CN109337846A

CN109337846A - 深海来源的菌株及其编码的β-半乳糖苷酶基因和应用

Info

Publication number: CN109337846A
Application number: CN201811395362.XA
Authority: CN
Inventors: 孙晶晶; 郝建华; 王伟; 刘均忠
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2038-11-22
Also published as: CN109337846B

Abstract

本发明涉及一种深海来源的菌株及其编码的β‑半乳糖苷酶基因和应用，属于生物技术领域，所述菌株为交替单胞菌属(Alteromonas sp.)菌株ML117，该菌株于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017788。所述菌株含有编码低温β‑半乳糖苷酶的基因，所述低温β‑半乳糖苷酶在低乳糖牛奶生产中具有广阔的应用前景。

Description

深海来源的菌株及其编码的β-半乳糖苷酶基因和应用

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种深海微生物来源的菌株、低温β-半乳糖苷酶的编码基因及其表达和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.23)又称乳糖酶，属于水解酶，广泛分布于动物，植物和微生物中，包括细菌，真菌和酵母。该酶能特异性的水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，而且具有转糖基作用，以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为糖基受体，合成半乳糖苷键，生成功能性低聚糖。由于它们的水解和糖基转移活性，在食品工业上是一种被广泛使用的酶。基于β-半乳糖苷酶的疏水性，氨基酸序列相似性，反应机制和共同结构域等，将其归属于糖基水解酶家族中的GH1、GH2、GH35、GH42家族，另外还有一些属于GH16、GH53、GH98家族的酶能水解非糖化合物中的半乳糖苷键。目前发现的极端β-半乳糖苷酶，包括适冷，耐盐和嗜热等，大多属于GH2和GH42两个家族。

乳糖不耐症是指由于人体小肠内缺乏β-半乳糖苷酶，饮用牛乳或乳制品后引起的消化不良、腹胀、肠鸣、呕吐、急性腹痛或腹泻等症状。在我国，成人的乳糖酶缺乏和乳糖不耐受发生率较高。为了解决乳糖不耐症的问题，食品工业上通过在牛奶中添加β-半乳糖苷酶来生产低乳糖或无乳糖牛奶。如果添加低温β-半乳糖苷酶，在冷藏储存和运输过程中降解乳糖，避免额外的加热过程，就能最大限度保持风味、降低微生物污染和节约能源，从而降低生产成本。用于牛奶加工的商业化β-半乳糖苷酶大多为选择性中温酶，在冷藏温度时活性很低。因此，寻找新型低温β-半乳糖苷酶，提高其低温时水解乳糖的能力，是无乳糖牛奶生产的重要研究方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种深海来源的菌株交替单胞菌属(Alteromonas sp.)菌株ML117及其编码的β-半乳糖苷酶基因和应用，所述菌株能够产生低温β-半乳糖苷酶，所述低温β-半乳糖苷酶在低乳糖牛奶生产中具有广阔的应用前景。本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种深海来源的菌株，所述菌株为交替单胞菌属(Alteromonas sp.)菌株ML117，该菌株于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017788。

进一步，所述菌株的其16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，所述核苷酸序来源于交替单胞菌ML117(Alteromonas sp.ML117)。

一种上述核苷酸序列编码的β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

一种重组表达载体，它包含了SEQ ID No:2所示核苷酸序列；重组表达载体为pET-bgal。

一种重组菌，它包含了SEQ ID No:2所示核苷酸序列，所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

利用上述β-半乳糖苷酶的核苷酸序列制备重组β-半乳糖苷酶的方法，步骤如下：

(1)将来自Alteromonas sp.ML117(CCTCC NO:M2017788)的β-半乳糖苷酶基因序列SEQ ID No:2克隆到大肠杆菌表达载体pET-24a中，构建重组表达载体pET-bgal，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含β-半乳糖苷酶基因的重组菌株；

(2)将步骤(1)筛选出的菌株接种于LB液体培养基中，37℃培养10-12小时，获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度0.1-1mmol/L的IPTG诱导，诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-16小时；

(3)收集步骤(2)诱导后获得的菌体，超声破碎后，使用亲和层析柱对重组β-半乳糖苷酶进行纯化，获得电泳纯的重组β-半乳糖苷酶。

本发明还提供上述重组β-半乳糖苷酶在牛奶添加剂中的应用。

本发明还提供含有上述重组β-半乳糖苷酶的牛奶添加剂。

上述重组β-半乳糖苷酶具有如下酶学性质:

(1)根据SDS-PAGE和分子排阻色谱实验结果，推算出该β-半乳糖苷酶为同源四聚体，重组β-半乳糖苷酶的相对分子量约为450kDa。

(2)以化学底物ONPG作为底物时，重组β-半乳糖苷酶的最适温度为30℃，在温度为15℃时仍有最高酶活的50％；在以乳糖作为底物时，该酶的最适反应温度为35℃，在5℃时的酶活为最高酶活的27％。在反应温度高于最适反应温度后，重组酶对两种底物的水解活力都迅速下降。符合低温酶的特征。

(3)在以ONPG和乳糖为底物时，重组β-半乳糖苷酶的最适pH为8。

(4)重组β-半乳糖苷酶在pH范围6.5到9之间具有良好的稳定性。

(5)重组β-半乳糖苷酶在0到5℃温度范围，表现出高稳定性。20℃下作用2小时，重组β-半乳糖苷酶的残余酶活为60％。在35℃作用10分钟后，重组酶β-半乳糖苷酶丧失失活。

(6)K⁺对该重组β-半乳糖苷酶的活性有明显的激活作用，Na⁺、Mg²⁺对重组β-半乳糖苷酶的活性具有一定的激活作用，Ca²⁺存在时，重组β-半乳糖苷酶能保持82％的活性。牛奶中含量较高的离子为K⁺、Na⁺和Ca²⁺，能应用于无乳糖牛奶生产的β-半乳糖苷酶需要对这三种金属离子具有一定的耐受性，而该重组β-半乳糖苷酶表现出了较高的耐受性。

(7)作为海洋来源的酶，重组β-半乳糖苷酶具有耐盐的特性。在0-1mol/L的NaCl浓度范围内，重组β-半乳糖苷酶能够保持最高活性的80％以上；在NaCl浓度达到4mol/L时,仍然保留最高活性的50％以上。

(8)以乳糖作为底物，降低反应温度，重组β-半乳糖苷酶对底物的亲和力升高，这是适冷酶对低温环境适应性的表现。

本发明所述低温β-半乳糖苷酶在水解牛奶中的乳糖的应用是指：

在10℃冷藏条件下，低温β-半乳糖苷酶能在7小时内水解牛奶中30％以上的乳糖，经过24小时的反应，85％的牛奶乳糖被水解。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明提供一种来源与深海微生物的交替单胞菌属(Alteromonas sp.)菌株交替单胞菌ML117(Alteromonas sp.ML117)，所述菌株含有编码β-半乳糖苷酶的基因，利用所述基因重组的β-半乳糖苷酶在低温具有酶活性，因此在低乳糖牛奶生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、重组β-半乳糖苷酶的电泳图；1，包含pET-bgal的BL21(DE3)细胞裂解液；2，包含pET-bgal的BL21(DE3)经过IPTG诱导后细胞裂解液；3，纯化后的重组β-半乳糖苷酶；

图2、重组β-半乳糖苷酶水解ONPG的温度曲线；

图3、重组β-半乳糖苷酶水解乳糖的温度曲线；

图4、重组β-半乳糖苷酶水解ONPG的pH曲线；

图5、重组β-半乳糖苷酶水解乳糖的pH曲线；

图6、重组β-半乳糖苷酶的热稳定性曲线；

图7、重组β-半乳糖苷酶的pH稳定性曲线；

图8、盐浓度对重组β-半乳糖苷酶活性的影响。

交替单胞菌ML117(Alteromonas sp.ML117)菌株于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017788，保藏地址：中国武汉武汉大学。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1产β-半乳糖苷酶菌株的筛选

取采自4000m的深海海水，分别进行10倍，100倍，1000倍稀释后，取100μL涂布到含有1％乳糖和X-Gal(40μg/mL)的2216E琼脂平板上，将平板置于4℃培养箱中培养2周。挑取平板上的蓝色克隆，划线获得纯培养。单克隆接种到2216E液体培养基中，25℃培养2天。提取菌液的基因组DNA，通过16SrRNA通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR，PCR产物测序后，获得菌株的16SrRNA序列。将菌株ML117的16SrRNA序列与NCBI数据库中已知的16SrRNA序列进行Blast分析，发现产β-半乳糖苷酶菌株ML117属于Alteromonas属，该菌株于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017788，保藏地址：中国武汉武汉大学。

PCR体系(LA Taq酶购于TaKaRa)

PCR条件

1.94℃，5min

2.94℃，1min

55℃，30s

72℃，1min 30s

循环25次

3.72℃，5min

实施例2低温β-半乳糖苷酶新基因表达载体的构建

挑取2216E平板上生长的Alteromonas sp.ML117单克隆接种到2216E液体培养基中，25℃培养2天。取新鲜菌液提取基因组DNA，提取的DNA通过引物1(CGGAATTCATGCATACTGTGGCTG)和引物2(CCGCTCGAGGGCTACAGGGCAAA)进行PCR(划线部分分别为限制性酶切位点EcoR I和Xho I)，获得β-半乳糖苷酶基因。

PCR体系(LA Taq酶购于TaKaRa)

PCR条件

1.94℃，5min

2.94℃，1min

55℃，30s

72℃，3min

循环25次

3.72℃，5min

将PCR产物连接到T载体，进行基因测序。测序结果发现来源于Alteromonassp.ML117的低温β-半乳糖苷酶基因具有3126个碱基，共编码1042个氨基酸。理论相对分子质量为120KDa，理论等电点为5.44。该序列与己有酶学性质报道的β-半乳糖苷酶相似度高是来源于Pseudoalteromonas haloplanktis和Pseudoalteromonas sp.22b的β-半乳糖苷酶，相似度分别为61％和60％。根据NCBI氨基酸序列保守性分析，结果显示该低温β-半乳糖苷酶属于糖基水解酶2家族。

将PCR产物进行双酶切后，连接到表达质粒pET-24a上，连接子转化到大肠杆菌DH5α中，通过抗生素卡那霉素筛选出阳性克隆，并进行测序分析，从而获得带有β-半乳糖苷酶新基因的重组表达载体pET-bgal。

实施例3低温重组β-半乳糖苷酶的制备方法

将上述重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得低温β-半乳糖苷酶的基因工程菌株。将菌株接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃过夜培养。取1％培养液接种，培养至OD₆₀₀值0.6，加入IPTG至终浓度0.2mM，20℃诱导12小时。4℃，8500rpm离心15min收集菌体，菌体用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)重悬。超声破碎细胞，破碎液在4℃，10000rpm离心20min，上清液即为粗酶液。用平衡缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液,500mM NaCl,pH 7.3)将亲和层析柱Ni-NTA Agarose冲洗5个柱体积，粗酶液经过0.22μm滤膜过滤后进入柱子，随后用平衡缓冲液冲洗5个柱体积，非特异性条带通过含有20mM咪唑的平衡液冲洗5个柱体积来去除。用含20-250mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH 7.3)梯度洗脱，获得纯的重组β-半乳糖苷酶。表达和纯化过程中蛋白的纯度通过12％SDS-PAGE进行检测，电泳胶用考马斯亮蓝进行染色如图1所示。通过Bradford法测定蛋白浓度，以BSA为标准蛋白。

实施例4β-半乳糖苷酶的酶学性质

纯化后β-半乳糖苷酶的分子量是通过分子排阻色谱法来测定的，色谱柱为HR 10/30 Superdex-200 column(GE Healthcare)。蛋白分离溶液为50mM磷酸盐缓冲液，150mMNaCl，pH7.3，流速为0.5ml/min。分子量标准蛋白为碳酸酐酶(29,000Da)，牛血清白蛋白(66,000Da)，乙醇脱氢酶(150,000Da)，β-淀粉酶(200,000Da)，去铁铁蛋白(443,000Da)，甲状腺球蛋白(669,000Da)。根据分子排阻色谱法，估测纯化重组酶的相对分子质量为450kDa，结合SDS-PAGE实验结果判断β-半乳糖苷酶是同源四聚体。

β-半乳糖苷酶的最适反应温度是在温度范围5-55℃内测定的，对于化学底物邻硝基酚-β半乳糖苷(ONPG)，其温度与酶活的关系如图2所示，最适反应温度为30℃；对于天然底物乳糖，其温度与酶活的关系如图3所示，最适反应温度为35℃。β-半乳糖苷酶的最适pH是在pH范围6-10的Britton–Robinson缓冲液中进行测定的。对于ONPG和乳糖，其pH与酶活的关系分别如图4和图5所示，其最适pH均为8。β-半乳糖苷酶热稳定性的测定是通过将纯酶在温度范围5-30℃内作用2小时，每20min测定其残余酶活来实现的，实验结果如图6所示。β-半乳糖苷酶在0-5℃时，表现出良好的稳定性。20℃作用2小时后，β-半乳糖苷酶的残余酶活在60％以上。在35℃水浴10分钟后，β-半乳糖苷酶几乎丧失所有活性。β-半乳糖苷酶的pH稳定性实验是将纯酶置于pH范围6-10的Britton–Robinson缓冲液中作用1小时后，测定其残余酶活，其实验结果如图7所示。β-半乳糖苷酶在pH范围7-9的缓冲体系中，稳定性最高。

在酶活测定体系中加入终浓度为5mM的不同金属离子(Na⁺,K⁺,Li⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Co²⁺,Ba²⁺,Cu²⁺,Fe³⁺,Al³⁺)，在最佳条件下测定其残余酶活。实验结果在表1中，其中K⁺、Mn²⁺、Na⁺和Mg²⁺对β-半乳糖苷酶有激活作用，Ca²⁺对β-半乳糖苷酶的酶活影响较小，Ba² ⁺、Co²⁺、Li⁺、Al³⁺和Cu²⁺对β-半乳糖苷酶具有较强的抑制作用。

表1金属离子对β-半乳糖苷酶的影响

β-半乳糖苷酶对化学底物ONPG和天然底物乳糖的动力学参数如表2所示。测定缓冲液为50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.3)，其中ONPG浓度范围为1-36mM，乳糖浓度范围为1-60mM，测定温度分别为10，20和30℃，通过Lineweaver-Burk方法计算了K_m，V_max，k_cat和k_cat/K_m等动力学参数。

表2β-半乳糖苷酶的动力学参数

实施例5低温β-半乳糖苷酶在牛奶水解中的应用

在1mL牛奶中加入1U纯化的低温β-半乳糖苷酶，在10℃冷藏条件下反应24小时，每隔1小时检测乳糖含量。在反应体系中加入等体积的5％三氯乙酸，混合液于1000rpm离心2min，取上清液，通过高效液相色谱法监测乳糖含量的变化。色谱柱为糖分析柱(安捷伦)，检测器为示差折光检测器。实验结果如图8所示，30％的乳糖在反应7小时后被水解，而反应24小时后，85％以上的乳糖被水解。牛奶中70％-80％的乳糖水解即可称为低乳糖牛奶，可有效解决乳糖不耐症，因此该低温β-半乳糖苷酶在低乳糖牛奶生产中有广阔的应用前景。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 深海来源的菌株及其编码的β-半乳糖苷酶基因和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1421

<212> DNA

<213> 交替单胞菌ML117(Alteromonas sp.ML117)

<400> 1

gcgaggctag cctgcagtcg aacggaaaca tgtctagctt gctagataga tgtcgagtgg 60

cggacgggtg agtaatgctt gggaacttgc ctttgcgagg gggataacag ttggaaacga 120

ctgctaatac cgcataatgt ctacggacca aacggggctt cggctccggc gcaaagagag 180

gcccaagtga gattagctag ttggtgaggt aaaggctcac caaggcaacg atctctagct 240

gttctgagag gaagatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtggg gaatattgca caatggggga aaccctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga 360

agaaggcctt cgggttgtaa agcactttca gttgtgagga aaagttagta gttaatacct 420

gctagccgtg acgttaacaa cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt 480

aatacggagg gtgcgagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg caggcggttt 540

gttaagctag atgtgaaagc cccgggctca acctgggacg gtcatttaga actggcagac 600

tagagtcttg gagaggggag tggaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agatatctgg 660

aggaacatca gtggcgaagg cgactccctg gccaaagact gacgctcatg tgcgaaagtg 720

tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacacc gtaaacgctg tctactagct 780

gtttgtgact ttaagtcgtg agtagcgaag ctaacgcgat aagtagaccg cctggggagt 840

acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctacact tgacatgttg agaagtttcc 960

agagatggat tcgtgccttc gggaactcaa acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct tagttgccag 1080

catttagttg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggacgac 1140

gtcaagtcat catggccctt acgtgtaggg ctacacacgt gctacaatgg catatacaga 1200

gggaagcgag acagtgatgt ggagcggacc ccttaaagta tgtcgtagtc cggattggag 1260

tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gcaggtcaga atactgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gatgcaaaag 1380

aagtagttag tctaaccttc gggagaacga ttaccacttt t 1421

<210> 2

<211> 3126

<212> DNA

<213> 交替单胞菌ML117(Alteromonas sp.ML117)

<400> 2

atgcatactg tggctgaggt ggttgctcaa caagattggc aaaaccccgt ggtatatcag 60

cgtaatcgag taaatggtca tgcgccgctc aatggctata catgccttga cgatgcattg 120

aacaaaagcg gcgctcagaa acgcaagctc aatggtgatt ggcagtttag gttattcaac 180

tcacctttcg acgtgccaga taatgccatt gctgcacact tacccgccaa agaagaagct 240

cgttggcaac ctatctccgt gccatcaaat tggcagatgc aagggttcga taagcccatt 300

tattgcaacg taaagtatcc ttttgaggtt aacccaccgc aggtgccaca agacaatccc 360

acaggggttt accgcactga atttgaaatg actaaagcca tgcttttgca acgcaatcat 420

attgtctttg acggcgtaaa tagcgcgttt cacttgtggt gtaaccaatc atacgtggga 480

tattcgcaag acagccgttt gcccgctgag tttgacttat gccccttctt aaaagagggg 540

aaaaaccaga ttacagccat ggttatccgt tggtctgatg gtagctacct tgaagatcag 600

gacatgtggt ggttaagcgg tattttccgt gatgtttatt tggcaagtaa gccgcagcat 660

tacattcaag acgtatttgc caccccttca ttagatgctt gttaccgcga tggtcgcctc 720

gatattagaa cctccattgt cgcccctaag gatttcaaag tggccgtgca gctttttgat 780

ggcacgactg ccgttactca gccgcaggtg gcaaacacca ataatcgccg tattgatgaa 840

aaaggcggat gggatgatgt ggttttccaa tcactacacc taaatagccc caaaaaatgg 900

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atgtatgcca gagtagacag cgacgttcaa gatgatgcgg tgcccaaatg ggccatcaag 1560

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ggcgaaaagt attgggctta cggcggtgat tttggtgata ccgacaatga tagacagttt 1800

tgtatcaatg ggttgctatt cccggataga agcgctcacc cagccctcta tgaagcgaaa 1860

cactgccaac agcaccttca gttttcgtta acggaagata acggtacatt cgaactgaca 1920

gtggccagcg attacctgtt tagaaccacg gataatgaaa cgttagtgtg gcaacttttg 1980

gaagacggct gttgcgttgc acaggggagc ttcgttattg aggttaagcc acagcagaca 2040

gcgaactata ccattacacc cgcctacacg tataaagcgg gcgcacagta tcaccttaat 2100

gttgatacgc aaacgactaa agcctgcgcg tgggcagccg caggtcacgt tatcgatacg 2160

gcccagttta ggcttaaaaa tactgcgggg ttaggggcag caccccggcc actctgtacc 2220

cctactaaag cgaacgacaa ggggacgtct gctgtcgtac cattagcggc aaaaattgat 2280

gaacaaacgc tcaccgttaa tgcacacact agtgtgttta gtcttcatct tgaatcgggt 2340

cagttgattt catggttagt tgccgatgaa gagcaactga gcgcaccgat tgaagataac 2400

ttttttaggg cgccactgga taacgacatc ggcgtgagtg aagtggataa ccccgatccc 2460

aacgcgtggg aatcaagatg gcgcagagtg ggtataggag aatggcaacg tgtgtgtacg 2520

tcggttgatg tcaacgaaag cgcattagcg gttaccgttc acacacaatt cgattattgc 2580

catcaaggtg aagttttagc gaaaagcgtc tggcgctatc aattcttgcc gtcaggcgag 2640

cttgatgtag acattcaagt atcgttagct gatacattac cccctatgcc gagggtcggc 2700

gtgcaatttg cggtaccaca gcacgagact ggcactgttg tatggaaagg gttggggcca 2760

tttgaaaact accctgacag acacgtagcg gcgcgctatg ggcaatataa gcaagatatt 2820

aatgccatgc atacacctta tattttcccc accgataatg gattaaggag tcacagtgat 2880

acccttgaat taaatcagtg ccaggtacaa ggaagattcc attttgcggt tagtccttac 2940

agccaagtgc aacttgataa ggcgaaacat acttgcgacc tagccgcggg agattgtacg 3000

tatgtatatg tagatcacgc gcacatgggc gtaggggggg atgactcttg gagccctagt 3060

acgcataaac cctacttgct agaagataag tactatcgct atcatctgcg tttttgccct 3120

gtagcc 3126

<210> 3

<211> 1042

<212> PRT

<213> 交替单胞菌ML117(Alteromonas sp.ML117)

<400> 3

Met His Thr Val Ala Glu Val Val Ala Gln Gln Asp Trp Gln Asn Pro

1 5 10 15

Val Val Tyr Gln Arg Asn Arg Val Asn Gly His Ala Pro Leu Asn Gly

20 25 30

Tyr Thr Cys Leu Asp Asp Ala Leu Asn Lys Ser Gly Ala Gln Lys Arg

35 40 45

Lys Leu Asn Gly Asp Trp Gln Phe Arg Leu Phe Asn Ser Pro Phe Asp

50 55 60

Val Pro Asp Asn Ala Ile Ala Ala His Leu Pro Ala Lys Glu Glu Ala

65 70 75 80

Arg Trp Gln Pro Ile Ser Val Pro Ser Asn Trp Gln Met Gln Gly Phe

85 90 95

Asp Lys Pro Ile Tyr Cys Asn Val Lys Tyr Pro Phe Glu Val Asn Pro

100 105 110

Pro Gln Val Pro Gln Asp Asn Pro Thr Gly Val Tyr Arg Thr Glu Phe

115 120 125

Glu Met Thr Lys Ala Met Leu Leu Gln Arg Asn His Ile Val Phe Asp

130 135 140

Gly Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gln Ser Tyr Val Gly

145 150 155 160

Tyr Ser Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ala Glu Phe Asp Leu Cys Pro Phe

165 170 175

Leu Lys Glu Gly Lys Asn Gln Ile Thr Ala Met Val Ile Arg Trp Ser

180 185 190

Asp Gly Ser Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Trp Leu Ser Gly Ile

195 200 205

Phe Arg Asp Val Tyr Leu Ala Ser Lys Pro Gln His Tyr Ile Gln Asp

210 215 220

Val Phe Ala Thr Pro Ser Leu Asp Ala Cys Tyr Arg Asp Gly Arg Leu

225 230 235 240

Asp Ile Arg Thr Ser Ile Val Ala Pro Lys Asp Phe Lys Val Ala Val

245 250 255

Gln Leu Phe Asp Gly Thr Thr Ala Val Thr Gln Pro Gln Val Ala Asn

260 265 270

Thr Asn Asn Arg Arg Ile Asp Glu Lys Gly Gly Trp Asp Asp Val Val

275 280 285

Phe Gln Ser Leu His Leu Asn Ser Pro Lys Lys Trp Thr Ala Glu Thr

290 295 300

Pro Asn Leu Tyr Arg Leu Val Val Ser Leu Leu Asp Arg Ser Asp Ser

305 310 315 320

Leu Val Asp Met Glu Ala Tyr Asp Val Gly Phe Arg His Ile Glu Met

325 330 335

Ile Lys Gly Gln Leu Cys Val Asn Gly Glu Pro Val Leu Ile Arg Gly

340 345 350

Val Asn Arg His Glu His His Glu Ser Arg Gly His Ala Val Asn Glu

355 360 365

Ala Asp Met Leu Glu Asp Ile Lys Leu Leu Lys Gln Asn Asn Phe Asn

370 375 380

Ala Val Arg Thr Ala His Tyr Pro Asn His Pro Arg Trp Tyr Glu Leu

385 390 395 400

Cys Asp Glu Tyr Gly Leu Tyr Val Val Asp Glu Ala Asn Ile Glu Thr

405 410 415

His Gly Met Tyr Pro Met Gly Arg Leu Ser Arg Asp Pro Leu Trp Ala

420 425 430

Gly Ala Tyr Leu Ala Arg Tyr Thr Gln Met Val Glu Arg Asp Lys Asn

435 440 445

His Pro Cys Ile Ile Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu Cys Gly His Gly

450 455 460

Pro Thr His Asp Ala Met Tyr Gly Trp Ser Lys Ala Phe Asp Pro Ser

465 470 475 480

Arg Pro Val Gln Tyr Glu Gly Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Thr Asp

485 490 495

Ile Ile Ala Pro Met Tyr Ala Arg Val Asp Ser Asp Val Gln Asp Asp

500 505 510

Ala Val Pro Lys Trp Ala Ile Lys Lys Trp Leu Ser Leu Pro Gly Glu

515 520 525

His Arg Pro Val Ile Leu Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser

530 535 540

Leu Gly Ser Phe Ser Asp Tyr Trp Asp Ala Phe Lys Asp Tyr Pro Arg

545 550 555 560

Leu Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Trp Val Asp Gln Gly Leu Ala Lys

565 570 575

Tyr Thr Asp Ser Gly Glu Lys Tyr Trp Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Gly

580 585 590

Asp Thr Asp Asn Asp Arg Gln Phe Cys Ile Asn Gly Leu Leu Phe Pro

595 600 605

Asp Arg Ser Ala His Pro Ala Leu Tyr Glu Ala Lys His Cys Gln Gln

610 615 620

His Leu Gln Phe Ser Leu Thr Glu Asp Asn Gly Thr Phe Glu Leu Thr

625 630 635 640

Val Ala Ser Asp Tyr Leu Phe Arg Thr Thr Asp Asn Glu Thr Leu Val

645 650 655

Trp Gln Leu Leu Glu Asp Gly Cys Cys Val Ala Gln Gly Ser Phe Val

660 665 670

Ile Glu Val Lys Pro Gln Gln Thr Ala Asn Tyr Thr Ile Thr Pro Ala

675 680 685

Tyr Thr Tyr Lys Ala Gly Ala Gln Tyr His Leu Asn Val Asp Thr Gln

690 695 700

Thr Thr Lys Ala Cys Ala Trp Ala Ala Ala Gly His Val Ile Asp Thr

705 710 715 720

Ala Gln Phe Arg Leu Lys Asn Thr Ala Gly Leu Gly Ala Ala Pro Arg

725 730 735

Pro Leu Cys Thr Pro Thr Lys Ala Asn Asp Lys Gly Thr Ser Ala Val

740 745 750

Val Pro Leu Ala Ala Lys Ile Asp Glu Gln Thr Leu Thr Val Asn Ala

755 760 765

His Thr Ser Val Phe Ser Leu His Leu Glu Ser Gly Gln Leu Ile Ser

770 775 780

Trp Leu Val Ala Asp Glu Glu Gln Leu Ser Ala Pro Ile Glu Asp Asn

785 790 795 800

Phe Phe Arg Ala Pro Leu Asp Asn Asp Ile Gly Val Ser Glu Val Asp

805 810 815

Asn Pro Asp Pro Asn Ala Trp Glu Ser Arg Trp Arg Arg Val Gly Ile

820 825 830

Gly Glu Trp Gln Arg Val Cys Thr Ser Val Asp Val Asn Glu Ser Ala

835 840 845

Leu Ala Val Thr Val His Thr Gln Phe Asp Tyr Cys His Gln Gly Glu

850 855 860

Val Leu Ala Lys Ser Val Trp Arg Tyr Gln Phe Leu Pro Ser Gly Glu

865 870 875 880

Leu Asp Val Asp Ile Gln Val Ser Leu Ala Asp Thr Leu Pro Pro Met

885 890 895

Pro Arg Val Gly Val Gln Phe Ala Val Pro Gln His Glu Thr Gly Thr

900 905 910

Val Val Trp Lys Gly Leu Gly Pro Phe Glu Asn Tyr Pro Asp Arg His

915 920 925

Val Ala Ala Arg Tyr Gly Gln Tyr Lys Gln Asp Ile Asn Ala Met His

930 935 940

Thr Pro Tyr Ile Phe Pro Thr Asp Asn Gly Leu Arg Ser His Ser Asp

945 950 955 960

Thr Leu Glu Leu Asn Gln Cys Gln Val Gln Gly Arg Phe His Phe Ala

965 970 975

Val Ser Pro Tyr Ser Gln Val Gln Leu Asp Lys Ala Lys His Thr Cys

980 985 990

Asp Leu Ala Ala Gly Asp Cys Thr Tyr Val Tyr Val Asp His Ala His

995 1000 1005

Met Gly Val Gly Gly Asp Asp Ser Trp Ser Pro Ser Thr His Lys Pro

1010 1015 1020

Tyr Leu Leu Glu Asp Lys Tyr Tyr Arg Tyr His Leu Arg Phe Cys Pro

1025 1030 1035 1040

Val Ala

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

Thr Cys Ala Gly

20

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Gly Ala

1 5 10 15

Cys Thr Thr

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Cys Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala Thr Ala Cys

1 5 10 15

Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly

20

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Cys Cys Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala

1 5 10 15

Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala

20

Claims

1.一种深海来源的菌株，其特征在于所述菌株为交替单胞菌ML117，该菌株于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017788。

2.根据权利要求1所述的一种深海来源的菌株，其特征在于所述菌株的16S rRNA核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

3.一种编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，所述核苷酸序来源于权利要求1所述的交替单胞菌ML117。

4.权利要求3所述核苷酸序列编码的β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

5.一种重组表达载体，它包含了权利要求3所述的SEQ ID No:2核苷酸序列；重组表达载体为pET-bgal。

6.一种重组菌，它包含了权利要求3所述的SEQ ID No:2核苷酸序列，所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.利用权利要求3所述编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列制备重组β-半乳糖苷酶的方法，步骤如下：

(1)将来权利要求3所述编码β-半乳糖苷酶的基因序列SEQ ID No:2克隆到大肠杆菌表达载体pET-24a中，构建重组表达载体pET-bgal，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含β-半乳糖苷酶基因的重组菌株；

8.权利要求7所述重组β-半乳糖苷酶在牛奶添加剂中的应用。

9.一种含有权利要求7所述重组β-半乳糖苷酶的牛奶添加剂。