乳糖酶缺乏症的广泛存在是一个令人关注的问题，缺乏乳糖酶的人在食用牛奶或其他乳制品时通常会导致乳糖消化不良和吸收不良，从而引起腹痛、腹胀、发炎、肠胃气胀和腹泻等症状。为了使乳糖酶缺乏症患者能够食用含有乳糖的乳制品，需要在生产加工的过程中将乳制品中的乳糖水解。由于酶的作用温度和pH比较温和，不会对乳制品造成蛋白质变性或口味改变等严重的变化，还能保留乳制品的原始的营养价值，使其在水解乳制品中的乳糖中得到很好的应用。
牛奶和乳清乳糖工业对高效β-半乳糖苷酶的广泛需求使其成为重要的研究课题。目前β-半乳糖苷酶存在稳定性较差，易发生杂菌污染，分离纯化较为困难，会增加生产初始成本，酶活也会有损失的问题。
发明内容
本发明旨在解决上述技术问题之一，为此，本发明提供了一种重组β-半乳糖苷酶及其构建方法和应用。
本发明首先提供了一种重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH，所述β-Gal-LEH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
上述重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH通过如下方法构建，将β-Gal（Lactobacillus sp.B164，登录号JF345715.1）与ELP(VPGVG)50通过接头Linker连接，并且在ELP (VPGVG)50的C段增加6x-His标签，得到重组β-半乳糖苷酶β-Gal-Linker-ELP-6x-His，将其简称为β-Gal-LEH。
具体的，所述ELP(VPGVG)50为五肽序列Val-Pro-Gly-Val-Gly重复50次，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述接头Linker为连接肽(GGGGS)3，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了一种重组表达质粒pET28a（+）-β-Gal-LEH。
本发明还提供了一种含有上述重组表达质粒的重组菌。
本发明还提供了一种制备重组β- 半乳糖苷酶的方法，所述方法为发酵培养上述重组菌，得到β- 半乳糖苷酶。
本发明还提供了所述重组β- 半乳糖苷酶纯化的方法，所述纯化方法为采用浓度为1.5-2.0 M的(NH4)2SO4进行可逆相变循环纯化。
本发明所述重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH在水解乳糖中的作用。
本发明的优点：
本发明中，在β-半乳糖苷酶中连接了ELP (VPGVG)50，使β-半乳糖苷酶具有敏感且可逆的相变特性，在低于其临界温度时呈随机线圈形状，并且高度溶解；而当高于其临界温度的温度时，β-半乳糖苷酶将变得不溶，形成较大的微米级聚合物并能够被观察到；直至温度重新低于临界温度时，此时β-半乳糖苷酶在溶液中重新溶解。通过可逆相变的多次循环可以实现β-半乳糖苷酶的纯化，得到更高的纯化倍数，并获得具有更高的活性和稳定性的β-半乳糖苷酶。
本发明通过基因修饰技术构建了β-Gal-LEH重组β-半乳糖苷酶，在特定温度下，ELP表现出一种快速且热力学可逆的相变行为，ELP介导的纯化是一种廉价和高效的纯化形式，进而使重组β-半乳糖苷酶可以简单、快速、高效地自我纯化，这种快速而简单的纯化方式在效率上优于传统的镍柱亲和层析纯化方式，此外可以提高β-Gal酶热和不同温度储存条件下的稳定性。
本发明中构建的重组β-Gal-LEH可以在更大的温度及pH范围内有效工作，有利于提高酶催化工艺的效率。本发明得到的融合蛋白更适合于生物催化工艺的应用，更能满足社会生产的要求，有广阔的市场前景。
附图说明
图1重组质粒pET28a（+）-β-Gal-LEH构建示意图。
图2不同浓度（NH4)2SO4纯化的β-Gal-LEH的SDS-PAGE图。
图3不同浓度（NH4)2SO4纯化后的β-Gal-LEH回收率与纯化倍数。
图4实施例4中β-Gal-LEH和β-Gal-LH在不同温度（A）和pH（B）水解乳糖的效率。
图5实施例5中β-Gal-LEH和β-Gal-LH的热稳定性（A）和储存稳定性（B）图。
具体实施方式
结合附图和以下实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：重组表达质粒的构建
β-Gal基因来自于（Lactobacillus sp.B164，登录号JF345715.1），生物公司全基因合成β-Gal核苷酸序列，且5’和3’分别带上Spe I和Nhe I，同时将全基因合成好的带有Spe I和Nhe I酶切位点的β-Gal核苷酸序列构建到pet28a（+）质粒上，命名为pet28a（+）-β-Gal。
生物公司全基因合成Linker-ELP核苷酸序列，在linker的5’带有Nhe I酶切位点，ELP的3’ 带有Hind I酶切位点，Linker和ELP之间有Sac I酶切位点。然后将上述序列构建在PUC18质粒上，命名为 PUC18-Linker-ELP质粒。
使用Nhe I和Hind I双酶切pet28a（+）-β-Gal和PUC18-Linker-ELP，所述双酶切体系为：
Nhe I： 1μl；
Hind I： 1 μL；
10×Buffer： 2μL；
PUC18-Linker-ELP：5μL；
无菌水： 补齐至20μL；
将上述体系加入离心管中并混合混匀，在37℃下酶切2-3h。然后按照常规胶回收试剂盒的方法回收Linker-ELP基因片段和PUC18-Linker-ELP。把胶回收得到的Linker-ELP基因片段和PUC18-Linker-ELP通过T4连接酶连接。所述连接体系为：
10×T4 Ligase buffer： 2μL；
pet28a（+）-β-Gal：依回收浓度而定；
Linker-ELP：依回收浓度而定；
T4 DNA Ligase（10U/μL）： 1μL；
无菌水：补齐至20μL；
反应反应在在16℃的培养箱中进行，反应18小时左右，连接后得到重组质粒pET28a（+）-β-Gal-Linker-ELP-6x-His，命名pET28a（+）-β-Gal-LEH，核苷酸序列和限制酶位点如图1所示。
实施例2：扩大培养表达β-Gal-LEH的大肠杆菌
（1）将新鲜转化的重组大肠杆菌转移至补充有50 μg/mL卡那霉素的固体LB培养基（琼脂粉15g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4）中，并在37 ℃下培养过，然后将过夜培养后的单个菌落转移至5ml 含有50 μg/ mL卡那霉素的液体LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4）中，并在37℃，200 rpm的轨道振荡器中培养过夜，接着将3 mL过夜培养的细菌接种在300 mL 含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基在37 ℃，200 rpm下生长3小时或细菌的OD600达到0.4-0.6之间。
（2）将步骤（1）中最终得到的液体培养基置于冰上20分钟，向其中添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度0.4 mM，然后分别在16℃，25℃和37 ℃以180 rpm摇动培养16-20小时（过夜）来诱导重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH表达。最后将液体培养基在3000 rpm，4 ℃下离心20分钟弃上清，得到不同温度下培养的细胞沉淀物，将其保存在-80℃备用。
（3）将步骤（2）中三种培养温度下得到的细胞沉淀物解冻，分别重悬于10 mLTris-HCl（50 mM，pH 8.0）中，并在3000 rpm，4 ℃下离心20分钟后弃上清，收集菌体，菌体用50mM pH8.0的Tris-HCl洗涤两次。然后将细胞重悬于含1 mM PMSF（200 μL）的20 mLTris-HCl缓冲液中，并使用超声细胞破碎仪在冰上超声裂解30分钟，接着6 s交替超声处理，并间歇冷却6 s。最后将得到的含细胞沉淀物的溶液在4 ℃下13,000 rpm离心30分钟，重复两次，从沉淀物中分离出含有上清液的可溶性蛋白，即重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH。
为了确定以可溶形式或包涵体形式表达的目标蛋白质的性质，将沉淀重悬于2 mLTris-HCl缓冲液中，分别保存部分上述得到的裂解液，上清液和沉淀用于SDS-PAGE分析。结果显示在25 ℃诱导条件下，β-Gal-LEH上清中目标大小位置处明显增加一条条带，表明诱导成功可获得可溶性重组β-半乳糖苷酶β-Gal-LEH。
实施例3：可逆相变循环（ITC）纯化β-Gal-LEH
本实施例中利用可逆相变循环来纯化β-半乳糖苷酶，以此验证实施例2中制备的β-半乳糖苷酶的自纯化性能及其纯化效率。将适量浓度为1.0-2.0 M的(NH4)2SO4加到500 μL澄清的样品裂解物中，然后在25 ℃下1000 rpm 摇动20分钟，接着将样品在25 ℃，14,000rpm下热旋转离心30分钟，弃上清液，通过大量移液将沉淀重悬于1 mL冷Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.0）中。然后将样品在冰上放置60分钟，接着在4 ℃下13,000 rpm离心30分钟，得到含有目标纯化蛋白的上清液，将其转移到新的EP管中。保存一部分纯化的样品用于SDS-PAGE分析。
图2为不同浓度（NH4)2SO4纯化的β-Gal-LEH的SDS-PAGE图，从图中可以看出，1.5-2.0 M浓度的(NH4)2 SO4可ITC纯化β-Gal-LEH。图3是不同浓度（NH4)2SO4纯化后的β-Gal-LEH回收率与纯化倍数从图中可以进一步表明， ITC纯化β-Gal-LEH的最适盐为1.65-2.0 mol/L(NH4)2SO4。
实施例4：不同温度、pH下β-Gal-LEH水解乳糖效率
β-半乳糖苷酶的活性是由测量酶每分钟催化2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）底物的数量来确定。酶的比活力（U/mg）通过利用β-半乳糖苷酶在4500 mol/L/cm的摩尔吸光系数来测定。一单位β-半乳糖苷酶活力为在描述的条件下，每分钟ONPG释放1 nmol邻硝基苯酚。
首先采用实施例1-2中获得β-Gal-LEH的方法，除不添加ELP(VPGVG)50外其他步骤均不变来获得β-Gal-LH，并将其作为对照组。
将90 μL ONPG加入到400 μL NaAc-HAc缓冲液（50 mM, pH7.5）中，在40 ℃水浴10分钟，然后分别加入10 μL β-Gal-LEH溶液和β-Gal-LH溶液，反应 10分钟后加入500μL 1 MNa2CO3溶液终止反应。然后测定溶液的吸光度和酶活性。
将相同质量的β-Gal-LEH酶和β-Gal-LH酶分别与50 mM NaAc-HAc （pH7.5）缓冲液在20、25、30、35、40、45、50、55、60、70 ℃中预热10 min，加入一定体积的底物ONPG（终浓度是10 mM）在各自温度中反应10 min，通过上述方法检测β-Gal-LEH和β-Gal-LH酶活。以反应中最大酶活为100%，其它酶活与其作百分比，绘制温度相对酶活性的图。图4（A）为β-Gal-LEH和β-Gal-LH在不同温度下水解乳糖的效率，从图中可以看出，测定的温度范围内，β-Gal-LEH比β-Gal-LH更加稳定。
将相同质量的β-Gal-LEH酶和β-Gal-LH酶分别与不同pH值（4.0-9.0）的50 mMNaAc-HAc缓冲液40 ℃中预热10 min，加入终浓度是10 mM底物ONP反应10 min，通过上述方法测定β-Gal-LEH和β-Gal-LH酶活。以反应中最大酶活为100%，其它酶活与其作百分比，绘制pH相对酶活性的图。图4（B）为β-Gal-LEH和β-Gal-LH在不同pH下水解乳糖的效率，从图中可以看出，同时在测定的ｐＨ范围内，β-Gal-LEH同样比β-Gal-LH更加稳定。
实施例5：热和储存稳定性
将等量实施例3中获得的β-Gal-LEH和实施例4中得到的β-Gal-LH在不同温度（20-70℃）中放置30 分钟。按实施例4所述方法测定酶活，以最高点酶活作为100%，其它酶活值与最高点酶活值作比较，绘制不同温度对相对活性的曲线。图5（A）为β-Gal-LEH和β-Gal-LH的热稳定性图，即β-Gal-LEH和β-Gal-LH在不同温度下的相对酶活，从图中可以看出，当温度升高到50 ℃时，β-Gal-LH酶活性只有15%，β-Gal-LEH酶仍可以保持80%活性，由此可以得出，本发明所制备的β-Gal-LEH具有良好的热稳定性。
本实施例中还考察了β-Gal-LEH和β-Gal-LH的储存稳定性。将β-Gal-LEH和β-Gal-LH酶各准备两份，一份存放在4 ℃，另一份25 ℃中保存，然后分别在储存0、4、8、12、16、20、24天时按照实施例4所述方法检测酶活，并以最高点酶活为100%，其它酶活与最高点酶活作比较，同时绘制时间对相对酶活的曲线。图5（B）为β-Gal-LEH和β-Gal-LH的储存稳定性图，即β-Gal-LEH和β-Gal-LH在储存不同天数时的相对酶活，从图中可以看出不管是在4 ℃下还是在25 ℃下条件下，β-Gal-LEH酶的活性均高于β-Gal-LH酶活性。
综上，β-Gal-LEH酶的热和储存稳定性都明显高于β-Gal-LH酶。
本发明所述的改造后的酶的热和储存稳定性显著提高，同时可以简单、快速、高效地自我分离纯化。结果表明，这种策略可以广泛应用于酶学性质的改进，加速了酶在工业生产中的应用，具有重要的社会意义。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种重组β—半乳糖苷酶及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 953
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Tyr Asn Leu Ser Arg Gly Ile Thr Met Thr Gln Leu Lys Arg Phe
1 5 10 15
Leu Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp Pro Glu Asp Thr Trp
20 25 30
Ser Glu Asp Ile Lys Val Phe Lys Lys Ala Asp Leu Asn Ser Ala Thr
35 40 45
Ile Asn Val Phe Ser Trp Ser Leu Leu Glu Ser Arg Glu Gly Gln Tyr
50 55 60
Asp Phe Ser Lys Leu Asp Arg Ile Ile Gln Glu Leu Ser Asp Ala Asn
65 70 75 80
Phe Asp Ile Val Leu Ala Thr Ser Thr Ala Ala Met Pro Ala Trp Met
85 90 95
Phe Lys Lys Tyr Pro Asp Val Ala Arg Val Asp Tyr Gln Gly Arg Arg
100 105 110
His Val Phe Gly Ala Arg His Asn Phe Cys Pro Asn Ser Lys Asn Tyr
115 120 125
Gln Val Leu Ala Ser Lys Leu Val Glu Lys Ile Ala Glu Arg Tyr Ser
130 135 140
Asn Lys Pro His Ile Ala Val Trp His Val Asn Asn Glu Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Asn Cys Tyr Cys Glu Asn Cys Gln Asn Ala Phe Arg Thr Trp Leu Lys
165 170 175
Ser Lys Tyr Gln Thr Leu Asp Asn Leu Asn Glu Ala Trp Asn Met Asn
180 185 190
Val Trp Ser His Thr Ile His Asp Trp Asp Gln Ile Val Val Pro Asn
195 200 205
Glu Leu Gly Asp Ala Trp Gly Pro Glu Gly Ser Glu Thr Ile Val Ala
210 215 220
Gly Leu Ser Ile Asp Tyr Leu Arg Phe Gln Ser Asp Ser Leu Gln Asn
225 230 235 240
Leu Phe Gln Met Glu Lys Ser Ile Ile Lys Lys Tyr Asp Thr Asn Thr
245 250 255
Pro Val Thr Thr Asn Phe His Gly Leu Pro Asn Lys Met Val Asp Tyr
260 265 270
Gln Lys Trp Ala Lys Asp Gln Asp Ile Ile Ser Tyr Asp Ser Tyr Pro
275 280 285
Thr Tyr Asp Ala Pro Lys Tyr Leu Pro Ala Phe Leu Tyr Asp Leu Met
290 295 300
Arg Ser Leu Lys His Gln Pro Phe Met Leu Met Glu Ser Ala Pro Ser
305 310 315 320
Gln Val Asn Trp Gln Pro Tyr Ser Pro Leu Lys Arg Pro Gly Gln Met
325 330 335
Ala Ala Thr Glu Leu Gln Ala Val Ala His Gly Ala Asp Thr Val Gln
340 345 350
Phe Phe Gln Leu Lys Gln Ala Val Gly Gly Ser Glu Lys Phe His Ser
355 360 365
Ala Val Ile Ala His Ser Gln Arg Thr Asp Thr Arg Val Phe His Glu
370 375 380
Leu Glu Asp Leu Gly Lys Lys Leu Lys Lys Ile Gly Pro Thr Val Leu
385 390 395 400
Gly Ser Lys Thr Lys Ala Arg Ala Ala Ile Val Phe Asp Trp Asp Asn
405 410 415
Phe Trp Ser Tyr Glu Tyr Val Asp Gly Ile Ser Gln Asp Phe Asn Tyr
420 425 430
Met Glu Ser Ile Leu Asp Tyr Tyr Arg Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Ile
435 440 445
Pro Thr Asp Val Ile Ser Val Asp Asp Asp Phe Ser Gln Tyr Asp Leu
450 455 460
Val Val Ala Pro Val Leu Tyr Met Val Lys Ala Gly Leu Ser Lys Lys
465 470 475 480
Ile Asn Ala Tyr Val Lys Asn Gly Gly Asn Phe Val Thr Thr Tyr Met
485 490 495
Ser Gly Met Val Asn Asn Ser Asp Asn Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Pro
500 505 510
Gly Pro Leu Lys Asp Val Met Gly Ile Trp Val Glu Glu Ser Asp Ala
515 520 525
Ile Val Pro Gly His Lys Thr Ile Val Ser Leu Asn Gly Lys Asp Tyr
530 535 540
Lys Ala Gly Leu Val Cys Asp Leu Ile His Pro Glu Asn Ala Lys Val
545 550 555 560
Leu Ala Lys Tyr Ser Asn Glu Phe Tyr Ala Gly Thr Ala Ala Asp Thr
565 570 575
Glu Asn Lys Tyr Gly Gln Gly Lys Ala Trp Tyr Val Gly Thr Lys Leu
580 585 590
Asp His Ile Gly Leu Thr Gln Leu Phe Asn His Ile Val Leu Thr Ala
595 600 605
Asn Val Glu Ser Leu Val Gly Asp Ser His Lys Leu Glu Val Thr Lys
610 615 620
Arg Val Thr Gln Ser Gly Gln Glu Leu Tyr Phe Val Leu Asn Met Ser
625 630 635 640
Asn Glu Glu Arg Lys Leu Pro Gln Lys Phe Val Glu Tyr Gln Asn Ile
645 650 655
Leu Thr Gly Gln Gln Ala His Asp Gln Met Lys Ala Trp Asp Val Gln
660 665 670
Ile Leu Val Lys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
690 695 700
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
705 710 715 720
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
725 730 735
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
740 745 750
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
755 760 765
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
770 775 780
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
785 790 795 800
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
805 810 815
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
820 825 830
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
835 840 845
Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
850 855 860
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
865 870 875 880
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
885 890 895
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
900 905 910
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
915 920 925
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
930 935 940
Gly Lys Leu His His His His His His
945 950
<210> 2
<211> 2859
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtacaatt taagtagagg aattacaatg acacagttaa aacgtttttt atatggtggg 60
gactataacc cagatcaatg gccagaagac acttggtcag aagatattaa agtttttaaa 120
aaagcggatt taaattctgc tacaattaat gttttttctt ggagtttgct tgagtcaaga 180
gaaggccaat atgatttttc aaaattagat agaattattc aagaattgtc tgatgcaaat 240
tttgatattg tacttgctac ttctactgct gcgatgccag cttggatgtt taaaaaatac 300
cctgacgtag cgcgagttga ttatcaagga cggcggcatg tctttggcgc acgacataac 360
ttttgcccca atagtaagaa ttatcaagtt ttagctagta aattagtcga gaaaattgcc 420
gaaagatata gtaataaacc tcatattgct gtttggcatg tgaataatga atatggcggc 480
aattgctact gtgaaaattg tcaaaatgct tttcgtactt ggctcaagag taaatatcaa 540
acactagata acctgaatga ggcctggaat atgaatgtgt ggagccatac tattcatgat 600
tgggatcaga ttgttgttcc taatgagtta ggagacgcct ggggaccaga aggtagcgaa 660
accattgttg ccggtttatc aattgattat ttacgttttc aatctgatag tttacaaaat 720
ctttttcaga tggaaaaatc aattattaaa aagtatgata ctaacactcc tgtaactact 780
aatttccatg gtttaccaaa taagatggtt gattatcaaa aatgggctaa agatcaagat 840
attatttctt atgattctta cccaacctac gatgcaccta agtatttacc agcatttttg 900
tatgacttaa tgcgtagttt aaagcatcag ccatttatgt tgatggaatc tgcaccgtct 960
caagtcaatt ggcaaccata tagcccgctg aaaagaccag ggcagatggc agccacggaa 1020
ttgcaagcag ttgctcatgg tgcagatacg gttcagtttt tccaattaaa acaagcagta 1080
ggcggctcag aaaagttcca tagtgccgta attgcccact cacaaagaac cgacacgagg 1140
gtctttcatg aactagaaga tttgggtaaa aaattaaaaa agattggccc aactgtttta 1200
ggctctaaaa ctaaggctag agctgctatt gtatttgatt gggataactt ctggtcatat 1260
gagtacgttg acggtattag tcaagatttt aattatatgg aatcaatctt ggattattat 1320
cgccaatttt atgaacgcaa tattccgaca gatgtaatta gtgtcgatga tgattttagt 1380
caatatgatt tagtagttgc tcctgtttta tatatggtta aagcagggct aagcaaaaaa 1440
attaatgctt atgtcaaaaa tggtggcaac tttgtcacta cctatatgtc tggaatggtt 1500
aacaatagtg ataatgtcta tcttggtggc tatcctggcc cgttaaaaga cgttatgggt 1560
atttgggttg aagaaagtga tgcaattgta ccaggacata agacaattgt ttcactaaat 1620
ggcaaggatt ataaagcggg tttggtttgt gacttgattc atccagaaaa tgcaaaagtt 1680
ttagcaaagt actccaatga gttttatgca ggaacggctg cagacacgga aaataaatat 1740
ggtcaaggta aggcctggta tgttggtact aagttggatc acattgggtt gacgcagcta 1800
ttcaaccata ttgttttgac agctaacgtt gaatcattgg tgggcgacag tcataagtta 1860
gaagttacta agcgagttac tcagtctggg caagaattat actttgtttt aaatatgagt 1920
aatgaagaaa gaaaattgcc acaaaaattt gtagagtatc aaaatatttt aactggtcag 1980
caagctcatg atcaaatgaa ggcatgggat gtacaaatac ttgttaaagc tagcggtggc 2040
ggagggtctg gtggcggagg gtccggtggc ggagggtcag agctcgtacc gggtgtgggt 2100
gttcctggcg tgggtgttcc gggcgtaggt gtcccaggtg tgggcgtacc gggcgttggt 2160
gttcctggtg tcggcgtacc gggcgtgggt gtaccaggtg tgggcgttcc gggtgtgggc 2220
gtgccgggcg tgggcgtacc gggtgtgggt gttcctggcg tgggtgttcc gggcgtaggt 2280
gtcccaggtg tgggcgtacc gggcgttggt gttcctggtg tcggcgtgcc gggcgtgggt 2340
gtaccaggtg tgggcgttcc gggtgtgggc gtgccgggcg tgggcgtacc gggtgtgggt 2400
gttcctggcg tgggtgttcc gggcgtaggt gtcccaggtg tgggcgtacc gggcgttggt 2460
gttcctggtg tcggcgtacc gggcgtgggt gtaccaggtg tgggcgttcc gggtgtgggc 2520
gtgccgggcg tgggcgtacc gggtaaaggt gttcctggcg tgggtgttcc gggcgtaggt 2580
gtcccaggtg tgggcgtacc gggcgttggt gttcctggtg tcggcgtgcc gggcgtgggt 2640
gtaccaggtg tgggcgttcc gggtgtgggc gtgccgggcg tgggcgtacc gggtgtgggt 2700
gttcctggcg tgggtgttcc gggcgtaggt gtcccaggtg tgggcgtacc gggcgttggt 2760
gttcctggtg tcggcgtacc gggcgtgggt gtaccaggtg tgggcgttcc gggtgtgggc 2820
gtgccgggcg tgggcaagct tcatcaccat catcatcac 2859
<210> 3
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaccgggtg tgggtgttcc tggcgtgggt gttccgggcg taggtgtccc aggtgtgggc 60
gtaccgggcg ttggtgttcc tggtgtcggc gtaccgggcg tgggtgtacc aggtgtgggc 120
gttccgggtg tgggcgtgcc gggcgtgggc gtaccgggtg tgggtgttcc tggcgtgggt 180
gttccgggcg taggtgtccc aggtgtgggc gtaccgggcg ttggtgttcc tggtgtcggc 240
gtgccgggcg tgggtgtacc aggtgtgggc gttccgggtg tgggcgtgcc gggcgtgggc 300
gtaccgggtg tgggtgttcc tggcgtgggt gttccgggcg taggtgtccc aggtgtgggc 360
gtaccgggcg ttggtgttcc tggtgtcggc gtaccgggcg tgggtgtacc aggtgtgggc 420
gttccgggtg tgggcgtgcc gggcgtgggc gtaccgggta aaggtgttcc tggcgtgggt 480
gttccgggcg taggtgtccc aggtgtgggc gtaccgggcg ttggtgttcc tggtgtcggc 540
gtgccgggcg tgggtgtacc aggtgtgggc gttccgggtg tgggcgtgcc gggcgtgggc 600
gtaccgggtg tgggtgttcc tggcgtgggt gttccgggcg taggtgtccc aggtgtgggc 660
gtaccgggcg ttggtgttcc tggtgtcggc gtaccgggcg tgggtgtacc aggtgtgggc 720
gttccgggtg tgggcgtgcc gggcgtgggc 750
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggcggag ggtctggtgg cggagggtcc ggtggcggag ggtca 45
<210> 5
<211> 676
<212> PRT
<213> Lactobacillus sp. B164
<400> 5
Met Tyr Asn Leu Ser Arg Gly Ile Thr Met Thr Gln Leu Lys Arg Phe
1 5 10 15
Leu Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp Pro Glu Asp Thr Trp
20 25 30
Ser Glu Asp Ile Lys Val Phe Lys Lys Ala Asp Leu Asn Ser Ala Thr
35 40 45
Ile Asn Val Phe Ser Trp Ser Leu Leu Glu Ser Arg Glu Gly Gln Tyr
50 55 60
Asp Phe Ser Lys Leu Asp Arg Ile Ile Gln Glu Leu Ser Asp Ala Asn
65 70 75 80
Phe Asp Ile Val Leu Ala Thr Ser Thr Ala Ala Met Pro Ala Trp Met
85 90 95
Phe Lys Lys Tyr Pro Asp Val Ala Arg Val Asp Tyr Gln Gly Arg Arg
100 105 110
His Val Phe Gly Ala Arg His Asn Phe Cys Pro Asn Ser Lys Asn Tyr
115 120 125
Gln Val Leu Ala Ser Lys Leu Val Glu Lys Ile Ala Glu Arg Tyr Ser
130 135 140
Asn Lys Pro His Ile Ala Val Trp His Val Asn Asn Glu Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Asn Cys Tyr Cys Glu Asn Cys Gln Asn Ala Phe Arg Thr Trp Leu Lys
165 170 175
Ser Lys Tyr Gln Thr Leu Asp Asn Leu Asn Glu Ala Trp Asn Met Asn
180 185 190
Val Trp Ser His Thr Ile His Asp Trp Asp Gln Ile Val Val Pro Asn
195 200 205
Glu Leu Gly Asp Ala Trp Gly Pro Glu Gly Ser Glu Thr Ile Val Ala
210 215 220
Gly Leu Ser Ile Asp Tyr Leu Arg Phe Gln Ser Asp Ser Leu Gln Asn
225 230 235 240
Leu Phe Gln Met Glu Lys Ser Ile Ile Lys Lys Tyr Asp Thr Asn Thr
245 250 255
Pro Val Thr Thr Asn Phe His Gly Leu Pro Asn Lys Met Val Asp Tyr
260 265 270
Gln Lys Trp Ala Lys Asp Gln Asp Ile Ile Ser Tyr Asp Ser Tyr Pro
275 280 285
Thr Tyr Asp Ala Pro Lys Tyr Leu Pro Ala Phe Leu Tyr Asp Leu Met
290 295 300
Arg Ser Leu Lys His Gln Pro Phe Met Leu Met Glu Ser Ala Pro Ser
305 310 315 320
Gln Val Asn Trp Gln Pro Tyr Ser Pro Leu Lys Arg Pro Gly Gln Met
325 330 335
Ala Ala Thr Glu Leu Gln Ala Val Ala His Gly Ala Asp Thr Val Gln
340 345 350
Phe Phe Gln Leu Lys Gln Ala Val Gly Gly Ser Glu Lys Phe His Ser
355 360 365
Ala Val Ile Ala His Ser Gln Arg Thr Asp Thr Arg Val Phe His Glu
370 375 380
Leu Glu Asp Leu Gly Lys Lys Leu Lys Lys Ile Gly Pro Thr Val Leu
385 390 395 400
Gly Ser Lys Thr Lys Ala Arg Ala Ala Ile Val Phe Asp Trp Asp Asn
405 410 415
Phe Trp Ser Tyr Glu Tyr Val Asp Gly Ile Ser Gln Asp Phe Asn Tyr
420 425 430
Met Glu Ser Ile Leu Asp Tyr Tyr Arg Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Ile
435 440 445
Pro Thr Asp Val Ile Ser Val Asp Asp Asp Phe Ser Gln Tyr Asp Leu
450 455 460
Val Val Ala Pro Val Leu Tyr Met Val Lys Ala Gly Leu Ser Lys Lys
465 470 475 480
Ile Asn Ala Tyr Val Lys Asn Gly Gly Asn Phe Val Thr Thr Tyr Met
485 490 495
Ser Gly Met Val Asn Asn Ser Asp Asn Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Pro
500 505 510
Gly Pro Leu Lys Asp Val Met Gly Ile Trp Val Glu Glu Ser Asp Ala
515 520 525
Ile Val Pro Gly His Lys Thr Ile Val Ser Leu Asn Gly Lys Asp Tyr
530 535 540
Lys Ala Gly Leu Val Cys Asp Leu Ile His Pro Glu Asn Ala Lys Val
545 550 555 560
Leu Ala Lys Tyr Ser Asn Glu Phe Tyr Ala Gly Thr Ala Ala Asp Thr
565 570 575
Glu Asn Lys Tyr Gly Gln Gly Lys Ala Trp Tyr Val Gly Thr Lys Leu
580 585 590
Asp His Ile Gly Leu Thr Gln Leu Phe Asn His Ile Val Leu Thr Ala
595 600 605
Asn Val Glu Ser Leu Val Gly Asp Ser His Lys Leu Glu Val Thr Lys
610 615 620
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625 630 635 640
Asn Glu Glu Arg Lys Leu Pro Gln Lys Phe Val Glu Tyr Gln Asn Ile
645 650 655
Leu Thr Gly Gln Gln Ala His Asp Gln Met Lys Ala Trp Asp Val Gln
660 665 670
Ile Leu Val Lys
675
<210> 6
<211> 2031
<212> DNA
<213> Lactobacillus sp. B164
<400> 6
atgtacaatt taagtagagg aattacaatg acacagttaa aacgtttttt atatggtggg 60
gactataacc cagatcaatg gccagaagac acttggtcag aagatattaa agtttttaaa 120
aaagcggatt taaattctgc tacaattaat gttttttctt ggagtttgct tgagtcaaga 180
gaaggccaat atgatttttc aaaattagat agaattattc aagaattgtc tgatgcaaat 240
tttgatattg tacttgctac ttctactgct gcgatgccag cttggatgtt taaaaaatac 300
cctgacgtag cgcgagttga ttatcaagga cggcggcatg tctttggcgc acgacataac 360
ttttgcccca atagtaagaa ttatcaagtt ttagctagta aattagtcga gaaaattgcc 420
gaaagatata gtaataaacc tcatattgct gtttggcatg tgaataatga atatggcggc 480
aattgctact gtgaaaattg tcaaaatgct tttcgtactt ggctcaagag taaatatcaa 540
acactagata acctgaatga ggcctggaat atgaatgtgt ggagccatac tattcatgat 600
tgggatcaga ttgttgttcc taatgagtta ggagacgcct ggggaccaga aggtagcgaa 660
accattgttg ccggtttatc aattgattat ttacgttttc aatctgatag tttacaaaat 720
ctttttcaga tggaaaaatc aattattaaa aagtatgata ctaacactcc tgtaactact 780
aatttccatg gtttaccaaa taagatggtt gattatcaaa aatgggctaa agatcaagat 840
attatttctt atgattctta cccaacctac gatgcaccta agtatttacc agcatttttg 900
tatgacttaa tgcgtagttt aaagcatcag ccatttatgt tgatggaatc tgcaccgtct 960
caagtcaatt ggcaaccata tagcccgctg aaaagaccag ggcagatggc agccacggaa 1020
ttgcaagcag ttgctcatgg tgcagatacg gttcagtttt tccaattaaa acaagcagta 1080
ggcggctcag aaaagttcca tagtgccgta attgcccact cacaaagaac cgacacgagg 1140
gtctttcatg aactagaaga tttgggtaaa aaattaaaaa agattggccc aactgtttta 1200
ggctctaaaa ctaaggctag agctgctatt gtatttgatt gggataactt ctggtcatat 1260
gagtacgttg acggtattag tcaagatttt aattatatgg aatcaatctt ggattattat 1320
cgccaatttt atgaacgcaa tattccgaca gatgtaatta gtgtcgatga tgattttagt 1380
caatatgatt tagtagttgc tcctgtttta tatatggtta aagcagggct aagcaaaaaa 1440
attaatgctt atgtcaaaaa tggtggcaac tttgtcacta cctatatgtc tggaatggtt 1500
aacaatagtg ataatgtcta tcttggtggc tatcctggcc cgttaaaaga cgttatgggt 1560
atttgggttg aagaaagtga tgcaattgta ccaggacata agacaattgt ttcactaaat 1620
ggcaaggatt ataaagcggg tttggtttgt gacttgattc atccagaaaa tgcaaaagtt 1680
ttagcaaagt actccaatga gttttatgca ggaacggctg cagacacgga aaataaatat 1740
ggtcaaggta aggcctggta tgttggtact aagttggatc acattgggtt gacgcagcta 1800
ttcaaccata ttgttttgac agctaacgtt gaatcattgg tgggcgacag tcataagtta 1860
gaagttacta agcgagttac tcagtctggg caagaattat actttgtttt aaatatgagt 1920
aatgaagaaa gaaaattgcc acaaaaattt gtagagtatc aaaatatttt aactggtcag 1980
caagctcatg atcaaatgaa ggcatgggat gtacaaatac ttgttaaata a 2031

Claims (8)

1.一种重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH，其特征在于，所述β-Gal-LEH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将β-Gal与ELP(VPGVG)50通过接头Linker连接，并且在ELP (VPGVG)50的C段增加6x-His标签，得到重组β—半乳糖苷酶β-Gal-Linker-ELP-6x-His，将其简称为β-Gal-LEH。
3.根据权利要求2所述的重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH的构建方法，其特征在于，所述ELP(VPGVG)50为五肽序列Val-Pro-Gly-Val-Gly重复50次，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述接头Linker为连接肽(GGGGS)3，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种重组表达质粒pET28a（+）-β-Gal-LEH。
5.一种含有权利要求4所述重组表达质粒的重组菌。
6.一种制备重组β- 半乳糖苷酶的方法，其特征在于，所述方法为发酵培养上述重组菌，得到β- 半乳糖苷酶。
7.权利要求1所述重组β- 半乳糖苷酶的纯化方法，其特征在于，采用浓度为1.5-2.0 M的(NH4)2SO4进行可逆相变循环纯化。
8.权利要求1所述重组β—半乳糖苷酶β-Gal-LEH在水解乳糖中的用途。
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