CN102559571A - 可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌及构建方法和应用，属于应用微生物技术领域。该重组菌能表达生产热稳定性β-半乳糖苷酶，其分类命名为为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli.）BL21-LA1，已于2011年7月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.5097。 本发明重组菌表达分泌的热稳定β-半乳糖苷酶存在多方面的优势：1、其最适反应温度高达75℃，反应范围非常广泛，在50-90℃均能发挥良好的酶活力；2、其适应pH值的范围较宽（pH5.0-9.0）；3、其对去污剂、抑制剂及金属离子的耐受性强。

Description

可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及应用微生物技术领域，具体涉及一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌及构建方法和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶(lactase)， 该酶不仅能催化水解半乳糖苷键，将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，同时具有转移半乳糖苷的作用，可以生成低聚半乳糖，主要用于乳制品的加工。

β-半乳糖苷酶主要来源于动物、植物、细菌、酵母、霉菌。国外已经商品化的β-半乳糖苷酶主要来源于大肠杆菌、黑曲霉、米曲霉、酵母、乳酸杆菌等。目前，仅来源与微生物的β-半乳糖苷酶具有工业应用价值。利用微生物发酵法制取β-半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。该酶可广泛应用于食品加工、医药、免疫、环境检测等各个领域。

世界上平均约70%-90%的成年人（尤其是非洲人和亚洲人）喝牛奶后因缺乏β-半乳糖苷酶不能降解牛奶中大量的乳糖而产生乳糖不耐受。而在低乳糖乳制品中，β-半乳糖苷酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，可将乳糖含量降低70%-80%，可以减轻乳糖不耐受症状；还可以增加乳制品甜度，减少甜味剂的用量；防止乳制品的加工时结晶析出，影响产品质量；以牛乳或乳清中的乳糖为底物，经β-半乳糖苷酶催化可生成低聚半乳糖，低聚半乳糖的甜度为蔗糖的20%-40%，热稳定较好，在酸性条件下课作为双歧杆菌增殖因子，促进钙质吸收和有机酸生成、减低肠道pH、抑制外源菌生长和改善脂质代谢。β-半乳糖苷酶还可以用于酶免疫分析，具有无内源性干扰， 底物无致癌性和显色稳定的优点；β-半乳糖苷酶与荧光底物相结合可作超微量荧光酶联免；对微量激素、药物的定量分析，以及病毒、单克隆抗体等测定表明，乳糖酶具有灵敏的特点；乳清中含有乳糖，当乳清大量排放时会造成环境污染，用乳糖酶处理乳清，不但可生产食品添加剂（甜味剂、蛋白资源），易消化吸收的禽饲料和发酵原料（发酵生产酒精、乳酸、酶制剂等），而且还可解决乳清大量排放造成的环境污染问题。

一般而言，工业上所产生的酶大多数都反应温度较低，热稳定性不好，在乳制品生产应用中有一定局限性。而耐热β-半乳糖苷酶的热稳定性好，能在较高温度下作用，这样可以提高底物的浓度并能减少其它微生物的生产机会，对固定化酶很重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌，该重组菌能表达生产热稳定性β-半乳糖苷酶。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组菌的构建方法。

本发明最后解决的技术问题是提供上述重组菌在生产耐热β-半乳糖苷酶上的应用。

为了解决上述问题，本发明首先提供了一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.）BL21-LA1，已于2011年7月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5097。

所述的可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：用同样的限制性内切酶双酶切表达载体PGEX-4T-2和β-半乳糖苷酶基因后，将β-半乳糖苷酶基因克隆到表达载体PGEX-4T-2中，将其转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒，然后采用双酶切和测序的方法鉴定。

所述β-半乳糖苷酶基因来自嗜热厌氧菌群。

本发明还提供了一种利用所述的重组菌表达耐热β-半乳糖苷酶的方法，以IPTG为诱导剂培养重组菌BL21-LA1产酶，每100ml发酵液培养菌体生长至OD ₆₀₀达到0.8后，加入 IPTG， 使其终浓度达为1 m mol/L， 37℃振荡培养4-6 h，诱导重组蛋白获得表达。

本发明获得了一株可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌，所述重组菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.）BL21-LA1，已于2011年7月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 5097。该重组菌在含有100 mg/mL 氨苄青霉素的2×YT液体培养基中于37℃培养，经 IPTG诱导可获得目的蛋白的高效表达。经纯化处理得到的热稳定β-半乳糖苷酶对底物ONPG的降解表现出很高的效率。

    本发明重组菌表达分泌的热稳定β-半乳糖苷酶存在多方面的优势：1、其最适反应温度高达75℃，反应范围非常广泛，在50-90℃均能发挥良好的酶活力；2、其适应pH值的范围较宽（pH5.0-9.0）；3、其对去污剂、抑制剂及金属离子的耐受性强。

附图说明

图1为热稳定性β-半乳糖苷酶：基因克隆；A：β-半乳糖苷酶基因PCR扩增；B：重组质粒双酶切验证（BamHI/Xho I），其中泳道1-10分别表示随机挑取的10个重组克隆子的质粒DNA酶切图。

图2 为热稳定性β-半乳糖苷酶在大肠杆菌表达系统中的表达；M：protein marker; 1:未经IPTG诱导的非重组菌；2：经IPTG诱导的非重组菌；3：未经IPTG诱导的重组菌；4：经IPTG诱导的重组菌；5：纯化的GST－β-半乳糖苷酶融合蛋白。

图3为温度对重组β-半乳糖苷酶酶活和热稳定的影响；A，最适反应温度；B，热稳定性。

图4 为pH值对重组β-半乳糖苷酶酶活的影响。

图5为金属离子对重组β-半乳糖苷酶酶活的影响。

图6为酶抑制剂和去污剂对重组β-半乳糖苷酶酶活的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等所著的《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1. 

菌群总DNA的提取及耐热β-半乳糖苷酶基因的克隆：

用改进的CTAB/NaCl法提取从永泰热泉中富集得到的菌群YTY-70（用深水采样器采取70℃温泉2-3米处的深层水样，样品立即封存于厌氧瓶中，冷藏处理。以Hugate厌氧培养法以1%的接种量加入到100 mL的富集培养基中，一周后换到筛选培养基中，转接15代，使得利用纤维素的相关菌群富集，得到菌群YTY-70）的总DNA,采用下列简并引物：GlaF ：5'-ATG AGT TTT(A,C) CCA AAA GGA TT-3'，GlaR ：5'-TTA C(T)GA G(A)TT TTC CTT TAT AT-3'扩增热稳定性β-半乳糖苷酶酶的基因。PCR反应体系如下：95℃，5 min；再30个循环：95℃，1 min；57℃，1 min， 72℃  2 min；最后72℃延伸10 min。如附图1（A）所示，PCR所得产物经1%琼脂糖电泳验证得到一个约1400bp的DNA片段，并经测序所得该β-半乳糖苷酶的基因序列如序列表SEQ NO. 1所示。

实施例2. 

耐热β-半乳糖苷酶重组工程菌构建：

将表达载体pGEX-4T-2用BamHI和Xho I进行双酶切，37℃酶切3h。琼脂糖凝胶回收大片段。将用实施例1扩增的目的片段也同样用BamHI和Xho I进行双酶切，琼脂糖凝胶回收目的基因片段。将回收得到的β-半乳糖苷酶的基因片段与表达载体PGEX-4T-2连接，转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含Amp100ug/ml的LB平板上，挑取10个阳性重组克隆子，至含Amp100ug/ml的新鲜LB培养基中并提取质粒。然后采用双酶切和测序的方法鉴定目的基因是否成功插入。将成功插入目的片段的克隆子质粒再次送出测序。

结果如图1（B）所示，在随机挑取的10个克隆子中，有9个成功插入β-半乳糖苷酶基因序列，插入成功率为90%。由测序结果得知，重组β-半乳糖苷酶基因的长度为1359bp，含有一个编码452个氨基酸的阅读框，其氨基酸序列见序列表SEQ NO. 2。

实施例3.

重组耐热β-半乳糖苷酶的表达及纯化：

⑴      挑取含有重组质粒（含耐热β-半乳糖苷酶基因）的单菌落，接种于2×YT培养基中，37℃，250 rmp培养过夜。过夜菌按1％接种量转接至装有新鲜的100mL含有100 mg/mLAmp的 2×YT液体培养基中，37℃，250 rpm，培养至OD₆₀₀为0.8。加入 IPTG, 使其终浓度达为1 m mol/L,37℃振荡培养4-6 h,使诱导重组蛋白获得表达。

⑵      培养液于4℃，10000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，置于冰上。收集诱导表达的菌体。

⑶      按每mL培养物加入冰冷的10 ml PBS缓冲液。冰浴条件下超声裂解细菌，超声波条件：150W，工作10 s，间隔10 s，30次。

⑷      加入20% Triton X-100使其终浓度为1％，轻轻柔和30min。

⑸      4°C，12,000 × g离心10 min，上清转移至冰预冷的容器中。

⑹      上清与预先用PBS缓冲液平衡的Glutathione Sepharose 4B混匀，4°C轻摇30min，装柱。

⑺      用10倍柱床体积的PBS缓冲液洗去杂蛋白，重复操作3-5次。

⑻      用洗脱缓冲液(50 m mol/L Tris-HCl, 10 m mol/L 还原型谷胱甘肽，pH8.0)洗脱目的蛋白，所用的洗脱缓冲液与柱床体积相同。重复洗脱过程三次，合并三次洗脱流出液。

⑼      SDS-PAGE鉴定纯化的融合蛋白。

SDS－PAGE电泳结果（如附图2）表明，与未诱导菌株相比，经过IPTG诱导后的重组菌株在66kDa处出现一条非常明显的蛋白条带（图2，泳道2），此条带的大小符合β-半乳糖苷酶与GST融合蛋白的分子量（26kDa）之和符合。说明该基因成功插入表达载体pGEX-4T-2后在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。

实施例4.

表达纯化得到的重组耐热β-半乳糖苷酶（实施例3纯化的融合蛋白）的性质分析：

重组耐热β-半乳糖苷酶酶活测定方法：将邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液(PH7.0)配制成0.25％的底物溶液。取适当稀释的重组耐热β-半乳糖苷酶液400 ml加入1.6ml底物溶液中，75℃保温10min，加入2 ml l mol/L Na₂CO₃显色，以不加酶液的底物溶液（加入等体积0.1 mol/L磷酸缓冲液(PH7.0)）作为对照，测定420nm光吸收值。计算水解产物邻硝基酚(0NP)的含量, 将测得的数据代入由标准曲线测量值计算出的回归方程，再由回归方程计算出相应的邻硝基酚(0NP)的量，然后计算出酶活力大小。酶活力单位定义：一个酶活单位(u)即在pH7.0，温度75℃条件下，每分钟将0NPG分解为l umol黄色的0NP所需的酶量。

⑴ 重组耐热β-半乳糖苷酶作用的最适温度及温度耐受情况

以0.25％的邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)为底物，在0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中，于不同温度（35-95℃）下反应15min，以不加酶液的底物溶液为对照，测定420nm光吸收值，确定其最适作用温度。

将β-半乳糖苷酶加入到0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中，分别在不同温度 (80℃，85℃，90℃)下，温育30 min后，立即加入含有底物的反应溶液，反应15min，测定残余酶活。

结果附图3(A)显示，重组β-半乳糖苷酶的最适反应温度为75℃。该酶在50℃－90℃范围内均有良好的酶活力。55－80℃温度范围内，酶活力均高于50％。在85℃有38％的酶活力，而在50℃以下时相对酶活力较低。将重组β-半乳糖苷酶分别置于80℃、85℃和90℃温育30min，然后再测酶活力。结果如附图3 (B)所示，重组β-葡萄糖苷酶在80℃、85℃和90℃处理30min后，相比未处理的重组酶，仍分别具有57%、44%、27%的酶活力。由此说明，该重组β-半乳糖苷酶是一种优良的高温酶，反应温度范围比较广泛，具有非常优良的耐热性。

⑵ 重组耐热β-半乳糖苷酶作用的最适pH 

以0.25％的邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)为底物，分别在0.1 mol/L磷酸盐－柠檬酸缓冲液(pH值4-6)、 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7-8)和 0.1 mol/L甘氨酸一氢氧化钠缓冲(pH值9- 11)的缓冲液中，于最适温度下反应30min，以不加酶液的底物溶液为对照，测定420nm光吸收值，确定其最适作用pH。

结果如附图4显示，重组β-葡萄糖苷酶的最适pH值为7.0。在pH5.0-9.0之间，重组β-半乳糖苷酶有良好的酶活力。而当pH小于5.0和大于9.0的情况下，相对酶活力比较低。说明该重组酶适合中性环境。

⑶ 金属离子对重组耐热β-半乳糖苷酶的影响

以0.25％的邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)为底物，在0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中，分别加入终浓度为1mM或10mM的金属离子，以不加金属离子的底物溶液为对照，75℃下反应10min后，测定420nm光吸收值，来评价金属离子对β-半乳糖苷酶的影响。

⑷ 去污剂和抑制剂对重组耐热β-半乳糖苷酶的影响

以0.25％的邻硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)为底物，在0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中，分别加入终浓度为1mM（0.1%）或10mM（1%）的去污剂，以不加去污剂或抑制剂的底物溶液为对照，75℃下反应10min后测定420nm光吸收值，来评价去污剂和抑制剂对β-半乳糖苷酶的影响。

结果如附图5，6显示，大部分金属离子对该重组耐热β-半乳糖苷酶的酶活有一定的促进作用，基本能提高该酶酶活5-8倍，而且浓度为10mM的金属离子溶液比1mM的促进作用更明显。同时酶去污剂或抑制剂对该酶酶活的影响较少，甚至Triton X-100对其酶活有较强的促进作用。由此可得，该重组耐热β-半乳糖苷酶对金属离子、去污剂和抑制剂都有很强的耐受性。

<110>  福建农林大学

 

<120>  可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌及构建方法和应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1359

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgagttttc caaaaggatt tctgtggggt gctgcaactg catcatatca gattgaaggt     60

gcatggaaag aagatggaaa aggcgagtct atttgggaca ggttttctca tcaaaaagga    120

aatattctat acggtcatac aggcgatgtt gcgtgtgacc actaccacag gttcgaagaa    180

gatgttcttc ttatgaaaga gcttggactc aaagcctaca ggttttccat tgcatgggca    240

agaatctttc cagatggcta tggtactgtg aatcagaaag gtcttgagtt ttatgataaa    300

cttataaaca agcttgttga aaacggtatc gaacctgttg tcaccattta tcactgggat    360

cttcctcaaa agctacaaga cattggcggt tgggcaaaca aggaaattgc aaactattac    420

tttgaatatg caatgcttct tataaaccgc tacaaagaca aagtaaaaaa gtggataaca    480

ttcaatgaac cctattgtat tgcatttttg ggtcactggc atggggttca cgcaccagga    540

ataaaagact ttaaagttgc aatagatgtt gtgcacaaca ttatgctttc tcattttaag    600

gttgtaaaag ctgtaaagga aaacaatatt gatgttgaag taggaattac attgaattta    660

accccagtct atcttcagac agagaggctt ggatataagg taagcgaaat tgaaagagaa    720

atggtaaacc tcagcagcca gcttgacaat gaacttttcc ttgatccagt actcaaagga    780

aactatccac aaaagctgtt tgattatctt gttcaaaaag atttgttgga agctcaaaaa    840

gcattgagta tgcagcagga agtaagagaa aatttcattt tccctgattt tctaggtatc    900

aactactaca cacgtgctgt taggctttac gatgaaaatt cttcttggat attcccaata    960

agatgggaac atcctgcagg agaatacact gagatgggct gggaagtatt cccgcaggga   1020

ctttttgatc ttttgatttg gattaaagaa agttacccgc aaattccaat ttatataaca   1080

gaaaacggtg ctgcttataa cgacaaggta gaagatggaa gggttcatga ccaaaagaga   1140

gtggagtatt taaaacagca ctttgaagca gcaagaaagg caattgaaaa tggtgtggat   1200

ttgcgaggct attttgtgtg gtctttgatg gacaatttcg aatgggcaat gggttacaca   1260

aaaaggttcg gaattatata tgtggattat gaaacccaaa agagaattaa aaaagacagc   1320

ttctattttt atcagcagta tataaaggaa aactcataa                          1359

 

<210>  2

<211>  452

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  2

 Met Ser Phe Pro Lys Gly Phe Leu Trp Gly Ala Ala Thr Ala Ser Tyr

1 5 10 15

Gln Ile Glu Gly Ala TrpLys Glu Asp Gly Lys Gly Glu Ser Ile Trp

20 25 30

Asp Arg Phe Ser His Gln Lys Gly Asn Ile Leu Tyr Gly His Thr Gly

35 40 45

Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Arg Phe Glu Glu Asp Val Leu Leu

50 55 60

Met Lys Glu Leu Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ala

65 70 75 80

Arg Ile Phe Pro Asp Gly Tyr Gly Thr Val Asn Gln Lys Gly Leu Glu

85 90 95

Phe Tyr Asp Lys Leu Ile Asn Lys Leu Val Glu Asn Gly Ile Glu Pro

100 105 110

Val Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Lys Leu Gln Asp Ile

115 120 125

Gly Gly Trp Ala Asn Lys Glu Ile Ala Asn Tyr Tyr Phe Glu Tyr Ala

130 135 140

Met Leu Leu Ile Asn Arg Tyr Lys Asp Lys Val Lys Lys Trp Ile Thr

145 150 155 160

Phe Asn Glu Pro Tyr Cys Ile Ala Phe Leu Gly His Trp His Gly Val

165 170 175

His Ala Pro Gly Ile Lys Asp Phe Lys Val Ala Ile Asp Val Val His

180 185 190

Asn Ile Met Leu Ser His Phe Lys Val Val Lys Ala Val Lys Glu Asn

195 200 205

Asn Ile Asp Val Glu Val Gly Ile Thr Leu Asn Leu Thr Pro Val Tyr

210 215 220

Leu Gln Thr Glu Arg Leu Gly Tyr Lys Val Ser Glu Ile Glu Arg Glu

225 230 235 240

Met Val Asn Leu Ser Ser Gln Leu Asp Asn Glu Leu Phe Leu Asp Pro

245 250 255

Val Leu Lys Gly Asn Tyr Pro Gln Lys Leu Phe Asp Tyr Leu Val Gln

260 265 270

Lys Asp Leu Leu Glu Ala Gln Lys Ala Leu Ser Met Gln Gln Glu Val

275 280 285

Arg Glu Asn Phe Ile Phe Pro Asp Phe Leu Gly Ile Asn Tyr Tyr Thr

290 295 300

Arg Ala Val Arg Leu Tyr Asp Glu Asn Ser Ser Trp Ile Phe Pro Ile

305 310 315 320

Arg Trp Glu His Pro Ala Gly Glu Tyr Thr Glu Met Gly Trp Glu Val

325 330 335

Phe Pro Gln Gly Leu Phe Asp Leu Leu Ile Trp Ile Lys Glu Ser Tyr

340 345 350

Pro Gln Ile Pro Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Asn Asp

355 360 365

Lys Val Glu Asp Gly Arg Val His Asp Gln Lys Arg Val Glu Tyr Leu

370 375 380

Lys Gln His Phe Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ile Glu Asn Gly Val Asp

385 390 395 400

Leu Arg Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala

405 410 415

Met Gly Tyr Thr Lys Arg Phe Gly Ile Ile Tyr Val Asp Tyr Glu Thr

420 425 430

Gln Lys Arg Ile Lys Lys Asp Ser Phe Tyr Phe Tyr Gln Gln Tyr Ile

435 440 445

Lys Glu Asn Ser

450

Claims (4)

1.一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.）BL21-LA1，已于2011年7月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5097。

2.一种如权利要求1所述的可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：用同样的限制性内切酶双酶切表达载体PGEX-4T-2和β-半乳糖苷酶基因后，将β-半乳糖苷酶基因克隆到表达载体PGEX-4T-2中，将其转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒，然后采用双酶切和测序的方法鉴定。

3.根据权利要求2所述的可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌的构建方法，其特征在于：所述β-半乳糖苷酶基因来自嗜热厌氧菌群。

4.一种利用权利要求1所述的重组菌表达耐热β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于：以IPTG为诱导剂培养重组菌BL21-LA1产酶，每100ml发酵液培养菌体生长至OD ₆₀₀达到0.8后，加入 IPTG， 使其终浓度达为1 m mol/L， 37℃振荡培养4-6 h，诱导重组蛋白获得表达。

Images