CN111154740A

CN111154740A - 一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN111154740A
Application number: CN202010082392.6A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 姚宇晨; 温永平; 刘瑜; 孙健; 闫巧娟
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-02-07
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-02-07
Also published as: CN111154740B; WO2021155674A1

Abstract

本发明公开了一种沙质微泡菌β‑半乳糖苷酶及其编码基因与应用。本发明提供了一种沙质微泡菌β‑半乳糖苷酶，为序列表的序列2所示的蛋白质。本发明提供的沙质微泡菌β‑半乳糖苷酶酶学性质优异，对天然底物乳糖的比酶活为38.69U/mg。同时可高效水解乳糖，冷藏温度4℃下以1U/mL加酶量，反应36h后，水解牛奶中80％以上的乳糖，反应48h后，牛奶中90％以上的乳糖被水解，反应72h后，全部水解牛奶中乳糖。另外，反应84h后，水解5％(w/v)的乳清溶液中90％以上的乳糖。本发明所提供的蛋白质对于食品工业中低乳糖或无乳糖乳制品的生产，具有重要的应用价值。

Description

一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23，β-D-半乳糖苷半乳糖基水解酶)属于糖苷水解酶家族，具有催化非还原末端β-D-半乳糖苷之间的糖苷键水解和转半乳糖苷的功能。目前主要应用于食品、医药、分析等领域。

乳糖是一种二糖，由一分子半乳糖和一分子葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成。乳糖主要存在于乳制品中，牛奶中含有4.5％左右的乳糖。成人由于肠道中由于缺乏β-半乳糖苷酶活性而不能消化乳糖。肠道微生物能够发酵乳糖而引起腹胀、腹痛和腹泻等一系列症状，称为乳糖不耐症。使用β-半乳糖苷酶处理乳制品，能够将乳糖水解成人体能够吸收的半乳糖和葡萄糖，从而消除乳糖不耐症状。

β-半乳糖苷酶在动物、植物和微生物中均有存在。微生物β-半乳糖苷酶具有产酶量大、性质多样、成本低等优点，在乳品加工中应用广泛。目前已知的β-半乳糖苷酶根据氨基酸序列同源性主要分布在糖苷水解酶GH1、GH2、GH35、GH42、GH59和GH147家族中。

70％-80％的乳糖被水解的牛奶即可称为低乳糖牛奶，可有效解决乳糖不耐症问题。与中温和高温β-半乳糖苷酶相比，低温β-半乳糖苷酶能够在低温下水解乳糖，避免了由于加热而导致的牛奶品质下降，最大限度保持牛奶风味、热敏成分、降低微生物污染风险，从而节约资源，降低生产成本。同时在乳品加工中，低温水解乳糖能够避免浓缩时的结晶现象，改善乳品品质，提升反应速率和发酵效率，因而具有一定优势。目前用于乳品加工的商业化β-半乳糖苷酶大多为中温β-半乳糖苷酶，在冷藏温度时活性很低，如帝斯曼中性β-半乳糖苷酶(Maxilact LG2000)最适温度为37℃，水解率最高作用温度为43℃，低于37℃水解能力较差。因此，发掘新型低温中性β-半乳糖苷酶有十分重要的现实意义。

乳清是奶酪生产的副产物，其中含有大量的乳糖(约44-52g/L)。乳清中的乳糖被β-半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖后，甜味有所增加，可替代蔗糖和和玉米糖浆作为食品和饮料工业中的甜味剂。因此，通过β-半乳糖苷酶水解乳清中乳糖生产甜味剂，可以实现乳清的高值利用。

沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)是一类革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)Microbulbiferaceae科。目前尚未见微泡菌属(Microbulbifer)β-半乳糖苷酶的报道和专利。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用。

第一方面，本发明首先提供了蛋白质，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列2自N端第19至795位所示的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

A4)将A1)或A2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述蛋白质来源于沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)。

所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

所述融合蛋白质具体可为序列表的序列4所示的蛋白质。

本发明还保护编码所述蛋白质的基因。

所述基因为如下B1)-B5)任一所示：

B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

B3)序列表中序列1自5’端第55至2388位所示的DNA分子；

B4)编码序列是序列表中序列1自5’端第55至2388位所示的DNA分子；

B5)在严格条件下与B1)或B2)或B3)或B4)限定的DNA分子杂交，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

编码序列4所示的融合蛋白质的基因如序列表的序列3所示。

本发明还保护含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-28a(+)载体的NheI和XhoI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。

所述重组菌具体可为将上述重组表达载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到的重组菌。

第二方面，本发明还保护上述蛋白质在作为β-半乳糖苷酶中的应用。

第三方面，本发明还保护上述基因或重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备β-半乳糖苷酶中的应用。

第四方面，本发明还保护上述基因或重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的应用，为如下(C1)-(C6)中的至少一种：

(C1)水解乳糖；

(C2)水解牛奶中的乳糖；

(C3)水解乳清中的乳糖；

(C4)制备低乳糖或无乳糖制品；

(C5)制备低乳糖或无乳糖牛奶；

(C6)利用乳清生产甜味剂。

第五方面，本发明还保护制备β-半乳糖苷酶的方法，包括将上述基因导入到受体微生物中，得到表达β-半乳糖苷酶的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到β-半乳糖苷酶。

上述方法中，所述受体微生物为原核微生物。具体的，所述原核微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌Rosetta(DE3)。

上述方法中，所述基因可以通过含有所述基因的重组表达载体导入到受体微生物中。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-28a(+)载体的NheI和XhoI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。

本发明还保护上述方法制备得到的β-半乳糖苷酶。

所述β-半乳糖苷酶最适pH为6.5，在pH 5.5–7.5保温30min，残余酶活力在80％以上；最适温度为30℃，在30℃以下保持稳定。

第六方面，本发明还保护水解乳糖的方法，包括如下步骤：采用上述蛋白质或上述方法制备得到的β-半乳糖苷酶对样品中的乳糖进行水解。

上述方法中，所述样品具体可为牛奶或乳清。

上述方法中，所述水解体系中所述蛋白质或β-半乳糖苷酶的浓度可为1U/mL-5U/mL。具体可为1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL或5U/mL。

上述方法中，所述水解反应的温度具体可为冷藏温度(具体为4℃)或者室温(具体为20-25℃)。

上述方法中，所述水解的时间具体可为0-84h。更具体可为4h、8h、24h、36h、48h、72h或84h。

本发明利用基因工程技术从沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)BH1中克隆一个GH2家族的β-半乳糖苷酶基因，并在大肠杆菌中异源表达。本发明提供的沙质微泡菌β-半乳糖苷酶(MaBgal2A)的酶学性质优异，其最适pH为6.5，在pH 5.5–7.5保温30min，残余酶活力在80％以上；最适温度为30℃，在30℃以下保持稳定。MaBgal2A对天然底物乳糖的比酶活为38.69U/mg。MaBgal2A可高效水解乳糖，冷藏温度4℃下以1U/mL加酶量，反应36h后，水解牛奶中80％以上的乳糖，反应48h后，牛奶中90％以上的乳糖被水解，反应72h后，全部水解牛奶中乳糖。另外，反应84h后，水解5％(w/v)的乳清溶液中90％以上的乳糖。本发明所提供的蛋白质对于食品工业中低乳糖或无乳糖乳制品的生产，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的纯化电泳图。

图2为沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的最适pH测定曲线图。其中柠檬酸-柠檬酸三钠pH3.0-6.0(●)，乙酸-乙酸钠pH 3.6-5.6(■)，MES pH 5.0-6.5(▼)，MOPS pH 6.5-7.5(◆)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠pH 6.0-8.0(▲)，Tris-HCl pH 7.0-9.0

CAPS pH 10.0-11.0

图3为沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的pH稳定性测定曲线图。其中柠檬酸-柠檬酸三钠pH 3.0-6.0(●)，乙酸-乙酸钠pH 3.6-5.6(■)，MES pH 5.0-6.5(▼)，MOPS pH 6.5-7.5(◆)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠pH 6.0-8.0(▲)，Tris-HCl pH 7.0-9.0

CAPS pH10.0-11.0

图4为沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的最适温度测定曲线图。

图5为沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的温度稳定性测定曲线图。

图6为沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的半衰期测定曲线图。处理温度分别为25℃(●)、30℃(■)和35℃(▲)。

图7为沙质微泡菌β-半乳糖苷酶水解乳糖的历程图(A:TLC检测结果；B:HPLC检测结果)。图7B示半乳糖(▲)、葡萄糖(●)和乳糖(■)的浓度。

图8沙质微泡菌β-半乳糖苷酶加酶量水解牛奶中乳糖的历程图(A:冷藏温度；B:室温；C:TLC检测结果；D:HPLC检测结果)。图8D示半乳糖(▲)、葡萄糖(●)和乳糖(■)的浓度。

图9沙质微泡菌β-半乳糖苷酶加酶量水解乳清中乳糖的历程图(A:冷藏温度；B:室温；C:TLC检测结果；D:HPLC检测结果)图9D示半乳糖(▲)、葡萄糖(●)和乳糖(■)的浓度。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

沙质微泡菌BH1：参考文献：Junwen Ma,Qiaojuan Yan,Ping Yi,Shaoqing Yang,Haijie Liu,Zhengqiang Jiang.Biochemical characterization of a truncatedβ-agarase from Microbulbifer sp.suitable for efficient production ofneoagarotetraose.Process Biochemistry,2019,87:119-127.https://doi.org/10.1016/j.procbio.2019.08.021.；公众可以从中国农业大学获得。

测定β-半乳糖苷酶活力的方法参照文献：Katrolia P,Yan Q,Jia H,etal.Molecular cloning and high-level expression of aβ-galactosidase gene fromPaecilomyces aerugineus in Pichia pastoris[J].Journal ofMolecular Catalysis BEnzymatic,2011,69(3-4):112-119.的中记载的方法，具体测定步骤如下(该方法命名为通用标准方法)：

(1)将15mM邻硝基β-D吡喃半乳糖苷(oNPG)溶液(溶剂为水)75μL加入150μL磷酸盐缓冲液(pH 6.5,50mM)中，30℃恒温水浴中预热3min；

(2)在上述反应体系中加入25μL待测样品液(待测酶液或待测酶液的稀释液)置于30℃恒温水浴中反应10min；

(3)在上述反应体系中再加入750μL Na₂CO₃(2M)溶液使反应终止，利用分光光度计测定OD_410nm值(适当稀释酶液将OD_410nm控制在0.200-0.800范围内)。

β-半乳糖苷酶酶活力单位(1U)的定义：在上述实验条件下，每分钟生成1μmol邻硝基苯酚时所需的酶量。酶活力的计算公式：H(U/mL)＝Y×V₁×n/(T×V₂)，其中，H代表酶活力(U/mL)，Y代表试验液中邻硝基苯酚的浓度(mmol/L)，V₁代表反应试剂的总体积(mL)，n代表酶液的稀释倍数，T代表反应时间(min)，V₂代表加入稀释后的酶液体积(mL)。

以牛血清蛋白为标准蛋白，采用Lowry法(Lowry O H,Rosebrough N J,FarrAL,Randall R J,Protein measurement with the Folin phenol reagent.The JournalofBiological Chemistry,1951,193(1)：265-275)测定蛋白含量。

比酶活定义为每毫克蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

琼脂糖Ni-IDA亲和柱为自美国GE公司产品，产品目录号为17-0575-01。

含5％(质量百分含量)乳清粉的水溶液，其中乳清粉为美国Bio-NutritionInternational公司产品由生产奶酪后副产物乳清经喷雾干燥制得，其中乳糖含量≥78％。

pET-28a(+)载体：Novagen,产品目录编号：69864-3CN。

pET-40b(+)载体：Novagen，产品目录编号：70091-3CN。

pET-41a(+)载体：Novagen，产品目录编号：70556-3CN。

pET-44a(+)载体：Novagen，产品目录编号：71122-3CN。

大肠杆菌Rosetta(DE3)：博迈德基因技术有限公司。

实施例1、沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因的克隆

对沙质微泡菌BH1进行大量序列分析和功能验证，从中克隆得到一个β-半乳糖苷酶的编码基因，全长2388bp，如序列表的序列1所示。序列表的序列1所示的DNA分子编码序列2所示的β-半乳糖苷酶，命名为MaBgal2A。MaBgal2A由795个氨基酸组成，其中经预测自N端第1至18位氨基酸为信号肽序列。

实施例2、表达沙质微泡菌β-半乳糖苷酶工程菌构建

一、重组表达沙质微泡菌β-半乳糖苷酶载体的构建

1、采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-28a(+)载体的NheI和XhoI酶切位点之间的片段，得到重组表达载体pET-28a(+)-MaBgal2A(已经测序验证)。

外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成序列表的序列3所示的融合基因，编码序列表的序列4所示的融合蛋白。序列表的序列4中，第5-10位为6×His标签，第24-800位为不含有信号肽的MaBgal2A。

2、采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-40b(+)载体的BamHI和XhoI酶切位点之间的片段，得到重组表达载体pET-40b(+)-MaBgal2A(已经测序验证)。

外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成融合基因，编码融合蛋白。融合蛋白包括DsbC蛋白和不含有信号肽的MaBgal2A。DsbC蛋白能够促进含有二硫键蛋白的折叠。

3、采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-41a(+)载体的BamHI和XhoI酶切位点之间的片段，得到重组表达载体pET-41a(+)-MaBgal2A(已经测序验证)。

外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成融合基因，编码融合蛋白。融合蛋白包括GST蛋白和不含有信号肽的MaBgal2A。GST蛋白能够促进目的蛋白的可溶性表达，避免包涵体的形成。

4、采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-44a(+)载体的BamHI和XhoI酶切位点之间的片段，得到重组表达载体pET-44a(+)-MaBgal2A(已经测序验证)。

外源插入的DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成融合基因，编码融合蛋白。融合蛋白包括NusA蛋白和不含有信号肽的MaBgal2A。NusA蛋白能够促进目的蛋白的可溶性表达，避免包涵体的形成。

二、表达沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的工程菌的构建

将步骤一构建的4种重组表达载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)(博迈德基因技术有限公司)，得到4种重组菌。

实施例3、沙质微泡菌β-半乳糖苷酶的制备纯化及其酶学性质

一、重组蛋白MaBgal2A的制备

1、将实施例2制备的4种重组菌分别接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD_600nm达到0.6-0.8之间，向培养体系中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，IPTG在培养体系中的浓度为1mmol/L，30℃、200rpm诱导培养过夜，然后将培养体系11510g离心，收集菌体沉淀，采用缓冲液A重悬后超声破碎(250W，20min)，超声结束后11510g离心10min，收集上清液即为粗酶液。在破碎之后，目的蛋白在含有各种表达载体的大肠杆菌均未形成包涵体，因此优选含有重组质粒pET-28a(+)-MaBgal2A的重组菌用于后续工作。

缓冲液A为含有NaCl(300mM)和咪唑(20mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。

2、取步骤1得到的粗酶液，使用琼脂糖Ni-NTA亲和层析柱(1×5cm)纯化重组蛋白，具体步骤如下：(1)用缓冲液A以1mL/min流速平衡层析柱5-10个柱体积；(2)将粗酶液以0.5mL/min流速上样；(3)分别用缓冲液A和缓冲液B以1mL/min流速洗脱至OD_280nm<0.05；(4)以缓冲液C洗脱并收集OD_280nm>0.1的过柱后溶液；(5)透析浓缩得到纯化产物(重组蛋白MaBgal2A)。

缓冲液B为含有NaCl(300mM)和咪唑(50mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)；

缓冲液C为含有NaCl(300mM)和咪唑(100mM)的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。

将上述步骤中的产物进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。图1中，泳道M为分子量标准，泳道1为重组菌粗酶液，泳道2为重组蛋白MaBgal2A。图1的结果表明，重组蛋白MaBgal2A的大小为88.3kDa，与预期大小一致。

二、重组蛋白MaBgal2A的酶活力测定

分别将步骤1得到的粗酶液、步骤2得到的重组菌粗酶液经Ni-IDA亲和层析的纯化产物重组蛋白MaBgal2A作为待测酶液，以沸水浴加热10min灭活的重组蛋白MaBgal2A作为对照，按照通用标准方法检测β-半乳糖苷酶的酶活力。

结果如表2所示。

表2 β-半乳糖苷酶的纯化表

纯化倍数为各纯化步骤比酶活与粗酶液比酶活的比值；

回收率为各纯化步骤总酶活力与粗酶液总酶活力的比值。

三、重组蛋白MaBgal2A最适pH及pH稳定性的测定

1、最适pH的测定：在30℃条件下，测定步骤一制备的重组蛋白MaBgal2A在不同缓冲体系中的酶活力。

选择缓冲液的pH范围及体系如下(50mM)：

(1)柠檬酸-柠檬酸三钠(pH:3.0-6.0)；

(2)乙酸-乙酸钠(pH:3.6-5.6)；

(3)MES(pH:5.0-6.5)；

(4)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(pH:6.0-8.0)；

(5)MOPS(pH:6.5-7.5)；

(6)Tris-HCl(pH:7.0-9.0)；

(7)CAPS(pH:10.0-11.0)。

用以上缓冲液配制底物oNPG(15mM)，按照标准酶活方法测定活力，以酶活力的最高点设为100％，计算在不同pH缓冲液中反应时MaBgal2A的相对酶活力。

2、pH稳定性的测定：将步骤一制备的重组蛋白MaBgal2A用上述不同缓冲液进行稀释，置于25℃水浴锅中处理30min，然后将其迅速置于冰水中冷却30min，测定残余酶活力，未进行处理的重组蛋白MaBgal2A的酶活力作为100％，计算经过不同pH处理后MaBgal2A的相对酶活力。

结果如图2和图3所示。结果表明，MaBgal2A的最适反应pH为6.5(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)(如图2)，其具有良好的pH稳定性，在pH 5.5-7.5范围内保温30min后仍残留80％以上的酶活力(如图3)。

四、重组蛋白MaBgal2A最适温度的测定

将步骤一制备的重组蛋白MaBgal2A作为待测酶液在最适pH缓冲液(50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH为6.5)中进行酶活测定(将温度替换为0-80℃)，以最高酶活力为100％计算相对酶活。

结果如图4所示。结果显示，MaBgal2A的最适温度为30℃。

五、重组蛋白MaBgal2A温度稳定性的测定

将步骤一制备的重组蛋白MaBgal2A进行预处理后测定酶活力。预处理方法为：将重组蛋白MaBgal2A分别在不同温度(0-80℃)保温30min，将其迅速置于冰水中冷却30min。在最适pH缓冲液(50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH为6.5)和最适温度(30℃)下测定残余酶活力，以未进行处理的重组蛋白MaBgal2A的酶活力作为100％，计算经过不同温度处理后MaBgal2A的相对酶活力。

结果如图5所示。结果显示，MaBgal2A在30℃以下具有良好的稳定性。

六、重组蛋白MaBgal2A半衰期的测定

用磷酸盐缓冲液(50mM,pH 6.5)对步骤一制备的重组蛋白MaBgal2A进行适当稀释至酶蛋白浓度为1mg/mL，分别在25℃、30℃、35℃下进行保温处理，取样置于冰水浴中冷却0.5h，测定残余酶活力。对于25℃，保温0min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、150min、180min和240min后分别取样测定残余酶活力；对于30℃，保温0min、15min、30min、45min、60min、90min和120min后分别取样测定残余酶活力；对于35℃，保温0min、15min和30min后分别取样测定残余酶活力。以未处理酶液为对照，计算在不同温度下处理后的残余酶活力占空白对照酶活力的百分比，酶在不同温度下酶活力衰变到50％时所需时间即为该温度条件下的半衰期。

结果如图6所示。结果显示，MaBgal2A在25℃、30℃和35℃下的半衰期分别为4032min、252min和62min。

七、重组蛋白MaBgal2A底物特异性

以不同硝基苯基糖苷[邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(oNP-β-Galactopyranoside，CAS号：369-07-3)，对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(pNP-β-Galactopyranoside，CAS号：3150-24-1),对硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷(pNP-β-Glucopyranoside，CAS号：2492-87-7),对硝基苯-β-吡喃甘露糖苷(pNP-β-D-mannopyranoside，CAS号：252-633-9),对硝基苯-β-吡喃木糖苷(pNP-β-Xylopyranoside，CAS号：2001-96-9),对硝基苯-α-吡喃半乳糖苷(pNP-α-Galactopyranoside，CAS号：7493-95-0),对硝基苯-α-吡喃葡萄糖苷(pNP-α-Glucopyranoside，CAS号：3767-28-0)]和乳糖为底物测定酶活。上述底物均购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(上海)贸易有限公司；其中乳糖货号为V900080。

测定pNP-糖苷类底物酶活的方法按照上述通用标准方法进行。以乳糖为底物，测定酶活力的方法参照GOP-POD法：将10mg/mL乳糖溶液(采用50mM磷酸盐缓冲液配制，pH6.5)与适当稀释倍数的酶液混合，30℃保温反应10min，酶活力最终通过溶液中释放出来的葡萄糖的浓度来确定，用葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法，上海荣盛生物药业有限公司，货号361510)测定葡萄糖浓度。

以oNPG为底物时的β-半乳糖苷酶酶活力为100％，分别计算β-半乳糖苷酶对不同底物的比酶活和相对酶活。酶活定义：依照上述测定标准，每分钟生成1μmol硝基苯(pNP或oNP)或葡萄糖时所需的酶量。比酶活定义为每毫克蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

结果如表3所示。

表3 MaBgal2A的底物特异性

结果表明，该酶对人工合成底物的水解较为严格，仅能水解两种β-半乳糖苷底物，对pNPG的相对酶活为oNPG的60.4％。同时该酶对天然底物乳糖有较强的活性，相对酶活约是oNPG为底物时的四倍。

八、重组蛋白MaBgal2A水解特性

在磷酸盐缓冲液(50mM,pH 6.5)中配制5％(w/v)乳糖溶液作为底物，在底物中添加重组蛋白MaBgal2A 5U/mL(以通用标准方法测定的酶活)，混合均匀后在30℃水浴保温反应，定时取样后将样品煮沸5min，将酶灭活以待测。水解样品于TLC分析板上展层两次，用显色液完全浸湿吹干后在100℃显色。展层剂配比为正丁醇:乙醇:水＝5:3:2(v/v/v)，显色剂为5％(v/v)的硫酸甲醇溶液，标准对照为葡萄糖、半乳糖和乳糖浓度各1％(质量百分含量，w/v)的混合溶液。

HPLC检测条件：色谱柱为BP-800Pb++(Benson Polymeric，Reno，NE，USA)，进样量10μL，柱温80℃，流速0.6mL/min，流动相为超纯水,；色谱柱B为Waters Xbridge Amide(250×4.6mm)氨基柱，进样量10μL，柱温为45℃，流速为0.8mL/min，流动相为75％的乙腈水溶液。计算公式如下：

乳糖水解率(％,w/w)＝[初始乳糖含量(％,w/v)—取样时乳糖含量(％,w/v)]/初始乳糖含量(％,w/v)

结果如图7所示。TLC和HPLC结果表明，在pH 6.5和30℃条件下，12h后MaBgal2A可完全水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖(如图7)。

实施例4、沙质微泡菌β-半乳糖苷酶在水解牛奶中乳糖的应用

1、配置如下反应体系：将重组MaBgal2A蛋白(100U/mL，酶活以通用标准方法测得)添加至市售牛奶(购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司，超高温瞬时灭菌纯牛奶，百利包包装，每袋200mL)中水解其中的乳糖，反应体系总体积为10mL。设置不同反应体中最终酶浓度为为1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL和5U/mL，对应的水解体系中市售牛奶的体积均为9.5mL，酶蛋白添加体积分别为0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL，混合后体积不足10mL者以蒸馏水补足体积。

2、将步骤1配置的反应体系在冷藏温度(4℃)和不同室温(变化范围20-25℃)下进行反应。定时取样后将样品煮沸5min，将酶灭活以待测。以乳糖浓度作为指标，采用HPLC定量分析水解液中剩余乳糖浓度。TLC、HPLC检测条件：同实施例3步骤八。

不同β-半乳糖苷酶添加量对水解市售牛奶中乳糖的影响如图8所示。HPLC结果显示，实验所用市售牛奶中的乳糖浓度为4.5％(w/v)，随着加酶量的增加，水解相同含量的乳糖所需的时间逐渐缩短。室温条件下，加酶量1U/mL时36h可将牛奶中的乳糖水解完全。冷藏温度下，加酶量为1U/mL，反应36h后，水解牛奶中80％以上的乳糖，反应48h后，牛奶中90％以上的乳糖被水解，反应72h后，全部水解牛奶中乳糖。

实施例5、沙质微泡菌β-半乳糖苷酶在水解乳清中乳糖的应用

1、配置如下反应体系：将重组MaBgal2A蛋白(100U/mL，酶活以通用标准方法测得)添加至含5％(质量百分含量)乳清粉的水溶液中水解其中的乳糖，反应体系总体积为10mL。设置不同反应体中最终酶浓度为为1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL和5U/mL，对应的水解体系中乳清溶液的体积均为9.5mL，酶蛋白添加体积分别为0.1/mL、0.2/mL、0.3/mL、0.4/mL和0.5mL，混合后体积不足10mL者以蒸馏水补足体积。

不同β-半乳糖苷酶添加量对水解乳清溶液中乳糖的影响如图9所示。结果显示，随着加酶量的增加，水解时间逐渐缩短。加酶量为1U/mL时，室温条件下84h可将5％(w/v)乳清溶液中的乳糖水解完全。冷藏温度下，反应84h后5％(w/v)的乳清溶液中90％以上的乳糖被水解。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2388

<212> DNA

<213> 沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)

<400> 1

atgaaaaccc ttgccatcaa gagcagcctg cttgccagcg cattgcttct cgccgcctgc 60

ggccagcccg accaggaaca gaactcagcg cagcagcctg agcagaacag cagcgccgca 120

catcaatccg tgggccagcc ggtgaagctg aatcagggct gggaattcat gcgggccgac 180

caggtactta cccccgaaca ggctcttgcc gccgcagagt ggcagcgcgt agccctgccc 240

cacaccccgc gcatcgaacc gcgtatcgtc aacgaccagt ggcagggcga cgcctggtat 300

caacgccgta tcgacaacga cggtcgctgg gacggcaagc gtgtttacat cgattttgaa 360

ggcgccatga acgccagtga agtgtggctg aacggagaaa aaatcgcggc ccacctgggc 420

ggctacctgc cgtttaccat tgacctcagc gaccgactgc agcccggcaa caaccagctg 480

ctggtacgcc tggacaaccg cgacaacgaa gtgaccggcc ccaaaccgct ggagaaactc 540

gacttcaaca tgtacggcgg cctctaccgc aacgcctggc tgcgagtgga aaacccggtg 600

catatcaccg acccggtaca cgccggcgaa gtggcctccg gcggcctgtt tgtacgctac 660

ccgcagatct ccgaagaatc cgcacaggtg caggtgcaaa cgcacctgcg caacggcgac 720

aacacccaac ccctgcgcgt ggaacaccgc ctgctagacg gtgacaaggt ggtcgccagc 780

cacgagcagc aaatcccggc cggcggtgaa gccaccgtcg aagaccagca gacatttagc 840

gtcgatgcgc ccaagctgtg gtcgccgtcc tcccccaacc tctacgacct gcatacccgt 900

atttatgccg gcgacgacct ggtggacgag gaacacaccc gcatcggtat ccgcgaattc 960

cgcctggaaa atggcgaact gtttatcaac ggtgagaaaa cctttctgcg cggggtcaac 1020

cgtcaccagg aataccccta cgtgggctac gctctgtccg atgccgcgca gtatcgcgac 1080

gccgcgctga tcaaggccgc cggcttcgac tacgtgcgcc tgtcccacta cccgcacgcg 1140

aaagccttca tgcacgccgc ggatgaactg ggcctggtgc tactggatgc ggtactcggc 1200

tggcagtact acagcgacaa ccccgaattc cagaaccacg tggtgcagac ctgccgcgac 1260

ctgatccgcc gcgaccgcaa ccacgcctca gtactggcct gggaatgctc actcaacgaa 1320

tcctggatgc ccgagccgtt tatcgaccgc ctgcacgcca cggtgcatga agaatatccc 1380

ggagacaacg tctactccgg cggctggcag agctacggct acgacatcta cctacaggcc 1440

cgccagcacc gcctggagca ctacgaagaa cccagcaagc catacgtggt gtccgaatac 1500

ggtgactggg agtactacgc catgaacgcc ggcctgaacc aggacacctg gggcgacctg 1560

ctgcaagccg atcgctccag ccgccaactg ctgggcgacg gcgaaaaacg cctgcaacaa 1620

caggcgctca acatcatgga agcgcacaac gacaacttca acacacccgc tttcgccgac 1680

ggctactggg taatgttcga ctacaaccgc ggctacgctg acgacctcga agcctccggc 1740

atcatgagcc tggagcgcct gccaaaattc agctaccact tctaccagag ccaacgggac 1800

gccgatgact tcgccggccc actcgccggc ggctacatgg tacatatcgc cagccactgg 1860

cagaaagacg ccggcaacag cttctacgtc ttcagcaacg ccgacgaagt agaaatcctg 1920

ctgaacggca aaagcgttac acgcaccaaa cccaacagcc atttcaccaa cctcaagcac 1980

ccgccgttcc acttcgaact gccggcattt gaagcgggca ccctcgaagc cgtggcctac 2040

gccaacggca aagaagtcgc ccgccaccaa cgggtgaccg ccgaagctgc acaacagctg 2100

caactgaacg tcgacaccgc gggcacggca ccggtggcag acagcaaaga cctgctgttc 2160

gtacacgctg cactgctgga taaaaacggc aaccgcaccc acgtgaacga catcccggtc 2220

accttctcca tcaccggcga tgccgaaatc gtgtcaccga atgtcattgc cagtgaagat 2280

ggcgtggcca gtgtgttggt gcgtgtggga gaaacgctgg aaagcatcgc gatcaacgcg 2340

acgtctccga agatggaagc ggcaagtgtg aagctgccgc tggagtga 2388

<210> 2

<211> 795

<212> PRT

<213> 沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)

<400> 2

Met Lys Thr Leu Ala Ile Lys Ser Ser Leu Leu Ala Ser Ala Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ala Cys Gly Gln Pro Asp Gln Glu Gln Asn Ser Ala Gln Gln

20 25 30

Pro Glu Gln Asn Ser Ser Ala Ala His Gln Ser Val Gly Gln Pro Val

35 40 45

Lys Leu Asn Gln Gly Trp Glu Phe Met Arg Ala Asp Gln Val Leu Thr

50 55 60

Pro Glu Gln Ala Leu Ala Ala Ala Glu Trp Gln Arg Val Ala Leu Pro

65 70 75 80

His Thr Pro Arg Ile Glu Pro Arg Ile Val Asn Asp Gln Trp Gln Gly

85 90 95

Asp Ala Trp Tyr Gln Arg Arg Ile Asp Asn Asp Gly Arg Trp Asp Gly

100 105 110

Lys Arg Val Tyr Ile Asp Phe Glu Gly Ala Met Asn Ala Ser Glu Val

115 120 125

Trp Leu Asn Gly Glu Lys Ile Ala Ala His Leu Gly Gly Tyr Leu Pro

130 135 140

Phe Thr Ile Asp Leu Ser Asp Arg Leu Gln Pro Gly Asn Asn Gln Leu

145 150 155 160

Leu Val Arg Leu Asp Asn Arg Asp Asn Glu Val Thr Gly Pro Lys Pro

165 170 175

Leu Glu Lys Leu Asp Phe Asn Met Tyr Gly Gly Leu Tyr Arg Asn Ala

180 185 190

Trp Leu Arg Val Glu Asn Pro Val His Ile Thr Asp Pro Val His Ala

195 200 205

Gly Glu Val Ala Ser Gly Gly Leu Phe Val Arg Tyr Pro Gln Ile Ser

210 215 220

Glu Glu Ser Ala Gln Val Gln Val Gln Thr His Leu Arg Asn Gly Asp

225 230 235 240

Asn Thr Gln Pro Leu Arg Val Glu His Arg Leu Leu Asp Gly Asp Lys

245 250 255

Val Val Ala Ser His Glu Gln Gln Ile Pro Ala Gly Gly Glu Ala Thr

260 265 270

Val Glu Asp Gln Gln Thr Phe Ser Val Asp Ala Pro Lys Leu Trp Ser

275 280 285

Pro Ser Ser Pro Asn Leu Tyr Asp Leu His Thr Arg Ile Tyr Ala Gly

290 295 300

Asp Asp Leu Val Asp Glu Glu His Thr Arg Ile Gly Ile Arg Glu Phe

305 310 315 320

Arg Leu Glu Asn Gly Glu Leu Phe Ile Asn Gly Glu Lys Thr Phe Leu

325 330 335

Arg Gly Val Asn Arg His Gln Glu Tyr Pro Tyr Val Gly Tyr Ala Leu

340 345 350

Ser Asp Ala Ala Gln Tyr Arg Asp Ala Ala Leu Ile Lys Ala Ala Gly

355 360 365

Phe Asp Tyr Val Arg Leu Ser His Tyr Pro His Ala Lys Ala Phe Met

370 375 380

His Ala Ala Asp Glu Leu Gly Leu Val Leu Leu Asp Ala Val Leu Gly

385 390 395 400

Trp Gln Tyr Tyr Ser Asp Asn Pro Glu Phe Gln Asn His Val Val Gln

405 410 415

Thr Cys Arg Asp Leu Ile Arg Arg Asp Arg Asn His Ala Ser Val Leu

420 425 430

Ala Trp Glu Cys Ser Leu Asn Glu Ser Trp Met Pro Glu Pro Phe Ile

435 440 445

Asp Arg Leu His Ala Thr Val His Glu Glu Tyr Pro Gly Asp Asn Val

450 455 460

Tyr Ser Gly Gly Trp Gln Ser Tyr Gly Tyr Asp Ile Tyr Leu Gln Ala

465 470 475 480

Arg Gln His Arg Leu Glu His Tyr Glu Glu Pro Ser Lys Pro Tyr Val

485 490 495

Val Ser Glu Tyr Gly Asp Trp Glu Tyr Tyr Ala Met Asn Ala Gly Leu

500 505 510

Asn Gln Asp Thr Trp Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asp Arg Ser Ser Arg

515 520 525

Gln Leu Leu Gly Asp Gly Glu Lys Arg Leu Gln Gln Gln Ala Leu Asn

530 535 540

Ile Met Glu Ala His Asn Asp Asn Phe Asn Thr Pro Ala Phe Ala Asp

545 550 555 560

Gly Tyr Trp Val Met Phe Asp Tyr Asn Arg Gly Tyr Ala Asp Asp Leu

565 570 575

Glu Ala Ser Gly Ile Met Ser Leu Glu Arg Leu Pro Lys Phe Ser Tyr

580 585 590

His Phe Tyr Gln Ser Gln Arg Asp Ala Asp Asp Phe Ala Gly Pro Leu

595 600 605

Ala Gly Gly Tyr Met Val His Ile Ala Ser His Trp Gln Lys Asp Ala

610 615 620

Gly Asn Ser Phe Tyr Val Phe Ser Asn Ala Asp Glu Val Glu Ile Leu

625 630 635 640

Leu Asn Gly Lys Ser Val Thr Arg Thr Lys Pro Asn Ser His Phe Thr

645 650 655

Asn Leu Lys His Pro Pro Phe His Phe Glu Leu Pro Ala Phe Glu Ala

660 665 670

Gly Thr Leu Glu Ala Val Ala Tyr Ala Asn Gly Lys Glu Val Ala Arg

675 680 685

His Gln Arg Val Thr Ala Glu Ala Ala Gln Gln Leu Gln Leu Asn Val

690 695 700

Asp Thr Ala Gly Thr Ala Pro Val Ala Asp Ser Lys Asp Leu Leu Phe

705 710 715 720

Val His Ala Ala Leu Leu Asp Lys Asn Gly Asn Arg Thr His Val Asn

725 730 735

Asp Ile Pro Val Thr Phe Ser Ile Thr Gly Asp Ala Glu Ile Val Ser

740 745 750

Pro Asn Val Ile Ala Ser Glu Asp Gly Val Ala Ser Val Leu Val Arg

755 760 765

Val Gly Glu Thr Leu Glu Ser Ile Ala Ile Asn Ala Thr Ser Pro Lys

770 775 780

Met Glu Ala Ala Ser Val Lys Leu Pro Leu Glu

785 790 795

<210> 3

<211> 2403

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagcg cctgcggcca gcccgaccag gaacagaact cagcgcagca gcctgagcag 120

aacagcagcg ccgcacatca atccgtgggc cagccggtga agctgaatca gggctgggaa 180

ttcatgcggg ccgaccaggt acttaccccc gaacaggctc ttgccgccgc agagtggcag 240

cgcgtagccc tgccccacac cccgcgcatc gaaccgcgta tcgtcaacga ccagtggcag 300

ggcgacgcct ggtatcaacg ccgtatcgac aacgacggtc gctgggacgg caagcgtgtt 360

tacatcgatt ttgaaggcgc catgaacgcc agtgaagtgt ggctgaacgg agaaaaaatc 420

gcggcccacc tgggcggcta cctgccgttt accattgacc tcagcgaccg actgcagccc 480

ggcaacaacc agctgctggt acgcctggac aaccgcgaca acgaagtgac cggccccaaa 540

ccgctggaga aactcgactt caacatgtac ggcggcctct accgcaacgc ctggctgcga 600

gtggaaaacc cggtgcatat caccgacccg gtacacgccg gcgaagtggc ctccggcggc 660

ctgtttgtac gctacccgca gatctccgaa gaatccgcac aggtgcaggt gcaaacgcac 720

ctgcgcaacg gcgacaacac ccaacccctg cgcgtggaac accgcctgct agacggtgac 780

aaggtggtcg ccagccacga gcagcaaatc ccggccggcg gtgaagccac cgtcgaagac 840

cagcagacat ttagcgtcga tgcgcccaag ctgtggtcgc cgtcctcccc caacctctac 900

gacctgcata cccgtattta tgccggcgac gacctggtgg acgaggaaca cacccgcatc 960

ggtatccgcg aattccgcct ggaaaatggc gaactgttta tcaacggtga gaaaaccttt 1020

ctgcgcgggg tcaaccgtca ccaggaatac ccctacgtgg gctacgctct gtccgatgcc 1080

gcgcagtatc gcgacgccgc gctgatcaag gccgccggct tcgactacgt gcgcctgtcc 1140

cactacccgc acgcgaaagc cttcatgcac gccgcggatg aactgggcct ggtgctactg 1200

gatgcggtac tcggctggca gtactacagc gacaaccccg aattccagaa ccacgtggtg 1260

cagacctgcc gcgacctgat ccgccgcgac cgcaaccacg cctcagtact ggcctgggaa 1320

tgctcactca acgaatcctg gatgcccgag ccgtttatcg accgcctgca cgccacggtg 1380

catgaagaat atcccggaga caacgtctac tccggcggct ggcagagcta cggctacgac 1440

atctacctac aggcccgcca gcaccgcctg gagcactacg aagaacccag caagccatac 1500

gtggtgtccg aatacggtga ctgggagtac tacgccatga acgccggcct gaaccaggac 1560

acctggggcg acctgctgca agccgatcgc tccagccgcc aactgctggg cgacggcgaa 1620

aaacgcctgc aacaacaggc gctcaacatc atggaagcgc acaacgacaa cttcaacaca 1680

cccgctttcg ccgacggcta ctgggtaatg ttcgactaca accgcggcta cgctgacgac 1740

ctcgaagcct ccggcatcat gagcctggag cgcctgccaa aattcagcta ccacttctac 1800

cagagccaac gggacgccga tgacttcgcc ggcccactcg ccggcggcta catggtacat 1860

atcgccagcc actggcagaa agacgccggc aacagcttct acgtcttcag caacgccgac 1920

gaagtagaaa tcctgctgaa cggcaaaagc gttacacgca ccaaacccaa cagccatttc 1980

accaacctca agcacccgcc gttccacttc gaactgccgg catttgaagc gggcaccctc 2040

gaagccgtgg cctacgccaa cggcaaagaa gtcgcccgcc accaacgggt gaccgccgaa 2100

gctgcacaac agctgcaact gaacgtcgac accgcgggca cggcaccggt ggcagacagc 2160

aaagacctgc tgttcgtaca cgctgcactg ctggataaaa acggcaaccg cacccacgtg 2220

aacgacatcc cggtcacctt ctccatcacc ggcgatgccg aaatcgtgtc accgaatgtc 2280

attgccagtg aagatggcgt ggccagtgtg ttggtgcgtg tgggagaaac gctggaaagc 2340

atcgcgatca acgcgacgtc tccgaagatg gaagcggcaa gtgtgaagct gccgctggag 2400

tga 2403

<210> 4

<211> 800

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Ala Cys Gly Gln Pro Asp Gln Glu Gln

20 25 30

Asn Ser Ala Gln Gln Pro Glu Gln Asn Ser Ser Ala Ala His Gln Ser

35 40 45

Val Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Gln Gly Trp Glu Phe Met Arg Ala

50 55 60

Asp Gln Val Leu Thr Pro Glu Gln Ala Leu Ala Ala Ala Glu Trp Gln

65 70 75 80

Arg Val Ala Leu Pro His Thr Pro Arg Ile Glu Pro Arg Ile Val Asn

85 90 95

Asp Gln Trp Gln Gly Asp Ala Trp Tyr Gln Arg Arg Ile Asp Asn Asp

100 105 110

Gly Arg Trp Asp Gly Lys Arg Val Tyr Ile Asp Phe Glu Gly Ala Met

115 120 125

Asn Ala Ser Glu Val Trp Leu Asn Gly Glu Lys Ile Ala Ala His Leu

130 135 140

Gly Gly Tyr Leu Pro Phe Thr Ile Asp Leu Ser Asp Arg Leu Gln Pro

145 150 155 160

Gly Asn Asn Gln Leu Leu Val Arg Leu Asp Asn Arg Asp Asn Glu Val

165 170 175

Thr Gly Pro Lys Pro Leu Glu Lys Leu Asp Phe Asn Met Tyr Gly Gly

180 185 190

Leu Tyr Arg Asn Ala Trp Leu Arg Val Glu Asn Pro Val His Ile Thr

195 200 205

Asp Pro Val His Ala Gly Glu Val Ala Ser Gly Gly Leu Phe Val Arg

210 215 220

Tyr Pro Gln Ile Ser Glu Glu Ser Ala Gln Val Gln Val Gln Thr His

225 230 235 240

Leu Arg Asn Gly Asp Asn Thr Gln Pro Leu Arg Val Glu His Arg Leu

245 250 255

Leu Asp Gly Asp Lys Val Val Ala Ser His Glu Gln Gln Ile Pro Ala

260 265 270

Gly Gly Glu Ala Thr Val Glu Asp Gln Gln Thr Phe Ser Val Asp Ala

275 280 285

Pro Lys Leu Trp Ser Pro Ser Ser Pro Asn Leu Tyr Asp Leu His Thr

290 295 300

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Asp Leu Val Asp Glu Glu His Thr Arg Ile

305 310 315 320

Gly Ile Arg Glu Phe Arg Leu Glu Asn Gly Glu Leu Phe Ile Asn Gly

325 330 335

Glu Lys Thr Phe Leu Arg Gly Val Asn Arg His Gln Glu Tyr Pro Tyr

340 345 350

Val Gly Tyr Ala Leu Ser Asp Ala Ala Gln Tyr Arg Asp Ala Ala Leu

355 360 365

Ile Lys Ala Ala Gly Phe Asp Tyr Val Arg Leu Ser His Tyr Pro His

370 375 380

Ala Lys Ala Phe Met His Ala Ala Asp Glu Leu Gly Leu Val Leu Leu

385 390 395 400

Asp Ala Val Leu Gly Trp Gln Tyr Tyr Ser Asp Asn Pro Glu Phe Gln

405 410 415

Asn His Val Val Gln Thr Cys Arg Asp Leu Ile Arg Arg Asp Arg Asn

420 425 430

His Ala Ser Val Leu Ala Trp Glu Cys Ser Leu Asn Glu Ser Trp Met

435 440 445

Pro Glu Pro Phe Ile Asp Arg Leu His Ala Thr Val His Glu Glu Tyr

450 455 460

Pro Gly Asp Asn Val Tyr Ser Gly Gly Trp Gln Ser Tyr Gly Tyr Asp

465 470 475 480

Ile Tyr Leu Gln Ala Arg Gln His Arg Leu Glu His Tyr Glu Glu Pro

485 490 495

Ser Lys Pro Tyr Val Val Ser Glu Tyr Gly Asp Trp Glu Tyr Tyr Ala

500 505 510

Met Asn Ala Gly Leu Asn Gln Asp Thr Trp Gly Asp Leu Leu Gln Ala

515 520 525

Asp Arg Ser Ser Arg Gln Leu Leu Gly Asp Gly Glu Lys Arg Leu Gln

530 535 540

Gln Gln Ala Leu Asn Ile Met Glu Ala His Asn Asp Asn Phe Asn Thr

545 550 555 560

Pro Ala Phe Ala Asp Gly Tyr Trp Val Met Phe Asp Tyr Asn Arg Gly

565 570 575

Tyr Ala Asp Asp Leu Glu Ala Ser Gly Ile Met Ser Leu Glu Arg Leu

580 585 590

Pro Lys Phe Ser Tyr His Phe Tyr Gln Ser Gln Arg Asp Ala Asp Asp

595 600 605

Phe Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Met Val His Ile Ala Ser His

610 615 620

Trp Gln Lys Asp Ala Gly Asn Ser Phe Tyr Val Phe Ser Asn Ala Asp

625 630 635 640

Glu Val Glu Ile Leu Leu Asn Gly Lys Ser Val Thr Arg Thr Lys Pro

645 650 655

Asn Ser His Phe Thr Asn Leu Lys His Pro Pro Phe His Phe Glu Leu

660 665 670

Pro Ala Phe Glu Ala Gly Thr Leu Glu Ala Val Ala Tyr Ala Asn Gly

675 680 685

Lys Glu Val Ala Arg His Gln Arg Val Thr Ala Glu Ala Ala Gln Gln

690 695 700

Leu Gln Leu Asn Val Asp Thr Ala Gly Thr Ala Pro Val Ala Asp Ser

705 710 715 720

Lys Asp Leu Leu Phe Val His Ala Ala Leu Leu Asp Lys Asn Gly Asn

725 730 735

Arg Thr His Val Asn Asp Ile Pro Val Thr Phe Ser Ile Thr Gly Asp

740 745 750

Ala Glu Ile Val Ser Pro Asn Val Ile Ala Ser Glu Asp Gly Val Ala

755 760 765

Ser Val Leu Val Arg Val Gly Glu Thr Leu Glu Ser Ile Ala Ile Asn

770 775 780

Ala Thr Ser Pro Lys Met Glu Ala Ala Ser Val Lys Leu Pro Leu Glu

785 790 795 800

Claims

1.蛋白质，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列2自N端第19至795位所示的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下B1)-B5)任一所示：

B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

B3)序列表中序列1自5’端第55至2388位所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述的蛋白质在作为β-半乳糖苷酶中的应用。

6.权利要求2或3所述的基因，或，权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备β-半乳糖苷酶中的应用。

7.权利要求1所述的蛋白质，或，权利要求2或3所述的基因，或，权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的应用，为如下(C1)-(C6)中的至少一种：

(C1)水解乳糖；

(C2)水解牛奶中的乳糖；

(C3)水解乳清中的乳糖；

(C4)制备低乳糖或无乳糖制品；

(C5)制备低乳糖或无乳糖牛奶；

(C6)利用乳清生产甜味剂。

8.制备β-半乳糖苷酶的方法，包括将权利要求2或3所述的基因导入到受体微生物中，得到表达β-半乳糖苷酶的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到β-半乳糖苷酶。

9.权利要求8所述方法制备得到的β-半乳糖苷酶。

10.水解乳糖的方法，包括如下步骤：采用权利要求1所述的蛋白质或权利要求8所述方法制备得到的β-半乳糖苷酶对样品中的乳糖进行水解。