CN113564146A

CN113564146A - 一种耐热β-半乳糖苷酶及其在乳糖降解的应用

Info

Publication number: CN113564146A
Application number: CN202110908856.9A
Authority: CN
Inventors: 何宁宁; 周子涵; 宋静宜
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2021-08-09
Filing date: 2021-08-09
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-08-09
Also published as: CN113564146B

Abstract

本发明涉及一种耐热β‑半乳糖苷酶及其在乳糖降解的应用。所述β‑半乳糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的β‑半乳糖苷酶Gal‑T为结构与功能新颖的乳糖水解酶，其氨基酸序列与已有性质报道的β‑半乳糖苷酶序列相似度仅为75.75％，是一个新酶。本发明所述的β‑半乳糖苷酶产量可达460.4U/mL,最适反应温度为45℃，最适反应PH为7.5。本发明所述的β‑半乳糖苷酶具有耐热性，在40℃‑60℃的温度范围内显示出广泛的温度稳定性。本发明所述的β‑半乳糖苷酶产量大，热稳定性好，具有优良的工业化应用潜质。

Description

一种耐热β-半乳糖苷酶及其在乳糖降解的应用

技术领域

本发明涉及一种耐热β-半乳糖苷酶及其在乳糖降解的应用，属于生物技术领域。

背景技术

乳糖是目前人类营养中常见的一种双糖，它被乳糖酶水解成单糖后可被人体吸收利用。乳糖不耐症是一种由于乳糖消化不良造成的疾病，主要原因是生物体内缺乏乳糖酶或其活性较低。我国成年人乳糖吸收不良的发病率高达86.7％。

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23，乳糖酶)是水解β-D-半乳糖苷键产生游离D-半乳糖的活性酶。其广泛存在于微生物和动植物中，可应用于医药、乳制品、生物和环保领域都有应用。β-半乳糖苷酶还可以用于制造低聚半乳糖(具有半乳糖残基的低聚糖)，同时可以作为乳糖不耐症的潜在治疗选择。目前公认制备乳糖酶比较安全的菌株有米曲霉(Aspergillusoryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxinus)和细菌环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等。目前国内外已经对乳糖酶进行了大量的研究工作，但尚未得到广泛应用，主要原因包括产量低和耐热性差。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型耐热β-半乳糖苷酶Gal-T及其制备方法。本发明的β-半乳糖苷酶Gal-T为结构与功能新颖的乳糖水解酶，其氨基酸序列与已有性质报道的β-半乳糖苷酶序列相似度仅为75.75％，是一个新酶。本发明所述β-半乳糖苷酶Gal-T最适反应温度为45℃，最适反应pH为7.5；其具有耐热性，在40℃-60℃的温度范围内显示出广泛的温度稳定性，利于提高底物的溶解度以及防止杂菌污染。该酶产量大，是用于制造低聚半乳糖的理想选择。

一方面，本发明提供一种新型β-半乳糖苷酶Gal-T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

MINIRWRESLWELIHLIFHGLLKPGETFQTPEVVMVYSDSGLNKMSNTYHKLYRNRLMRSKFKDKERPILINNWEYFDFTEEKLKELAKEAKDLGIELFVLDDGWFGKRNSDNSSLGDWFVNKEKIPSGLDGLAKEINSLGLKFGLWMEPEMVSPDSDLYREHPNWCIHVPNRPRSESRNQLVLDLSRKDVQDYIIKVVSDILESANISYVKWDMNRNMTEIGSALLPPERQRETAHRYILGLYRILEEITTRFPDVLFESCAGGGGRFDPGMLYYMPQTWTSDNTDAVERLKIQYGTSIVYPLISMGSHVSAVPNHQVHRITPLKTRLDVAISGNFGFELDLTKLSEEEKDLAKKYVKKYKEIRKLIQFGDFYRLLSPFEGNETAWMFINEEKTEFVAFYFKVLATPNDTIKRIYLKALNPDYKYALQDTGEVYGGDELMYAGIKATKGDIPQLEGDFQSVMMHFKKEAAKMGRDVLNFNVDWLYIPEDLNDAYKFDFDESNFEVVSLPHANKTFPHHYFKEEDYRFVSWYRKHFKVDERYKGKKVYIHFEGVMTVAKVYVNGEFVGEHKGGYTPFEFDITEYVKYGDFENLIAVQVDSREHKDIPPEGHLVDYMLFGGIYRNVWLKILNDTHIKDVYFVVDKLQNSVAEISITTTIEGKEVRNAKILTEVINKEGVVCSSSVTDVKDMQKEIVQRIKMENPLTWHPDHPYLYNVSVKLVAENEILDNYTFKTGIRTVEFRDDGKFYINGEPLKLRGLNRHQTFPYVGGAMPDRVQRKDADILKYELGLNYVRTSHYPQAVSFLDRCDEIGLLVFEEIPGWQHIGDENWKNIAKENLKEMILRDRNHPCIFMWGVRINESLDDHDFYKEMNEIAHYLHKLDRSRPTGGVRYLRDSEKLEDVFTYNDFIYNLEGKIQLPNHKKYMVTEYMGHMYPTKSYDNLNRLITHARLHALIQDKQYGIPNMAGASGWCAFDYNTTSAFGSGDNICYHGVCDIFRLPKFAAHFYRSQADPHLYGPYVFIASYLIPSFREENGDKLLVFSNCEEIELYINDKFVMKQMPNRVDFPSLPYPPFEFSLNQLGVNYMDMAIKANDVSITAVGLINGKEVARHTTYLRTYGKPDKLILSCDDNEIMADGSDCTRVVVSVVDENGSILPYANIPVSFEIEGEGKLIGENPLALEAGRGAVYVKSTRKPGEIILKAKSHYVAEESSVSIKTNSIGYYQKAHPLGWFFSILILFSNKYWGIKNYQ。

另一方面，本发明还提供一种新型耐热β-半乳糖苷酶Gal-T对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGATTAACATTCGCTGGCGCGAAAGCCTGTGGGAACTGATTCATCTGATTTTTCATGGCCTGCTGAAACCGGGCGAAACCTTTCAGACCCCGGAAGTGGTGATGGTGTATAGCGATAGCGGCCTGAACAAAATGAGCAACACCTATCATAAACTGTATCGCAACCGCCTGATGCGCAGCAAATTTAAAGATAAAGAACGCCCGATTCTGATTAACAACTGGGAATATTTTGATTTTACCGAAGAAAAACTGAAAGAACTGGCGAAAGAAGCGAAAGATCTGGGCATTGAACTGTTTGTGCTGGATGATGGCTGGTTTGGCAAACGCAACAGCGATAACAGCAGCCTGGGCGATTGGTTTGTGAACAAAGAAAAAATTCCGAGCGGCCTGGATGGCCTGGCGAAAGAAATTAACAGCCTGGGCCTGAAATTTGGCCTGTGGATGGAACCGGAAATGGTGAGCCCGGATAGCGATCTGTATCGCGAACATCCGAACTGGTGCATTCATGTGCCGAACCGCCCGCGCAGCGAAAGCCGCAACCAGCTGGTGCTGGATCTGAGCCGCAAAGATGTGCAGGATTATATTATTAAAGTGGTGAGCGATATTCTGGAAAGCGCGAACATTAGCTATGTGAAATGGGATATGAACCGCAACATGACCGAAATTGGCAGCGCGCTGCTGCCGCCGGAACGCCAGCGCGAAACCGCGCATCGCTATATTCTGGGCCTGTATCGCATTCTGGAAGAAATTACCACCCGCTTTCCGGATGTGCTGTTTGAAAGCTGCGCGGGCGGCGGCGGCCGCTTTGATCCGGGCATGCTGTATTATATGCCGCAGACCTGGACCAGCGATAACACCGATGCGGTGGAACGCCTGAAAATTCAGTATGGCACCAGCATTGTGTATCCGCTGATTAGCATGGGCAGCCATGTGAGCGCGGTGCCGAACCATCAGGTGCATCGCATTACCCCGCTGAAAACCCGCCTGGATGTGGCGATTAGCGGCAACTTTGGCTTTGAACTGGATCTGACCAAACTGAGCGAAGAAGAAAAAGATCTGGCGAAAAAATATGTGAAAAAATATAAAGAAATTCGCAAACTGATTCAGTTTGGCGATTTTTATCGCCTGCTGAGCCCGTTTGAAGGCAACGAAACCGCGTGGATGTTTATTAACGAAGAAAAAACCGAATTTGTGGCGTTTTATTTTAAAGTGCTGGCGACCCCGAACGATACCATTAAACGCATTTATCTGAAAGCGCTGAACCCGGATTATAAATATGCGCTGCAGGATACCGGCGAAGTGTATGGCGGCGATGAACTGATGTATGCGGGCATTAAAGCGACCAAAGGCGATATTCCGCAGCTGGAAGGCGATTTTCAGAGCGTGATGATGCATTTTAAAAAAGAAGCGGCGAAAATGGGCCGCGATGTGCTGAACTTTAACGTGGATTGGCTGTATATTCCGGAAGATCTGAACGATGCGTATAAATTTGATTTTGATGAAAGCAACTTTGAAGTGGTGAGCCTGCCGCATGCGAACAAAACCTTTCCGCATCATTATTTTAAAGAAGAAGATTATCGCTTTGTGAGCTGGTATCGCAAACATTTTAAAGTGGATGAACGCTATAAAGGCAAAAAAGTGTATATTCATTTTGAAGGCGTGATGACCGTGGCGAAAGTGTATGTGAACGGCGAATTTGTGGGCGAACATAAAGGCGGCTATACCCCGTTTGAATTTGATATTACCGAATATGTGAAATATGGCGATTTTGAAAACCTGATTGCGGTGCAGGTGGATAGCCGCGAACATAAAGATATTCCGCCGGAAGGCCATCTGGTGGATTATATGCTGTTTGGCGGCATTTATCGCAACGTGTGGCTGAAAATTCTGAACGATACCCATATTAAAGATGTGTATTTTGTGGTGGATAAACTGCAGAACAGCGTGGCGGAAATTAGCATTACCACCACCATTGAAGGCAAAGAAGTGCGCAACGCGAAAATTCTGACCGAAGTGATTAACAAAGAAGGCGTGGTGTGCAGCAGCAGCGTGACCGATGTGAAAGATATGCAGAAAGAAATTGTGCAGCGCATTAAAATGGAAAACCCGCTGACCTGGCATCCGGATCATCCGTATCTGTATAACGTGAGCGTGAAACTGGTGGCGGAAAACGAAATTCTGGATAACTATACCTTTAAAACCGGCATTCGCACCGTGGAATTTCGCGATGATGGCAAATTTTATATTAACGGCGAACCGCTGAAACTGCGCGGCCTGAACCGCCATCAGACCTTTCCGTATGTGGGCGGCGCGATGCCGGATCGCGTGCAGCGCAAAGATGCGGATATTCTGAAATATGAACTGGGCCTGAACTATGTGCGCACCAGCCATTATCCGCAGGCGGTGAGCTTTCTGGATCGCTGCGATGAAATTGGCCTGCTGGTGTTTGAAGAAATTCCGGGCTGGCAGCATATTGGCGATGAAAACTGGAAAAACATTGCGAAAGAAAACCTGAAAGAAATGATTCTGCGCGATCGCAACCATCCGTGCATTTTTATGTGGGGCGTGCGCATTAACGAAAGCCTGGATGATCATGATTTTTATAAAGAAATGAACGAAATTGCGCATTATCTGCATAAACTGGATCGCAGCCGCCCGACCGGCGGCGTGCGCTATCTGCGCGATAGCGAAAAACTGGAAGATGTGTTTACCTATAACGATTTTATTTATAACCTGGAAGGCAAAATTCAGCTGCCGAACCATAAAAAATATATGGTGACCGAATATATGGGCCATATGTATCCGACCAAAAGCTATGATAACCTGAACCGCCTGATTACCCATGCGCGCCTGCATGCGCTGATTCAGGATAAACAGTATGGCATTCCGAACATGGCGGGCGCGAGCGGCTGGTGCGCGTTTGATTATAACACCACCAGCGCGTTTGGCAGCGGCGATAACATTTGCTATCATGGCGTGTGCGATATTTTTCGCCTGCCGAAATTTGCGGCGCATTTTTATCGCAGCCAGGCGGATCCGCATCTGTATGGCCCGTATGTGTTTATTGCGAGCTATCTGATTCCGAGCTTTCGCGAAGAAAACGGCGATAAACTGCTGGTGTTTAGCAACTGCGAAGAAATTGAACTGTATATTAACGATAAATTTGTGATGAAACAGATGCCGAACCGCGTGGATTTTCCGAGCCTGCCGTATCCGCCGTTTGAATTTAGCCTGAACCAGCTGGGCGTGAACTATATGGATATGGCGATTAAAGCGAACGATGTGAGCATTACCGCGGTGGGCCTGATTAACGGCAAAGAAGTGGCGCGCCATACCACCTATCTGCGCACCTATGGCAAACCGGATAAACTGATTCTGAGCTGCGATGATAACGAAATTATGGCGGATGGCAGCGATTGCACCCGCGTGGTGGTGAGCGTGGTGGATGAAAACGGCAGCATTCTGCCGTATGCGAACATTCCGGTGAGCTTTGAAATTGAAGGCGAAGGCAAACTGATTGGCGAAAACCCGCTGGCGCTGGAAGCGGGCCGCGGCGCGGTGTATGTGAAAAGCACCCGCAAACCGGGCGAAATTATTCTGAAAGCGAAAAGCCATTATGTGGCGGAAGAAAGCAGCGTGAGCATTAAAACCAACAGCATTGGCTATTATCAGAAAGCGCATCCGCTGGGCTGGTTTTTTAGCATTCTGATTCTGTTTAGCAACAAATATTGGGGCATTAAAAACTATCAG。

另一方面，本发明还提供一种β-半乳糖苷酶Gal-T的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述β-半乳糖苷酶Gal-T在降解乳糖中的应用。

另一方面，一种降解乳糖的方法，所选用的β-半乳糖苷酶为Gal-T。

优选：所述降解条件中反应温度为0～70℃。最适反应温度为45℃。

优选：所述降解条件中反应pH为5.5～10.5。最适反应pH为7.5。

有益效果：

1.本发明的β-半乳糖苷酶Gal-T为结构与功能新颖的乳糖水解酶，其氨基酸序列与已有性质报道的β-半乳糖苷酶序列相似度仅为75.75％。

2.本发明提供了一种制备β-半乳糖苷酶Gal-T的方法，即利用基因工程的技术方法，将Gal-T的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达460.4U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，可利用镍柱对其进行一步亲和纯化。

3.本发明的β-半乳糖苷酶Gal-T具有优良的理化性质，该酶最适反应温度和pH分别为45℃和7.5，其具有热稳定的特性，在40℃-60℃的温度范围内显示出广泛的温度稳定性。本发明所述的β-半乳糖苷酶Gal-T具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明β-半乳糖苷酶Gal-T蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品；1，纯化所得β-半乳糖苷酶Gal-T)；

图2为本发明β-半乳糖苷酶Gal-T的温度和pH适应性分析(A，β-半乳糖苷酶Gal-T的最适反应温度；B，β-半乳糖苷酶Gal-T的最适反应pH；

图3为本发明β-半乳糖苷酶Gal39的热稳定性分析；

图4为薄层层析(TLC)法检测本发明β-半乳糖苷酶Gal-T的酶解产物(M，半乳糖标准品；0-1依次为该酶降解乳糖0min和60min)；

具体实施方式

实施例1β-半乳糖苷酶Gal-T的序列分析及重组表达

本发明所述β-半乳糖苷酶Gal-T的产酶基因Gal-T来源于海洋细菌Baciliiussp.BY57，包含有3750个碱基序列，编码1250个氨基酸序列。利用National Center forBiotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain(CDD)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，该序列包含有一段多糖水解酶GH家族的β-半乳糖苷酶保守区。已经报道的β-半乳糖苷酶中，与Gal-T氨基酸序列相似度最高的为多糖水解酶第42家族(GH42)的β-半乳糖苷酶(Genbank AJ316559.1)，两者之间的氨基酸序列相似度(Identity)为75.75％。该发明所述的β-半乳糖苷酶Gal-T归属于多糖水解酶(GH42)家族。本发明所述β-半乳糖苷酶Gal-T序列新颖，与其他同一家族序列相比，长度较短，含有3个独立的结构域，利用同源模建和分子对接发现，本发明所述β-半乳糖苷酶Gal-T催化腔与乳糖分子的结合能力强。

将β-半乳糖苷酶Gal-T的产酶序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：SEQ ID NO.3：PGal-T-F：

5’-CATGCCATGGAAGTTGTCTTGTATCGCT-3’(Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PGal-T-R：

5’-CCGCTCGAGCTTGATTTCGTATGGGTCA-3’(Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET20b(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-20b(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有100μg/mL氨苄青霉素)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中(含有100μg/mL氨苄青霉素)，转速为200r/min的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET20b-Gal-T。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET20b-Gal-T，保存在-80℃备用。

实施例2β-半乳糖苷酶Gal-T的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET20b-Gal-T在100mL的LB液体培养基中(100μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中200/min震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导24h。β-半乳糖苷酶活性测定方法为：50μL酶液加入450μL 10mM邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)底物(20mM磷酸盐缓冲液，pH＝8.0)，在40℃下反应10min，加入500μL的Na₂CO₃试剂终止反应。将混合物以10,000rpm离心10min，在OD420下检测其吸光度。酶活力定义为1U为每min产生1μM ONP所需要的酶量。经检测，发酵液中壳聚糖酶活力可达460.4U/mL。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃上清液后收集菌体。将菌体重悬于20mM磷酸盐缓冲液中，使用超声细胞破碎仪破碎菌体(全程操作在冰上，保持低温)。最后，将细菌裂解物离心并收集上清液，使用Akta150 FPLC纯化系统进行纯化。将收集的上清液上样于经过预平衡的5mL镍离子亲和层析柱上，上样流速为5mL/min。洗涤缓冲液(500mM NaCl，20mM磷酸缓冲液，PH7.6)用于去除杂质蛋白，使用洗脱缓冲液(500mM咪唑，500mM NaCl，20mM磷酸缓冲液，PH7.6)用于活性成分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。纯化所得β-半乳糖苷酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图1所示，纯化所得β-半乳糖苷酶Gal-T的分子量为145kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。

实施例3β-半乳糖苷酶Gal-T的最适温度和pH测定

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal-T在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度(0-80℃)下反应10min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，计算不同温度下Gal-T的相对酶活力。如图2A所示，β-半乳糖苷酶Gal-T的最适反应温度为45℃。

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal-T与Britton-Robinson缓冲液体系(PH5.5-10.5)的乳糖底物反应。该缓冲液由磷酸，硼酸和乙酸组成，可以添加不同量的氢氧化钠以形成具有宽pH范围的缓冲溶液。在最适温度下检测活性，酶活性最高值为100％。如图2B所示，β-半乳糖苷酶Gal-T的最适反应pH为7.5。

实施例4β-半乳糖苷酶Gal-T的热稳定性测定

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal-T在不同温度(0-80℃)下孵育1h，然后检测其酶活力。以不孵育酶液的活力为100％；检测不同孵育温度对其热稳定性的影响；如图3所示，β-半乳糖苷酶Gal-T具有耐热性，在40℃-60℃的温度范围内显示出广泛的温度稳定性。

实施例5β-半乳糖苷酶Gal-T酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶Gal-T纯酶与乳糖在45℃下进行反应，检测其酶解产物。将100μL纯化的Gal-T和900μL乳糖底物(5mg/mL)在200mM磷酸盐缓冲液(PH 7.5)中于45℃下孵育6小时，在不同的时间点收集产物，并通过煮沸10分钟使酶失活，然后在高效薄层层析板(HPTLC)检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将4μL样品点样在硅胶TLC板原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰醋酸:水＝2:2:1)的展缸中30min，吹干层析板，浸入显色剂(0.5％茚三酮乙醇溶液)中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，β-半乳糖苷酶Gal-T酶解主产物为葡萄糖和半乳糖。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种耐热β-半乳糖苷酶及其在乳糖降解的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1250

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ile Asn Ile Arg Trp Arg Glu Ser Leu Trp Glu Leu Ile His Leu

1 5 10 15

Ile Phe His Gly Leu Leu Lys Pro Gly Glu Thr Phe Gln Thr Pro Glu

20 25 30

Val Val Met Val Tyr Ser Asp Ser Gly Leu Asn Lys Met Ser Asn Thr

35 40 45

Tyr His Lys Leu Tyr Arg Asn Arg Leu Met Arg Ser Lys Phe Lys Asp

50 55 60

Lys Glu Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp Glu Tyr Phe Asp Phe Thr

65 70 75 80

Glu Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ala Lys Glu Ala Lys Asp Leu Gly Ile

85 90 95

Glu Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly Lys Arg Asn Ser Asp

100 105 110

Asn Ser Ser Leu Gly Asp Trp Phe Val Asn Lys Glu Lys Ile Pro Ser

115 120 125

Gly Leu Asp Gly Leu Ala Lys Glu Ile Asn Ser Leu Gly Leu Lys Phe

130 135 140

Gly Leu Trp Met Glu Pro Glu Met Val Ser Pro Asp Ser Asp Leu Tyr

145 150 155 160

Arg Glu His Pro Asn Trp Cys Ile His Val Pro Asn Arg Pro Arg Ser

165 170 175

Glu Ser Arg Asn Gln Leu Val Leu Asp Leu Ser Arg Lys Asp Val Gln

180 185 190

Asp Tyr Ile Ile Lys Val Val Ser Asp Ile Leu Glu Ser Ala Asn Ile

195 200 205

Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn Arg Asn Met Thr Glu Ile Gly Ser

210 215 220

Ala Leu Leu Pro Pro Glu Arg Gln Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Ile

225 230 235 240

Leu Gly Leu Tyr Arg Ile Leu Glu Glu Ile Thr Thr Arg Phe Pro Asp

245 250 255

Val Leu Phe Glu Ser Cys Ala Gly Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly

260 265 270

Met Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala

275 280 285

Val Glu Arg Leu Lys Ile Gln Tyr Gly Thr Ser Ile Val Tyr Pro Leu

290 295 300

Ile Ser Met Gly Ser His Val Ser Ala Val Pro Asn His Gln Val His

305 310 315 320

Arg Ile Thr Pro Leu Lys Thr Arg Leu Asp Val Ala Ile Ser Gly Asn

325 330 335

Phe Gly Phe Glu Leu Asp Leu Thr Lys Leu Ser Glu Glu Glu Lys Asp

340 345 350

Leu Ala Lys Lys Tyr Val Lys Lys Tyr Lys Glu Ile Arg Lys Leu Ile

355 360 365

Gln Phe Gly Asp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu

370 375 380

Thr Ala Trp Met Phe Ile Asn Glu Glu Lys Thr Glu Phe Val Ala Phe

385 390 395 400

Tyr Phe Lys Val Leu Ala Thr Pro Asn Asp Thr Ile Lys Arg Ile Tyr

405 410 415

Leu Lys Ala Leu Asn Pro Asp Tyr Lys Tyr Ala Leu Gln Asp Thr Gly

420 425 430

Glu Val Tyr Gly Gly Asp Glu Leu Met Tyr Ala Gly Ile Lys Ala Thr

435 440 445

Lys Gly Asp Ile Pro Gln Leu Glu Gly Asp Phe Gln Ser Val Met Met

450 455 460

His Phe Lys Lys Glu Ala Ala Lys Met Gly Arg Asp Val Leu Asn Phe

465 470 475 480

Asn Val Asp Trp Leu Tyr Ile Pro Glu Asp Leu Asn Asp Ala Tyr Lys

485 490 495

Phe Asp Phe Asp Glu Ser Asn Phe Glu Val Val Ser Leu Pro His Ala

500 505 510

Asn Lys Thr Phe Pro His His Tyr Phe Lys Glu Glu Asp Tyr Arg Phe

515 520 525

Val Ser Trp Tyr Arg Lys His Phe Lys Val Asp Glu Arg Tyr Lys Gly

530 535 540

Lys Lys Val Tyr Ile His Phe Glu Gly Val Met Thr Val Ala Lys Val

545 550 555 560

Tyr Val Asn Gly Glu Phe Val Gly Glu His Lys Gly Gly Tyr Thr Pro

565 570 575

Phe Glu Phe Asp Ile Thr Glu Tyr Val Lys Tyr Gly Asp Phe Glu Asn

580 585 590

Leu Ile Ala Val Gln Val Asp Ser Arg Glu His Lys Asp Ile Pro Pro

595 600 605

Glu Gly His Leu Val Asp Tyr Met Leu Phe Gly Gly Ile Tyr Arg Asn

610 615 620

Val Trp Leu Lys Ile Leu Asn Asp Thr His Ile Lys Asp Val Tyr Phe

625 630 635 640

Val Val Asp Lys Leu Gln Asn Ser Val Ala Glu Ile Ser Ile Thr Thr

645 650 655

Thr Ile Glu Gly Lys Glu Val Arg Asn Ala Lys Ile Leu Thr Glu Val

660 665 670

Ile Asn Lys Glu Gly Val Val Cys Ser Ser Ser Val Thr Asp Val Lys

675 680 685

Asp Met Gln Lys Glu Ile Val Gln Arg Ile Lys Met Glu Asn Pro Leu

690 695 700

Thr Trp His Pro Asp His Pro Tyr Leu Tyr Asn Val Ser Val Lys Leu

705 710 715 720

Val Ala Glu Asn Glu Ile Leu Asp Asn Tyr Thr Phe Lys Thr Gly Ile

725 730 735

Arg Thr Val Glu Phe Arg Asp Asp Gly Lys Phe Tyr Ile Asn Gly Glu

740 745 750

Pro Leu Lys Leu Arg Gly Leu Asn Arg His Gln Thr Phe Pro Tyr Val

755 760 765

Gly Gly Ala Met Pro Asp Arg Val Gln Arg Lys Asp Ala Asp Ile Leu

770 775 780

Lys Tyr Glu Leu Gly Leu Asn Tyr Val Arg Thr Ser His Tyr Pro Gln

785 790 795 800

Ala Val Ser Phe Leu Asp Arg Cys Asp Glu Ile Gly Leu Leu Val Phe

805 810 815

Glu Glu Ile Pro Gly Trp Gln His Ile Gly Asp Glu Asn Trp Lys Asn

820 825 830

Ile Ala Lys Glu Asn Leu Lys Glu Met Ile Leu Arg Asp Arg Asn His

835 840 845

Pro Cys Ile Phe Met Trp Gly Val Arg Ile Asn Glu Ser Leu Asp Asp

850 855 860

His Asp Phe Tyr Lys Glu Met Asn Glu Ile Ala His Tyr Leu His Lys

865 870 875 880

Leu Asp Arg Ser Arg Pro Thr Gly Gly Val Arg Tyr Leu Arg Asp Ser

885 890 895

Glu Lys Leu Glu Asp Val Phe Thr Tyr Asn Asp Phe Ile Tyr Asn Leu

900 905 910

Glu Gly Lys Ile Gln Leu Pro Asn His Lys Lys Tyr Met Val Thr Glu

915 920 925

Tyr Met Gly His Met Tyr Pro Thr Lys Ser Tyr Asp Asn Leu Asn Arg

930 935 940

Leu Ile Thr His Ala Arg Leu His Ala Leu Ile Gln Asp Lys Gln Tyr

945 950 955 960

Gly Ile Pro Asn Met Ala Gly Ala Ser Gly Trp Cys Ala Phe Asp Tyr

965 970 975

Asn Thr Thr Ser Ala Phe Gly Ser Gly Asp Asn Ile Cys Tyr His Gly

980 985 990

Val Cys Asp Ile Phe Arg Leu Pro Lys Phe Ala Ala His Phe Tyr Arg

995 1000 1005

Ser Gln Ala Asp Pro His Leu Tyr Gly Pro Tyr Val Phe Ile Ala Ser

1010 1015 1020

Tyr Leu Ile Pro Ser Phe Arg Glu Glu Asn Gly Asp Lys Leu Leu Val

1025 1030 1035 1040

Phe Ser Asn Cys Glu Glu Ile Glu Leu Tyr Ile Asn Asp Lys Phe Val

1045 1050 1055

Met Lys Gln Met Pro Asn Arg Val Asp Phe Pro Ser Leu Pro Tyr Pro

1060 1065 1070

Pro Phe Glu Phe Ser Leu Asn Gln Leu Gly Val Asn Tyr Met Asp Met

1075 1080 1085

Ala Ile Lys Ala Asn Asp Val Ser Ile Thr Ala Val Gly Leu Ile Asn

1090 1095 1100

Gly Lys Glu Val Ala Arg His Thr Thr Tyr Leu Arg Thr Tyr Gly Lys

1105 1110 1115 1120

Pro Asp Lys Leu Ile Leu Ser Cys Asp Asp Asn Glu Ile Met Ala Asp

1125 1130 1135

Gly Ser Asp Cys Thr Arg Val Val Val Ser Val Val Asp Glu Asn Gly

1140 1145 1150

Ser Ile Leu Pro Tyr Ala Asn Ile Pro Val Ser Phe Glu Ile Glu Gly

1155 1160 1165

Glu Gly Lys Leu Ile Gly Glu Asn Pro Leu Ala Leu Glu Ala Gly Arg

1170 1175 1180

Gly Ala Val Tyr Val Lys Ser Thr Arg Lys Pro Gly Glu Ile Ile Leu

1185 1190 1195 1200

Lys Ala Lys Ser His Tyr Val Ala Glu Glu Ser Ser Val Ser Ile Lys

1205 1210 1215

Thr Asn Ser Ile Gly Tyr Tyr Gln Lys Ala His Pro Leu Gly Trp Phe

1220 1225 1230

Phe Ser Ile Leu Ile Leu Phe Ser Asn Lys Tyr Trp Gly Ile Lys Asn

1235 1240 1245

Tyr Gln

1250

<210> 2

<211> 3750

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgattaaca ttcgctggcg cgaaagcctg tgggaactga ttcatctgat ttttcatggc 60

ctgctgaaac cgggcgaaac ctttcagacc ccggaagtgg tgatggtgta tagcgatagc 120

ggcctgaaca aaatgagcaa cacctatcat aaactgtatc gcaaccgcct gatgcgcagc 180

aaatttaaag ataaagaacg cccgattctg attaacaact gggaatattt tgattttacc 240

gaagaaaaac tgaaagaact ggcgaaagaa gcgaaagatc tgggcattga actgtttgtg 300

ctggatgatg gctggtttgg caaacgcaac agcgataaca gcagcctggg cgattggttt 360

gtgaacaaag aaaaaattcc gagcggcctg gatggcctgg cgaaagaaat taacagcctg 420

ggcctgaaat ttggcctgtg gatggaaccg gaaatggtga gcccggatag cgatctgtat 480

cgcgaacatc cgaactggtg cattcatgtg ccgaaccgcc cgcgcagcga aagccgcaac 540

cagctggtgc tggatctgag ccgcaaagat gtgcaggatt atattattaa agtggtgagc 600

gatattctgg aaagcgcgaa cattagctat gtgaaatggg atatgaaccg caacatgacc 660

gaaattggca gcgcgctgct gccgccggaa cgccagcgcg aaaccgcgca tcgctatatt 720

ctgggcctgt atcgcattct ggaagaaatt accacccgct ttccggatgt gctgtttgaa 780

agctgcgcgg gcggcggcgg ccgctttgat ccgggcatgc tgtattatat gccgcagacc 840

tggaccagcg ataacaccga tgcggtggaa cgcctgaaaa ttcagtatgg caccagcatt 900

gtgtatccgc tgattagcat gggcagccat gtgagcgcgg tgccgaacca tcaggtgcat 960

cgcattaccc cgctgaaaac ccgcctggat gtggcgatta gcggcaactt tggctttgaa 1020

ctggatctga ccaaactgag cgaagaagaa aaagatctgg cgaaaaaata tgtgaaaaaa 1080

tataaagaaa ttcgcaaact gattcagttt ggcgattttt atcgcctgct gagcccgttt 1140

gaaggcaacg aaaccgcgtg gatgtttatt aacgaagaaa aaaccgaatt tgtggcgttt 1200

tattttaaag tgctggcgac cccgaacgat accattaaac gcatttatct gaaagcgctg 1260

aacccggatt ataaatatgc gctgcaggat accggcgaag tgtatggcgg cgatgaactg 1320

atgtatgcgg gcattaaagc gaccaaaggc gatattccgc agctggaagg cgattttcag 1380

agcgtgatga tgcattttaa aaaagaagcg gcgaaaatgg gccgcgatgt gctgaacttt 1440

aacgtggatt ggctgtatat tccggaagat ctgaacgatg cgtataaatt tgattttgat 1500

gaaagcaact ttgaagtggt gagcctgccg catgcgaaca aaacctttcc gcatcattat 1560

tttaaagaag aagattatcg ctttgtgagc tggtatcgca aacattttaa agtggatgaa 1620

cgctataaag gcaaaaaagt gtatattcat tttgaaggcg tgatgaccgt ggcgaaagtg 1680

tatgtgaacg gcgaatttgt gggcgaacat aaaggcggct ataccccgtt tgaatttgat 1740

attaccgaat atgtgaaata tggcgatttt gaaaacctga ttgcggtgca ggtggatagc 1800

cgcgaacata aagatattcc gccggaaggc catctggtgg attatatgct gtttggcggc 1860

atttatcgca acgtgtggct gaaaattctg aacgataccc atattaaaga tgtgtatttt 1920

gtggtggata aactgcagaa cagcgtggcg gaaattagca ttaccaccac cattgaaggc 1980

aaagaagtgc gcaacgcgaa aattctgacc gaagtgatta acaaagaagg cgtggtgtgc 2040

agcagcagcg tgaccgatgt gaaagatatg cagaaagaaa ttgtgcagcg cattaaaatg 2100

gaaaacccgc tgacctggca tccggatcat ccgtatctgt ataacgtgag cgtgaaactg 2160

gtggcggaaa acgaaattct ggataactat acctttaaaa ccggcattcg caccgtggaa 2220

tttcgcgatg atggcaaatt ttatattaac ggcgaaccgc tgaaactgcg cggcctgaac 2280

cgccatcaga cctttccgta tgtgggcggc gcgatgccgg atcgcgtgca gcgcaaagat 2340

gcggatattc tgaaatatga actgggcctg aactatgtgc gcaccagcca ttatccgcag 2400

gcggtgagct ttctggatcg ctgcgatgaa attggcctgc tggtgtttga agaaattccg 2460

ggctggcagc atattggcga tgaaaactgg aaaaacattg cgaaagaaaa cctgaaagaa 2520

atgattctgc gcgatcgcaa ccatccgtgc atttttatgt ggggcgtgcg cattaacgaa 2580

agcctggatg atcatgattt ttataaagaa atgaacgaaa ttgcgcatta tctgcataaa 2640

ctggatcgca gccgcccgac cggcggcgtg cgctatctgc gcgatagcga aaaactggaa 2700

gatgtgttta cctataacga ttttatttat aacctggaag gcaaaattca gctgccgaac 2760

cataaaaaat atatggtgac cgaatatatg ggccatatgt atccgaccaa aagctatgat 2820

aacctgaacc gcctgattac ccatgcgcgc ctgcatgcgc tgattcagga taaacagtat 2880

ggcattccga acatggcggg cgcgagcggc tggtgcgcgt ttgattataa caccaccagc 2940

gcgtttggca gcggcgataa catttgctat catggcgtgt gcgatatttt tcgcctgccg 3000

aaatttgcgg cgcattttta tcgcagccag gcggatccgc atctgtatgg cccgtatgtg 3060

tttattgcga gctatctgat tccgagcttt cgcgaagaaa acggcgataa actgctggtg 3120

tttagcaact gcgaagaaat tgaactgtat attaacgata aatttgtgat gaaacagatg 3180

ccgaaccgcg tggattttcc gagcctgccg tatccgccgt ttgaatttag cctgaaccag 3240

ctgggcgtga actatatgga tatggcgatt aaagcgaacg atgtgagcat taccgcggtg 3300

ggcctgatta acggcaaaga agtggcgcgc cataccacct atctgcgcac ctatggcaaa 3360

ccggataaac tgattctgag ctgcgatgat aacgaaatta tggcggatgg cagcgattgc 3420

acccgcgtgg tggtgagcgt ggtggatgaa aacggcagca ttctgccgta tgcgaacatt 3480

ccggtgagct ttgaaattga aggcgaaggc aaactgattg gcgaaaaccc gctggcgctg 3540

gaagcgggcc gcggcgcggt gtatgtgaaa agcacccgca aaccgggcga aattattctg 3600

aaagcgaaaa gccattatgt ggcggaagaa agcagcgtga gcattaaaac caacagcatt 3660

ggctattatc agaaagcgca tccgctgggc tggtttttta gcattctgat tctgtttagc 3720

aacaaatatt ggggcattaa aaactatcag 3750

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

catgccatgg aagttgtctt gtatcgct 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ccgctcgagc ttgatttcgt atgggtca 28

Claims

1.一种耐热的β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的β-半乳糖苷酶在降解牛奶中乳糖的应用。

5.一种降解乳糖的方法，其特征是，所选用的半乳糖苷酶为权利要求1所述的β-半乳糖苷酶。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为0～70℃，最适反应温度为45℃。

7.如权利要求5所述的方法，其特征是，降解条件中反应pH为5.5～10.5，最适反应pH为7.5。